CN114277015B - Crispr酶以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于核酸编辑领域，涉及新型CRISPR酶以及应用，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明提供了一类新型的Cas酶，其与已报道的Cas酶的同源性较低，可以在细胞内和细胞外表现出核酸酶的活性，具有广泛的应用前景。

Description

CRISPR酶以及应用

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，涉及CRISPR酶以及应用，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明涉及一种Cas效应蛋白，包含此类蛋白的融合蛋白，以及编码它们的核酸分子。本发明还涉及用于核酸编辑(例如，基因或基因组编辑)的复合物和组合物，其包含本发明的Cas蛋白或融合蛋白，或编码它们的核酸分子。

背景技术

CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。

CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，它识别3’-NGG的PAM基序，对靶标序列进行平末端切割。CRISPR/Cas Type V系统是一类新发现的CRISPR系统，它具有5’-TTN的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如Cpf1,C2c1,CasX,CasY。然而目前存在的不同的CRISPR/Cas各有不同的优点和缺陷。例如Cas9,C2c1和CasX均需要两条RNA进行指导RNA，而Cpf1只需要一条指导RNA而且可以用来进行多重基因编辑。CasX具有980个氨基酸的大小，而常见的Cas9，C2c1，CasY和Cpf1通常大小在1300个氨基酸左右。此外，Cas9，Cpf1，CasX，CasY的PAM序列都比较复杂多样，而C2c1识别严谨的5’-TTN，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应。

总之，鉴于目前可获得的CRISPR/Cas系统都受限于一些缺陷，开发一种更稳健的、具有多方面良好性能的CRISPR/Cas系统对生物技术的发展具有重要意义。

发明内容

本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现了一类核酸内切酶(Cas酶)。所述Cas酶包括Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7中的一种或任意几种，基于这一发现，本发明人开发了新的CRISPR/Cas系统以及基于该系统的基因编辑方法和核酸检测方法。

Cas效应蛋白

一方面，本发明提供了一种Cas蛋白(或者，称之为Cas酶，或者，称之为CRISPR酶)，所述Cas蛋白是CRISPR/Cas系统中的效应蛋白，所述效应蛋白选自Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7中的一种或任意几种。

其中，Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.1-3所示。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白氨基酸序列与SEQ ID No.1-3任意一条序列相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性，并且基本保留了其源自序列的生物学功能。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白氨基酸序列与SEQ ID No.1-3任意一条序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，并且基本保留了其源自序列的生物学功能；所述一个或多个氨基酸包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加。

本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代,这些保守性取代最好根据表1进行替换而产生。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。

保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变(缺失、取代或置换)而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在Cas酶的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。

表1

本领域熟知，可以从蛋白质的N和/或C末端改变(置换、删除、截短或插入)一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，从本发明的Cas蛋白的N和/或C末端改变了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的蛋白，也在本发明的范围内。这些改变可以包括通过现代分子方法例如PCR而引入的改变，所述方法包括借助于在PCR扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的PCR扩增。

应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对DNA的突变来制备Cas蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffl ing)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。

本领域技术人员能够理解，本发明Cas蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r-DNA技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。

本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定Cas蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白包含SEQ ID No.1-3任一所示的氨基酸序列。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白为SEQ ID No.1-3任一所示的氨基酸序列。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白是与具有SEQ ID No.1-3任一所示的序列的蛋白质相同生物学功能的衍生化蛋白。

所述生物学功能包括但不限于，与指导RNA结合的活性、核酸内切酶活性、在指导RNA引导下与靶序列特定位点结合并切割的活性，包括但不限于Cis切割活性和Trans切割活性。

本发明还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括选自Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7中的任意一种Cas蛋白和其他的修饰部分。

在一个实施方式中，所述修饰部分选自另外的蛋白或多肽、可检测的标记或其任意组合。

在一个实施方式中，所述修饰部分选自表位标签、报告基因序列、核定位信号(NLS)序列、靶向部分、转录激活结构域(例如，VP64)、转录抑制结构域(例如，KRAB结构域或SID结构域)、核酸酶结构域(例如，Fok1)，以及具有选自下列的活性的结构域：核苷酸脱氨酶，甲基化酶活性,去甲基化酶,转录激活活性,转录抑制活性,转录释放因子活性,组蛋白修饰活性,核酸酶活性,单链RNA切割活性,双链RNA切割活性,单链DNA切割活性,双链DNA切割活性和核酸结合活性；以及其任意组合。所述NLS序列是本领域技术人员熟知的，其实例包括但不限于所述，SV40大T抗原，EGL-13，c-Myc以及TUS蛋白。

在一个实施方式中，所述NLS序列位于、靠近或接近本发明的Cas蛋白的末端(例如，N端、C端或两端)。

所述表位标签(epitope tag)是本领域技术人员熟知的，包括但不限于His、V5、FLAG、HA、Myc、VSV-G、Trx等，并且本领域技术人员可以选择其他合适的表位标签(例如，纯化、检测或示踪)。

所述报告基因序列是本领域技术人员熟知的，其实例包括但不限于GST、HRP、CAT、GFP、HcRed、DsRed、CFP、YFP、BFP等。

在一个实施方式中，本发明的融合蛋白包含能够与DNA分子或细胞内分子结合的结构域，例如麦芽糖结合蛋白(MBP)、Lex A的DNA结合结构域(DBD)、GAL4的DBD等。

在一个实施方式中，本发明的融合蛋白包含可检测的标记，例如荧光染料，例如FITC或DAPI。

在一个实施方式中，本发明的Cas蛋白任选地通过接头与所述修饰部分偶联、缀合或融合。

在一个实施方式中，所述修饰部分直接连接至本发明的Cas蛋白的N端或C端。

在一个实施方式中，所述修饰部分通过接头连接至本发明的Cas蛋白的N端或C端。这类接头是本领域熟知的，其实例包括但不限于包含一个或多个(例如，1个，2个，3个，4个或5个)氨基酸(如，Glu或Ser)或氨基酸衍生物(如，Ahx、β-Ala、GABA或Ava)的接头，或PEG等。

本发明的Cas蛋白、蛋白衍生物或融合蛋白不受其产生方式的限定，例如，其可以通过基因工程方法(重组技术)产生，也可以通过化学合成方法产生。

Cas蛋白的核酸

另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含：编码本发明的Cas蛋白或融合蛋白的多核苷酸序列。

在一个实施方式中，所述分离的多核苷酸的序列如SEQ ID No.12-14任一所示，或者是SEQ ID No.12-14任一序列的互补序列。

在一个实施方式中，所述的多核苷酸序列经密码子优化用于在原核细胞中进行表达。在一个实施方式中，所述的多核苷酸序列经密码子优化用于在真核细胞中进行表达。

在一个实施方式中，所述的多核苷酸优选是单链的或双链的。

同向重复(Direct Repeat)序列

另一方面，本发明提供了一种与选自上述Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7的任意一种Cas蛋白形成复合物的工程化同向重复序列。

所述同向重复序列与能够和靶序列杂交的引导序列连接后构成指导RNA(guideRNA或gRNA)。

所述靶序列与gRNA的杂交，代表靶序列和gRNA的核酸序列至少70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的同一性，从而可以杂交形成复合物；或者代表靶序列和gRNA的核酸序列至少有12个，15个，16个，17个，18个，19个，20个，21个，22个，或更多个碱基可以互补配对，形成复合物。

在一些实施例中，该同向重复序列与SEQ ID No.4-6任意一条序列具有至少90％的序列同一性，例如，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％的同一性。在一些实施例中，该同向重复序列与SEQ ID No.4-6任意一条所示的序列相比具有一个或多个碱基的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个碱基的置换、缺失或添加)的序列。

在一些实施例中，同向重复序列如SEQ ID No.4-6任意一条序列所示，或者如SEQID No.7-9任意一条序列所示。

本发明中，SEQ ID No.4-6分别对应Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7的原型同向重复序列；SEQ ID No.7-9分别对应Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7的成熟同向重复序列。

指导RNA(gRNA)

另一方面，本发明提供了一种gRNA，所述gRNA包括第一区段和第二区段；所述第一区段又称为“骨架区”、“蛋白质结合区段”、“蛋白质结合序列”、或者“同向重复(DirectRepeat)序列”；所述第二区段又称为“靶向核酸的靶向序列”或者“靶向核酸的靶向区段”，或者“靶向靶序列的引导序列”。

所述gRNA的第一区段能够与本发明的Cas蛋白相互作用，从而使Cas蛋白和gRNA形成复合物。

本发明靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段包含与靶核酸中的序列互补的核苷酸序列。换言之，本发明靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段经过杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。因此，靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段可改变，或可被修饰以杂交靶核酸内的任何希望的序列。所述核酸选自DNA或RNA。

靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段与靶核酸的靶序列之间的互补百分比可为至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)。

本发明gRNA的“骨架区”、“蛋白质结合区段”、“蛋白质结合序列”、或者“同向重复序列”可以与CRISPR蛋白(或者，Cas蛋白)相互作用。本发明gRNA经过靶向核酸的靶向序列的作用将其相互作用的Cas蛋白引导至靶核酸内的特异性核苷酸序列。

优选的，所述指导RNA从5’至3’方向包含第一区段和第二区段。

本发明中，所述第二区段还可以理解为与靶序列杂交的引导序列。

本发明的gRNA能够与所述Cas蛋白形成复合物。

载体

本发明还提供了一种载体，其包含如上述的Cas蛋白、分离的核酸分子或多核苷酸；优选的，其还包括与之可操作连接的调控元件。

在一个实施方式中，所述的调控元件选自下组中的一种或多种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多腺苷酸序列、标记基因。

在一个实施方式中，所述的载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体。

在一些实施方案中，所述系统中包括的载体是病毒载体(例如逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关载体和单纯疱疹载体)，还可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。

载体系统

本发明提供了一种工程化的非天然存在的载体系统，或者是CRISPR-Cas系统，该系统包括Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列以及编码一种或多种指导RNA的核酸。

在一种实施方式中，所述编码所述Cas蛋白的核酸序列和编码一种或多种指导RNA的核酸是人工合成的。

在一种实施方式中，所述编码所述Cas蛋白的核酸序列和编码一种或多种指导RNA的核酸并不共同天然存在。

该一种或多种指导RNA在细胞中靶向一个或多个靶序列。所述一个或多个靶序列与编码一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位杂交，并且引导该Cas蛋白到达所述一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位部位，Cas蛋白到达靶序列位置后对靶序列进行修饰、编辑或切割，由此该一种或多种基因产物的表达被改变或修饰。

本发明的细胞包括动物、植物或微生物中的一种或多种。

在一些实施例中，该Cas蛋白是密码子优化的，用于在细胞中进行表达。

在一些实施例中，该Cas蛋白指导切割在该靶序列位置处的一条或两条链。

本发明还提供了一种工程化的非天然存在的载体系统，该载体系统可以包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：

a)第一调控元件，该第一调控元件可操作地与gRNA连接，

b)第二调控元件，该第二调控元件可操作地与所述Cas蛋白连接；

其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上。

所述第一和第二调控元件包括启动子(例如，组成型启动子或诱导型启动子)、增强子(例如35S promoter或35S enhanced promoter)、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如，多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。

在一些实施方案中，所述系统中的载体是病毒载体(例如逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关载体和单纯疱疹载体)，还可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。

在一些实施例中，本文提供的系统处于递送系统中。在一些实施方案中，递送系统是纳米颗粒，脂质体，外体，微泡和基因枪。

在一个实施方式中，当所述靶序列为DNA时，所述靶序列位于原间隔序列临近基序(PAM)的3’端，并且所述PAM具有TTN所示的序列，其中，N选自A、G、T、C。

在一个实施方式中，所述靶序列是来自原核细胞或真核细胞的DNA或RNA序列。在一个实施方式中，所述靶序列是非天然存在的DNA或RNA序列。

在一个实施方式中，所述靶序列存在于细胞内。在一个实施方式中，所述靶序列存在于细胞核内或细胞质(例如，细胞器)内。在一个实施方式中，所述细胞是真核细胞。在其他实施方式中，所述细胞是原核细胞。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白连接有一个或多个NLS序列。在一个实施方式中，所述融合蛋白包含一个或多个NLS序列。在一个实施方式中，所述NLS序列连接至所述蛋白的N端或C端。在一个实施方式中，所述NLS序列融合至所述蛋白的N端或C端。

另一方面，本发明涉及一种工程化的CRISPR系统，所述系统包含上述Cas蛋白以及一种或多种指导RNA，其中，所述指导RNA包括同向重复序列和能够与靶核酸杂交的间隔序列，所述Cas蛋白能够结合所述指导RNA并靶向与间隔序列互补的靶核酸序列。

蛋白-核酸复合物/组合物

另一方面，本发明提供了一种复合物或者组合物，其包含：

(i)蛋白组分，其选自：上述Cas蛋白、衍生化蛋白或融合蛋白，及其任意组合；和

(ii)核酸组分，其包含(a)能够与靶序列杂交的引导序列；以及(b)能够与本发明的Cas蛋白结合的同向重复序列。

所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物。

在一个实施方式中，所述核酸组分是CRISPR-Cas系统中的指导RNA。

在一个实施方式中，所述复合物或组合物是非天然存在的或经修饰的。在一个实施方式中，所述复合物或组合物中的至少一个组分是非天然存在的或经修饰的。在一个实施方式中，所述第一组分是非天然存在的或经修饰的；和/或，所述第二组分是非天然存在的或经修饰的。

活化的CRISPR复合物

另一方面，本发明还提供了一种活化的CRISPR复合物，所述活化的CRISPR复合物包含：(1)蛋白组分，其选自：本发明的Cas蛋白、衍生化蛋白或融合蛋白，及其任意组合；(2)gRNA，其包含(a)能够与靶序列杂交的引导序列；以及(b)能够与本发明的Cas蛋白结合的同向重复序列；以及(3)结合在gRNA上的靶序列，优选的，所述结合为通过gRNA上的能够与靶序列杂交的引导序列与靶靶序列进行的结合。

本文所用术语“活化的CRISPR复合物”，“活化复合物”或“三元复合物”是指CRISPR系统中Cas蛋白、gRNA与靶核酸结合或修饰后的复合物。

本发明的Cas蛋白和gRNA可以形成二元复合物，该二元复合物在与核酸底物结合时被活化，形成活化的CRISPR复合物。该核酸底物与gRNA中的间隔序列(或者称之为，与靶核酸杂交的引导序列)互补。在一些实施方案中，gRNA的间隔序列与靶底物完全匹配。在其它实施方案中，gRNA的间隔序列与靶底物的部分(连续或不连续)匹配。

在优选的实施方式中，所述活化的CRISPR复合物可以表现出侧枝核酸酶切活性，所述侧枝核酸酶切活性是指活化的CRISPR复合物表现的对单链核酸的非特异切割活性或乱切活性，在本领域又称之为trans切割活性。

递送及递送组合物

本发明的Cas蛋白、gRNA、融合蛋白、核酸分子、载体、系统、复合物和组合物，可以通过本领域已知的任何方法进行递送。此类方法包括但不限于，电穿孔、脂转染、核转染、显微注射、声孔效应、基因枪、磷酸钙介导的转染、阳离子转染、脂质体转染、树枝状转染、热激转染、核转染、磁转染、脂转染、穿刺转染、光学转染、试剂增强性核酸摄取、以及经由脂质体、免疫脂质体、病毒颗粒、人工病毒体等的递送。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种递送组合物，其包含递送载体，以及选自下列的一种或任意几种：本发明的Cas蛋白、融合蛋白、核酸分子、载体、系统、复合物和组合物。

在一个实施方式中，所述递送载体是粒子。

在一个实施方式中，所述递送载体选自脂质颗粒、糖颗粒、金属颗粒、蛋白颗粒、脂质体、外泌体、微泡、基因枪或病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒)。

宿主细胞

本发明还涉及一种体外的、离体的或体内的细胞或细胞系或它们的子代，所述细胞或细胞系或它们的子代包含：本发明所述的Cas蛋白、融合蛋白、核酸分子、蛋白-核酸复合物、活化的CRISPR复合物、载体、本发明递送组合物。

在某些实施方案中，所述细胞是原核细胞。

在某些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞是人类细胞。某些实施方案中，所述细胞是非人哺乳动物细胞，例如非人灵长类动物、牛、羊、猪、犬、猴、兔、啮齿类(如大鼠或小鼠)的细胞。在某些实施方案中，所述细胞是非哺乳动物真核细胞，例如家禽鸟类(如鸡)、鱼类或甲壳动物(如蛤蜊、虾)的细胞。在某些实施方案中，所述细胞是植物细胞，例如单子叶植物或双子叶植物具有的细胞或栽培植物或粮食作物如木薯、玉米、高粱、大豆、小麦、燕麦或水稻具有的细胞，例如藻类、树或生产植物、果实或蔬菜(例如，树类如柑橘树、坚果树；茄属植物、棉花、烟草、番茄、葡萄、咖啡、可可等)。

在某些实施方案中，所述细胞是干细胞或干细胞系。

在某些情况下，本发明的宿主细胞包含基因或基因组的修饰，该修饰是在其野生型中不存在的修饰。

基因编辑方法和应用

本发明的Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物或上述活化的CRISPR复合物或者上述宿主细胞可用于以下任一或任意几个用途：靶向和/或编辑靶核酸；切割双链DNA、单链DNA或单链RNA；非特异性切割和/或降解侧枝核酸；非特异性切割单链核酸；核酸检测；检测目标样品中的核酸；特异性地编辑双链核酸；碱基编辑双链核酸；碱基编辑单链核酸。在其他的实施方式中，还可以用于制备用于上述任一或任意几个用途的试剂或试剂盒。

本发明还提供了上述Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物或上述活化的CRISPR复合物在基因编辑、基因靶向或基因切割中的应用；或者，在制备用于基因编辑、基因靶向或基因切割的试剂或试剂盒中的用途。

在一个实施方式中，所述基因编辑、基因靶向或基因切割为在细胞内和/或细胞外进行基因编辑、基因靶向或基因切割。

本发明还提供了一种编辑靶核酸、靶向靶核酸或切割靶核酸的方法，所述方法包括将靶核酸与上述Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物或上述活化的CRISPR复合物进行接触。在一个实施方式中，所述方法为在细胞内和/或细胞外编辑靶核酸、靶向靶核酸或切割靶核酸。

所述基因编辑或编辑靶核酸包括修饰基因、敲除基因、改变基因产物的表达、修复突变、和/或插入多核苷酸、基因突变。

所述编辑可以在原核细胞和/或真核细胞中进行编辑。

另一方面，本发明还提供了上述Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物或上述活化的CRISPR复合物在核酸检测中的应用，或在制备用于核酸检测的试剂或试剂盒中的用途。

另一方面，本发明还提供了一种切割单链核酸的方法，所述方法包括，使核酸群体与上述Cas蛋白和gRNA接触，其中所述核酸群体包含靶核酸和多个非靶单链核酸，所述Cas蛋白切割所述多个非靶单链核酸。

所述gRNA能够结合所述Cas蛋白。

所述gRNA能够靶向所述靶核酸。

所述接触可以是在体外、离体或体内的细胞内部。

优选的，所述切割单链核酸为非特异性的切割。

另一方面，本发明还提供了上述Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物或上述活化的CRISPR复合物在非特异性的切割单链核酸中的应用，或在制备用于非特异性的切割单链核酸的试剂或试剂盒中的用途。

另一方面，本发明还提供了一种用于基因编辑、基因靶向或基因切割的试剂盒，所述试剂盒包括上述Cas蛋白、gRNA、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物、上述活化的CRISPR复合物或上述宿主细胞。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测样品中的靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)Cas蛋白，或编码所述Cas蛋白的核酸；(b)指导RNA，或编码所述指导RNA的核酸，或包含所述指导RNA的前体RNA，或编码所述前体RNA的核酸；和(c)为单链的且不与所述指导RNA杂交的单链核酸检测器。

本领域知晓，前体RNA可被切割或加工成为上述成熟的指导RNA。

另一方面，发明提供了上述Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物、上述活化的CRISPR复合物或上述宿主细胞在制备制剂或试剂盒中的用途，所述制剂或试剂盒用于：

(i)基因或基因组编辑；

(ii)靶核酸检测和/或诊断；

(iii)编辑靶基因座中的靶序列来修饰生物或非人类生物；

(iv)疾病的治疗；

(v)靶向靶基因；

(vi)切割目的基因。

优选的，上述基因或基因组编辑为在细胞内或细胞外进行基因或基因组编辑。

优选的，所述靶核酸检测和/或诊断为在体外进行靶核酸检测和/或诊断。

优选的，所述疾病的治疗为治疗由靶基因座中的靶序列的缺陷引起的病症。

另一个方面，本发明提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与所述Cas蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的指导序列；检测由所述Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交。

特异性修饰靶核酸的方法

另一方面，本发明还提供了一种特异性修饰靶核酸的方法，方法包括：使靶核酸与上述Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物或上述活化的CRISPR复合物接触。

该特异性修饰可以发生在体内或者体外。

该特异性修饰可以发生在细胞内或者细胞外。

在一些情况下，细胞选自原核细胞或真核细胞，例如，动物细胞、植物细胞或微生物细胞。

在一个实施方式中，所述修饰是指所述靶序列的断裂，如，DNA的单链/双链断裂，或者RNA的单链断裂。

在一些情况下，所述方法还包括使靶核酸与供体多核苷酸接触，其中将供体多核苷酸、供体多核苷酸的部分、供体多核苷酸的拷贝或供体多核苷酸的拷贝的部分整合到靶核酸中。

在一个实施方式中，所述修饰还包括将编辑模板(例如外源核酸)插入所述断裂中。

在一个实施方式中，所述方法还包括：将编辑模板与所述靶核酸接触，或者递送至包含所述靶核酸的细胞中。在此实施方式中，所述方法通过与外源模板多核苷酸同源重组修复所述断裂的靶基因；在一些实施方式中，所述修复导致一种突变，包括所述靶基因的一个或多个核苷酸的插入、缺失、或取代，在其他的实施方式中，所述突变导致在从包含该靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸改变。

检测(非特异切割)

另一方面，本发明提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与上述Cas蛋白、核酸、上述组合物、上述CIRSPR/Cas系统、上述载体系统、上述递送组合物或上述活化的CRISPR复合物和单链核酸检测器接触；检测由所述Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸。

本发明中，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸；包括单链核酸、双链核酸，例如单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA。

在一个实施方式中，所述靶核酸来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、动物、植物等样品。优选的，所述靶核酸为PCR、NASBA、RPA、SDA、LAMP、HAD、NEAR、MDA、RCA、LCR、RAM等方法富集或扩增的产物。

在一个实施方式中，所述靶核酸为病毒核酸、细菌核酸、与疾病相关的特异核酸，如特定的突变位点或SNP位点或与对照有差异的核酸；优选地，所述病毒为植物病毒或动物病毒，例如，乳头瘤病毒，肝DNA病毒，疱疹病毒，腺病毒，痘病毒，细小病毒，冠状病毒；优选地，所述病毒为冠状病毒，优选地，SARS、SARS-CoV2(COVID-19)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、Mers-Cov。

在一些实施方式中，所述靶核酸来源于细胞，例如，来源于细胞裂解液。

在一个实施方式中，所述的靶核酸包括DNA、RNA，优选为单链核酸或双链核酸或核酸修饰物。

本发明中，所述gRNA与靶核酸上的靶序列至少有50％的匹配度，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％。

在一个实施方式中，当所述的靶序列含有一个或多个特征位点(如特定的突变位点或SNP)时，所述的特征位点与gRNA完全匹配。

在一个实施方式中，所述检测方法中可以包含一种或多种导向序列互不相同的gRNA，其靶向不同的靶序列。

本发明中，所述单链核酸检测器包括但不限于单链DNA、单链RNA、DNA-RNA杂交体、核酸类似物、碱基修饰物、以及含有无碱基间隔物的单链核酸检测器等；“核酸类似物”包括但不限于：锁核酸、桥核酸、吗啉核酸、乙二醇核酸、己糖醇核酸、苏糖核酸、阿拉伯糖核酸、2’氧甲基RNA、2’甲氧基乙酰基RNA、2’氟RNA、2’氨基RNA、4’硫RNA及其组合，包括任选的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸残基。

本发明中，所述可检测信号通过以下方式实现：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于荧光信号的检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，荧光检测，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。

本发明中，优选的，所述单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的荧光信号。所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，通过胶体金检测的方式，检测所述单链核酸检测器被Cas蛋白切割前和被Cas蛋白切割后的胶体金测试结果；所述单链核酸检测器被Cas蛋白切割前和被Cas蛋白切割后在胶体金的检测线和质控线上将表现出不同的显色结果。

在一些实施方案中，检测靶核酸的方法还可以包括将可检测信号的电平与参考信号电平进行比较，以及基于可检测信号的电平确定样品中靶核酸的量。

在一些实施方案中，检测靶核酸的方法还可以包括在不同的通道上使用RNA报告核酸和DNA报告核酸(例如，荧光颜色)，并通过测量RNA和DNA报告分子的信号电平，以及通过测量RNA和DNA报告分子中靶核酸的量来确定可检测信号的电平，基于组合(例如，使用最小或乘积)可检测信号的电平来采样。

在一个实施方式中，所述靶核酸存在于细胞内。

在一个实施方式中，所述细胞是原核细胞。

在一个实施方式中，所述细胞是真核细胞。

在一个实施方式中，所述细胞是动物细胞。

在一个实施方式中，所述细胞是人类细胞。

在一个实施方式中，所述细胞是植物细胞，例如栽培植物(如木薯、玉米、高粱、小麦或水稻)、藻类、树或蔬菜具有的细胞。

在一个实施方式中，所述靶基因存在于体外的核酸分子(例如，质粒)中。

在一个实施方式中，所述靶基因存在于质粒中。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学、化学、分子生物学、生物化学、细胞培养、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

Cas蛋白

在本发明中，Cas蛋白、Cas酶、Cas效应蛋白、CRISPR酶可以互换使用；本发明人首次发现并鉴定了一种Cas效应蛋白，其具有选自下列的氨基酸序列：

(i)SEQ ID No.1-3任一所示的序列；

(ii)与SEQ ID No.1-3任一所示的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID No.1-3任一所示的序列具有至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的序列。

本文中的核酸切割或切割核酸包括:由本文所述Cas酶产生的靶核酸中的DNA或RNA断裂(Cis切割)、DNA或RNA在侧枝核酸底物(单链核酸底物)中的断裂(即非特异性或非靶向性，Trans切割)。在一些实施方式中，所述切割是双链DNA断裂。在一些实施方案中，切割是单链DNA断裂或单链RNA断裂。

CRISPR系统

如本文中所使用的，术语“规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR-相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统”或“CRISPR系统”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义，其通常包含与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达有关的转录产物或其他元件，或者能够指导所述Cas基因活性的转录产物或其他元件。

CRISPR/Cas复合物

如本文中所使用的，术语“CRISPR/Cas复合物”是指，指导RNA(guide RNA)或成熟crRNA与Cas蛋白结合所形成的复合体，其包含杂交到靶序列的引导序列上并且与Cas蛋白结合的同向重复序列，该复合体能够识别并切割能与该指导RNA或成熟crRNA杂交的多核苷酸。

指导RNA(guide RNA，gRNA)

如本文中所使用的，术语“指导RNA(guide RNA，gRNA)”、“成熟crRNA”、“指导序列”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，指导RNA可以包含同向重复序列(direct repeat)和引导序列，或者基本上由或由同向重复序列和引导序列组成。

在某些情况下，指导序列是与靶序列具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列。在一个实施方式中，当最佳比对时，指导序列与其相应靶序列之间的互补程度为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。

靶序列

“靶序列”是指被gRNA中的引导序列所靶向的多核苷酸，例如与该引导序列具有互补性的序列，其中靶序列与引导序列之间的杂交将促进CRISPR/Cas复合物(包括Cas蛋白和gRNA)的形成。完全互补性不是必需的，只要存在足够互补性以引起杂交并且促进一种CRISPR/Cas复合物的形成即可。

靶序列可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA。在某些情况下，所述靶序列位于细胞内或细胞外。在某些情况下，所述靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在某些情况下，该靶序列可位于真核细胞的一个细胞器例如线粒体或叶绿体内。可被用于重组到包含该靶序列的靶基因座中的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一个实施方式中，所述编辑模板为外源核酸。在一个实施方式中，该重组是同源重组。

在本发明中，“靶序列”或“靶多核苷酸”或“靶核酸”可以是对细胞(例如，真核细胞)而言任何内源或外源的多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种存在于真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例如，调节多核苷酸或无用DNA)。在某些情况下，该靶序列应该与原间隔序列临近基序(PAM)相关。

单链核酸检测器

本发明所述的单链核酸检测器是指含有2-200个核苷酸的序列，优选，具有2-150个核苷酸，优选，3-100个核苷酸，优选，3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。优选为单链DNA分子、单链RNA分子或单链DNA-RNA杂交体。

所述的单链核酸检测器两端包括不同的报告基团或标记分子，当其处于初始状态(即未被切割状态时)不呈现报告信号，当该单链核酸检测器被切割后，呈现出可检测的信号，即切割后与切割前表现出可检测的区别。

在一个实施方式中，所述的报告基团或标记分子包括荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在一个实施方式中，所述的单链核酸检测器具有连接至5’端第一分子(如FAM或FITC)和连接至3’端的第二分子(如生物素)。所述的含有单链核酸检测器的反应体系与流动条配合用以检测靶核酸(优选，胶体金检测方式)。所述的流动条被设计为具有两条捕获线，在样品接触端(胶体金)设有结合第一分子的抗体(即第一分子抗体)，在第一线(control line)处含有结合第一分子抗体的抗体，在第二线(test line)处含有与第二分子结合的第二分子的抗体(即第二分子抗体，如亲和素)。当反应沿着条带流动时，第一分子抗体与第一分子结合携带切割或未切割的寡核苷酸至捕获线，切割的报告子将在第一个捕获线处结合第一分子抗体的抗体，而未切割的报告子将在第二捕获线处结合第二分子抗体。报告基团在各条线的结合将导致强读出/信号(例如颜色)。随着更多的报告子被切割，更多的信号将在第一捕获线处累积，并且在第二线处将出现更少的信号。在某些方面，本发明涉及如本文所述的流动条用于检测核酸的用途。在某些方面，本发明涉及用本文定义的流动条检测核酸的方法，例如(侧)流测试或(侧)流免疫色谱测定。在某些方面，所述单链核酸检测器中的分子可相互替换，或改变分子的位置，只要其报告原理与本发明相同或相近，所改进的方式也均包含在本发明中。

本发明所述的检测方法，可用于待检测靶核酸的定量检测。所述的定量检测指标可以根据报告基团的信号强弱进行定量，如根据荧光基团的发光强度，或根据显色条带的宽度等。

野生型

如本文中所使用的，术语“野生型”具有本领域技术人员通常理解的含义，其表示生物、菌株、基因的典型形式或者当它在自然界存在时区别于突变体或变体形式的特征，其可从自然中的来源分离并且没有被人为有意地修饰。

衍生化

如本文中所使用的，术语“衍生化”是指，对氨基酸、多肽或蛋白的化学修饰，其中一个或多个取代基已与所述氨基酸、多肽或蛋白共价连接。取代基也可称为侧链。

衍生化的蛋白是该蛋白的衍生物，通常，蛋白的衍生化不会不利影响该蛋白的期望活性(例如，与指导RNA结合的活性、核酸内切酶活性、在指导RNA引导下与靶序列特定位点结合并切割的活性)，也就是说蛋白的衍生物与蛋白有相同的活性。

衍生化蛋白

又称“蛋白衍生物”，是指蛋白的经修饰形式，例如其中所述蛋白的一个或多个氨基酸可以被缺失、插入、修饰和/或取代。

非天然存在的

如本文中所使用的，术语“非天然存在的”或“工程化的”可互换地使用并且表示人工的参与。当这些术语用于描述核酸分子或多肽时，其表示该核酸分子或多肽至少基本上从它们在自然界中或如发现于自然界中的与其结合的至少另一种组分游离出来。

直系同源物(orthologue,ortholog)

如本文中所使用的，术语“直系同源物(orthologue,ortholog)”具有本领域技术人员通常理解的含义。作为进一步指导，如本文中所述的蛋白质的“直系同源物”是指属于不同物种的蛋白质，该蛋白质执行与作为其直系同源物的蛋白相同或相似的功能。

同一性

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Al ign程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Mil ler(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residuetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

载体

术语“载体”是指一种核酸分子，它能够运送与其连接的另一种核酸分子。载体包括但不限于，单链、双链、或部分双链的核酸分子；包括一个或多个自由端、无自由端(例如环状的)的核酸分子；包括DNA、RNA、或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多样的多核苷酸。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。一种载体可以被引入到宿主细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的蛋白、融合蛋白、分离的核酸分子等(例如，CRISPR转录物，如核酸转录物、蛋白质、或酶)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以例如通过标准分子克隆技术插入另外的DNA片段的环状双链DNA环。

另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于用于包装病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒、以及腺相关病毒)的载体中。病毒载体还包含由用于转染到一种宿主细胞中的病毒携带的多核苷酸。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。

其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到该宿主细胞的基因组中，并且由此与该宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在此被称为“表达载体”。

宿主细胞

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如微生物细胞、真菌细胞、动物细胞和植物细胞的真核细胞。

本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。

调控元件

如本文中所使用的，术语“调控元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)，其详细描述可参考戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(1990)。在某些情况下，调控元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。在某些情况下，调控元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在某些情况下，术语“调控元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段((Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。

启动子

如本文中所使用的，术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。

NLS

“核定位信号”或“核定位序列”(NLS)是对蛋白质“加标签”以通过核转运导入细胞核的氨基酸序列，即，具有NLS的蛋白质被转运至细胞核。典型地，NLS包含暴露在蛋白质表面的带正电荷的Lys或Arg残基。示例性核定位序列包括但不限于来自以下的NLS：SV40大T抗原，EGL-13，c-Myc以及TUS蛋白。在一些实施例中，该NLS包含PKKKRKV序列。在一些实施例中，该NLS包含AVKRPAATKKAGQAKKKKLD序列。在一些实施例中，该NLS包含PAAKRVKLD序列。在一些实施例中，该NLS包含MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN序列。在一些实施例中，该NLS包含KLKIKRPVK序列。其他核定位序列包括但不限于hnRNP A1的酸性M9结构域、酵母转录抑制子Matα2中的序列KIPIK和PY-NLS。

可操作地连接

如本文中所使用的，术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调控元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。

互补性

如本文中所使用的，术语“互补性”是指核酸与另一个核酸序列借助于传统的沃森-克里克或其他非传统类型形成一个或多个氢键的能力。互补百分比表示一个核酸分子中可与一个第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个之中有5、6、7、8、9、10个即为50％、60％、70％、80％、90％、和100％互补)。“完全互补”表示一个核酸序列的所有连续残基与一个第二核酸序列中的相同数目的连续残基形成氢键。如本文使用的“基本上互补”是指在一个具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的互补程度，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。

严格条件

如本文中所使用的，对于杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的一个核酸主要地与该靶序列杂交并且基本上不杂交到非靶序列上的条件。严格条件通常是序列依赖性的，并且取决于许多因素而变化。一般而言，该序列越长，则该序列特异性地杂交到其靶序列上的温度就越高。

杂交

术语“杂交”或“互补的”或“基本上互补的”是指核酸(例如RNA、DNA)包含使其能够非共价结合的核苷酸序列，即以序列特异性，反平行的方式(即核酸特异性结合互补核酸)与另一核酸形成碱基对和/或G/U碱基对，“退火”或“杂交”。

杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管碱基之间可能存在错配。两个核酸之间杂交的合适条件取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域公知的变量。典型地，可杂交核酸的长度为8个核苷酸或更多(例如，10个核苷酸或更多，12个核苷酸或更多，15个核苷酸或更多，20个核苷酸或更多，22个核苷酸或更多，25个核苷酸或更多，或30个核苷酸或更多)。

应当理解，多核苷酸的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补以特异性杂交。多核苷酸可包含60％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，98％或更高，99％或更高，99.5％或更高，或与其杂交的靶核酸序列中的靶区域的序列互补性为100％。

靶序列与gRNA的杂交代表靶序列和gRNA的核酸序列至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的可以杂交，形成复合物；或者代表靶序列和gRNA的核酸序列至少有12个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或更多个碱基可以互补配对，杂交形成复合物。

表达

如本文中所使用的，术语“表达”是指，藉此从DNA模板转录成多核苷酸(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后藉此翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。

接头

如本文中所使用的，术语“接头”是指，由多个氨基酸残基通过肽键连接形成的线性多肽。本发明的接头可以为人工合成的氨基酸序列，或天然存在的多肽序列，例如具有铰链区功能的多肽。此类接头多肽是本领域众所周知的(参见例如，Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure 2:1121-1123)。

治疗

如本文中所使用的，术语“治疗”是指，治疗或治愈病症，延缓病症的症状的发作，和/或延缓病症的发展。

受试者

如本文中所使用的，术语“受试者”包括但不限于各种动物、植物和微生物。

动物

例如哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、兔科动物、啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)、非人灵长类动物(例如，猕猴或食蟹猴)或人。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有病症(例如，疾病相关基因缺陷所导致的病症)。

植物

术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearing tree)、以及灌木和其他苗木。

发明的有益效果

本发明发现了一类Cas酶，其可以在体内和体外表现出核酸酶的活性，具有广泛的应用前景。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1.Cas-sf12用于体外核酸检测时的荧光结果图。

图2.Cas-sf2用于体外核酸检测时的荧光结果图。

图3.Cas-sf7用于体外核酸检测时的荧光结果图。

图4.不同Cas蛋白体外切割活性电泳结果，其中，泳道1为PCR产物对照组，泳道2为Cas-sf7实验组，泳道3为不添加Cas-sf7的对照组，泳道4为Cas-sf12实验组，泳道5为不添加Cas-sf12的对照组。

序列信息

/>

具体实施方式

以下实施例仅用于描述本发明，而非限定本发明。除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:APRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,A LABORATORYMANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。

另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

实施例1.Cas蛋白的获得

发明人对未培养物的宏基因组进行分析，通过对去冗余、蛋白质聚类分析，鉴定得到了一类新的Cas酶，分别将其命名为Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.1-3所示，其核酸序列分别如SEQ ID No.12-14所示。Blast结果显示，上述Cas蛋白与已报道的Cas蛋白的序列一致性较低。

分析发现，Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7所对应的gRNA的原型同向重复序列分别如SEQ ID No.4-6所示，其对应的PAM为TTN(N可以为任意的碱基)；其对应的成熟的同向重复序列分别如SEQ ID No.7-9所示。

实施例2.Cas蛋白在进行体外核酸检测时的应用

本实施例通过体外检测以验证Cas酶的trans切割活性。本实施例中利用可以与靶核酸配对的gRNA引导Cas酶识别并结合在靶核酸上；随后，Cas酶激发对任意单链核酸的trans切割活性，从而切割体系里的单链核酸检测器；单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，如果单链核酸检测器被切割，则会激发荧光；在其他的实施方式中，单链核酸检测器的两端还可以设置成能够被胶体金检测的标记。

将Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7蛋白分别构建至pet30a表达载体上，转入大肠杆菌，进行原核表达蛋白的纯化，均可以得到纯化的目的蛋白。

本实施例中选择靶核酸为单链DNA，N-B-i3g1-ssDNA0，其序列如SEQ ID No.10所示。

gRNA的5’到3’端依次为不同Cas蛋白的DR区和靶向靶核酸的序列，所述靶向靶核酸的序列为cccccagcgcuucagcguuc；

单链核酸检测器序列为FAM-TTATT-BHQ1。

采用如下反应体系：Cas酶终浓度为50nM，gRNA终浓度为50nM，靶核酸终浓度为500nM,单链核酸检测器终浓度200nM。37℃孵育，读取FAM荧光/1min。对照组不添加靶核酸。

本实施例中针对Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7的trans切割活性进行了测试，gRNA的DR区选择相应蛋白的成熟的同向重复序列，Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7蛋白的成熟的同向重复序列分别如SEQ IDNo.7-9所示。

如图1-3所示，与不加靶核酸的对照相比，在有靶核酸存在的情况下，Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7能够切割体系里的单链核酸，快速的报告出荧光。以上实验反映出，配合单链核酸检测器，Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7可以用于靶核酸的检测。图1-3中，线条1为添加靶核酸的实验结果，线条2为不添加靶核酸的对照组。

实施例3.Cas蛋白体外切割活性的验证

将纯化的Cas-sf12、Cas-sf7蛋白、体外转录的gRNA(gRNA参见实施例2中gRNA)、PAM为TTC的PCR产物(PCR产物的序列如SEQ IDNo.11所示)在37℃共孵育1h，之后进行琼脂糖凝胶，以未酶切的PCR Product做对照。每种蛋白设置不添加蛋白的对照组。

如图4所示，Cas-sf12和Cas-sf7蛋白都在不同程度上切割了PCR产物，反映出，Cas-sf12和Cas-sf7蛋白可以切割靶核酸。

实施例4.Cas蛋白在原生质体中的编辑效率

为了验证上述Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7蛋白在真核细胞内是否可以产生编辑效果。首先用TTC的PAM构建了表达不同Cas蛋白的质粒及表达gRNA的质粒转化了玉米/水稻原生质体。转化后提取DNA，扩增包含靶位点的片段，进行二代测序；试验结果显示，Cas-sf12、Cas-sf2、Cas-sf7蛋白在原生质体中可以表现出一定程度的编辑效率。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 新型CRISPR酶以及应用

<130> P2021-0541

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1259

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Asn Ile Leu Lys Pro Phe Thr Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys

1 5 10 15

Thr Leu Arg Phe Glu Leu Lys Pro Val Gly Ala Thr Leu Thr Asn Ile

20 25 30

Glu Lys Lys Gly Leu Val Ser Glu Asp Glu Asn Leu Ala Val Ser Tyr

35 40 45

Lys Lys Leu Lys Lys Val Ile Asp Glu Tyr His Lys Asp Phe Ile Gly

50 55 60

Leu Ala Leu Lys Asp Leu Lys Leu Asn Ile Leu Asp Asp Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Leu Tyr Tyr Lys Thr Ile Lys Asp Glu Ile Asp Lys Lys Arg Phe Ile

85 90 95

Glu Leu Gln Leu Asn Leu Arg Lys Gln Ile Val Asp Ser Phe Ser Lys

100 105 110

Asn Ala Ser Asp Glu Ile Lys Asn Lys Phe Asp Arg Leu Phe Lys Lys

115 120 125

Glu Leu Ile Gln Ile Asp Leu Ile Glu Trp Leu Lys Ser Lys Asn Asp

130 135 140

Phe Glu Thr Ile Glu Leu Val Glu Lys Phe Lys Thr Phe Thr Thr Tyr

145 150 155 160

Phe Asn Gly Phe Asn Glu Asn Arg Lys Asn Met Tyr Ser Val Asp Glu

165 170 175

His Ser Thr Ala Ile Ala Tyr Arg Leu Ile His Glu Asn Leu Pro Lys

180 185 190

Phe Leu Asp Asn Leu Lys Ala Tyr Arg Phe Ile Lys Lys Ser Tyr Leu

195 200 205

Asp Phe Asp Phe Asn Lys Ile Glu Lys Glu Leu Glu Leu Ile Ser Val

210 215 220

Ser Phe Asp Ser Ile Phe Asp Val Asn Gly Phe Asn Gln Thr Leu Thr

225 230 235 240

Gln Asn Gly Ile Asp Phe Tyr Asn Thr Met Leu Gly Gly Leu Thr Glu

245 250 255

Gly His Gly Lys Lys Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Phe Ile Asn Leu

260 265 270

Tyr Lys Gln Glu Lys His Leu Lys Ser Lys Glu Ile Pro Ser Leu Lys

275 280 285

Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Glu Ser Val Ser Phe Leu

290 295 300

Gln Asp Glu Phe Ile Asp Asp Ser Asp Val Leu Asn Ser Ile Glu Val

305 310 315 320

Phe Tyr Arg Glu Glu Ile Lys Glu Lys Val Ile Asp Gly Asn Thr Ile

325 330 335

Asn Ile Leu Glu Thr Ile Asp Ser Val Leu Lys Glu Ile Glu Ser Phe

340 345 350

Asp Thr Ser Lys Ile Tyr Leu Arg Asn Asp Thr Ser Leu Thr Asp Ile

355 360 365

Ser Gln Arg Leu Tyr Gly Ser Trp Ser Val Val Lys Asn Ala Leu Ser

370 375 380

His Tyr Phe Glu Glu Ile Val Lys Pro Leu Asn Gly Lys Lys Arg Thr

385 390 395 400

Glu Lys Tyr Asp Lys Glu Leu Glu Gln Trp Leu Gly Lys Gln Asn Gln

405 410 415

Gln Phe Ser Ile Lys Phe Leu Gln Asp Val Cys Thr Ser Tyr Phe Ser

420 425 430

Ser Gln Asp Glu Lys Pro Leu Asn Val Asn Gly Lys Glu Trp Leu Glu

435 440 445

Tyr Phe Lys Asn Thr Gly Ser Ile Ser Asn Asp Val Asn Ser Ile Ser

450 455 460

Phe Ile Lys Arg Ile Glu Thr Ala Tyr Ser Ala Ile Glu Ser Phe Leu

465 470 475 480

Asn Val Glu Leu Asn Ser Ser Asn Arg Lys Leu Val Gln Glu Gln Val

485 490 495

Lys Val Asp Leu Leu Lys Leu Phe Leu Asp Glu Ile Val Thr Phe Leu

500 505 510

His Phe Ile Lys Pro Ile Thr Leu Lys Asp Ser Ser Ile Glu Lys Asp

515 520 525

Asp Val Phe Tyr Ser Val Leu Glu Gly Leu Tyr Asn Gln Leu Asp Phe

530 535 540

Val Thr Pro Leu Tyr Asn Lys Thr Arg Asn Tyr Leu Thr Lys Lys Ala

545 550 555 560

Tyr Ser Leu Glu Lys Val Lys Leu Asn Phe Gln Asn Ala Gln Leu Leu

565 570 575

Asn Gly Trp Asp Val Asn Lys Glu Thr Asp Asn Thr Ser Ile Leu Phe

580 585 590

Arg Lys Glu Gly Leu Tyr Tyr Leu Cys Val Met Asp Lys Lys His Asn

595 600 605

Lys Val Phe Lys Ser Pro Asn Asp Phe Pro Lys Asn Glu Glu Glu Tyr

610 615 620

Tyr Glu Lys Val Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu

625 630 635 640

Pro Lys Val Phe Phe Ser Asn Lys Ser Ile Glu Tyr Tyr Ala Pro Ser

645 650 655

Phe Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Lys Asn Glu Thr His Lys Lys Gly Glu

660 665 670

Thr Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Asp Leu Ile Asp Phe Phe Lys Glu

675 680 685

Ser Ile Asn Lys His Pro Asp Trp Lys Asn Phe Asn Tyr Gln Phe Ser

690 695 700

Glu Thr Ser Ser Tyr Glu Asp Leu Ser Gly Phe Tyr Arg Glu Val Glu

705 710 715 720

His Gln Gly Tyr Lys Ile Thr Phe Gln Asn Ile Ala Thr Ser Tyr Ile

725 730 735

Asp Asp Leu Ile Asn Glu Gly Lys Ile Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn

740 745 750

Lys Asp Phe Ser Pro Phe Ser Lys Gly Lys Pro Asn Met His Thr Leu

755 760 765

Tyr Trp Arg Ala Leu Phe Asp Glu Asn Asn Leu Lys Asp Val Ile Tyr

770 775 780

Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Ile Phe Tyr Arg Lys Lys Ser Leu Glu

785 790 795 800

Tyr Ser Asp Asp Ile Trp Leu Lys Gly His His Ala Asn Asp Leu Lys

805 810 815

Asp Lys Phe Asp Tyr Pro Ile Val Lys Asp Lys Arg Phe Ala Leu Asp

820 825 830

Ser Phe His Phe His Val Pro Ile Thr Met Asn Phe Lys Ala Asn Glu

835 840 845

Gly Asn Asn Phe Asn Gly Gln Val Asn Glu Phe Leu Lys Asn Asn Lys

850 855 860

Asp Ile Asn Ile Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu Leu Tyr

865 870 875 880

Leu Thr Leu Ile Asn Gln Arg Gly Glu Ile Ile Ile Gln Lys Ser Leu

885 890 895

Asn Thr Ile Thr Asn Lys Val Lys Asp Glu Leu Val Ser Val Asp Tyr

900 905 910

His Lys Arg Leu Asp Asp Arg Glu Lys Asn Arg Asn Asn Ala Arg Lys

915 920 925

Thr Trp Gly Thr Ile Glu Thr Ile Lys Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Leu

930 935 940

Ser Leu Val Ile His Glu Val Ala Lys Met Met Val Glu Asn Asn Ala

945 950 955 960

Val Val Val Leu Glu Asp Leu Asn Phe Gly Phe Lys Arg Gly Arg Gln

965 970 975

Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp

980 985 990

Lys Leu Asn Tyr Leu Ile Phe Lys Asp Arg Lys Asp Asp Glu Ile Gly

995 1000 1005

Gly Val Phe Asn Ala Leu Gln Leu Thr Ser Lys Phe Glu Ser Phe Gln

1010 1015 1020

Lys Leu Gly Lys Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Ile Pro Ala Ala Leu

1025 1030 1035 1040

Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ala Thr Gly Phe Val Asn Phe Met Asp Thr

1045 1050 1055

Lys Tyr Tyr Ser Val Glu Lys Ser Lys Glu Phe Phe Gly Lys Phe Ser

1060 1065 1070

Asn Ile Gln Tyr Asn Ile Asp Lys Asp Tyr Phe Glu Phe Glu Phe Asp

1075 1080 1085

Tyr Asn Ser Phe Thr Thr Lys Ala Glu Gly Thr Lys Thr Lys Trp Lys

1090 1095 1100

Val Cys Thr Ser Gly Asp Glu Arg Trp Arg Tyr Asn Pro Thr Thr Lys

1105 1110 1115 1120

Asn Ser Glu Arg Val Asn Val Thr Ala Glu Leu Lys Thr Leu Phe Glu

1125 1130 1135

Lys Asn Gln Ile Ile Phe Lys Asn Gly Asn Asp Leu Lys Ser Tyr Ile

1140 1145 1150

Ile Glu Lys Asp Glu Lys Gly Ile Tyr Ser Thr Leu Leu His Leu Leu

1155 1160 1165

Gly Leu Thr Leu Ser Leu Arg His Ser Glu Ser Gly Thr Glu Asn Asp

1170 1175 1180

Phe Ile Leu Ser Pro Val Phe Asn Asp Ser Glu Val Phe Phe Asp Ser

1185 1190 1195 1200

Arg Lys Ala Thr Glu Lys Ser Pro Lys Asp Ser Asp Ala Asn Gly Ala

1205 1210 1215

Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Leu Trp Ala Leu Arg Gln Ile Asp Ser

1220 1225 1230

Cys Asp Asp Trp Lys Lys Leu Lys Leu Ala Ile Ser Asn Lys Glu Trp

1235 1240 1245

Leu Asp Phe Val Gln Lys Arg Pro Phe Glu Lys

1250 1255

<210> 2

<211> 1294

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Asn Lys Lys Thr Phe Ser Asp Phe Thr Asn Leu Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Ser Lys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Gln Pro Val Gly Lys Thr Glu Glu

20 25 30

Ile Leu Lys Asn Asn Gly Val Phe Glu Thr Asp Lys Lys Arg Lys Lys

35 40 45

Ala Tyr Glu Asn Thr Lys Pro Tyr Phe Asp Arg Leu His Arg Glu Phe

50 55 60

Ile Ser Glu Ser Leu Ala Asn Ala Tyr Leu Asp Gly Leu Ser Asp Tyr

65 70 75 80

Phe Lys Val Phe Gln Ala Phe Lys Lys Asp Arg Lys Asn Gln Leu Ile

85 90 95

Asn Lys Gln Ile Asp Thr Leu Arg Lys Ser Leu Arg Glu Gln Ile Val

100 105 110

Gly Tyr Phe Asp Lys Asn Gly Lys Glu Trp Ala Thr Lys Lys Tyr Phe

115 120 125

His Leu Lys Ile Lys Arg Lys Asp Leu Asp Ile Leu Phe Glu Glu Glu

130 135 140

Val Phe Gln Ile Leu Lys His Lys Tyr Gly Asn Glu Lys Glu Thr Lys

145 150 155 160

Leu Thr Asn Pro Glu Thr Asp Glu Ile Ile Ser Ile Phe Asn Gly Trp

165 170 175

Lys Gly Phe Thr Gly Tyr Phe Ile Lys Phe Phe Ala Thr Arg Lys Asn

180 185 190

Phe Tyr Lys Ala Glu Val Glu Asn Gly Lys Gly Lys Ser Gly Gln Ile

195 200 205

Ser Thr Arg Ile Val Asp Gln Asn Leu Asp Arg Phe Leu Asp Asn Leu

210 215 220

Ile Thr Tyr Asp Phe Ile Lys Gly Lys Ile Asp Ile Thr Glu Val Glu

225 230 235 240

Lys Phe Phe Glu Leu Lys Ala Gly Glu Val Phe Ser Val Asp Phe Tyr

245 250 255

Asn Tyr Cys Leu Leu Gln Asp Gly Ile Asp Lys Tyr Asn Asp Phe Leu

260 265 270

Gly Gly Lys Thr Val Asn Asn Gly Glu Lys Ile Arg Gly Val Asn Glu

275 280 285

Ile Ile Asn Lys Tyr Arg Gln Asp Asn Lys Gly Glu Lys Leu Pro Phe

290 295 300

Leu Lys Lys Leu Asp Lys Gln Ile Leu Ser Glu Lys Glu Lys Phe Ile

305 310 315 320

Asp Glu Ile Glu Thr Pro Glu Glu Leu Leu Glu Val Leu Arg Glu Phe

325 330 335

Tyr Asp Ser Ala Gly Ser Lys Val Lys Val Leu Gln Thr Leu Leu Asn

340 345 350

Ser Phe Phe Lys Asp Tyr Asn Glu Tyr Asp Leu Asn Gly Ile Tyr Leu

355 360 365

Ser Lys Glu Ala Leu Asn Thr Ile Ser Asn Lys Trp Thr Asn Glu Thr

370 375 380

Glu Thr Phe Gly Ser Asn Leu Tyr Glu Val Leu Lys Ser Glu Lys Ile

385 390 395 400

Leu Thr Ser Ser Ala Lys Lys Thr Asp Gly Gly Tyr Ser Phe Pro Asp

405 410 415

Phe Ile Ser Ile Ala Asn Ile Lys Ala Ser Ile Glu Arg Ile Pro Arg

420 425 430

Glu Ser Lys Phe Trp Lys Glu Arg Tyr Tyr Glu Asn Pro Asn Gly Ser

435 440 445

Ser Val Leu Val Gly Asp Glu Pro Val Trp Glu Gln Phe Leu Lys Ile

450 455 460

Phe Lys Phe Glu Phe Phe Ser His Phe Glu Arg Thr Ile Val Asp Arg

465 470 475 480

Glu Thr Gly Gln Arg Glu Ala Glu Gly Tyr Asp Ile Phe Lys Ser Asn

485 490 495

Leu Glu Arg Leu Leu Lys Asp Phe Lys Ile Asp Lys Asn Ser Lys Leu

500 505 510

Ile Ile Lys Asp Phe Ala Asp Glu Val Leu Tyr Ile Tyr Gln Met Ala

515 520 525

Lys Tyr Phe Ala Leu Glu Lys Lys Arg Ala Trp Asn Thr Glu Tyr Asp

530 535 540

Asp Ser Leu Asp Val Phe Tyr Thr Asp Pro Asn Asn Gly Tyr Phe Thr

545 550 555 560

Phe Tyr Glu Asn Ala Tyr Lys Glu Ile Val Gln Pro Tyr Asn Lys Ile

565 570 575

Arg Asn Phe Leu Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Glu Tyr Lys Trp Lys Leu

580 585 590

Asn Phe Asp Asn Pro Thr Leu Ala Asp Gly Trp Asp Lys Asn Lys Glu

595 600 605

Ser Asp Asn Thr Ala Val Ile Leu Arg Lys Glu Gly Lys Tyr Tyr Leu

610 615 620

Gly Ile Met Lys Lys Gly His Asn Gln Ile Phe Gln Asp Lys Asn Lys

625 630 635 640

Thr Gln Ser Gln Leu Lys Gly Met Ser Asn Tyr Tyr Glu Lys Leu Val

645 650 655

Tyr Lys Gln Met Ala Asp Pro Lys Arg Asp Phe Pro Lys Gly Ile Phe

660 665 670

Ser Lys Lys Gly Phe Glu Thr Tyr Asn Pro Pro Glu Asp Ile Ile Gln

675 680 685

Ile Tyr Glu Gln Lys Thr Phe Lys Thr Glu Ser Leu Glu Phe Ser Lys

690 695 700

Gln Asp Leu Trp Lys Leu Ile Asp Phe Tyr Lys Ile Cys Ile Ser Leu

705 710 715 720

His Pro Ser Trp Lys Leu Tyr Asp Phe Ser Phe Ser Asn Thr Thr Lys

725 730 735

Tyr Glu Asn Leu Asn Asp Phe Tyr Ser Glu Val Ser Lys Asn Ala Tyr

740 745 750

Lys Thr Trp Phe Glu Ser Ile Ser Glu Asn Tyr Ile Ala Asp Lys Asn

755 760 765

Asn Leu Gly Glu Leu Phe Leu Phe Arg Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser

770 775 780

Asp Lys Ser Thr Gly Thr Lys Asn Leu His Thr Leu Tyr Phe Lys Glu

785 790 795 800

Leu Phe Ser Gln Ala Asn Met Glu Asn Asn Phe Pro Phe Lys Leu Asn

805 810 815

Gly Gln Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser Ile Asp Ala Val Val

820 825 830

Glu Lys Arg Asn Phe Lys Arg Glu Ile Val Asn Lys Lys Arg Tyr Ser

835 840 845

Glu Asn Lys Ile Phe Phe His Val Pro Ile Thr Leu Asn Arg Val Ser

850 855 860

Lys Asn Val Tyr Arg Phe Asn Thr Glu Ile Asn Asn Phe Leu Ala Asn

865 870 875 880

Asn Ser Gly Ile Asn Ile Ile Gly Val Asp Arg Gly Glu Lys His Leu

885 890 895

Val Tyr Tyr Ser Val Ile Asn Gln Lys Gly Glu Val Leu Asp Ser Glu

900 905 910

Ser Leu Asn Thr Ile Asn Gln Val Asp Tyr His Glu Lys Leu Glu Glu

915 920 925

Arg Ala Asp Asp Arg Lys Arg Ala Arg Lys Asn Trp Glu Glu Ile Glu

930 935 940

Gly Ile Lys Asp Leu Lys Lys Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val Arg Lys

945 950 955 960

Leu Ala Asp Leu Ala Ile Lys His Asn Ala Ile Ile Val Met Glu Asp

965 970 975

Leu Asn Met Arg Phe Lys Gln Ile Arg Gly Gly Ile Glu Lys Ser Ala

980 985 990

Tyr Gln Gln Leu Glu Lys Ala Leu Ile Gly Lys Leu Asn Phe Leu Val

995 1000 1005

Asn Lys Gly Glu Val Asp Pro Leu Lys Thr Gly His Leu Leu Ser Ala

1010 1015 1020

Tyr Gln Leu Thr Ala Leu Phe Glu Thr Phe Lys Asp Met Gly Lys Gln

1025 1030 1035 1040

Thr Gly Ile Ile Phe Tyr Thr Gln Ala Ser Tyr Thr Ser Arg Ile Asp

1045 1050 1055

Pro Leu Thr Gly Trp Arg Pro Asn Ile Tyr Leu Lys Tyr Ser Asn Ala

1060 1065 1070

Asp Gln Ala Lys Lys Asp Ile Leu Lys Phe Ser Asn Ile Asn Phe Asn

1075 1080 1085

Glu Ala Lys Gly Leu Phe Glu Phe Thr Tyr Asp Ile Lys Asp Phe Ser

1090 1095 1100

Asn Thr Lys Asp Phe Pro Ile Lys Thr Lys Trp Thr Val Cys Ser Asn

1105 1110 1115 1120

Val Lys Arg Phe Arg Trp Asp Arg Lys Leu Asn Asn Asn Lys Gly Gly

1125 1130 1135

Tyr Thr His Tyr Lys Asn Leu Thr Asp Gly Lys Thr Glu Asn Lys Asn

1140 1145 1150

Pro Lys Ser Thr Lys Pro Asp Asn Leu Lys Glu Leu Phe Glu Lys Tyr

1155 1160 1165

Lys Ile Asp Val Tyr Ser Asp Ile Lys Asn Gln Ile Gln Asn Leu Glu

1170 1175 1180

Thr Lys Arg Asn Glu Lys Phe Phe Gln His Phe Ile Phe Phe Phe Asn

1185 1190 1195 1200

Leu Ile Cys Gln Ile Arg Asn Thr Gln Gln Asp Lys Asp Gly Asp Glu

1205 1210 1215

Asn Asp Phe Ile Leu Ser Pro Val Glu Pro Phe Phe Asp Ser Arg Tyr

1220 1225 1230

Ser Glu Lys Phe Gly Lys Asn Leu Pro Gln Asn Gly Asp Asp Asn Gly

1235 1240 1245

Ala Tyr Asn Ile Ala Arg Lys Gly Ile Ile Ile Leu Asp Lys Ile Ser

1250 1255 1260

Lys His Tyr Lys Gln Val Gly Ser Thr Asp Lys Leu Ser Trp Asn Asp

1265 1270 1275 1280

Leu Tyr Ile Ser His Met Asp Trp Asp Asp Phe Ala Gln Ser

1285 1290

<210> 3

<211> 1282

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asn Gly Asn Arg Ser Ile Val Tyr Arg Glu Phe Val Gly Val Ile

1 5 10 15

Pro Val Ala Lys Thr Leu Arg Asn Glu Leu Arg Pro Val Gly His Thr

20 25 30

Gln Glu His Ile Ile Gln Asn Gly Leu Ile Gln Glu Asp Glu Leu Arg

35 40 45

Gln Glu Lys Ser Thr Glu Leu Lys Asn Ile Met Asp Asp Tyr Tyr Arg

50 55 60

Glu Tyr Ile Asp Lys Ser Leu Ser Gly Val Thr Asp Leu Asp Phe Thr

65 70 75 80

Leu Leu Phe Glu Leu Met Asn Leu Val Gln Ser Ser Pro Ser Lys Asp

85 90 95

Asn Lys Lys Ala Leu Glu Lys Glu Gln Ser Lys Met Arg Glu Gln Ile

100 105 110

Cys Thr His Leu Gln Ser Asp Ser Asn Tyr Lys Asn Ile Phe Asn Ala

115 120 125

Lys Leu Leu Lys Glu Ile Leu Pro Asp Phe Ile Lys Asn Tyr Asn Gln

130 135 140

Tyr Asp Val Lys Asp Lys Ala Gly Lys Leu Glu Thr Leu Ala Leu Phe

145 150 155 160

Asn Gly Phe Ser Thr Tyr Phe Thr Asp Phe Phe Glu Lys Arg Lys Asn

165 170 175

Val Phe Thr Lys Glu Ala Val Ser Thr Ser Ile Ala Tyr Arg Ile Val

180 185 190

His Glu Asn Ser Leu Ile Phe Leu Ala Asn Met Thr Ser Tyr Lys Lys

195 200 205

Ile Ser Glu Lys Ala Leu Asp Glu Ile Glu Val Ile Glu Lys Asn Asn

210 215 220

Gln Asp Lys Met Gly Asp Trp Glu Leu Asn Gln Ile Phe Asn Pro Asp

225 230 235 240

Phe Tyr Asn Met Val Leu Ile Gln Ser Gly Ile Asp Phe Tyr Asn Glu

245 250 255

Ile Cys Gly Val Val Asn Ala His Met Asn Leu Tyr Cys Gln Gln Thr

260 265 270

Lys Asn Asn Tyr Asn Leu Phe Lys Met Arg Lys Leu His Lys Gln Ile

275 280 285

Leu Ala Tyr Thr Ser Thr Ser Phe Glu Val Pro Lys Met Phe Glu Asp

290 295 300

Asp Met Ser Val Tyr Asn Ala Val Asn Ala Phe Ile Asp Glu Thr Glu

305 310 315 320

Lys Gly Asn Ile Ile Gly Lys Leu Lys Asp Ile Val Asn Lys Tyr Asp

325 330 335

Glu Leu Asp Glu Lys Arg Ile Tyr Ile Ser Lys Asp Phe Tyr Glu Thr

340 345 350

Leu Ser Cys Phe Met Ser Gly Asn Trp Asn Leu Ile Thr Gly Cys Val

355 360 365

Glu Asn Phe Tyr Asp Glu Asn Ile His Ala Lys Gly Lys Ser Lys Glu

370 375 380

Glu Lys Val Lys Lys Ala Val Lys Glu Asp Lys Tyr Lys Ser Ile Asn

385 390 395 400

Asp Val Asn Asp Leu Val Glu Lys Tyr Ile Asp Glu Lys Glu Arg Asn

405 410 415

Glu Phe Lys Asn Ser Asn Ala Lys Gln Tyr Ile Arg Glu Ile Ser Asn

420 425 430

Ile Ile Thr Asp Thr Glu Thr Ala His Leu Glu Tyr Asp Asp His Ile

435 440 445

Ser Leu Ile Glu Ser Glu Glu Lys Ala Asp Glu Met Lys Lys Arg Leu

450 455 460

Asp Met Tyr Met Asn Met Tyr His Trp Ala Lys Ala Phe Ile Val Asp

465 470 475 480

Glu Val Leu Asp Arg Asp Glu Met Phe Tyr Ser Asp Ile Asp Asp Ile

485 490 495

Tyr Asn Ile Leu Glu Asn Ile Val Pro Leu Tyr Asn Arg Val Arg Asn

500 505 510

Tyr Val Thr Gln Lys Pro Tyr Asn Ser Lys Lys Ile Lys Leu Asn Phe

515 520 525

Gln Ser Pro Thr Leu Ala Asn Gly Trp Ser Gln Ser Lys Glu Phe Asp

530 535 540

Asn Asn Ala Ile Ile Leu Ile Arg Asp Asn Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile

545 550 555 560

Phe Asn Ala Lys Asn Lys Pro Asp Lys Lys Ile Ile Gln Gly Asn Ser

565 570 575

Asp Lys Lys Asn Asp Asn Asp Tyr Lys Lys Met Val Tyr Asn Leu Leu

580 585 590

Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val Phe Leu Ser Lys Lys Gly

595 600 605

Ile Glu Thr Phe Lys Pro Ser Asp Tyr Ile Ile Ser Gly Tyr Asn Ala

610 615 620

His Lys His Ile Lys Thr Ser Glu Asn Phe Asp Ile Ser Phe Cys Arg

625 630 635 640

Asp Leu Ile Asp Tyr Phe Lys Asn Ser Ile Glu Lys His Ala Glu Trp

645 650 655

Arg Lys Tyr Glu Phe Lys Phe Ser Ala Thr Asp Ser Tyr Ser Asp Ile

660 665 670

Ser Glu Phe Tyr Arg Glu Val Glu Met Gln Gly Tyr Arg Ile Asp Trp

675 680 685

Thr Tyr Ile Ser Glu Ala Asp Ile Asn Lys Leu Asp Glu Glu Gly Lys

690 695 700

Ile Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Glu Asn Ser Thr

705 710 715 720

Gly Lys Glu Asn Leu His Thr Met Tyr Phe Lys Asn Ile Phe Ser Glu

725 730 735

Glu Asn Leu Lys Asp Ile Ile Ile Lys Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu

740 745 750

Phe Tyr Arg Arg Ala Ser Val Lys Asn Pro Val Lys His Lys Lys Asp

755 760 765

Ser Val Leu Val Asn Lys Thr Tyr Lys Asn Gln Leu Asp Asn Gly Asp

770 775 780

Val Val Arg Ile Pro Ile Pro Asp Asp Ile Tyr Asn Glu Ile Tyr Lys

785 790 795 800

Met Tyr Asn Gly Tyr Ile Lys Glu Ser Asp Leu Ser Glu Ala Ala Lys

805 810 815

Glu Tyr Leu Asp Lys Val Glu Val Arg Thr Ala Gln Lys Asp Ile Val

820 825 830

Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Asp Lys Tyr Phe Ile His Thr Pro Ile

835 840 845

Thr Ile Asn Tyr Lys Val Thr Ala Arg Asn Asn Val Asn Asp Met Val

850 855 860

Val Lys Tyr Ile Ala Gln Asn Asp Asp Ile His Val Ile Gly Ile Asp

865 870 875 880

Arg Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Ser Val Ile Asp Ser His Gly

885 890 895

Asn Ile Val Lys Gln Lys Ser Tyr Asn Ile Leu Asn Asn Tyr Asp Tyr

900 905 910

Lys Lys Lys Leu Val Glu Lys Glu Lys Thr Arg Glu Tyr Ala Arg Lys

915 920 925

Asn Trp Lys Ser Ile Gly Asn Ile Lys Glu Leu Lys Glu Gly Tyr Ile

930 935 940

Ser Gly Val Val His Glu Ile Ala Met Leu Ile Val Glu Tyr Asn Ala

945 950 955 960

Ile Ile Ala Met Glu Asp Leu Asn Tyr Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe

965 970 975

Lys Val Glu Arg Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu Ser Met Leu Ile Asn

980 985 990

Lys Leu Asn Tyr Phe Ala Ser Lys Glu Lys Ser Val Asp Glu Pro Gly

995 1000 1005

Gly Leu Leu Lys Gly Tyr Gln Leu Thr Tyr Val Pro Asp Asn Ile Lys

1010 1015 1020

Asn Leu Gly Lys Gln Cys Gly Val Ile Phe Tyr Val Pro Ala Ala Phe

1025 1030 1035 1040

Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser Thr Gly Phe Ile Ser Ala Phe Asn Phe

1045 1050 1055

Lys Ser Ile Ser Thr Asn Ala Ser Arg Lys Gln Phe Phe Met Gln Phe

1060 1065 1070

Asp Glu Ile Arg Tyr Cys Ala Glu Lys Asp Met Phe Ser Phe Gly Phe

1075 1080 1085

Asp Tyr Asn Asn Phe Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Met Gly Lys Thr Gln

1090 1095 1100

Trp Thr Val Tyr Thr Asn Gly Glu Arg Leu Gln Ser Glu Phe Asn Asn

1105 1110 1115 1120

Ala Arg Arg Thr Gly Lys Thr Lys Ser Ile Asn Leu Thr Glu Thr Ile

1125 1130 1135

Lys Leu Leu Leu Glu Asp Asn Glu Ile Asn Tyr Ala Asp Gly His Asp

1140 1145 1150

Ile Arg Ile Asp Met Glu Lys Met Asp Glu Asp Lys Lys Ser Glu Phe

1155 1160 1165

Phe Ala Gln Leu Leu Ser Leu Tyr Lys Leu Thr Val Gln Met Arg Asn

1170 1175 1180

Ser Tyr Thr Glu Ala Glu Glu Gln Glu Asn Gly Ile Ser Tyr Asp Lys

1185 1190 1195 1200

Ile Ile Ser Pro Val Ile Asn Asp Glu Gly Glu Phe Phe Asp Ser Asp

1205 1210 1215

Asn Tyr Lys Glu Ser Asp Asp Lys Glu Cys Lys Met Pro Lys Asp Ala

1220 1225 1230

Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Cys Ile Ala Leu Lys Gly Leu Tyr Glu Val

1235 1240 1245

Leu Lys Ile Lys Ser Glu Trp Thr Glu Asp Gly Phe Asp Arg Asn Cys

1250 1255 1260

Leu Lys Leu Pro His Ala Glu Trp Leu Asp Phe Ile Gln Asn Lys Arg

1265 1270 1275 1280

Tyr Glu

<210> 4

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gucuaaaagg cuaauuaaau uucuacuauu guagau 36

<210> 5

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cucaaauauu gauauuacau uucuacuuuu guagau 36

<210> 6

<211> 36

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

guuugaauaa ccuuaaauaa uuucuacuuu guagau 36

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aauuucuacu auuguagau 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cauuucuacu uuuguagau 19

<210> 9

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aauuucuacu uuguagau 18

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgacattccg aagaacgctg aagcgctggg ggcaaattgt gcaatttgcg gc 52

<210> 11

<211> 144

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aacattggcc gcaaattgca caatttcccc ccagcgcttc agcgttcttc ggaatgtcgc 60

gcattggcat ggaagtcaca ccttcgggaa cgtggttgac ctacacaggt gccatcaaat 120

tggatgacaa agatccaaat ttca 144

<210> 12

<211> 3780

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgaagaaca tcctgaagcc cttcaccaac aagtactccc tcagcaagac cctcaggttc 60

gagctgaagc ccgtcggcgc gacgctgacg aacatcgaga agaaggggct cgtgtccgag 120

gacgagaacc tcgccgtgag ctacaagaag ctcaagaagg tcatcgacga gtaccacaag 180

gacttcatcg gcctcgcgct caaggatctg aagctcaaca tcctcgacga ctacagcgac 240

ctgtactaca agacgatcaa ggacgagatc gacaagaaga ggttcatcga gctgcagctc 300

aacctgagga agcagatcgt ggacagcttc agcaagaacg ccagcgacga gatcaagaac 360

aagttcgaca ggctcttcaa gaaggagctg atccagatcg acctgatcga gtggctcaag 420

agcaagaacg acttcgagac catcgagctg gtggagaagt tcaagacctt caccacgtac 480

ttcaacggct tcaacgagaa caggaagaac atgtactccg tcgacgagca ctccaccgcc 540

atcgcgtaca ggctcatcca cgagaacctg cccaagttcc tggacaacct gaaggcctac 600

cgcttcatca agaagtccta cctcgacttc gacttcaaca agatcgagaa ggagctggag 660

ctgatcagcg tctccttcga ctccatcttc gacgtcaacg gcttcaacca gacgctcacc 720

cagaacggca tcgacttcta caacacgatg ctcggcgggc taaccgaggg ccacggcaag 780

aagaagatca aggggctgaa cgagttcatc aacctgtaca agcaggagaa gcacctcaag 840

agcaaggaga tcccgagcct gaaggtgctg ttcaagcaga tcctgtccga ccgcgagagc 900

gtgagcttcc tccaggacga gttcatcgac gactccgacg tcctcaactc catcgaggtg 960

ttctacaggg aggagatcaa ggagaaggtc atcgacggca acaccatcaa catcctcgag 1020

acgatcgact ccgtgctgaa ggagatcgag tccttcgaca cctccaagat ctacctgagg 1080

aacgacacgt ccctcaccga catcagccag cgcctctacg gctcctggag cgtggtcaag 1140

aacgcgctgt cccactactt cgaggagatc gtgaagcccc tcaacggcaa gaagcgcacg 1200

gagaagtacg acaaggagct ggagcagtgg ctcggcaagc agaaccagca gttcagcatc 1260

aagttcctcc aggacgtgtg cacctcctac ttctccagcc aggacgagaa gcccctgaac 1320

gtgaacggca aggagtggct cgagtacttc aagaacacgg gctccatctc caacgacgtg 1380

aactccatca gcttcatcaa gaggatcgag accgcgtaca gcgccatcga gtccttcctg 1440

aacgtcgagc tgaacagcag caaccgcaag ctcgtgcagg agcaggtcaa ggtggacctc 1500

ctcaagctct tcctcgacga gatcgtgacg ttcctccact tcatcaagcc gatcacgctc 1560

aaggactcct ccatcgagaa ggacgacgtg ttctactccg tcctcgaggg gctctacaac 1620

cagctggact tcgtcacgcc cctctacaac aagacgagga actacctcac gaagaaggcg 1680

tactcgctag agaaggtgaa gctcaacttc cagaacgcgc agctgctcaa cggctgggac 1740

gtcaacaagg agaccgacaa cacgagcatc ctcttcagga aggaggggct gtactacctg 1800

tgcgtcatgg acaagaagca caacaaggtc ttcaagagcc cgaacgactt ccccaagaac 1860

gaggaggagt actacgagaa ggtgaactac aagctgctcc ccggcgccaa caagatgctc 1920

cccaaggtgt tcttcagcaa caagtccatc gagtactacg cgccgtcctt cgagctgctc 1980

gagaagtaca agaacgagac ccacaagaag ggcgagacct tcaacctcaa cgactgccac 2040

gacctcatcg acttcttcaa ggagagcatc aacaagcacc ccgactggaa gaacttcaac 2100

taccagttca gcgagacgtc cagctacgag gatctgtccg gcttctacag ggaggtcgag 2160

caccagggct acaagatcac gttccagaac atcgccacga gctacatcga cgacctcatc 2220

aacgagggca agatctacct cttccagatc tacaacaagg acttctcccc cttcagcaag 2280

ggcaagccca acatgcacac cctgtactgg cgcgcgctct tcgacgagaa caacctgaag 2340

gacgtgatct acaagctcaa cggcgaggcg gagatcttct acaggaagaa gtccctcgag 2400

tacagcgacg acatctggct gaagggccac cacgccaacg acctcaagga caagttcgac 2460

taccccatcg tgaaggacaa gaggttcgcg ctcgactcct tccacttcca cgtcccgatc 2520

accatgaact tcaaggcgaa cgagggcaac aacttcaacg gccaggtcaa cgagttcctg 2580

aagaacaaca aggacatcaa catcatcggc atcgaccgcg gcgagaggca cctgctgtac 2640

ctcacgctga tcaaccagcg cggcgagatc atcatccaga agagcctcaa caccatcacc 2700

aacaaggtga aggacgagct ggtgtccgtc gactaccaca agaggctcga cgacagggag 2760

aagaacagga acaacgcgcg caagacgtgg ggcaccatcg agaccatcaa ggagctgaag 2820

gagggctacc tgagcctcgt catccacgag gtcgccaaga tgatggtcga gaacaacgcc 2880

gtcgtggtgc tcgaggatct gaacttcggc ttcaagcgcg gcaggcagaa ggtcgagaag 2940

caggtctacc agaagttcga gaagatgctg atcgacaagc tgaactacct catcttcaag 3000

gaccgcaagg acgacgagat cggcggcgtg ttcaacgcgc tgcagctgac ctccaagttc 3060

gagtccttcc agaagctcgg caagcagtcc ggcttcctct tctacatccc ggcggccctc 3120

accagcaaga tcgaccccgc caccggcttc gtgaacttca tggacaccaa gtactacagc 3180

gtggagaagt ccaaggagtt cttcggcaag ttcagcaaca tccagtacaa catcgacaag 3240

gactacttcg agttcgagtt cgactacaac tccttcacga cgaaggcgga gggcacgaag 3300

acgaagtgga aggtgtgcac gtccggcgac gagcgctggc gctacaaccc cacgaccaag 3360

aactccgagc gcgtcaacgt cacggcggag ctgaagacgc tgttcgagaa gaaccagatc 3420

atcttcaaga acggcaacga cctcaagtcc tacatcatcg agaaggacga gaagggcatc 3480

tacagcacgc tgctccacct cctcggcctg accctctccc tcaggcacag cgagtccggc 3540

acggagaacg acttcatcct cagcccggtc ttcaacgaca gcgaggtgtt cttcgacagc 3600

cgcaaggcga ccgagaagtc ccccaaggac tccgacgcca acggcgccta ccacatcgcc 3660

ctgaaggggc tctgggcgct gaggcagatc gactcctgcg acgactggaa gaagctgaag 3720

ctcgcgatct ccaacaagga gtggctcgac ttcgtgcaga agcgcccgtt cgagaagtga 3780

<210> 13

<211> 3885

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggccaaca agaagacctt ctccgacttc acgaacctct actccctgag caagaccctg 60

aggttcgagc tgcagcccgt gggcaagacg gaggagatcc tgaagaacaa cggcgtcttc 120

gagacggaca agaagaggaa gaaggcctac gagaacacga agccctactt cgacaggctc 180

caccgcgagt tcatctccga gagcctggcc aacgcgtacc tcgacggcct gtccgactac 240

ttcaaggtgt tccaggcgtt caagaaggac cgcaagaacc agctgatcaa caagcagatc 300

gacaccctca ggaagagcct ccgcgagcag atcgtcggct acttcgacaa gaacggcaag 360

gagtgggcca cgaagaagta cttccacctc aagatcaaga ggaaggatct cgacattctc 420

ttcgaggagg aggtgttcca gatcctcaag cacaagtacg gcaacgagaa ggagacgaag 480

ctgacgaacc cggagacgga cgagatcatc tccatcttca acggctggaa gggcttcacc 540

ggctacttca tcaagttctt cgccacgcgc aagaacttct acaaggcgga ggtggagaac 600

ggcaagggca agtccggcca gatcagcacc cgcatcgtcg accagaacct cgacaggttc 660

ctcgacaacc tgatcaccta cgacttcatc aagggcaaga tcgacatcac ggaggtcgag 720

aagttcttcg agctgaaggc gggcgaggtg ttcagcgtcg acttctacaa ctactgcctc 780

ctccaagacg gcatcgacaa gtacaacgac ttcctcggcg gcaagaccgt gaacaacggc 840

gagaagatcc gcggcgtcaa cgagatcatc aacaagtaca ggcaggacaa caagggcgag 900

aagctcccgt tcctgaagaa gctcgacaag cagatcctgt ccgagaagga gaagttcatc 960

gacgagatcg agacgccgga ggagctgctc gaggtgctca gggagttcta cgactccgcc 1020

ggcagcaagg tgaaggtgct ccagacgctc ctgaacagct tcttcaagga ctacaacgag 1080

tacgacctga acggcatcta tctctccaag gaggcgctca acaccatcag caacaagtgg 1140

acgaacgaga cggagacgtt cggctccaat ctctacgagg tgctcaagag cgagaagatc 1200

ctcacctcca gcgccaagaa gacggacggt ggctactcct tcccggactt catcagcatc 1260

gccaacatca aggcgtccat cgagcgcatc ccgcgcgaga gcaagttctg gaaggagagg 1320

tactacgaga accccaacgg ctccagcgtg ctcgtcggcg acgagcccgt gtgggagcag 1380

ttcctgaaga tcttcaagtt cgagttcttc tcccacttcg agaggacgat cgtggacagg 1440

gagacgggcc agagggaggc cgagggctac gacatcttca agtccaacct ggagaggctc 1500

ctcaaggact tcaagatcga caagaacagc aagctcatca tcaaggactt cgccgacgag 1560

gtgctgtaca tctaccagat ggccaagtac ttcgcgctcg agaagaagag ggcgtggaac 1620

accgagtacg acgacagcct ggacgtgttc tacaccgacc cgaacaacgg ctacttcacg 1680

ttctacgaga acgcctacaa ggagatcgtc cagccgtaca acaagatccg caacttcctc 1740

acgaagaagc cctactccga gtacaagtgg aagctcaact tcgacaaccc aaccctggcc 1800

gacggctggg acaagaacaa ggagagcgac aacacggccg tgattctccg caaggagggc 1860

aagtactacc tgggcatcat gaagaagggc cacaaccaga tcttccagga caagaacaag 1920

acccagtccc agctcaaggg catgagcaac tactacgaga agctggtcta caagcagatg 1980

gcggacccga agagggactt cccaaagggc atcttctcca agaagggctt cgagacgtac 2040

aacccgcccg aggacatcat ccagatctac gagcagaaga ccttcaagac ggagtccctg 2100

gagttcagca agcaggatct ctggaagctc atcgacttct acaagatctg catctccctc 2160

cacccgagct ggaagctgta cgacttctcc ttcagcaata ccacgaagta cgagaacctg 2220

aacgacttct actccgaggt gagcaagaac gcctacaaga cctggttcga gtccatcagc 2280

gagaactaca tcgcggacaa gaacaacctc ggcgagctgt tcctcttccg catctacaac 2340

aaggacttct ccgacaagag caccggcacg aagaacctgc acaccctcta cttcaaggag 2400

ctgttctccc aggcgaacat ggagaacaac ttcccgttca agctcaacgg ccaggccgag 2460

ctgttctaca ggcccaagag catcgacgcg gtggtcgaga agaggaactt caagcgcgag 2520

atcgtgaaca agaagaggta ctccgagaac aagatcttct tccacgtccc catcaccctc 2580

aaccgcgtga gcaagaacgt ctacaggttc aacacggaga tcaacaactt cctggccaac 2640

aactccggca tcaacatcat cggcgtggac cgcggcgaga agcacctcgt gtactacagc 2700

gtcatcaacc agaagggcga ggtgctcgac tccgagagcc tgaacaccat caaccaggtc 2760

gactaccacg agaagctgga ggagagggcg gacgaccgca agagggcgcg caagaactgg 2820

gaggagatcg agggcatcaa ggatctcaag aagggctaca tcagccaggt ggtcaggaag 2880

ctggccgacc tcgcgatcaa gcacaacgcc atcatcgtga tggaggatct caacatgcgc 2940

ttcaagcaga tcaggggcgg catcgagaag tccgcctacc agcagctgga gaaggcgctc 3000

atcggcaagc tgaacttcct cgtgaacaag ggcgaggtcg acccgctcaa gacgggccac 3060

ctcctgagcg cctaccagct gaccgcgctc ttcgagacgt tcaaggacat gggcaagcag 3120

accggcatca tcttctacac ccaggcgtcc tacacgagcc gcatcgaccc gctcacgggc 3180

tggaggccca acatctacct gaagtactcc aacgccgacc aggcgaagaa ggacatcctc 3240

aagttcagca acatcaactt caacgaggcc aaggggctct tcgagttcac ctacgacatc 3300

aaggacttct ccaacacgaa ggacttcccc atcaagacca agtggacggt gtgcagcaac 3360

gtcaagaggt tccgctggga ccgcaagctc aacaacaaca agggcggcta cacccactac 3420

aagaacctga ccgacggcaa gacggagaac aagaacccga agtccacgaa gcccgacaac 3480

ctgaaggagc tgttcgagaa gtacaagatc gacgtgtaca gcgacatcaa gaaccagatc 3540

cagaacctcg agacgaagcg caacgagaag ttcttccagc acttcatctt cttcttcaac 3600

ctcatctgcc agatcaggaa cacgcagcag gacaaggacg gcgacgagaa cgacttcatc 3660

ctgtccccgg tggagccctt cttcgactcc cgctacagcg agaagttcgg caagaacctc 3720

ccccagaacg gcgacgacaa cggcgcctac aacatcgcga ggaagggcat catcatcctc 3780

gacaagatca gcaagcacta caagcaggtc ggctccaccg acaagctcag ctggaacgac 3840

ctgtacatct cccacatgga ctgggacgac ttcgcccaga gctga 3885

<210> 14

<211> 3849

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgaacggca accgcagcat cgtgtacagg gagttcgtgg gcgtcatccc cgtggctaag 60

acgctcagga acgagctgcg cccggtgggc cacacgcagg agcacatcat ccagaacggg 120

ctcatccagg aggacgagct gcgccaggag aagtccaccg agctgaagaa catcatggac 180

gactactaca gggagtacat cgacaagtcc ctgagcggcg tgaccgacct cgacttcacg 240

ctcctgttcg agctgatgaa cctcgtccag tccagcccca gcaaggacaa caagaaggcg 300

ctggagaagg agcagtccaa gatgcgcgag cagatctgca cccacctcca gtccgacagc 360

aactacaaga acatcttcaa cgccaagctc ctgaaggaga tcctgccgga cttcatcaag 420

aactacaacc agtacgacgt gaaggacaag gccggcaagc tcgagacgct ggcgctcttc 480

aacggcttca gcacgtactt caccgacttc ttcgagaagc gcaagaacgt gttcaccaag 540

gaggccgtct ccacgagcat cgcgtacagg atcgtccacg agaactccct gatcttcctc 600

gccaacatga cctcctacaa gaagatcagc gagaaggcgc tcgacgagat cgaggtcatc 660

gagaagaaca accaggacaa gatgggcgac tgggagctga accagatctt caaccccgac 720

ttctacaaca tggtcctcat ccagagcggc atcgacttct acaacgagat ctgcggcgtg 780

gtcaacgcgc acatgaacct gtactgccag cagaccaaga acaactacaa cctcttcaag 840

atgcgcaagc tgcacaagca gatcctcgcc tacacctcca cgagcttcga ggtgccgaag 900

atgttcgagg acgacatgag cgtgtacaac gccgtcaacg cgttcatcga cgagacggag 960

aagggcaaca tcatcggcaa gctgaaggac atcgtcaaca agtacgacga gctggacgag 1020

aagaggatct acatctccaa ggacttctac gagacgctgt cctgcttcat gagcggcaac 1080

tggaacctca tcacgggctg cgtggagaac ttctacgacg agaacatcca cgccaagggc 1140

aagagcaagg aggagaaggt gaagaaggcg gtcaaggagg acaagtacaa gtccatcaac 1200

gacgtgaacg acctggtcga gaagtacatc gacgagaagg agaggaacga gttcaagaac 1260

agcaacgcca agcagtacat cagggagatc tccaacatca tcaccgacac ggagacggcg 1320

cacctggagt acgacgacca catctccctc atcgagagcg aggagaaggc cgacgagatg 1380

aagaagcgcc tggacatgta catgaacatg taccactggg ccaaggcgtt catcgtggac 1440

gaggtgctcg acagggacga gatgttctac tccgacatcg acgacatcta caacatcctg 1500

gagaacatcg tcccgctcta caaccgcgtg aggaactacg tcacccagaa gccctacaac 1560

agcaagaaga tcaagctgaa cttccagtcc cccacgctcg ccaacggctg gtcccagagc 1620

aaggagttcg acaacaacgc gatcatcctg atccgcgaca acaagtacta cctcgccatc 1680

ttcaacgcga agaacaagcc cgacaagaag atcatccagg gcaacagcga caagaagaac 1740

gataacgact acaagaagat ggtgtacaac ctcctgccgg gcgcgaacaa gatgctgccc 1800

aaggtcttcc tctccaagaa gggcatcgag acgttcaagc cgtccgacta catcatcagc 1860

ggctacaacg cccacaagca catcaagacg agcgagaact tcgacatctc cttctgccgc 1920

gacctcatcg actacttcaa gaacagcatc gagaagcacg ccgagtggag gaagtacgag 1980

ttcaagttca gcgcgaccga ctcctacagc gacatctccg agttctacag ggaggtggag 2040

atgcagggct acaggatcga ctggacgtac atctccgagg cggacatcaa caagctggac 2100

gaggagggca agatctacct cttccagatc tacaacaagg acttcgccga gaacagcact 2160

ggcaaggaga acctgcacac gatgtacttc aagaacatct tctccgagga gaacctcaag 2220

gacatcatca tcaagctcaa cggccaggcg gagctgttct acaggagggc gagcgtgaag 2280

aaccccgtca agcacaagaa ggactccgtg ctggtcaaca agacttacaa gaaccagctc 2340

gacaacggcg acgtggtccg catcccgatc ccagacgaca tctacaacga gatctacaag 2400

atgtacaacg gctacatcaa ggagtccgat ctctccgagg ccgcgaagga gtatctcgac 2460

aaggtggagg tccgcaccgc ccagaaggac atcgtgaagg actacaggta cacggtcgac 2520

aagtacttca tccacacgcc gatcaccatc aactacaagg tgaccgccag gaacaacgtc 2580

aacgacatgg tggtcaagta catcgcgcag aacgacgaca tccacgtcat cggcatcgac 2640

cgcggcgaga ggaacctgat ctacatctcc gtgatcgaca gccacggcaa catcgtcaag 2700

cagaagagct acaacatcct gaacaactac gactacaaga agaagctcgt ggagaaggag 2760

aagacccgcg agtacgcgag gaagaactgg aagagcatcg gcaacatcaa ggagctgaag 2820

gagggctaca tctccggcgt ggtccacgag atcgccatgc tgatcgtcga gtacaacgcc 2880

atcatcgcga tggaggatct caactacggc ttcaagcgcg gcaggttcaa ggtggagcgc 2940

caggtctacc agaagttcga gtccatgctg atcaacaagc tcaactactt cgcgtccaag 3000

gagaagtcgg tggacgagcc gggcgggctc ctcaagggct accagctgac ctacgtcccg 3060

gataacatca agaacctcgg caagcagtgc ggcgtgatct tctacgtccc ggccgcgttc 3120

acctccaaga tcgaccccag cacgggcttc atctccgcct tcaacttcaa gtccatcagc 3180

acgaacgcga gccgcaagca gttcttcatg cagttcgacg agatcaggta ctgcgccgag 3240

aaggacatgt tctccttcgg cttcgactac aacaacttcg acacctacaa catcacgatg 3300

ggcaagacgc agtggaccgt gtacacgaac ggcgagaggc tgcagagcga gttcaacaac 3360

gcgcgcagga ccggcaagac gaagtccatc aacctcacgg agacgatcaa gctgctcctc 3420

gaggacaacg agatcaacta cgccgacggc cacgacatcc gcatcgacat ggagaagatg 3480

gacgaggaca agaagagcga gttcttcgcg cagctgctct ccctgtacaa gctcaccgtg 3540

cagatgagga acagctacac ggaggccgag gagcaggaga acggcatcag ctacgataag 3600

atcatctccc ccgtcatcaa cgacgagggc gagttcttcg acagcgacaa ctacaaggag 3660

tccgacgaca aggagtgcaa gatgcccaag gacgcggatg ccaacggcgc ctactgcatc 3720

gcgctgaagg ggctctacga ggtgctcaag atcaagtccg agtggaccga ggacggcttc 3780

gaccgcaact gcctcaagct cccccacgcg gagtggctcg acttcatcca gaacaagcgc 3840

tacgagtga 3849

Claims (20)

1.一种Cas蛋白，其特征在于，所述Cas蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

2.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1所述的Cas蛋白和其他的修饰部分。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述Cas蛋白的多核苷酸序列，或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸序列。

4.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。

5.一种CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1所述的Cas蛋白以及至少一种gRNA，所述gRNA包括与权利要求1所述的Cas蛋白或权利要求2所述的融合蛋白结合的同向重复序列以及能够靶向靶序列的指导序列。

6.一种载体系统，其特征在于，所述载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：

a)第一调控元件，该第一调控元件可操作地与gRNA连接，所述gRNA包括与权利要求1所述的Cas蛋白或权利要求2所述的融合蛋白结合的同向重复序列以及能够靶向靶序列的指导序列；

b)第二调控元件，该第二调控元件可操作地与编码权利要求1所述的Cas蛋白的核苷酸序列连接；

其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上。

7.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：

(i)蛋白组分，其选自：权利要求1所述的Cas蛋白或权利要求2所述的融合蛋白；

(ii)核酸组分，其选自：gRNA，或编码所述的gRNA的核酸，或所述gRNA的前体RNA，或编码所述gRNA的前体RNA核酸，所述gRNA包括与权利要求1所述的Cas蛋白或权利要求2所述的融合蛋白结合的同向重复序列以及能够靶向靶序列的指导序列；

所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物。

8.一种工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求6所述的载体系统，或权利要求7所述的组合物。

9.权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求6所述的载体系统，或权利要求7所述的组合物，或权利要求8所述的宿主细胞在基因编辑或基因靶向中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用；或者，在制备用于基因编辑或基因靶向的试剂或试剂盒中的用途。

10.权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求6所述的载体系统，或权利要求7所述的组合物，或权利要求8所述的宿主细胞在基因切割中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用；或者，在制备用于基因切割的试剂或试剂盒中的用途。

11.权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求6所述的载体系统，或权利要求7所述的组合物，或权利要求8所述的宿主细胞在选自如下任一或任意几种中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用：

靶向靶核酸；切割双链DNA、单链DNA或单链RNA；非特异性切割和/或降解侧枝核酸；非特异性的切割单链核酸；特异性地编辑双链核酸；碱基编辑双链核酸；碱基编辑单链核酸。

12.权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求6所述的载体系统，或权利要求7所述的组合物，或权利要求8所述的宿主细胞在编辑靶核酸中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。

13.一种编辑靶核酸或靶向靶核酸的方法，所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法，所述方法包括将靶核酸与权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求6所述的载体系统，或权利要求7所述的组合物，或权利要求8所述的宿主细胞进行接触。

14.一种切割靶核酸的方法，所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法，所述方法包括将靶核酸与权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求6所述的载体系统，或权利要求7所述的组合物，或权利要求8所述的宿主细胞进行接触。

15.一种切割单链核酸的方法，所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法，所述方法包括，使核酸群体与权利要求1所述的Cas蛋白和gRNA接触，其中所述核酸群体包含靶核酸和至少一个非靶单链核酸，所述gRNA包括与权利要求1所述的Cas蛋白或权利要求2所述的融合蛋白结合的同向重复序列以及能够靶向靶序列的指导序列，所述Cas蛋白切割所述非靶单链核酸。

16.一种用于基因编辑或基因靶向的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求6所述的载体系统，或权利要求7所述的组合物，或权利要求8所述的宿主细胞。

17.一种用于基因切割的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求6所述的载体系统，或权利要求7所述的组合物，或权利要求8所述的宿主细胞。

18.一种用于检测样品中的靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)权利要求1所述的Cas蛋白，或编码所述Cas蛋白的核酸；(b)gRNA，或编码所述gRNA的核酸，或包含所述gRNA的前体RNA，或编码所述前体RNA的核酸，所述gRNA包括与权利要求1所述的Cas蛋白或权利要求2所述的融合蛋白结合的同向重复序列以及能够靶向靶序列的指导序列；和(c)为单链的且不与所述gRNA杂交的单链核酸检测器。

19.权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4所述的载体，或权利要求5所述的CRISPR-Cas系统，或权利要求6所述的载体系统，或权利要求7所述的组合物，或权利要求8所述的宿主细胞在制备制剂或试剂盒中的用途，所述制剂或试剂盒用于：

(i)基因组编辑；

(ii)靶核酸检测和/或诊断；

(iii)编辑靶基因座中的靶序列来修饰生物；

(iv)疾病的治疗；

(v)靶向靶基因；

(vi)切割目的基因。

20.一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法，所述方法包括将样品与权利要求1所述的Cas蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的指导序列；检测由所述Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交。