JP4631003B2 - タンパク質複合体検出方法、およびタンパク質複合体検出キット - Google Patents
タンパク質複合体検出方法、およびタンパク質複合体検出キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP4631003B2 JP4631003B2 JP2006510754A JP2006510754A JP4631003B2 JP 4631003 B2 JP4631003 B2 JP 4631003B2 JP 2006510754 A JP2006510754 A JP 2006510754A JP 2006510754 A JP2006510754 A JP 2006510754A JP 4631003 B2 JP4631003 B2 JP 4631003B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- chimeric
- gene
- expression vector
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、２つのタンパク質による複合体形成を検出する技術に関するものであり、より詳しくは、転写因子によって転写を活性化されるレポーター遺伝子の転写をトランスに抑制するトランス転写抑制を指標として、複合体形成を検出するタンパク質複合体検出方法、およびタンパク質複合体検出キットに関するものである。
２つの異なるタンパク質による複合体形成を検出する方法として、従来知られたものに、いわゆるツーハイブリッドシステムを利用したものがある。この方法では、酵母の転写因子であるＧＡＬ４の機能的な再構成を通じて、レポーター遺伝子の転写を活性化する。そして、この転写活性化を検出することによって、２つ異なるタンパク質による複合体形成を検出する。以下では、その仕組みを、図６（ａ）、図６（ｂ）および図７を参照して説明する。
ツーハイブリッドシステムでは、まず、図６（ａ）に示すように、ＧＡＬ４を、ＤＮＡに結合する性質を有するＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤと略す）１１２と、転写活性化能力を有する転写活性化ドメイン（ＡＤと略す）１２２とに分離する。次に、ＧＡＬ４のＤＢＤ１１２にＸタンパク質１１１を連結させた、キメラタンパク質１１０を設計する。これに加えて、ＧＡＬ４のＡＤ１２２にＹタンパク質１２１を連結させた、キメラタンパク質１２０ａも設計する。
そして、キメラタンパク質１１０・１２０ａをそれぞれコードする遺伝子を、プラスミドに繋げ、二種類のプラスミドを構築する。このとき、これらのプラスミドは、ＤＢＤ１１２が結合可能なＣＩＳエレメント（ＣＩＳと略す）１３２を有しており、レポーター遺伝子１３１（図中 Reporterと記載）のＧＡＬ４依存的な転写活性化が起こるように改変されている。そして、これらのプラスミドを、レポーター遺伝子１３１を有する酵母に導入する。
すると、キメラタンパク質１１０および１２０ａが、遺伝子発現によって、酵母内に導入したプラスミドから合成される。
ここで、もしＸタンパク質１１１およびＹタンパク質１２１が、相互作用して複合体を形成すれば、図６（ｂ）に示すように、この複合体形成を通じて、キメラタンパク質１１０およびキメラタンパク質１２０ａが、複合体１４０を形成する。すると、ＤＢＤ１１２およびＡＤ１２２が複合体を形成して、転写因子ＧＡＬ４を機能的に再構成する。
その結果、再構成されたＧＡＬ４は、レポーター遺伝子１３１の転写を促進（活性化）する。この転写活性化を検出することにより、従来方法では、Ｘタンパク質１１１とＹタンパク質１２１とが、複合体を形成したことを決定できる。
一方、図７に示すように、従来方法において、キメラタンパク質１２０ａの代わりに、Ｘタンパク質１１１とは複合体を形成しないＺタンパク質１２３と、ＡＤ１２２とが連結したキメラタンパク質１２０ｂを用いた場合、複合体１４０は形成されない。したがって、ＤＢＤ１１２およびＡＤ１２２による、ＧＡＬ４の機能的な再構成も起こらないため、レポーター遺伝子１３１の転写は促進されない。この場合、レポーター遺伝子１３１の転写活性化を検出できないため、Ｘタンパク質１１１とＺタンパク質１２３とは、複合体を形成しないと決定できる。
以上のような特徴を有するツーハイブリッドシステムは、例えば、非特許文献１に開示されている。
ところで、本発明者は、任意の転写因子を転写抑制因子に転換するペプチドを種々見出している（例えば、特許文献１〜７、非特許文献２、３参照）。このペプチドは、Class II ＥＲＦ（Ethylene Responsive Element Binding Factor）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。
［特許文献１］
日本国公開特許公報「特開２００１−２６９１７７公報」（公開日：平成１３年（２００１）１０月２日）
［特許文献２］
日本国公開特許公報「特開２００１−２６９１７８公報」（公開日:平成１３年（２００１）１０月２日）
［特許文献３］
日本国公開特許公報「特開２００１−２９２７７６公報」（公開日:平成１３年（２００１）１０月２日）
［特許文献４］
日本国公開特許公報「特開２００１−２９２７７７公報」（公開日：平成１３年（２００１）１０月２３日）
［特許文献５］
日本国公開特許公報「特開２００１−２６９１７６公報」（公開日：平成１３年（２００１）１０月２日）
［特許文献６］
日本国公開特許公報「特開２００１−２６９１７９公報」（公開日：平成１３年（２００１）１０月２３日）
［特許文献７］
日本国公開特許公報「特開２００１−２６９１７６公報」（公開日：平成１３年（２００１）１０月２日）
［非特許文献１］
遺伝子工学キーワードブック、緒方宣邦・野島博著、羊土社、２５４〜２５５頁、２０００年
［非特許文献２］
Ohta,M., Matsui,K., Hiratsu,K., Shinshi,H. and Ohme-Takagi,M., The Plant Cell, Vol.13, 1959-1968, August, 2001
［非特許文献３］
Hiratsu,K., Ohta,M., Matsui,K., Ohme-Takagi,M., FEBS Letters 514(2002)351-354
［特許文献１］
日本国公開特許公報「特開２００１−２６９１７７公報」（公開日：平成１３年（２００１）１０月２日）
［特許文献２］
日本国公開特許公報「特開２００１−２６９１７８公報」（公開日:平成１３年（２００１）１０月２日）
［特許文献３］
日本国公開特許公報「特開２００１−２９２７７６公報」（公開日:平成１３年（２００１）１０月２日）
［特許文献４］
日本国公開特許公報「特開２００１−２９２７７７公報」（公開日：平成１３年（２００１）１０月２３日）
［特許文献５］
日本国公開特許公報「特開２００１−２６９１７６公報」（公開日：平成１３年（２００１）１０月２日）
［特許文献６］
日本国公開特許公報「特開２００１−２６９１７９公報」（公開日：平成１３年（２００１）１０月２３日）
［特許文献７］
日本国公開特許公報「特開２００１−２６９１７６公報」（公開日：平成１３年（２００１）１０月２日）
［非特許文献１］
遺伝子工学キーワードブック、緒方宣邦・野島博著、羊土社、２５４〜２５５頁、２０００年
［非特許文献２］
Ohta,M., Matsui,K., Hiratsu,K., Shinshi,H. and Ohme-Takagi,M., The Plant Cell, Vol.13, 1959-1968, August, 2001
［非特許文献３］
Hiratsu,K., Ohta,M., Matsui,K., Ohme-Takagi,M., FEBS Letters 514(2002)351-354
ところが、上記ツーハイブリッドシステムでは、実際には複合体を形成しているにも関わらず複合体形成を検出できない場合があるという問題点を有している。
この問題の原因は、このシステムを使用して２つの異なるタンパク質の複合体形成を検出する際に、再構成した転写因子（ＧＡＬ４）によるレポーター遺伝子１３１の転写活性化を指標としていることにある。
すなわち、ツーハイブリッドシステムでは、レポーター遺伝子１３１の転写活性化を指標として、複合体の形成を確認する。そのため、例えば、図６（ａ）・図６（ｂ）に示すＸタンパク質１１１や、あるいはＹタンパク質１２１が、レポーター遺伝子１３１の転写を単独で促進できる性質を有する場合、これらのタンパク質が複合体を形成するまでもなく、レポーター遺伝子１３１の転写は促進される。一方、Ｘタンパク質１１１とＹタンパク質１２１とが、複合体を形成する場合であっても、再構成されたＧＡＬ４によって、レポーター遺伝子１３１の転写が促進される。
したがって、いずれにせよ、レポーター遺伝子１３１の転写が促進されることになる。そのため、レポーター遺伝子１３１の転写活性化を検出できたとしても、その結果を元に、Ｘタンパク質１１１とＹタンパク質１２１とが、複合体を形成したのか否かを決定できない。
このため、従来のツーハイブリッドシステムを利用したタンパク質複合体検出方法では、複合体形成を検出したいタンパク質として、遺伝子の転写を活性化する機能を有するタンパク質（数多くの転写因子）を選択できない。すなわち、この従来方法には、転写因子と他のタンパク質との複合体形成を検出できないという問題点がある。
本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、一般的なタンパク質に加えて、転写因子と転写因子以外のタンパク質とによる複合体形成をも検出できる、タンパク質複合体検出方法およびタンパク質複合体検出キットを提供することにある。
本願発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチドが結合されたタンパク質が、転写因子に結合すると、この転写因子をトランスに転写抑制因子に転換することを見いだし、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明に係るタンパク質複合体検出方法は、上記の課題を解決するために、第１タンパク質および第２タンパク質が複合体を形成するか否かを検出するために、遺伝子発現によりタンパク質を生産できるタンパク質合成系中にて、第１タンパク質を含む第１キメラタンパク質をコードする第１キメラ遺伝子と、第２タンパク質を含む第２キメラタンパク質をコードする第２キメラ遺伝子とを発現させるキメラ遺伝子発現工程と、第１タンパク質および第２タンパク質との複合体形成を検出する複合体確認工程とを含んでおり、上記第１キメラ遺伝子がコードする第１キメラタンパク質が、レポーター遺伝子のプロモーター配列を特異的に認識するＤＮＡ結合ペプチドと上記第１タンパク質とを結合したものであるタンパク質複合体検出方法において、上記第２キメラ遺伝子がコードする第２キメラタンパク質が、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能性ペプチドと上記第２タンパク質とを結合したものであり、上記第１キメラタンパク質の第１タンパク質部分と、第２キメラタンパク質の第２タンパク質部分とが結合して複合体を形成した場合に、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されるようになっているとともに、上記複合体確認工程では、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されたか否かを確認することにより、複合体形成を検出するようになっていることを特徴としている。
本発明に係るタンパク質複合体検出方法の好ましい例としては、以下の方法が挙げられる。
第１タンパク質および第２タンパク質が複合体を形成するか否かを検出するために、遺伝子発現によりタンパク質を生産できる植物細胞を用いたタンパク質合成系中にて、第１タンパク質を含む第１キメラタンパク質をコードする第１キメラ遺伝子と、第２タンパク質を含む第２キメラタンパク質をコードする第２キメラ遺伝子とを発現させるキメラ遺伝子発現工程と、第１タンパク質および第２タンパク質との複合体形成を検出する複合体確認工程とを含んでおり、上記第１キメラ遺伝子がコードする第１キメラタンパク質が、レポーター遺伝子のプロモーター配列を特異的に認識するＤＮＡ結合ペプチドと上記第１タンパク質とを結合したものであるタンパク質複合体検出方法において、上記第２キメラ遺伝子がコードする第２キメラタンパク質が、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能性ペプチドと上記第２タンパク質とを結合したものであり、上記第１キメラタンパク質の第１タンパク質部分と、第２キメラタンパク質の第２タンパク質部分とが結合して複合体を形成した場合に、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されるようになっているとともに、上記複合体確認工程では、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されたか否かを確認することにより、複合体形成を検出するようになっていることを特徴とするタンパク質複合体検出方法。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出方法では、さらに、上記第１キメラ遺伝子および第２キメラ遺伝子は、何れも発現ベクターに組み込まれて植物細胞に導入されることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出方法では、上記レポーター遺伝子は、発現ベクターに組み込まれて植物細胞に導入されることが好ましい。
本発明に係るタンパク質複合体検出方法の他の好ましい例としては、以下の方法が挙げられる。
第１タンパク質および第２タンパク質が複合体を形成するか否かを検出するために、遺伝子発現によりタンパク質を生産できる無細胞タンパク質合成系中にて、第１タンパク質を含む第１キメラタンパク質をコードする第１キメラ遺伝子と、第２タンパク質を含む第２キメラタンパク質をコードする第２キメラ遺伝子とを発現させるキメラ遺伝子発現工程と、第１タンパク質および第２タンパク質との複合体形成を検出する複合体確認工程とを含んでおり、上記第１キメラ遺伝子がコードする第１キメラタンパク質が、レポーター遺伝子のプロモーター配列を特異的に認識するＤＮＡ結合ペプチドと上記第１タンパク質とを結合したものであるタンパク質複合体検出方法において、上記第２キメラ遺伝子がコードする第２キメラタンパク質が、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能性ペプチドと上記第２タンパク質とを結合したものであり、上記第１キメラタンパク質の第１タンパク質部分と、第２キメラタンパク質の第２タンパク質部分とが結合して複合体を形成した場合に、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されるようになっているとともに、上記複合体確認工程では、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されたか否かを確認することにより、複合体形成を検出するようになっていることを特徴とするタンパク質複合体検出方法。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出方法では、上記機能性ペプチドが、次に示す式（１）〜（４）
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
の何れかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
の何れかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出方法では、上記機能性ペプチドが、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
（５）α1−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
本発明に係るタンパク質複合体検出方法の好ましい例としては、以下の方法が挙げられる。
第１タンパク質および第２タンパク質が複合体を形成するか否かを検出するために、遺伝子発現によりタンパク質を生産できるタンパク質合成系中にて、第１タンパク質を含む第１キメラタンパク質をコードする第１キメラ遺伝子と、第２タンパク質を含む第２キメラタンパク質をコードする第２キメラ遺伝子とを発現させるキメラ遺伝子発現工程と、第１タンパク質および第２タンパク質との複合体形成を検出する複合体確認工程とを含んでおり、上記第１キメラ遺伝子がコードする第１キメラタンパク質が、レポーター遺伝子のプロモーター配列を特異的に認識するＤＮＡ結合ペプチドと上記第１タンパク質とを結合したものであるタンパク質複合体検出方法において、上記第２キメラ遺伝子がコードする第２キメラタンパク質が、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する上述の式（１）〜（５）の何れかで表されるアミノ酸配列を有する機能性ペプチドと上記第２タンパク質とを結合したものであり、上記第１キメラタンパク質の第１タンパク質部分と、第２キメラタンパク質の第２タンパク質部分とが結合して複合体を形成した場合に、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されるようになっているとともに、上記複合体確認工程では、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されたか否かを確認することにより、複合体形成を検出するようになっていることを特徴とするタンパク質複合体検出方法。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出方法では、さらに、上記タンパク質合成系として、植物細胞を用いることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出方法では、さらに、上記第１キメラ遺伝子および第２キメラ遺伝子は、何れも発現ベクターに組み込まれて植物細胞に導入されることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出方法では、上記レポーター遺伝子は、発現ベクターに組み込まれて植物細胞に導入されることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出方法では、上記タンパク質合成系として、無細胞タンパク質合成系を用いることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出方法では、上記ＤＮＡ結合ペプチドとして、転写因子または転写因子に含まれるＤＮＡ結合ドメインを用いることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出方法では、上記レポーター遺伝子として、外観上その増減を相対的に確認することが可能なタンパク質をコードする遺伝子を用いることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出方法では、上記第１キメラ遺伝子、第２キメラ遺伝子、およびレポーター遺伝子は、それぞれ発現ベクターとして構築された上で、タンパク質合成系中に導入されることが好ましい。
本発明に係るタンパク質複合体検出キットは、上記の課題を解決するために、上述したタンパク質複合体検出方法を行うためのキットであることを特徴としている。
本発明に係る他のタンパク質複合体検出キットは、上記の課題を解決するために、レポーター遺伝子のプロモーター配列を特異的に認識するＤＮＡ結合ペプチドと第１タンパク質とを結合した第１キメラタンパク質を生産可能とする第１キメラ遺伝子発現ベクターと、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能性ペプチドと第２タンパク質とを結合した第２キメラタンパク質を生産可能とする第２キメラ遺伝子発現ベクターとを含むことを特徴としている。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出キットでは、さらに、上記第１キメラ遺伝子発現ベクターは、少なくとも、（ａ）上記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）をコードするポリヌクレオチドであるＤＢＤセグメントと、（ｂ）当該ＤＢＤセグメントに隣接し、少なくとも１種の制限酵素（ＲＥ）により認識される塩基配列を有するポリヌクレオチドである第１ＲＥ認識セグメントとを有しているとともに、上記第２キメラ遺伝子発現ベクターは、少なくとも、（ｃ）上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドである機能性ペプチドセグメントと、（ｄ）当該機能性ペプチドセグメントに隣接し、少なくとも１種の制限酵素（ＲＥ）により認識される塩基配列を有するポリヌクレオチドである第２ＲＥ認識セグメントとを有しており、上記第１キメラ遺伝子発現ベクターは、上記（ｂ）第１ＲＥ認識セグメントに第１タンパク質をコードする遺伝子を組み込むことで、上記第１キメラタンパク質を生産可能とするとともに、上記第２キメラ遺伝子発現ベクターは、上記（ｄ）第２ＲＥ認識セグメントに第２タンパク質をコードする遺伝子を組み込むことで、上記第２キメラタンパク質を生産可能とすることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出キットは、さらに、レポーター遺伝子を発現するレポーター遺伝子発現ベクターを含むことが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出キットでは、さらに、上記第１キメラ遺伝子発現ベクター、第２キメラ遺伝子発現ベクター、およびレポーター遺伝子発現ベクターのうち少なくとも何れかには、プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターが含まれていることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出方法は、上昇している転写活性を抑制することによって、タンパク質相互作用を検出する方法であることから、エフェクターを入れていない状態で、ある程度レポーターの活性があった方が検出しやすい。したがって、レポーター遺伝子発現ベクターにはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどのエンハンサーを含むことが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出キットでは、さらに、上記第１キメラ遺伝子発現ベクター、第２キメラ遺伝子発現ベクター、およびレポーター遺伝子発現ベクターのうち少なくとも何れかには、ターミネーターとして、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターが含まれていることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出キットでは、さらに、上記ＤＮＡ結合ペプチドとして、転写因子または転写因子に含まれるＤＮＡ結合ドメインが用いられることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出キットでは、さらに、上記ＤＮＡ結合ペプチドとして、酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが用いられることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出キットでは、さらに、上記レポーター遺伝子として、外観上その増減を相対的に確認することが可能なタンパク質をコードする遺伝子が用いられることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出キットでは、さらに、上記レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子が用いられることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出キットでは、さらに、上記機能性ペプチドが、次に示す式（１）〜（４）（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
の何れかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅ又はＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−Ｌｅｕ又はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、Ｇｌｎ又はＡｓｐを示す。）
の何れかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出キットでは、さらに、上記機能性ペプチドが、次に示す式（５）
（５）α1−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
（５）α1−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ１−Ｌｅｕ
（但し、式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出キットでは、さらに、上記機能性ペプチドが、次に示す式（６）〜（８）
（６）α1−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ２はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓを示す。）
の何れかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
（６）α1−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ２−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、各式中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ２はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、又はＬｙｓを示す。）
の何れかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出キットでは、上記機能性ペプチドが、配列番号１〜３８のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることが好ましい。
また、本発明に係るタンパク質複合体検出キットでは、さらに、（ａ）植物細胞に発現ベクターを導入するための試薬群、（ｂ）第１キメラ遺伝子発現ベクターまたは第２キメラ遺伝子発現ベクターに、第１タンパク質をコードする遺伝子または第２タンパク質をコードする遺伝子を組み込むための試薬群、および、（ｃ）レポーター遺伝子の発現量の変化を確認するための試薬群のうち、少なくとも一つの試薬群を含むことが好ましい。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
以下、本発明の実施の一形態について、図１（ａ）〜図１５に基づいて説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
（Ｉ）本発明に係るタンパク質複合体検出方法
本発明に係るタンパク質複合体検出方法（本方法）は、少なくとも、キメラ遺伝子発現工程と複合体確認工程とを含む方法である。
本発明に係るタンパク質複合体検出方法（本方法）は、少なくとも、キメラ遺伝子発現工程と複合体確認工程とを含む方法である。
＜本方法の概要＞
まず、本発明の概要について、図１（ａ）・図１（ｂ）を例に挙げて説明する。本発明では、第１タンパク質および第２タンパク質が複合体を形成するか否かを検出することを目的とする。そこで、図１（ａ）に示すように、まず、第１タンパク質をＸタンパク質１１とし、第２タンパク質をＹタンパク質２１とする。上記キメラ遺伝子発現工程では、タンパク質合成系にて、Ｘタンパク質１１を含むキメラタンパク質１０（第１キメラタンパク質）をコードする第１キメラ遺伝子と、Ｙタンパク質２１を含むキメラタンパク質２０ａ（第２キメラタンパク質）をコードする第２キメラ遺伝子とを発現させる。
まず、本発明の概要について、図１（ａ）・図１（ｂ）を例に挙げて説明する。本発明では、第１タンパク質および第２タンパク質が複合体を形成するか否かを検出することを目的とする。そこで、図１（ａ）に示すように、まず、第１タンパク質をＸタンパク質１１とし、第２タンパク質をＹタンパク質２１とする。上記キメラ遺伝子発現工程では、タンパク質合成系にて、Ｘタンパク質１１を含むキメラタンパク質１０（第１キメラタンパク質）をコードする第１キメラ遺伝子と、Ｙタンパク質２１を含むキメラタンパク質２０ａ（第２キメラタンパク質）をコードする第２キメラ遺伝子とを発現させる。
ここで、上記第１キメラ遺伝子がコードするキメラタンパク質１０は、ＤＮＡ結合ペプチド（ＤＢＤ）１２とＸタンパク質１１とを結合したものである。ＤＢＤ１２は後述するように、レポーター遺伝子３１に含まれるＣＩＳエレメント（ＣＩＳ）３２を特異的に認識するペプチドである。ＣＩＳ３２の上流域にはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓのプロモーターなどを含むエンハンサー３３が存在している。また、第２キメラ遺伝子がコードするキメラタンパク質２０ａは、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能性ペプチド２２とＹタンパク質２１とを結合したものである。レポーター遺伝子３１は３５Ｓプロモーターなどのエンハンサー３３により、ＤＮＡ結合ペプチド（ＤＢＤ）１２の転写活性能にかかわらず、転写が活性化されている。
次に、上記複合体確認工程では、Ｘタンパク質１１およびＹタンパク質２１との複合体形成を検出する。具体的には、図１（ｂ）に示すように、上記第１キメラタンパク質１０のＸタンパク質１１部分と、第２キメラタンパク質２０ａのＹタンパク質２１部分とが結合して複合体４０を形成した場合に、上記レポーター遺伝子３１の転写が抑制されるようになっているので、レポーター遺伝子３１の転写が抑制されたか否かを確認することにより、複合体形成を検出することになる。
すなわち、上記複合体４０には機能性ペプチド２２が含まれているが、この機能性ペプチド２２の作用によって、ＤＢＤ１２が、レポーター遺伝子３１の転写をトランスに（間接的に）抑制する。本方法では、この転写抑制化を複合体確認工程にて確認することによって、Ｘタンパク質１１およびＹタンパク質２１が複合体を形成することを検出することができる。
一方、図２に示すように、第２タンパク質が、Ｘタンパク質１１と複合体４０を形成するＹタンパク質２１ではなく、複合体４０を形成し得ないＺタンパク質であるとする。この場合、タンパク質合成系中で生産される第２キメラタンパク質２０ｂは、機能性ペプチド２２とＺタンパク質２３とを結合したものとなる。そのため、第１キメラタンパク質１０のＸタンパク質１１部分と、第２キメラタンパク質２０ｂのＺタンパク質２３部分とは結合できず複合体４０を形成しない。したがって、レポーター遺伝子３１の転写は、キメラタンパク質１０のＤＢＤ１２部分の働きまたは自身のエンハンサー３３によって活性化したままで、抑制されることがない。それゆえ、この転写抑制が起こらないことを確認することによって、Ｘタンパク質１１およびＺタンパク質２３が複合体を形成しないことを検出することができる。
次に、本方法について、（１）キメラ遺伝子発現工程、（２）複合体確認工程の順に、より詳細に説明する。
（１）キメラ遺伝子発現工程
この工程では、キメラタンパク質１０をコードする第１キメラ遺伝子と、キメラタンパク質２０ａをコードする第２キメラ遺伝子とを、レポーター遺伝子３１を含んだタンパク質合成系において発現させる。
この工程では、キメラタンパク質１０をコードする第１キメラ遺伝子と、キメラタンパク質２０ａをコードする第２キメラ遺伝子とを、レポーター遺伝子３１を含んだタンパク質合成系において発現させる。
そこで、以下では、キメラタンパク質１０に含まれるＸタンパク質１１およびＤＢＤ１２と、キメラタンパク質２０ａに含まれるＹタンパク質２１および機能性ペプチド２２とについて、詳細に説明する。さらに、レポーター遺伝子３１およびタンパク質合成系についても、併せて詳細に説明する。
＜Ｘタンパク質１１＞
Ｘタンパク質１１は、後述するＹタンパク質２１と相互作用することにより、複合体を形成するかを決定したいタンパク質であり、原則として、任意のタンパク質とすることができる。ただし、Ｘタンパク質１１には、後述するレポーター遺伝子３１の転写を単独で抑制するタンパク質が含まれないものとする。このようなタンパク質は、本発明において、複合体を形成するか否かを決定できないからである。
Ｘタンパク質１１は、後述するＹタンパク質２１と相互作用することにより、複合体を形成するかを決定したいタンパク質であり、原則として、任意のタンパク質とすることができる。ただし、Ｘタンパク質１１には、後述するレポーター遺伝子３１の転写を単独で抑制するタンパク質が含まれないものとする。このようなタンパク質は、本発明において、複合体を形成するか否かを決定できないからである。
その理由を、以下に説明する。Ｘタンパク質１１が、レポーター遺伝子３１の転写を単独で抑制できる場合、Ｙタンパク質２１と複合体を形成するまでもなく、レポーター遺伝子３１の転写を抑制する。一方、Ｘタンパク質１１およびＹタンパク質２１が、複合体を形成する場合でも、やはり、レポーター遺伝子３１の転写を抑制する。したがって、何れにせよ、複合体確認工程にて転写抑制が確認されるため、Ｘタンパク質１１とＹタンパク質２１とが、複合体を形成したか、決定できない。
Ｘタンパク質１１は、任意の長さのポリペプチドからなるものであればよい。さらに、ツーハイブリッドシステムを利用した従来のタンパク質複合体検出方法とは異なり、本方法では、Ｘタンパク質１１を、任意の転写因子や、あるいは転写因子に結合する性質を有するタンパク質とすることもできる。これは、後述するキメラタンパク質複合体４０によるレポーター遺伝子３１の転写抑制は、転写因子であるＸタンパク質１１が存在する環境下において、優性に行われるからである。
＜ＤＢＤ１２＞
本方法で使用するＤＢＤ１２は、後述するレポーター遺伝子３１に含まれるＣＩＳ３２（シスエレメント）へ結合することによって、レポーター遺伝子３１の転写を活性化する能力を持つ、または転写活性を持たない、いわゆるＤＮＡ結合ペプチドである。
本方法で使用するＤＢＤ１２は、後述するレポーター遺伝子３１に含まれるＣＩＳ３２（シスエレメント）へ結合することによって、レポーター遺伝子３１の転写を活性化する能力を持つ、または転写活性を持たない、いわゆるＤＮＡ結合ペプチドである。
このＤＢＤ１２は、転写因子そのもの、または転写因子内のＤＮＡ結合ドメインであればよい。例えば、ＤＢＤ１２は、ＧＡＬ４、ＰＡＰ１，ＥＩＮ３，ＣＵＣ１，ＣＵＣ２，ＡｔＭＹＢ２３等の転写因子や、あるいはそれらに含まれるＤＮＡ結合ドメインとすることができるが、これらに限定されるものではない。なお、本方法では、ＤＢＤ１２として、酵母由来のＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを使用することが好ましい。
また、ＤＢＤ１２は、転写因子または転写因子に含まれるＤＮＡ結合ドメインを構成するアミノ酸配列のうち、必ずしも全てからなる必要は無い。すなわち、ＤＢＤ１２は、転写因子やそのＤＮＡ結合ドメインの全アミノ酸配列のうち、一部分からなるものあってもよい。
＜Ｙタンパク質２１＞
Ｙタンパク質２１は、上述したＸタンパク質１１と相互作用することによって、複合体を形成するか決定したいタンパク質であり、原則として、任意のタンパク質とすることができる。ただし、Ｙタンパク質２１には、後述するレポーター遺伝子３１の転写を単独で抑制するタンパク質が含まれないものとする。このようなタンパク質は、本発明において、複合体を形成するか否か決定できないからである。
Ｙタンパク質２１は、上述したＸタンパク質１１と相互作用することによって、複合体を形成するか決定したいタンパク質であり、原則として、任意のタンパク質とすることができる。ただし、Ｙタンパク質２１には、後述するレポーター遺伝子３１の転写を単独で抑制するタンパク質が含まれないものとする。このようなタンパク質は、本発明において、複合体を形成するか否か決定できないからである。
その理由を、以下に説明する。Ｙタンパク質２１が、レポーター遺伝子３１の転写を単独で抑制できる場合、Ｘタンパク質１１と複合体を形成するまでもなく、レポーター遺伝子３１の転写を抑制する。一方、Ｙタンパク質２１とＸタンパク質１１とが、複合体を形成した場合でも、やはり、レポーター遺伝子３１の転写を抑制する。したがって、何れにせよ、複合体確認工程で転写抑制が確認されるため、Ｙタンパク質２１とＸタンパク質１１とが複合体を形成したか、区別できない。
Ｙタンパク質２１は、任意の長さのポリペプチドからなるものであってよい。さらに、ツーハイブリッドシステムを利用した従来のタンパク質複合体検出方法とは異なり、本方法では、Ｙタンパク質２１を、任意の転写因子や、あるいは転写因子に結合する性質を有するタンパク質とすることもできる。これは、後述するキメラタンパク質複合体４０によるレポーター遺伝子３１の転写抑制は、転写因子であるＹタンパク質２１が存在する環境下において、優性に行われるからである。
＜機能性ペプチド２２＞
本発明で用いられる、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド２２は、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子により制御される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチド（特許文献１〜７、非特許文献２，３等参照）であればよい。このペプチドは、Class II ＥＲＦ（Ethylene Responsive Element Binding Factor）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。
本発明で用いられる、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド２２は、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子により制御される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチド（特許文献１〜７、非特許文献２，３等参照）であればよい。このペプチドは、Class II ＥＲＦ（Ethylene Responsive Element Binding Factor）タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質（Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質等）から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。
機能性ペプチド２２の一例の具体的な構造は、下記式（１）〜（４）の何れかで表されるアミノ酸配列となっている。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
〔式（１）の機能性ペプチド２２〕
上記式（１）の機能性ペプチド２２においては、上記Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の機能性ペプチド２２においては、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
（１）Ｘ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｘ２−Ｌｅｕ−Ｘ３
（但し、式中、Ｘ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｘ２はＡｓｎ又はＧｌｕを示し、Ｘ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（２）Ｙ１−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｙ２−Ｙ３
（但し、式中、Ｙ１は０〜１０個のアミノ酸残基を示し、Ｙ２はＰｈｅまたはＩｌｅを示し、Ｙ３は少なくとも６個のアミノ酸残基を示す。）
（３）Ｚ１−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｚ３
（但し、式中、Ｚ１はＬｅｕ、Ａｓｐ−ＬｅｕまたはＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕを示し、Ｚ２はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示し、Ｚ３は０〜１０個のアミノ酸残基を示す。）
（４）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｚ４−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（但し、式中、Ｚ４はＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐを示す。）
〔式（１）の機能性ペプチド２２〕
上記式（１）の機能性ペプチド２２においては、上記Ｘ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｘ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の機能性ペプチド２２においては、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
このＸ１で表されるアミノ酸残基は、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
同様に、上記式（１）の機能性ペプチド２２においては、上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｘ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（１）の機能性ペプチド２２においては、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｘ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
上記式（１）の機能性ペプチド２２において、Ｘ１およびＸ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号３９、４０に示す。なお、上記Ｘ２がＡｓｎの場合のアミノ酸配列が配列番号３９に示すアミノ酸配列であり、上記Ｘ２がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号４０に示すアミノ酸配列である。
〔式（２）の機能性ペプチド２２〕
上記式（２）の機能性ペプチド２２においては、上記式（１）の機能性ペプチド２２のＸ１と同様、上記Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の機能性ペプチド２２においては、上記式（１）の機能性ペプチド２２と同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
上記式（２）の機能性ペプチド２２においては、上記式（１）の機能性ペプチド２２のＸ１と同様、上記Ｙ１で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｙ１で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の機能性ペプチド２２においては、上記式（１）の機能性ペプチド２２と同様、Ｎ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
このＹ１で表されるアミノ酸残基は、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。
同様に、上記式（２）の機能性ペプチド２２においては、上記式（１）の機能性ペプチド２２のＸ３と同様、上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基の数は少なくとも６個であればよい。また、Ｙ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（２）の機能性ペプチド２２においては、上記式（１）の機能性ペプチド２２と同様、Ｃ末端側には、６個以上の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていればよい。上記Ｙ３で表されるアミノ酸残基は、最低６個あれば上記機能を示すことができる。
上記式（２）の機能性ペプチド２２において、Ｙ１およびＹ３を除いた５個のアミノ酸残基からなるペンタマー（５mer）の具体的な配列は、配列番号４１、４２に示す。なお、上記Ｙ２がＰｈｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４１に示すアミノ酸配列であり、上記Ｙ２がＩｌｅの場合のアミノ酸配列が配列番号４２に示すアミノ酸配列である。また、Ｙ２を除いた４個のアミノ酸残基からなるテトラマー（４mer）の具体的な配列は、配列番号４３に示す。
〔式（３）の機能性ペプチド２２〕
上記式（３）の機能性ペプチド２２においては、上記Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものとなっている。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっており、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっている。
上記式（３）の機能性ペプチド２２においては、上記Ｚ１で表されるアミノ酸残基は、１〜３個の範囲内でＬｅｕを含むものとなっている。アミノ酸１個の場合は、Ｌｅｕであり、アミノ酸２個の場合は、Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっており、アミノ酸３個の場合はＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕとなっている。
一方、上記式（３）の機能性ペプチド２２においては、上記式（１）の機能性ペプチド２２のＸ１等と同様、上記Ｚ３で表されるアミノ酸残基の数は０〜１０個の範囲内であればよい。また、Ｚ３で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式（３）の機能性ペプチド２２においては、Ｃ末端側には、１個の任意のアミノ酸または２〜１０個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
このＺ３で表されるアミノ酸残基は、できるだけ短いほうがよい。具体的には、１０個以下であることが好ましく、５個以下であることがより好ましい。Ｚ３で表されるアミノ酸残基の具体的な例としては、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ等が挙げられるが、もちろんこれらに限定されるものではない。
また、この式（３）で表される機能性ペプチド２２全体のアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、合成するときの容易さからみれば、２０アミノ酸以下であることが好ましい。
上記式（３）の機能性ペプチド２２において、Ｚ３を除いた７〜１０個のアミノ酸残基からなるオリゴマーの具体的な配列は、配列番号４４〜５２に示す。なお、上記Ｚ１がＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４４、４５または４６に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＡｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４７、４８または４９に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ１がＬｅｕ−Ａｓｐ−ＬｅｕかつＺ２がＧｌｕ、ＧｌｎまたはＡｓｐの場合のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号５０、５１または５２に示すアミノ酸配列である。
〔式（４）の機能性ペプチド２２〕
上記式（４）の機能性ペプチド２２は、６個のアミノ酸残基からなるヘキサマー（６mer）であり、その具体的な配列は、配列番号５、１４、５３に示す。なお、上記Ｚ４がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号５に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＡｓｐの場合のアミノ酸配列が配列番号１４に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＧｌｎの場合のアミノ酸配列が配列番号５３に示すアミノ酸配列である。
上記式（４）の機能性ペプチド２２は、６個のアミノ酸残基からなるヘキサマー（６mer）であり、その具体的な配列は、配列番号５、１４、５３に示す。なお、上記Ｚ４がＧｌｕの場合のアミノ酸配列が配列番号５に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＡｓｐの場合のアミノ酸配列が配列番号１４に示すアミノ酸配列であり、上記Ｚ４がＧｌｎの場合のアミノ酸配列が配列番号５３に示すアミノ酸配列である。
特に、本発明において用いられる機能性ペプチド２２は、上記式（４）で表されるヘキサマーのような最小配列を有するペプチドであってもよい。例えば、配列番号５に示すアミノ酸配列は、シロイヌナズナＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質（ＳＵＰタンパク質）の１９６〜２０１番目のアミノ酸配列に相当し、上述したように、本発明者が新たに上記転写抑制転換ペプチドとして見出したものである。
〔機能性ペプチド２２のより具体的な例〕
上述した各式で表される機能性ペプチド２２のより具体的な例として、例えば、配列番号１〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。これらオリゴペプチドは、本発明者が上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである（例えば、特許文献７参照）。
上述した各式で表される機能性ペプチド２２のより具体的な例として、例えば、配列番号１〜１７のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。これらオリゴペプチドは、本発明者が上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである（例えば、特許文献７参照）。
〔機能性ペプチド２２の他の例〕
本発明者は、さらに、上記モチーフの構造について検討した結果、新たに６つのアミノ酸からなるモチーフを見出した。このモチーフは、具体的には、次に示す一般式（５）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。これらのペプチドも、上記転写抑制転換ペプチドに含まれる。
（５）α1−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
但し、上記式（５）中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓを示す。
本発明者は、さらに、上記モチーフの構造について検討した結果、新たに６つのアミノ酸からなるモチーフを見出した。このモチーフは、具体的には、次に示す一般式（５）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。これらのペプチドも、上記転写抑制転換ペプチドに含まれる。
（５）α1−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ1−Ｌｅｕ
但し、上記式（５）中α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ１は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓを示す。
なお、上記一般式（５）で表される機能性ペプチド２２を、便宜上、次に示す一般式（６）、（７）、（８）又は（９）で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドに分類する。
（６）α1−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β3−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
但し、上記各式中、α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示す。また、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β３は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＧｌｎを示す。さらに、γ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓを示す。
（６）α1−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−γ2−Ｌｅｕ
（７）α1−Ｌｅｕ−β２−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（８）α2−Ｌｅｕ−β１−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
（９）Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β3−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ
但し、上記各式中、α1は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α２は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示す。また、β１は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β２はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β３は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＧｌｎを示す。さらに、γ２は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓを示す。
上記式（５）〜（９）で表されるアミノ酸配列を有する機能性ペプチド２２のより具体的な例としては、配列番号１８〜３６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。このうち、配列番号２５、２６、２８又は３０のペプチドは、一般式（６）に示されるペプチドに相当し、配列番号１８、２１、３１、３２又は３３のペプチドは、一般式（７）に示されるペプチドに相当し、配列番号２２、２３、２４、２７、又は２９のペプチドは、一般式（８）に示されるペプチドに相当し、配列番号１９又は２０のペプチドは、一般式（９）に示されるペプチドに相当する。
また、上記一般式（５）〜（９）に示されるペプチド以外にも、配列番号３７または３８で表されるアミノ酸配列を有する機能性ペプチド２２を用いることもできる。
＜レポーター遺伝子＞
本発明で利用できるレポーター遺伝子３１は、ＤＢＤ１２が結合することができるものである必要はあるが、必ずしもＤＢＤ１２によって転写が活性化される遺伝子である必要はない。例えば、リポーター遺伝子３１がエンハンサー３３をプロモーター領域に備えていれば、必ずしもＤＢＤ１２によって転写が活性化される必要はない。このレポーター遺伝子３１には、ＤＢＤ１２が結合するプロモーター配列やエフェクター領域が結合していていることが好ましい。
本発明で利用できるレポーター遺伝子３１は、ＤＢＤ１２が結合することができるものである必要はあるが、必ずしもＤＢＤ１２によって転写が活性化される遺伝子である必要はない。例えば、リポーター遺伝子３１がエンハンサー３３をプロモーター領域に備えていれば、必ずしもＤＢＤ１２によって転写が活性化される必要はない。このレポーター遺伝子３１には、ＤＢＤ１２が結合するプロモーター配列やエフェクター領域が結合していていることが好ましい。
さらに、このレポーター遺伝子３１は、遺伝子の転写が抑制されているか否かを、何らかの手段によって確認できる遺伝子であることが好ましい。具体的には、レポーター遺伝子３１は、外観上その増減を相対的に確認することが可能なタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。
このような条件に該当する遺伝子の例を挙げると、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、およびβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子等があるが、これらに限定されるものではない。これらの中でも、ルシフェラーゼ遺伝子を用いることが好ましい。
レポーター遺伝子３１を取得するためには、公知の技術を用いればよい。例えば、生体内のＤＮＡからレポーター遺伝子３１を制限酵素で切断した後、電気泳動等で単離すれば、レポーター遺伝子３１を調製できる。または、ポリヌクレオチド合成機を使用して、レポーター遺伝子３１を化学的に合成してもよい。あるいは、レポーター遺伝子３１の塩基配列を鋳型にして、ＰＣＲ等のＤＮＡ増幅技術を用いて大量に調製してもよい。
＜タンパク質合成系＞
本方法では、上述のキメラ遺伝子およびレポーター遺伝子３１を、遺伝子発現によりタンパク質を生産できるタンパク質合成系中にて発現させる。このようなタンパク質合成系として、後述するように、植物や動物の細胞を使用することが好ましいが、無細胞タンパク質合成系を使用することもできる。
本方法では、上述のキメラ遺伝子およびレポーター遺伝子３１を、遺伝子発現によりタンパク質を生産できるタンパク質合成系中にて発現させる。このようなタンパク質合成系として、後述するように、植物や動物の細胞を使用することが好ましいが、無細胞タンパク質合成系を使用することもできる。
例えば、遺伝子のＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡを転写するために必要なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、およびメッセンジャーＲＮＡの材料となるヌクレオチド、ｍＲＮＡからタンパク質を翻訳するために必要なリボソームＲＮＡ、翻訳されるタンパク質の材料となる各種のアミノ酸、などが含まれており、これらの酵素やヌクレオチド、アミノ酸を基に、遺伝子からメッセンジャーＲＮＡへの転写、および転写されたメッセンジャーＲＮＡからタンパク質への翻訳が行われうる環境を、本方法で使用可能な無細胞タンパク質合成系として挙げることができる。
＜組換え発現ベクター＞
なお、本方法では、以下に説明するように、上記したキメラ遺伝子やレポーター遺伝子３１を、それぞれ組換え発現ベクターに組み込んで、タンパク質合成系に導入することが好ましい。そこで、以下では、本方法で使用可能な組換え発現ベクターについて説明する。
なお、本方法では、以下に説明するように、上記したキメラ遺伝子やレポーター遺伝子３１を、それぞれ組換え発現ベクターに組み込んで、タンパク質合成系に導入することが好ましい。そこで、以下では、本方法で使用可能な組換え発現ベクターについて説明する。
〔キメラタンパク質１０をコードするキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクター〕
キメラタンパク質１０をコードするキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクター（第２キメラ遺伝子発現ベクター）は、ＤＢＤ１２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、Ｘタンパク質１１のアミノ酸配列をコードする塩基配列とが結合した、キメラ塩基配列（第１キメラ遺伝子）を含む構成であればよい。
キメラタンパク質１０をコードするキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクター（第２キメラ遺伝子発現ベクター）は、ＤＢＤ１２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、Ｘタンパク質１１のアミノ酸配列をコードする塩基配列とが結合した、キメラ塩基配列（第１キメラ遺伝子）を含む構成であればよい。
その際、これらの塩基配列に相当するポリヌクレオチドを取得するためには、上述のレポーター遺伝子３１を取得する方法として説明した、公知技術を含む任意の手法を利用すればよい。
また、この組換え発現ベクターに、上記のキメラ塩基配列に相当するポリヌクレオチドを組み込む場合、上記のキメラ塩基配列に相当するポリヌクレオチドそのものを、組換え発現ベクターに直接的に組み込めばよい。あるいは、ＤＢＤ１２またはＸタンパク質１１のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するポリヌクレオチドの一方が事前に組み込まれている発現ベクターに、読み枠が一致するように設計した、もう一方のポリヌクレオチドを組み込んでもよい。
なお、この組換え発現ベクターを構築する際には、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどに、上記したポリヌクレオチドを組み込めばよい。
〔キメラタンパク質２０ａをコードするキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクター〕
キメラタンパク質２０ａをコードするキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクター（第２キメラ遺伝子発現ベクター）は、機能性ペプチド２２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、Ｙタンパク質２１のアミノ酸配列をコードする塩基配列が結合した、キメラ塩基配列（第２キメラ遺伝子）を含む構成であればよい。
キメラタンパク質２０ａをコードするキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクター（第２キメラ遺伝子発現ベクター）は、機能性ペプチド２２のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、Ｙタンパク質２１のアミノ酸配列をコードする塩基配列が結合した、キメラ塩基配列（第２キメラ遺伝子）を含む構成であればよい。
その際、これらの塩基配列に相当するポリヌクレオチドを取得するためには、上述のレポーター遺伝子３１を取得する方法として説明した、公知技術を含む任意の手法を利用すればよい。
また、この組換え発現ベクターに、上記のキメラ塩基配列に相当するポリヌクレオチドを組み込む場合、このポリヌクレオチドそのものを組換え発現ベクターに直接組み込めばよい。あるいは、機能性ペプチド２２またはＹタンパク質２１のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するポリヌクレオチドの一方が事前に組み込まれている発現ベクターに、読み枠が一致するように設計した、もう一方のポリヌクレオチドを組み込んでもよい。
ここで、機能性ペプチド２２のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、遺伝暗号表に基づいて、上記の一般式（１）〜（９）に示されるアミノ酸配列、配列番号１６、または配列番号１７のペプチドをコードする塩基配列を有するものであればよい。
例えば、機能性ペプチド２２のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するポリヌクレオチドの具体例として、配列番号５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、又は１２８に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
また、配列番号５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、又は１２９に示されるポリヌクレオチドは、それぞれ、上記例示されたポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドは、以下の表１に示すように、配列番号１〜３８に示されるアミノ酸配列に対応するものである。
これらの塩基配列には、必要に応じて、Ｙタンパク質２１をコードする遺伝子と連結するための連結部位となる塩基配列を含めてもよい。さらに、これらの塩基配列の読み枠と、Ｙタンパク質２１のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列の読み枠とが一致しない場合には、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含んでいてもよい。
また、この組換え発現ベクターを構築する際には、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどに、上記したポリヌクレオチドを組み込めばよい。
〔レポーター遺伝子３１を含む組換え発現ベクター〕
レポーター遺伝子３１を含む組換え発現ベクター（レポーター遺伝子発現ベクター）は、上述のようにして取得できるレポーター遺伝子３１の塩基配列に相当するポリヌクレオチドを、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどに組み込んだものであればよい。
レポーター遺伝子３１を含む組換え発現ベクター（レポーター遺伝子発現ベクター）は、上述のようにして取得できるレポーター遺伝子３１の塩基配列に相当するポリヌクレオチドを、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどに組み込んだものであればよい。
〔発現ベクターに組み込み可能な他の領域〕
上述した３種類の組換え発現ベクターには、種々のＤＮＡセグメントを含めてもよい。例えば、これらの組換え発現ベクターの少なくとも何れかには、遺伝子を発現させるための任意のプロモーター配列が含まれていることが好ましい。その際、プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを用いることが好ましい。なお、他にも、イネのアクチンプロモーターを用いることもできる。
上述した３種類の組換え発現ベクターには、種々のＤＮＡセグメントを含めてもよい。例えば、これらの組換え発現ベクターの少なくとも何れかには、遺伝子を発現させるための任意のプロモーター配列が含まれていることが好ましい。その際、プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを用いることが好ましい。なお、他にも、イネのアクチンプロモーターを用いることもできる。
さらに、これらの組換え発現ベクターの少なくとも何れかには、任意のターミネーター領域が含まれていることが好ましい。その際、ターミネーターとして、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターを使用することが好ましい。
また、以上の３種類の、本発明で利用できる組換え発現ベクターは、何れも、公知の任意手法を用いて生産（増殖）できる。一般的には、大腸菌をホストとして、当該菌の細胞内で増殖させればよい。このときベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。
〔形質転換体〕
本発明では、上記した３種類の組換え発現ベクターを、任意の細胞に導入してこれを形質転換体に転換させることによって、この形質転換体内で、遺伝子発現によりキメラタンパク質１０および２０ａを生産させることが好ましい。
本発明では、上記した３種類の組換え発現ベクターを、任意の細胞に導入してこれを形質転換体に転換させることによって、この形質転換体内で、遺伝子発現によりキメラタンパク質１０および２０ａを生産させることが好ましい。
ここで、これらの組換え発現ベクターを導入する細胞は、キメラタンパク質１０や２０ａを、遺伝子発現により生産できる細胞であればよい。このような細胞として、植物細胞を挙げることができる。なお、ここでいう植物細胞には、単離された植物細胞のみならず、植物体に含まれた状態の細胞、花・葉・根等の植物器官における各組織に含まれた状態の細胞、カルス内の細胞、および懸濁培養細胞等も含まれる。
また、上記の組換え発現ベクターは、植物細胞以外にも、動物細胞やヒト細胞、あるいはこれらの細胞由来の培養細胞に導入することもできる。
また、本発明では、組換え発現ベクターを、Ｘタンパク質１１やＹタンパク質２１が本来存在する細胞種以外の細胞に導入してもよい。すなわち、本発明では、様々な細胞種由来のＸタンパク質１１やＹタンパク質２１による複合体形成の検証を、異種または同種の一種類の細胞（例えば植物細胞）において行うことができる。言い換えると、本発明では、組換え発現ベクターを導入する細胞において、本来その細胞には存在しないタンパク質の複合体形成をも検証できる。
例えば、本発明では、酵母やヒト由来のＸタンパク質１１やＹタンパク質２１をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを、植物細胞に導入してもよい。この場合であっても、Ｘタンパク質１１およびＹタンパク質２１による複合体形成の検証を行うことができる。
なお、本発明では、組換え発現ベクターを導入する細胞を、Ｘタンパク質１１やＹタンパク質２１が本来存在する細胞とすれば、これらのタンパク質の複合体形成を、より本来の条件に近い環境下で検証することができる。例えば、Ｘタンパク質１１やＹタンパク質２１が植物由来のタンパク質であれば、組換え発現ベクターを植物細胞に導入することによって、動物細胞に導入する場合に比べて、より本来の生体内環境に近い条件でタンパク質複合体の形成を検証できる。
また、組換え発現ベクターは、細胞内に結果的に導入できればよい。すなわち、組換え発現ベクターを、単離された単独の細胞に直接的に導入するだけでなく、各種生物の組織、器官あるいは個体（植物体や動物体等）に対して導入してもよい。この場合、組換え発現ベクターは、組織、器官あるいは個体が有する細胞内に導入されればよい。
ここで、組換え発現ベクターを導入する個体は、植物であっても動物であってもよい。個体が植物であれば、例えばシロイヌナズナ、タバコ、イネ、あるいはペニチュア等に導入できるが、これらに限定されるものではない。動物であれば、マウス、ラット、ショウジョウバエ、線虫等に導入できるが、これらに限定されるものではない。
また、組換え発現ベクターを細胞や個体に導入するためには、任意の遺伝子導入方法を用いればよい。このような方法として、パーティクルガン法、プロトプラスト／スフェロプラスト法、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リン酸カルシウム法、リボソーム、ＤＥＡＥデキストラン法等があるが、これらに限定されるものではない。
また、組換え発現ベクターが細胞に導入され、なおかつ導入された細胞内で遺伝子を確実に発現しているか否かを確認するために、各種のマーカーを用いてもよい。例えば、導入した細胞内で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして、細胞に導入する。これにより、マーカー遺伝子の発現を指標として、本発明の遺伝子が導入されたか否か確認できる。
また、組換え発現ベクターには、形質転換体における発現部位を可視化してモニターするための遺伝子を導入することもできる。このような遺伝子の一例として、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子があるが、この遺伝子に限定されるものではない。
（２）複合体確認工程
この工程では、レポーター遺伝子３１の転写が抑制されたか否かを確認することにより、Ｘタンパク質１１およびＹタンパク質２１による複合体形成を検出する。
この工程では、レポーター遺伝子３１の転写が抑制されたか否かを確認することにより、Ｘタンパク質１１およびＹタンパク質２１による複合体形成を検出する。
具体的には、レポーター遺伝子３１の転写活性が、コントロールの条件下に比べて顕著に抑制されているか否かを基準として、Ｘタンパク質１１およびＹタンパク質２１による複合体が形成された否かを決定する。
ここで、レポーター遺伝子３１の転写活性を測定する際には、公知手法を含む任意の手法を利用すればよい。具体的には、レポーター遺伝子３１がコードするタンパク質の発現量、あるいは、その活性度を測定すればよい。
例えば、レポーター遺伝子３１がＣＡＴ遺伝子である場合には、ＣＡＴタンパク質の酵素活性を測定する。また、レポーター遺伝子３１がルシフェラーゼ遺伝子である場合には、ルシフェラーゼタンパク質によって引き起こされる、ルシフェリンの発光を測定する。
他にも、レポーター遺伝子３１の転写産物が、植物や動物の形態に顕著な変化をもたらす性質のものである場合、タンパク質合成系として、植物や動物（に含まれる細胞）を用いれば、そのような形態変化の度合いを指標として、レポーター遺伝子３１の転写活性度を測定できる。
（ＩＩ）タンパク質複合体検出キット
本発明に係るタンパク質複合体検出キット（本キット）として、まず、上述したタンパク質複合体検出方法を行うためのキットを挙げることができる
また、本キットとして、レポーター遺伝子３１のプロモーター配列を特異的に認識するＤＢＤ１２（ＤＮＡ結合ペプチド）とＸタンパク質１１（第１タンパク質）とを結合したキメラタンパク質１０（第１キメラタンパク質）を生産可能とする第１キメラ遺伝子発現ベクターと、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能性ペプチド２２とＹタンパク質２１（第２タンパク質）とを結合したキメラタンパク質２０ａ（第２キメラタンパク質）を生産可能とする第２キメラ遺伝子発現ベクターとを含むことを特徴したキットを挙げることもできる。
本発明に係るタンパク質複合体検出キット（本キット）として、まず、上述したタンパク質複合体検出方法を行うためのキットを挙げることができる
また、本キットとして、レポーター遺伝子３１のプロモーター配列を特異的に認識するＤＢＤ１２（ＤＮＡ結合ペプチド）とＸタンパク質１１（第１タンパク質）とを結合したキメラタンパク質１０（第１キメラタンパク質）を生産可能とする第１キメラ遺伝子発現ベクターと、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能性ペプチド２２とＹタンパク質２１（第２タンパク質）とを結合したキメラタンパク質２０ａ（第２キメラタンパク質）を生産可能とする第２キメラ遺伝子発現ベクターとを含むことを特徴したキットを挙げることもできる。
また、本キットでは、上記第１キメラ遺伝子発現ベクターは、少なくとも、（ａ）ＤＢＤ２１をコードするポリヌクレオチドであるＤＢＤセグメントと、（ｂ）当該ＤＢＤセグメントに隣接し、少なくとも１種の制限酵素（ＲＥ）により認識される塩基配列を有するポリヌクレオチドである第１ＲＥ認識セグメントとを有しているとともに、上記第２キメラ遺伝子発現ベクターは、少なくとも、（ｃ）機能性ペプチド２２をコードするポリヌクレオチドである機能性ペプチドセグメントと、（ｄ）当該機能性ペプチドセグメントに隣接し、少なくとも１種の制限酵素（ＲＥ）により認識される塩基配列を有するポリヌクレオチドである第２ＲＥ認識セグメントを有しており、上記第１キメラ遺伝子発現ベクターは、上記（ｂ）第１ＲＥ認識セグメントにＸタンパク質１１をコードする遺伝子を組み込むことで、キメラタンパク質１０を生産可能とするとともに、上記第２キメラ遺伝子発現ベクターは、上記（ｄ）第２ＲＥ認識セグメントにＹタンパク質２１をコードする遺伝子を組み込むことで、キメラタンパク質２０ａを生産可能とすることが好ましい。
また、本キットには、レポーター遺伝子３１を発現するレポーター遺伝子発現ベクターを含むことが好ましい。この発現ベクターを含むことによって、本キットを、レポーター遺伝子３１が存在しない細胞においても使用できる。
さらに、本キットには、（ａ）植物細胞に発現ベクターを導入するための試薬群、（ｂ）第１キメラ遺伝子発現ベクターまたは第２キメラ遺伝子発現ベクターに、Ｘタンパク質１１をコードする遺伝子またはＹタンパク質２１をコードする遺伝子を組み込むための試薬群、および、（ｃ）レポーター遺伝子３１の発現量の変化を確認するための試薬群のうち、少なくとも一つの試薬群が含まれることが好ましい。
これらの試薬群を本キットに含むことによって、発現ベクターを植物細胞に確実に導入したり、遺伝子を発現ベクターに確実に組み込めたり、あるいは、レポーター遺伝子３１の発現量の変化を確実に確認したりできる。なお、ここでいう「試薬群」には、酵素や塩類等の一般的な試薬の他に、一連の操作に使用される器具等を含んでもよいものとする。
さらに、本キットにおいて使用可能な機能性ペプチド、機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、タンパク質合成系、組換え発現ベクター、レポーター遺伝子、形質転換体、プロモーター、およびターミネーターについては、本発明に係るタンパク質複合体検出方法と共通するものである。
したがって、本キットを使用すれば、上述したタンパク質複合体検出方法を使用する場合と同様の効果を得ることができる。
なお本発明は、以上示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、上述した実施形態に開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる新たな実施形態についても、本発明の技術的範囲に含まれる。
以下、本発明の好ましい態様を実施例においてより詳細に説明するが、以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明がこれらに限定されるものではないことは言うまでもない。当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
〔実施例１〕
本実施例では、本発明に係るタンパク質複合体検出方法によって、２つのタンパク質の複合体形成を検出できることを証明するため、すでに複合体を形成することが確かめられている２つのタンパク質を使用して、複合体検出のモデル実験を行った。
本実施例では、本発明に係るタンパク質複合体検出方法によって、２つのタンパク質の複合体形成を検出できることを証明するため、すでに複合体を形成することが確かめられている２つのタンパク質を使用して、複合体検出のモデル実験を行った。
具体的には、ヒトＪＵＮおよびＦＯＳタンパク質の相互作用領域を、それぞれ、Ｘタンパク質１１およびＹタンパク質２１として使用した。なお、これらのタンパク質は、複合体を形成した場合、転写因子として機能することが知られている。ここで、配列表において、ヒトＪＵＮの全アミノ酸配列を配列番号１３０に示し、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１３１に示す。また、配列表において、ヒトＦＯＳの全アミノ酸配列を配列番号１３２に示し、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１３３に示す。
＜転写因子ＧＡＬ４とヒトＪＵＮとが連結したキメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターの作製＞
〔p35S-NOSの構築〕
pBI221プラスミド（クローンテック社）を、制限酵素XhoIとSacIとで消化した。この消化物をＴ４ポリメラーゼで平滑末端化処理した後、アガロースゲル電気泳動を行って、消化物からGUS遺伝子を除去した。以上の処理によって、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓのプロモーター（以下、CaMV35Sと略す）およびノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（ＮＯＳターミネーター、以下Nos-terと略す）を含む、p35S-NOSプラスミド断片ＤＮＡを得た。
〔p35S-NOSの構築〕
pBI221プラスミド（クローンテック社）を、制限酵素XhoIとSacIとで消化した。この消化物をＴ４ポリメラーゼで平滑末端化処理した後、アガロースゲル電気泳動を行って、消化物からGUS遺伝子を除去した。以上の処理によって、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓのプロモーター（以下、CaMV35Sと略す）およびノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（ＮＯＳターミネーター、以下Nos-terと略す）を含む、p35S-NOSプラスミド断片ＤＮＡを得た。
〔p35S-GAL4DBDの構築〕
pAS2-1ベクター（クローンテック社）を制限酵素HindIIIで消化した。この消化物から、アガロースゲル電気泳動を行って、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合領域（１〜１４７アミノ酸残基）をコードする748bpのＤＮＡ断片（以下、GAL4DBと略す）を単離した。単離したGAL4DBに対して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。このGAL4DBコード領域を含むＤＮＡ断片を、p35S-NOSにおける、CaMV35SとNos-terとの間の、平滑末端化処理した部分に挿入した。このようにして得たベクターの中から、CaMV35Sに対して、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合領域のオープンリーディングフレームが順方向に並んでいるものを選抜して、p35S-GAL4DBDを構築した。
pAS2-1ベクター（クローンテック社）を制限酵素HindIIIで消化した。この消化物から、アガロースゲル電気泳動を行って、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合領域（１〜１４７アミノ酸残基）をコードする748bpのＤＮＡ断片（以下、GAL4DBと略す）を単離した。単離したGAL4DBに対して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。このGAL4DBコード領域を含むＤＮＡ断片を、p35S-NOSにおける、CaMV35SとNos-terとの間の、平滑末端化処理した部分に挿入した。このようにして得たベクターの中から、CaMV35Sに対して、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合領域のオープンリーディングフレームが順方向に並んでいるものを選抜して、p35S-GAL4DBDを構築した。
〔pGal4DB-JUNの構築〕
GAL4DBDの読み枠（フレーム）が一致するように設計した、ヒトＪＵＮ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列２７７〜３１５番（配列番号１３４）に相当する領域の、リン酸化した５末端アッパープライマー（配列番号１３５）と、制限酵素SalIによって認識される部位を有する３末端ローワープライマー（配列番号１３６）とを化学的に合成した。
GAL4DBDの読み枠（フレーム）が一致するように設計した、ヒトＪＵＮ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列２７７〜３１５番（配列番号１３４）に相当する領域の、リン酸化した５末端アッパープライマー（配列番号１３５）と、制限酵素SalIによって認識される部位を有する３末端ローワープライマー（配列番号１３６）とを化学的に合成した。
これらのプライマーを用いて、ＪＵＮタンパク質のアミノ酸配列２７７〜３１５番に相当するコード領域を、ＰＣＲ法によって増幅し、ＤＮＡ断片を得た。このとき、変性反応を９５℃で１分、アニーリングを５８℃で３０秒、さらに伸長反応を７４℃で２０秒行った。これらの一連の反応を１サイクルとして、合計で３０サイクル行い、ＤＮＡを増幅した。このようにして得たＤＮＡ断片を、制限酵素SalIで消化した。得られた消化物から、アガロースゲル電気泳動によって目的のＤＮＡ断片を単離した。このＪＵＮをコードするＤＮＡ断片を、あらかじめ制限酵素SmaIとSalIとで消化しておいたp35S-GAL4DBDに組込み、エフェクタープラスミドpGAL-JUNを構築した。
＜機能性ペプチドとヒトＦＯＳとが連結したキメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターの作製＞
〔p35s-NLS-NOSの構築〕
まず、SV40 T-antigen nuclear localization sequenceである核移行シグナル配列（配列番号１３７）をコードする２つのＤＮＡストランド（配列番号１３８、配列番号１３９）を化学的に合成した。その際、これらのＤＮＡストランドの５末端をリン酸化し、それからアニーリングして、２本鎖ＤＮＡとした。このようにして合成したＤＮＡ断片を、p35S-NOSベクターのSmaI部位に挿入した。こうして得たベクターの中から、CaMV35Sに対して上記のＤＮＡ断片が順方向に並んでいるものを選抜することによって、核移行シグナル配列をコードするＤＮＡストランドの３末端にSmaI部位を有するp35s-NLS-NOSを構築した。
〔p35s-NLS-NOSの構築〕
まず、SV40 T-antigen nuclear localization sequenceである核移行シグナル配列（配列番号１３７）をコードする２つのＤＮＡストランド（配列番号１３８、配列番号１３９）を化学的に合成した。その際、これらのＤＮＡストランドの５末端をリン酸化し、それからアニーリングして、２本鎖ＤＮＡとした。このようにして合成したＤＮＡ断片を、p35S-NOSベクターのSmaI部位に挿入した。こうして得たベクターの中から、CaMV35Sに対して上記のＤＮＡ断片が順方向に並んでいるものを選抜することによって、核移行シグナル配列をコードするＤＮＡストランドの３末端にSmaI部位を有するp35s-NLS-NOSを構築した。
〔NLS-FOS-SRDXの構築〕
まず、ＪＵＮと相互作用するＦＯＳタンパク質のアミノ酸配列１３３〜２１５番を含み、かつ、Ｃ末端にリプレッションドメインであるＳＲＤＸ（本発明の機能性ペプチド、配列番号１４０）が連結されたキメラタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するＤＮＡを得るために必要な、５’末端アッパープライマー（配列番号１４１）および３’末端ローワープライマー（配列番号１４２）をそれぞれ化学的に合成した。
まず、ＪＵＮと相互作用するＦＯＳタンパク質のアミノ酸配列１３３〜２１５番を含み、かつ、Ｃ末端にリプレッションドメインであるＳＲＤＸ（本発明の機能性ペプチド、配列番号１４０）が連結されたキメラタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するＤＮＡを得るために必要な、５’末端アッパープライマー（配列番号１４１）および３’末端ローワープライマー（配列番号１４２）をそれぞれ化学的に合成した。
これらのプライマーを用いて、ＦＯＳタンパク質のアミノ酸配列１３３〜２１５番に上記のＳＲＤＸが連結したアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するキメラＤＮＡを、ＰＣＲ法によって増幅し、ＤＮＡ断片を得た。このとき、変性反応を９５℃で１分、アニーリングを５８℃で３０秒、および伸長反応を７４℃で３０秒、それぞれ行った。これらの一連の反応を１サイクルとして、合計３０サイクル行い、ＤＮＡ断片を増幅した。こうして得たＤＮＡ断片を制限酵素SalIで消化し、次に、アガロースゲル電気泳動を行って、得られた消化物から目的のＤＮＡ断片を単離した。こうして得た目的のＤＮＡ断片を、あらかじめ制限酵素SmaIとSalIとで消化しておいたp35S-NLS-NOSに組込み、エフェクタープラスミドpNLS-FOS-SRDXを構築した。
〔NLS-FOSの構築〕
まず、ＪＵＮと相互作用するＦＯＳタンパク質のアミノ酸配列１３３〜２１５番を含むタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するＤＮＡ（ＦＯＳ−ＤＮＡ）を得るための、５’末端アッパープライマー（配列番号１４１）および３’末端ローワープライマー（配列番号１４３）をそれぞれ化学的に合成した。
まず、ＪＵＮと相互作用するＦＯＳタンパク質のアミノ酸配列１３３〜２１５番を含むタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するＤＮＡ（ＦＯＳ−ＤＮＡ）を得るための、５’末端アッパープライマー（配列番号１４１）および３’末端ローワープライマー（配列番号１４３）をそれぞれ化学的に合成した。
これらのプライマーを用いて、ＦＯＳ−ＤＮＡをＰＣＲ法によって増幅し、ＤＮＡ断片を得た。このとき、変性反応を９４℃で１分、アニーリングを５８℃で３０秒、および伸長反応を７４℃で３０秒、それぞれ行った。これらの一連の反応を１サイクルとして、合計３０サイクル行い、ＤＮＡ断片を増幅した。こうして得たＤＮＡ断片を制限酵素SalIで消化し、次に、アガロースゲル電気泳動を行って、消化物から目的のＤＮＡ断片を単離した。こうして得た目的のＤＮＡ断片を、あらかじめ制限酵素SmaIとSalIとで消化しておいたp35S-NLS-NOSに組込み、エフェクタープラスミドpNLS-FOSを構築した。
＜レポーター遺伝子を含む組換え発現ベクターの作製＞
〔35S-GAL4-LUCレポーター遺伝子の構築〕
まず、pBI221プラスミド（クローンテック社）を制限酵素EcoRIとSstIとで消化して、この消化物からNos-terを含む２７０ｂｐのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によって単離した。そして、単離したＤＮＡ断片を、制限酵素EcoRIとSstIで消化しておいたプラスミドpUC18の、EcoRI-SstI部位に挿入した。
〔35S-GAL4-LUCレポーター遺伝子の構築〕
まず、pBI221プラスミド（クローンテック社）を制限酵素EcoRIとSstIとで消化して、この消化物からNos-terを含む２７０ｂｐのＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によって単離した。そして、単離したＤＮＡ断片を、制限酵素EcoRIとSstIで消化しておいたプラスミドpUC18の、EcoRI-SstI部位に挿入した。
次に、CaMV35SのTATA-Boxを含む相補鎖のＤＮＡ１（配列番号１４４）およびＤＮＡ２（配列番号１４５）を合成した。
合成したＤＮＡを９０℃で２分間加熱した後、さらに６０℃で１時間、加熱した。その後、室温（２５℃）で２時間、静置してアニーリングさせて、２本鎖を形成させた。次に、Nos-terを有するpUC18プラスミドを、制限酵素HindIIIとBamHIとで消化した。このpUC18のHindIII−BamHI部位に、合成した２本鎖ＤＮＡを挿入し、TATA-BoxとNos-terとを含むプラスミドを構築した。このプラスミドを制限酵素SstIで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。
〔pTATA-LUCレポーター遺伝子の構築〕
次に、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）をもつプラスミドベクターpGV-CS2（商品名、東洋インキ社製）を、制限酵素XbaIとNcoIで消化した。この消化物に対してＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動によって、この消化物からルシフェラーゼ遺伝子を含む１．６５ｋｂのＤＮＡ断片を単離して精製した。精製したＤＮＡ断片を、上記のTATA-BoxとNos-terとを含むプラスミドに挿入し、pTATA-LUCレポーター遺伝子を構築した。
次に、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）をもつプラスミドベクターpGV-CS2（商品名、東洋インキ社製）を、制限酵素XbaIとNcoIで消化した。この消化物に対してＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動によって、この消化物からルシフェラーゼ遺伝子を含む１．６５ｋｂのＤＮＡ断片を単離して精製した。精製したＤＮＡ断片を、上記のTATA-BoxとNos-terとを含むプラスミドに挿入し、pTATA-LUCレポーター遺伝子を構築した。
〔レポーター遺伝子pGAL4-LUCの構築〕
次に、酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列を５コピー持つプラスミドpG5CAT（商品名、クローンテック社製）を、制限酵素SmaIとXbaIとによって消化した。この消化物に対してＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、５コピーのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列を含むＤＮＡ断片を、この消化物からアガロースゲル電気泳動で単離精製した。さらに、pTATA-LUCベクターを制限酵素BglIIで消化し、得た消化物に対してＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。この部位に、平滑末端化した５コピーのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列を含むＤＮＡ断片を挿入した。このようにして得たプラスミドのうち、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列が順方向に向いているものを選抜し、レポーター遺伝子pGAL4-LUCを構築した。
次に、酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列を５コピー持つプラスミドpG5CAT（商品名、クローンテック社製）を、制限酵素SmaIとXbaIとによって消化した。この消化物に対してＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、５コピーのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列を含むＤＮＡ断片を、この消化物からアガロースゲル電気泳動で単離精製した。さらに、pTATA-LUCベクターを制限酵素BglIIで消化し、得た消化物に対してＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。この部位に、平滑末端化した５コピーのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列を含むＤＮＡ断片を挿入した。このようにして得たプラスミドのうち、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列が順方向に向いているものを選抜し、レポーター遺伝子pGAL4-LUCを構築した。
〔p35S-GAL4-LUCレポーター遺伝子の構築〕
プラスミドpBI121を鋳型としてＰＣＲを行い、CaMV35Sの塩基配列のうち−８００〜−４６番目の領域を含むＤＮＡ断片を得た。このときＰＣＲに用いた５’末端アッパープライマーおよび３’末端ローワープライマーは、それぞれ配列番号１４６および１４７に示す通りである。
プラスミドpBI121を鋳型としてＰＣＲを行い、CaMV35Sの塩基配列のうち−８００〜−４６番目の領域を含むＤＮＡ断片を得た。このときＰＣＲに用いた５’末端アッパープライマーおよび３’末端ローワープライマーは、それぞれ配列番号１４６および１４７に示す通りである。
このＤＮＡ断片を、制限酵素HindIIIで消化した後、上記−８００〜−４６番目の領域を含む７６０ｂｐのＤＮＡ断片を、消化物からアガロースゲル電気泳動によって単離した。このHindIII断片を、あらかじめ制限酵素HindIIIで消化しておいたレポーター遺伝子pGAL4-LUCに挿入した。このようにして得たプラスミドの中から、CaMV35SのＤＮＡが順方向に向いているものを選抜し、p35S-GAL4-LUCレポーター遺伝子を構築した。
＜リファレンス遺伝子pPTRLの構築＞
ウミシイタケ由来のルシフェラーゼ遺伝子をもつカセットベクターpRL-null（商品名：プロメガ社製）を制限酵素NheIとXbaI制限酵素で切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動でウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子を含む９４８ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。このＤＮＡ断片を、エフェクタープラスミドの構築の際に用いた、ＧＵＳ遺伝子を除いたpBI221ベクターのＧＵＳ遺伝子があった領域に挿入した。こうして得たプラスミドのうち、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子が順方向に向いているものを選抜し、pPTRLを構築した。
ウミシイタケ由来のルシフェラーゼ遺伝子をもつカセットベクターpRL-null（商品名：プロメガ社製）を制限酵素NheIとXbaI制限酵素で切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動でウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子を含む９４８ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。このＤＮＡ断片を、エフェクタープラスミドの構築の際に用いた、ＧＵＳ遺伝子を除いたpBI221ベクターのＧＵＳ遺伝子があった領域に挿入した。こうして得たプラスミドのうち、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子が順方向に向いているものを選抜し、pPTRLを構築した。
＜レポーター遺伝子の活性測定法＞
シロイヌナズナに、レポーター遺伝子とエフェクタープラスミドとをパーティクルガン法にて導入し、エフェクターの効果を、レポーター遺伝子の活性を測定することにより調べた。
シロイヌナズナに、レポーター遺伝子とエフェクタープラスミドとをパーティクルガン法にて導入し、エフェクターの効果を、レポーター遺伝子の活性を測定することにより調べた。
＜パーティクルガン法による遺伝子導入＞
pGAL4-LUCレポーター遺伝子１．６μｇと、エフェクタープラスミドの総ＤＮＡを１．２μｇと、リファレンス遺伝子プラスミド０．４μｇを直径１μｍの金粒子（バイオラッド社製）５１０μｇにコーティングした。生育期間２１日目のシロイヌナズナ葉４〜７枚を、水で湿らせた濾紙をおいた９ｃｍシャーレに並べ、この葉に、バイオラッド社製ＰＤＳ−１０００／Ｈｅボンバートメント機を用いてＤＮＡを打ち込んだ。
pGAL4-LUCレポーター遺伝子１．６μｇと、エフェクタープラスミドの総ＤＮＡを１．２μｇと、リファレンス遺伝子プラスミド０．４μｇを直径１μｍの金粒子（バイオラッド社製）５１０μｇにコーティングした。生育期間２１日目のシロイヌナズナ葉４〜７枚を、水で湿らせた濾紙をおいた９ｃｍシャーレに並べ、この葉に、バイオラッド社製ＰＤＳ−１０００／Ｈｅボンバートメント機を用いてＤＮＡを打ち込んだ。
なお、バイオラッド社製ＰＤＳ−１０００／Ｈｅボンバートメント機を用いたシロイヌナズナ葉へのＤＮＡの導入は、以下の条件で行った。金粒子を葉に導入するためのガス圧を調節するラプチャーディスクは、１１００ｐｓｉ用を用いた。金粒子を打ち込むシロイヌナズナの葉を並べたサンプル台は、ラプチャーディスクの位置より約２０ｃｍ下の位置にセットするために、器機の高さを調節する段の下から３段目に設置した。それ以外の条件は、器機の操作マニュアルに従った。
金粒子を打ち込んだ葉は２２℃、１４〜１８時間、明所で静置し、それからレポーター遺伝子の活性を測定した。
＜ルシフェラーゼ活性測定＞
１４〜１８時間静置したシロイヌナズナ葉を、液体窒素中で粉砕し、Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System（プロメガ社製）に添付されているPassive Lysis Buffer２００μｌに懸濁した後、遠心して上清を回収した。この細胞抽出液２０μｌをDual-LuciferaseTM Reporter Assay System（プロメガ社製）に添付されている測定バッファー１００μｌに混合し、ルミノメーター（TD20/20,Turener Design社製）を用いてルシフェラーゼ活性測定を行った。ホタル・ルシフェラーゼおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を、測定キットの説明書にしたがって、１０秒間の発光を積分モードでカウントして測定した。リファレンス遺伝子の活性値をレポーター遺伝子の活性値で割り、その相対値であるRelative lucifarase activityを、測定値として求めた。
１４〜１８時間静置したシロイヌナズナ葉を、液体窒素中で粉砕し、Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System（プロメガ社製）に添付されているPassive Lysis Buffer２００μｌに懸濁した後、遠心して上清を回収した。この細胞抽出液２０μｌをDual-LuciferaseTM Reporter Assay System（プロメガ社製）に添付されている測定バッファー１００μｌに混合し、ルミノメーター（TD20/20,Turener Design社製）を用いてルシフェラーゼ活性測定を行った。ホタル・ルシフェラーゼおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を、測定キットの説明書にしたがって、１０秒間の発光を積分モードでカウントして測定した。リファレンス遺伝子の活性値をレポーター遺伝子の活性値で割り、その相対値であるRelative lucifarase activityを、測定値として求めた。
実験は、エフェクタープラスミドの種類ごとに３回、個別にトランジェントアッセイ実験を行い、平均値と標準偏差とを求めた。各エフェクタープラスミドを入れない場合の、p35S-GAL4-LUCレポーター遺伝子の活性の相対値を１００として、エフェクタープラスミドを同時に細胞に導入したときに、レポーター遺伝子の活性値の変動によってエフェクターの効果を調査した。
すなわち、p35S-GAL4-LUCレポーター遺伝子と、上記各エフェクタープラスミドとを同時にシロイヌナズナに導入したときに、レポーター遺伝子の活性値が減少すれば、そのエフェクターは、レポーター遺伝子の活性を抑制する効果（リプレッサー機能）があることを示している。
＜実験結果＞
シロイヌナズナの細胞内に導入したエフェクター遺伝子の種類別の、レポーター遺伝子の活性の結果を、図３に示す。図３において、CONTOLはエフェクタープラスミドを導入していない結果を示し、それ以外は、それぞれ図に示すエフェクター遺伝子を導入した結果を示している。
シロイヌナズナの細胞内に導入したエフェクター遺伝子の種類別の、レポーター遺伝子の活性の結果を、図３に示す。図３において、CONTOLはエフェクタープラスミドを導入していない結果を示し、それ以外は、それぞれ図に示すエフェクター遺伝子を導入した結果を示している。
なお、以下では、説明の便宜上、ＦＯＳタンパク質のアミノ酸配列１３３〜２１５番に相当するポリペプチドをＦＯＳタンパク質と略称し、ＪＵＮタンパク質のアミノ酸配列２７７〜３１５番に相当するポリペプチドをＪＵＮタンパク質と略称する。
図３によると、レポーター遺伝子を含むp35S-GAL4-LUCと同時に、GAL4DB-JUNをシロイヌナズナ葉に導入して、ＧＡＬ４とＪＵＮとが連結したキメラタンパク質（ＧＡＬ４−ＪＵＮ）を発現させた場合、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ活性は１０５＋−１０であり、コントロールと比較して大差がなかった。
また、図３によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、NLS-FOS-SRDXをシロイヌナズナ葉に導入して、ＦＯＳとＳＲＤＸ（機能性ペプチド２２）とが連結したキメラタンパク質（ＦＯＳ−ＳＲＤＸ）を発現させた場合、ルシフェラーゼ活性は７５＋−１５であり、コントロールと比較して大差が無かった。
また、図３によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、NLS-FOSをシロイヌナズナ葉に導入して、ＦＯＳタンパク質を発現させた場合、ルシフェラーゼ活性は７６＋−５であり、コントロールと比較して大差が無かった。
また、図３によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、GAL4DB-JUNとNLS-FOSとを何れもシロイヌナズナ葉に導入して、ＧＡＬ４−ＪＵＮとＦＯＳタンパク質とを同時に発現させた場合、ルシフェラーゼ活性は７７＋−３であり、コントロールと比較して大差が無かった。
一方、図３によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、GAL4DB-JUNとNLS-FOS-SRDXとを何れもシロイヌナズナ葉に導入して、ＧＡＬ４−ＪＵＮとＦＯＳ−ＳＲＤＸとを同時に発現させた場合、ルシフェラーゼ活性は４＋−２となり、コントロールの約４％にまで抑制される結果となった。
以上の結果から、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ活性の顕著な抑制は、ＧＡＬ４−ＪＵＮとＦＯＳ−ＳＲＤＸとが同時に存在する環境下でのみ起こることがわかる。すなわち、この結果は、ＧＡＬ４−ＪＵＮとＦＯＳ−ＳＲＤＸとが、ＪＵＮとＦＯＳとによる相互作用を介して複合体を形成した結果、ＧＡＬ４によるルシフェラーゼ遺伝子の転写活性化を、ＳＲＤＸがトランスに抑制したことを表している。
したがって、以上の結果から、本発明によるタンパク質複合体検出方法を用いて、２つのタンパク質ＪＵＮとＦＯＳとの複合体形成を検出できることが証明された。
〔実施例２〕
本実施例では、組換え発現ベクターの構築、およびレポーター遺伝子活性の測定には実施例１と同一の手法を用いたが、ＧＡＬ４を連結させるタンパク質をＪＵＮではなくＦＯＳにし、かつ、ＳＲＤＸを連結させるタンパク質をＦＯＳではなくＪＵＮにした。
本実施例では、組換え発現ベクターの構築、およびレポーター遺伝子活性の測定には実施例１と同一の手法を用いたが、ＧＡＬ４を連結させるタンパク質をＪＵＮではなくＦＯＳにし、かつ、ＳＲＤＸを連結させるタンパク質をＦＯＳではなくＪＵＮにした。
なお、35S-GAL4-FOSを構築する際には、配列番号１４８に示す５末端アッパープライマーと、配列番号１４９に示す３末端ローワープライマーとを用いた。また、NLS-JUNを構築する際には、配列番号１５０に示す５末端アッパープライマーと、配列番号１５１に示す３末端ローワープライマーとを用いた。また、NLS-JUN-SRDXを構築する際には、配列番号１５０に示す５末端アッパープライマーと、配列番号１５２に示す３末端ローワープライマーとを用いた。
シロイヌナズナの細胞内に導入したエフェクター遺伝子の種類別の、レポーター遺伝子の活性の測定結果を、図４に示す。なお、図４において、CONTOLはエフェクタープラスミドを導入していない結果を示し、それ以外は、それぞれ図に示すエフェクター遺伝子を導入した結果を示すことは、実施例１における図３と同様である。
図４によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、GAL4DBをシロイヌナズナ葉に導入して、ＧＡＬ４タンパク質を発現させた場合、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ活性は１１４＋−６０であり、コントロールと比較して大差が無かった。
また、図４によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、GAL4DB-FOSをシロイヌナズナ葉に導入して、ＧＡＬ４とＦＯＳとが連結したキメラタンパク質（ＧＡＬ４−ＦＯＳ）を発現させた場合、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ活性は１７４＋−６０であり、コントロールと比較して顕著に増加した。この結果は、発現されたＧＡＬ４−ＦＯＳが、p35S-GAL4-LUCのＧＡＬ４結合サイトに結合し、レポーター遺伝子の転写を活性化したことを表している。
また、図４によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、NLS-JUNをシロイヌナズナ葉に導入して、ＪＵＮタンパク質を発現させた場合、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ活性は８５．６＋−１４であり、コントロールと比較して大差が無かった。
また、図４によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、NLS-JUN-SRDXをシロイヌナズナ葉に導入して、ＪＵＮタンパク質とＳＲＤＸ（機能性ペプチド２２）とが連結したキメラタンパク質（ＪＵＮ−ＳＲＤＸ）を発現させた場合、ルシフェラーゼ活性は９８．６＋−１８であり、コントロールと比較して大差が無かった。
また、図４によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、GAL4DB-FOSとNLS-JUNとを何れもシロイヌナズナ葉に導入して、ＧＡＬ４−ＦＯＳとＪＵＮタンパク質とを同時に発現させた場合、ルシフェラーゼ活性は１７４．４＋−３１であり、コントロールと比較して顕著に増加した。この結果は、GAL4DB-FOSのみを導入した場合の結果とほぼ等しい。ここで、ＦＯＳとＪＵＮとは細胞内で結合していると考えられるため、この結果は、ＦＯＳにＪＵＮが結合しても、ＧＡＬ４によるレポーター遺伝子の活性化には特に影響が無いことを表している。
また、図４によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、GAL4DBとNLS-JUN-SRDXとを何れもシロイヌナズナ葉に導入して、ＧＡＬ４タンパク質とＪＵＮ−ＳＲＤＸとを同時に発現させた場合には、ルシフェラーゼ活性は８６．４＋−１３．１となり、コントロールと比較して大差が無かった。この結果は、ＧＡＬ４とＪＵＮとが互いに相互作用しないことを表している。
一方、図４によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、GAL4DB-FOSとNLS-JUN-SRDXとを何れもシロイヌナズナ葉に導入して、ＧＡＬ４−ＦＯＳとＪＵＮ−ＳＲＤＸとを同時に発現させた場合、ルシフェラーゼ活性は６．２＋−２．７となり、コントロールの約６％にまで抑制される結果となった。
以上の結果から、まず、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ活性の顕著な抑制は、ＧＡＬ４−ＦＯＳとＪＵＮ−ＳＲＤＸとが同時に存在する環境下でのみ起こることがわかる。すなわち、このことは、ＧＡＬ４−ＦＯＳとＪＵＮ−ＳＲＤＸとが相互作用して複合体を形成した結果、複合体に含まれるＳＲＤＸの作用によって、複合体のＧＡＬ４部分が、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子の転写をトランスに抑制したことを表している。
ここで、ＧＡＬ４−ＦＯＳとＪＵＮ−ＳＲＤＸとが複合体を形成する際、ＪＵＮと結合したのは、ＧＡＬ４−ＦＯＳのＧＡＬ４部分またはＦＯＳ部分の何れかである。しかし、図４に示すように、ＧＡＬ４とＪＵＮとの相互作用を否定する結果も得られているため、ＪＵＮと結合したのはＧＡＬ４ではなくＦＯＳであることがわかる。
したがって、以上の結果から、本発明によるタンパク質複合体検出方法を用いて、２つのタンパク質ＦＯＳとＪＵＮとの複合体形成を検出できることが証明された。
〔実施例３〕
本実施例では、シロイヌナズナ由来のタンパク質であり、互いに相互作用することが明らかになっているＰＩとＡＰ３とを、Ｘタンパク質１１およびＹタンパク質２１として使用した。ここで、ＰＩの全アミノ酸配列を配列番号１５３に示し、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１５４に示す。また、ＡＰ３の全アミノ酸配列を配列番号１５５に示し、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１５６に示す。なお、本実施例においても、組換え発現ベクターの構築、およびレポーター遺伝子活性の測定には、実施例１と同一の手法を用いた。
本実施例では、シロイヌナズナ由来のタンパク質であり、互いに相互作用することが明らかになっているＰＩとＡＰ３とを、Ｘタンパク質１１およびＹタンパク質２１として使用した。ここで、ＰＩの全アミノ酸配列を配列番号１５３に示し、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１５４に示す。また、ＡＰ３の全アミノ酸配列を配列番号１５５に示し、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１５６に示す。なお、本実施例においても、組換え発現ベクターの構築、およびレポーター遺伝子活性の測定には、実施例１と同一の手法を用いた。
35S-GAL4-PIを構築する際には、配列番号１５７に示す５末端アッパープライマーと、配列番号１５８に示す３末端ローワープライマーとを用いた。また、NLS-AP3の構築には、配列番号１５９に示す５末端アッパープライマーと、配列番号１６０に示す３末端ローワープライマーとを用いた。また、NLS-AP3-SRDXの構築には、配列番号１５９に示す５末端アッパープライマーと、配列番号１６１に示す３末端ローワープライマーとを用いた。
シロイヌナズナの細胞内に導入したエフェクター遺伝子の種類別の、レポーター遺伝子の活性の測定結果を、図５に示す。なお、図５において、CONTOLはエフェクタープラスミドを導入していない結果を示し、それ以外は、それぞれ図に示すエフェクター遺伝子を導入した結果を示すことは、実施例１における図１と同様である。
図５によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、GAL4DB-PIをシロイヌナズナ葉に導Ｉ入して、ＧＡＬ４とＰＩとが連結したキメラタンパク質（ＧＡＬ４−Ｐ）を発現させた場合、ルシフェラーゼ活性は９９．６＋−３５．２であり、コントロールに比べて大差が無かった。
また、図５によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、NLS-AP3をシロイヌナズナ葉に導入して、ＡＰ３タンパク質を発現させた場合、ルシフェラーゼ活性は６７．６＋−１８．２であり、コントロールの約６７％に減少した。
また、図５によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、NLS-AP3-SRDXをシロイヌナズナ葉に導入して、ＡＰ３タンパク質とＳＲＤＸ（機能性ペプチド２２）が連結したキメラタンパク質（ＡＰ３−ＳＲＤＸ）を発現させた場合、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ活性は９３．８＋−３４．９であり、コントロールと比較して大差が無かった。
また、図５によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、GAL4DB-PIとNLS-AP3とを何れもシロイヌナズナ葉に導入して、ＧＡＬ４−ＰＩとＡＰ３タンパク質とを同時に発現させた場合、ルシフェラーゼ活性は８９．３＋−２５．１であり、コントロールと比較して大差が無かった。
一方、図５によると、p35S-GAL4-LUCと同時に、GAL4DB-PIとNLS-AP3-SRDXとを何れもシロイヌナズナ葉に導入して、ＧＡＬ４−ＰＩとＡＰ３−ＳＲＤＸとを同時に発現させた場合、ルシフェラーゼ活性は３４．２＋−１３．４となり、コントロールの約３４％にまで抑制される結果となった。
以上の結果から、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ活性の顕著な抑制は、ＧＡＬ４−ＰＩとＡＰ３−ＳＲＤＸとが同時に存在する環境下のみで起こることがわかる。すなわち、この結果は、ＧＡＬ４−ＰＩとＡＰ３−ＳＲＤＸとが、ＰＩとＡＰ３とによる相互作用を介して複合体を形成した結果、ＧＡＬ４によるルシフェラーゼ遺伝子の転写活性化をＳＲＤＸがトランスに抑制したことを表している。
したがって、以上の結果から、本発明によるタンパク質複合体検出方法を用いて、２つのタンパク質ＰＩとＡＰ３との複合体形成を検出できることが明らかになった。
〔実施例４〕
以下の実施例４においては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域との間に、転写抑制転換ペプチドのひとつである１２アミノ酸ペプチドＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ）（配列番号１４０）をコードするポリヌクレオチドまたは上記ＳＲＤＸのロイシンを変換した変異ペプチドであるＳＲＤＸｍをコードするポリヌクレオチドを、ＴＴＧ１遺伝子の下流に結合したポリヌクレオチドを組み込んだ組換え発現ベクターを構築し、これをシロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換した。
以下の実施例４においては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域との間に、転写抑制転換ペプチドのひとつである１２アミノ酸ペプチドＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ）（配列番号１４０）をコードするポリヌクレオチドまたは上記ＳＲＤＸのロイシンを変換した変異ペプチドであるＳＲＤＸｍをコードするポリヌクレオチドを、ＴＴＧ１遺伝子の下流に結合したポリヌクレオチドを組み込んだ組換え発現ベクターを構築し、これをシロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換した。
なお、ＴＴＧ１タンパク質は、ＷＤ４０と呼ばれるグループに分類されるタンパク質であり、転写因子と結合することが報告されている。また、ＴＴＧ１遺伝子の変異体では、トリコームの発生抑制、根毛の過剰形成（表皮細胞の発生、分化）、タンニンの合成制御、アントシアニンの生合成の抑制、種子表面のコルメラの形成抑制が、表現型として現れることが報告されている。
＜形質転換用ベクター構築用ベクターの構築＞
形質転換用ベクター構築用ベクターであるｐ３５ＳＧを、図１３に示すように、以下の工程（１）〜（４）のとおりに構築した。
形質転換用ベクター構築用ベクターであるｐ３５ＳＧを、図１３に示すように、以下の工程（１）〜（４）のとおりに構築した。
（１）インビトロジェン社製ｐＥＮＴＲベクター上のａｔｔＬ１、ａｔｔＬ２のそれぞれの領域をプライマーａｔｔＬ１−Ｆ（配列番号１６２）、ａｔｔＬ１−Ｒ（配列番号１６３）、ａｔｔＬ２−Ｆ（配列番号１６４）、ａｔｔＬ２−Ｒ（配列番号１６５）を用いてＰＣＲにて増幅した。得られたａｔｔＬ１断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ａｔｔＬ２断片をＥｃｏＲＩで消化し、精製した。ＰＣＲ反応の条件は、変性反応９４℃１分、アニール反応４７℃２分、伸長反応７４℃１分を１サイクルとして、２５サイクル行った。以下すべてのＰＣＲ反応は同じ条件で行った。
（２）クローンテック社製（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、ＵＳＡ）のプラスミドｐＢＩ２２１を制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ遺伝子を除き、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（以下の説明では、便宜上、ＣａＭＶ３５Ｓと称する）とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（以下の説明では、便宜上、Ｎｏｓ−ｔｅｒと称する）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。
（３）以下の配列番号１６６、１６７の配列を有するＤＮＡ断片を合成し、９０℃で２分間加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。これを上記３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡのＸｂａＩ−ＳａｃＩ領域にライゲーションし、ｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを完成させた。配列番号１６６、１６７の配列を有するＤＮＡ断片には、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位、翻訳効率を高めるタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列、及び制限酵素部位ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＳｓｔＩがこの順に含まれる。
５’−ｃｔａｇａｇｇａｔｃｃａｃａａｔｔａｃｃａａｃａａｃａａｃａａａｃａａｃａａａｃａａｃａｔｔａｃａａｔｔａｃａｇａｔｃｃｃｇｇｇｇｇｔａｃｃｇｔｃｇａｃｇａｇｃｔｃ−３’（配列番号１６６）
５’−ｃｇｔｃｇａｃｇｇｔａｃｃｃｃｃｇｇｇａｔｃｔｇｔａａｔｔｇｔａａｔｇｔｔｇｔｔｔｇｔｔｇｔｔｔｇｔｔｇｔｔｇｔｔｇｇｔａａｔｔｇｔｇｇａｔｃｃｔ−３’（配列番号１６７）
５’−ｃｔａｇａｇｇａｔｃｃａｃａａｔｔａｃｃａａｃａａｃａａｃａａａｃａａｃａａａｃａａｃａｔｔａｃａａｔｔａｃａｇａｔｃｃｃｇｇｇｇｇｔａｃｃｇｔｃｇａｃｇａｇｃｔｃ−３’（配列番号１６６）
５’−ｃｇｔｃｇａｃｇｇｔａｃｃｃｃｃｇｇｇａｔｃｔｇｔａａｔｔｇｔａａｔｇｔｔｇｔｔｔｇｔｔｇｔｔｔｇｔｔｇｔｔｇｔｔｇｇｔａａｔｔｇｔｇｇａｔｃｃｔ−３’（配列番号１６７）
（４）このｐ３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、上記ａｔｔＬ１断片を挿入した。さらにこれをＥｃｏＲＩで消化し、ａｔｔＬ２断片を挿入して、ベクターｐ３５ＳＧを完成させた。
＜転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターの構築＞
転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターであるｐ３５ＳＳＲＤＸＧを、図１４に示すように、以下の工程（１）〜（２）のとおりに構築した。
転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターであるｐ３５ＳＳＲＤＸＧを、図１４に示すように、以下の工程（１）〜（２）のとおりに構築した。
（１）１２アミノ酸転写抑制転換ペプチドＬＤＬＤＬＥＬＲＬＧＦＡ（ＳＲＤＸ）をコードし、３’末端に終止コドンＴＡＡを持つように設計した、以下の配列を有するＤＮＡをそれぞれ合成し、７０℃で１０分加温した後、自然冷却によりアニールさせて２本鎖ＤＮＡとした。
５’−ｇｇｇｃｔｔｇａｔｃｔｇｇａｔｃｔａｇａａｃｔｃｃｇｔｔｔｇｇｇｔｔｔｃｇｃｔｔａａｇ−３’（配列番号１６８）
５’−ｔｃｇａｃｔｔａａｇｃｇａａａｃｃｃａａａｃｇｇａｇｔｔｃｔａｇａｔｃｃａｇａｔｃａａｇｃｃｃ−３’（配列番号１６９）
５’−ｇｇｇｃｔｔｇａｔｃｔｇｇａｔｃｔａｇａａｃｔｃｃｇｔｔｔｇｇｇｔｔｔｃｇｃｔｔａａｇ−３’（配列番号１６８）
５’−ｔｃｇａｃｔｔａａｇｃｇａａａｃｃｃａａａｃｇｇａｇｔｔｃｔａｇａｔｃｃａｇａｔｃａａｇｃｃｃ−３’（配列番号１６９）
（２）ｐ３５ＳＧを制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩで消化し、この領域に上記のＳＲＤＸをコードする２本鎖ＤＮＡを挿入して、ｐ３５ＳＳＲＤＸＧを構築した。
＜形質転換用ベクターの構築＞
構築用ベクターのａｔｔ部位で挟まれたＤＮＡ断片と組換えるための、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターであるｐＢＩＧＣＫＨを、図１５に示すように、以下の工程（１）から（３）のとおりに構築した。
構築用ベクターのａｔｔ部位で挟まれたＤＮＡ断片と組換えるための、２つのａｔｔ部位を有する植物形質転換用ベクターであるｐＢＩＧＣＫＨを、図１５に示すように、以下の工程（１）から（３）のとおりに構築した。
（１）米国ミシガン州立大学より譲渡されたｐＢＩＧ（Ｂｅｃｋｅｒ， Ｄ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：２０３，１９９０)を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩで消化し、ＧＵＳ、Ｎｏｓ領域を電気泳動で除いた。
（２）インビトロジェン社から購入したＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ベクターコンバージョンシステムのＦｒａｇｍｅｎｔＡをプラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＶサイトに挿入した。これをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、ＦｒａｇｍｅｎｔＡ断片を回収した。
（３）回収したＦｒａｇｍｅｎｔＡ断片を上記のｐＢＩＧプラスミド断片とライゲーションを行い、ｐＢＩＧＣＫＨを構築した。これらは大腸菌ＤＢ３．１（インビトロジェン社）でのみ増殖可能で、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性である。
＜構築用ベクターへのＴＴＧ１ポリヌクレオチドの組み込み＞
上記構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧにシロイヌナズナ由来の転写因子ＴＴＧ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを以下の工程（１）〜（３）のとおりに組み込んだ。
上記構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧにシロイヌナズナ由来の転写因子ＴＴＧ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを以下の工程（１）〜（３）のとおりに組み込んだ。
（１）シロイヌナズナ完全長ｃＤＮＡ ｐｄａ０１６７３を鋳型として、以下のプライマーを用いて、終止コドンを除くＴＴＧ１ポリヌクレオチド（Ａｔ５ｇ２４５２０）のコード領域のみを含むＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。
プライマー１ ５’−ｇａｔｇｇａｔａａｔｔｃａｇｃｔｃｃａｇａｔｔｃｇｔｔａｔｃ−３’（配列番号１７０）
プライマー２ ５’−ａａｃｔｃｔａａｇｇａｇｃｔｇｃａｔｔｔｔｇｔｔａｇｃａａａ−３’（配列番号１７１）
ＴＴＧ１ポリヌクレオチドのコードするアミノ酸配列およびＴＴＧ１ポリヌクレオチドのｃＤＮＡをそれぞれ配列番号１７２および１７３に示す。
プライマー１ ５’−ｇａｔｇｇａｔａａｔｔｃａｇｃｔｃｃａｇａｔｔｃｇｔｔａｔｃ−３’（配列番号１７０）
プライマー２ ５’−ａａｃｔｃｔａａｇｇａｇｃｔｇｃａｔｔｔｔｇｔｔａｇｃａａａ−３’（配列番号１７１）
ＴＴＧ１ポリヌクレオチドのコードするアミノ酸配列およびＴＴＧ１ポリヌクレオチドのｃＤＮＡをそれぞれ配列番号１７２および１７３に示す。
（２）得られたＴＴＧ１コード領域のＤＮＡ断片を、図１４に示すように、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいた構築用ベクターｐ３５ＳＳＲＤＸＧのＳｍａＩ部位にライゲーションした。
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調整して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＳＲＤＸとのキメラ遺伝子となったものを得た。
＜ＴＴＧ１ＳＲＤＸｍコンストラクトの構築＞
（１）ＴＴＧ１とＳＲＤＸｍとのキメラタンパク質であるＴＴＧ１ＳＲＤＸｍをコードするキメラ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＴＴＧ１ＳＲＤＸｍは、ＴＴＧ１のコード領域を含んでいる。
プライマー１ ５’−ｇａｔｇｇａｔａａｔｔｃａｇｃｔｃｃａｇａｔｔｃｇｔｔａｔｃ−３’（配列番号１７０）
プライマー２ ５’− ｔｔａａｇｃｇａａａｃｃｇａａａｃｇｇｇｃｔｔｃｔｔｇａｔｃｃｇｇａｔｃｇａａｃｃｃａａｃ−３’（配列番号１７４）
ＴＴＧ１ＳＲＤＸｍポリヌクレオチドのコードするアミノ酸配列を配列番号１７５に示す。
（１）ＴＴＧ１とＳＲＤＸｍとのキメラタンパク質であるＴＴＧ１ＳＲＤＸｍをコードするキメラ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＴＴＧ１ＳＲＤＸｍは、ＴＴＧ１のコード領域を含んでいる。
プライマー１ ５’−ｇａｔｇｇａｔａａｔｔｃａｇｃｔｃｃａｇａｔｔｃｇｔｔａｔｃ−３’（配列番号１７０）
プライマー２ ５’− ｔｔａａｇｃｇａａａｃｃｇａａａｃｇｇｇｃｔｔｃｔｔｇａｔｃｃｇｇａｔｃｇａａｃｃｃａａｃ−３’（配列番号１７４）
ＴＴＧ１ＳＲＤＸｍポリヌクレオチドのコードするアミノ酸配列を配列番号１７５に示す。
（２）得られたＴＴＧ１ＳＲＤＸｍのＤＮＡ断片を精製後、予め制限酵素ＳｍａＩで消化しておいたＳＲＤＸを含まないエントリーベクター（３５Ｓ−Ｎｏｓ）のＳｍａＩ部位にライゲーションした。
（３）このプラスミドで大腸菌を形質転換し、プラスミドを調整して、塩基配列を決定し、順方向に挿入されたクローンを単離し、ＳＲＤＸｍとのキメラ遺伝子となったものを得た。
＜組換え発現ベクターの構築＞
上記構築用ベクター上にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、キメラ遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）を用いて以下の工程（１）〜（３）のとおりに行った。
上記構築用ベクター上にあるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、キメラ遺伝子、Ｎｏｓ−ｔｅｒ等を含むＤＮＡ断片を、植物形質転換用ベクターｐＢＩＧＣＫＨに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）を用いて以下の工程（１）〜（３）のとおりに行った。
（１）まず、上記構築用ベクターにＴＴＧ１を組み込んだコンストラクトまたは上記ＴＴＧ１ＳＲＤＸｍコンストラクト１．５μＬ（約３００ｎｇ）とｐＢＩＧＣＫＨ４．０μＬ（約６００ｎｇ）に５倍希釈したＬＲ ｂｕｆｆｅｒ ４．０μＬとＴＥ緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＣｌ ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）５．５μＬを加えた。
（２）この溶液にＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ４．０μＬを加えて２５℃で６０分間インキュベートした。続いて、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ２μＬを加えて３７℃で１０分間インキュベートした。
（３）その後、この溶液１〜２μＬを大腸菌（ＤＨ５ａ等）に形質転換し、カナマイシンで選択した。
＜組換え発現ベクターにより形質転換した植物体の生産および表現型の観察＞
次に、以下の工程（１）〜（３）に示すように、上記キメラ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＩＧＣＫＨに組み込んだプラスミドであるｐＢＩＧ−ＴＴＧ１ＳＲＤＸまたはｐＢＩＧ−ＴＴＧ１ＳＲＤＸｍで、シロイヌナズナの形質転換を行い、形質転換植物体を生産した。シロイヌナズナ植物の形質転換は、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｂｙ ｖａｃｕｕｍ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｃｈ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｐａｍｇｒｅｅｎ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍ)に従った。ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。
次に、以下の工程（１）〜（３）に示すように、上記キメラ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＩＧＣＫＨに組み込んだプラスミドであるｐＢＩＧ−ＴＴＧ１ＳＲＤＸまたはｐＢＩＧ−ＴＴＧ１ＳＲＤＸｍで、シロイヌナズナの形質転換を行い、形質転換植物体を生産した。シロイヌナズナ植物の形質転換は、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｂｙ ｖａｃｕｕｍ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｃｈ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｐａｍｇｒｅｅｎ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍ)に従った。ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。
（１）まず得られたプラスミド、ｐＢＩＧ−ＴＴＧ１ＳＲＤＸまたはｐＢＩＧ−ＴＴＧ１ＳＲＤＸｍを、土壌細菌（（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＧＶ３１０１（Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆｒ）ｐＭＰ９０（Ｇｍｒ）(ｋｏｎｃｚ ａｎｄ Ｓａｈｅｌｌ １９８６)）株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を１リットルの、抗生物質（カナマイシン（Ｋｍ）５０μｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）２５μｇ／ｍｌ、リファンピシリン（Ｒｉｆ）５０μｇ／ｍｌ）を含むＹＥＰ培地でＯＤ６００が１になるまで培養した。次いで、培養液から菌体を回収し、１リットルの感染用培地（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ、下表２）に懸濁した。
（２）この溶液に、１４日間育成したシロイヌナズナを１分間浸し感染させた後、再び育成させ結種させた。回収した種子を２５％ブリーチ、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で７分間滅菌した後、滅菌水で３回リンスし、滅菌したハイグロマイシン選択培地（下表３）に蒔種した。
（３）蒔種した約５０００粒の種子から平均して５０個体のハイグロマイシン耐性植物である形質転換植物体を得た。これらの植物から全ＲＮＡを調整し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＴＴＧ１ＳＲＤＸまたはＴＴＧ１ＳＲＤＸｍの遺伝子が導入されていることを確認した。
（４）上記形質転換植物体について、表現型を観察した。図８（ａ）は、野生型のシロイヌナズナの種子を表すものであり、趣旨はタンニンが合成されているため濃い茶色を呈した。図８（ｂ）はＴＴＧ１ＳＲＤＸが発現しているシロイヌナズナの種子を表すものであり、キメラ遺伝子を作製したことによりＴＴＧ１に変異が生じていることからタンニンの合成が抑制され、種子は淡い黄色を呈した。図８（ｃ）はＴＴＧ１ＳＲＤＸｍが発現しているシロイヌナズナの種子を表すものであり、種子は野生型と同様に濃い茶色を呈した。
図９（ａ）は野生型のシロイヌナズナの葉を表すものであり、葉にはトリコームが形成されている。図９（ｂ）はＴＴＧ１ＳＲＤＸが発現しているシロイヌナズナの葉を表すものであり、トリコームは形成されていなかった。図９（ｃ）はＴＴＧ１ＳＲＤＸｍが発現しているシロイヌナズナの葉を表すものであり、葉には野生型と同様にトリコームが形成されていた。
図１０（ａ）は野生型のシロイヌナズナの植物体を表すものであり、アントシアニンの蓄積が観察された。図１０（ｂ）はＴＴＧ１ＳＲＤＸが発現しているシロイヌナズナの植物体を表すものであり、アントシアニンの蓄積は抑制されていた。図１０（ｃ）はＴＴＧ１ＳＲＤＸｍが発現しているシロイヌナズナの植物体を表すものであり、野生型と同様にアントシアニンの蓄積が観察された。
図１１（ａ）は野生型のシロイヌナズナの根を表すものである。図１１（ｂ）はＴＴＧ１ＳＲＤＸが発現しているシロイヌナズナの根を表すものであり、根毛の過剰形成が観察された。図１１（ｃ）はＴＴＧ１ＳＲＤＸｍが発現しているシロイヌナズナの根を表すものであり、根毛の量は野生型と同様であった。
図１２（ａ）は野生型のシロイヌナズナの種子を表すものであり、種子表面にはコルメラが形成されていた。図１２（ｂ）はＴＴＧ１ＳＲＤＸが発現しているシロイヌナズナの種子を表すものであり、コルメラの形成は観察されなかった。図１２（ｃ）はＴＴＧ１ＳＲＤＸｍが発現しているシロイヌナズナの種子を表すものであり、野生型と同様にコルメラの形成が観察された。
図８（ａ）〜図１２（ｃ）に示した以上の結果は、タンパクの相互作用を介したＳＲＤＸによるトランスリプレッションが一過性のものではなく、生体内でも同様にＳＲＤＸによる転写因子の転写抑制因子への転換と、それに伴う転写因子の標的遺伝子の転写抑制という現象が生じていることを証明するものである。
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
本発明は、以上のように、第２キメラ遺伝子をコードする第２キメラタンパク質が、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能性ペプチドと上記第２タンパク質とを結合したものであり、第１キメラタンパク質の第１タンパク質部分と、第２キメラタンパク質の第２タンパク質部分とが結合して複合体を形成した場合に、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されるようになっている。そして、複合体確認工程では、レポーター遺伝子の転写が抑制されたか否かを確認することにより、複合体形成を検出するようになっている。
この構成により、本発明では、レポーター遺伝子の転写が抑制されたか否かを確認することにより、２つのタンパク質の複合体形成を検出することになる。したがって、本発明は、一般的なタンパク質に加えて、転写因子や、あるいは転写因子に結合可能なタンパク質を含む、広範囲なタンパク質の複合体形成を検知できるという効果を奏する。
本発明に係るタンパク質複合体検出方法およびキットは、転写因子や、あるいは転写因子に結合する性質を有するタンパク質のみならず、これらを含めた各種生物の広範囲なタンパク質における複合体形成を検出できるため、例えば医薬産業で利用可能である。
Claims (17)
- 第１タンパク質および第２タンパク質が複合体を形成するか否かを検出するために、遺伝子発現によりタンパク質を生産できるタンパク質合成系中にて、第１タンパク質を含む第１キメラタンパク質をコードする第１キメラ遺伝子と、第２タンパク質を含む第２キメラタンパク質をコードする第２キメラ遺伝子とを発現させるキメラ遺伝子発現工程と、
第１タンパク質および第２タンパク質との複合体形成を検出する複合体確認工程とを含んでおり、
上記第１キメラ遺伝子がコードする第１キメラタンパク質が、レポーター遺伝子のプロモーター配列を特異的に認識するＤＮＡ結合ペプチドと上記第１タンパク質とを結合したものであるタンパク質複合体検出方法において、
上記第２キメラ遺伝子がコードする第２キメラタンパク質が、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する、以下の（ａ），（ｂ），（ｃ）または（ｄ）に示すアミノ酸配列を有する機能性ペプチドと上記第２タンパク質とを結合したものであり、
上記第１キメラタンパク質の第１タンパク質部分と、第２キメラタンパク質の第２タンパク質部分とが結合して複合体を形成した場合に、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されるようになっているとともに、
上記複合体確認工程では、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されたか否かを確認することにより、複合体形成を検出するようになっていることを特徴とするタンパク質複合体検出方法：
（ａ）配列番号２５，２６，２８もしくは３０に示されるアミノ酸配列を有する機能性ペプチド。
（ｂ）配列番号１８，２１，３１，３２もしくは３３に示されるアミノ酸配列を有する機能性ペプチド。
（ｃ）配列番号２２，２３，２４，２７もしくは２９に示されるアミノ酸配列を有する機能性ペプチド。
（ｄ）配列番号３７もしくは３８で表されるアミノ酸配列を有する機能性ペプチド。 - 上記タンパク質合成系として、植物細胞を用いることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質複合体検出方法。
- 上記第１キメラ遺伝子および第２キメラ遺伝子は、何れも発現ベクターに組み込まれて植物細胞に導入されることを特徴とする請求項２に記載のタンパク質複合体検出方法。
- 上記レポーター遺伝子は、発現ベクターに組み込まれて植物細胞に導入されることを特徴とする請求項２または３に記載のタンパク質複合体検出方法。
- 上記ＤＮＡ結合ペプチドとして、転写因子または転写因子に含まれるＤＮＡ結合ドメインを用いることを特徴とする請求項１から４の何れか１項に記載のタンパク質複合体検出方法。
- 上記レポーター遺伝子として、外観上その増減を相対的に確認することが可能なタンパク質をコードする遺伝子を用いることを特徴とする請求項１から５の何れか１項に記載のタンパク質複合体検出方法。
- 上記第１キメラ遺伝子、第２キメラ遺伝子、およびレポーター遺伝子は、それぞれ発現ベクターとして構築された上で、タンパク質合成系中に導入されることを特徴とする請求項１から６の何れか１項に記載のタンパク質複合体検出方法。
- レポーター遺伝子のプロモーター配列を特異的に認識するＤＮＡ結合ペプチドと第１タ
ンパク質とを結合した第１キメラタンパク質を生産可能とする第１キメラ遺伝子発現ベクターと、
任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能性ペプチドと第２タンパク質とを結合した第２キメラタンパク質を生産可能とする第２キメラ遺伝子発現ベクターとを含み、
上記機能性ペプチドが、以下の（ａ），（ｂ），（ｃ）または（ｄ）に示すアミノ酸配列を有する機能性ペプチドであることを特徴とするタンパク質複合体検出キット：
（ａ）配列番号２５，２６，２８もしくは３０に示されるアミノ酸配列を有する機能性ペプチド。
（ｂ）配列番号１８，２１，３１，３２もしくは３３に示されるアミノ酸配列を有する機能性ペプチド。
（ｃ）配列番号２２，２３，２４，２７もしくは２９に示されるアミノ酸配列を有する機能性ペプチド。
（ｄ）配列番号３７もしくは３８で表されるアミノ酸配列を有する機能性ペプチド。 - 上記第１キメラ遺伝子発現ベクターは、少なくとも、（ａ）上記ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）をコードするポリヌクレオチドであるＤＢＤセグメントと、（ｂ）当該ＤＢＤセグメントに隣接し、少なくとも１種の制限酵素（ＲＥ）により認識される塩基配列を有するポリヌクレオチドである第１ＲＥ認識セグメントとを有しているとともに、
上記第２キメラ遺伝子発現ベクターは、少なくとも、（ｃ）上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドである機能性ペプチドセグメントと、（ｄ）当該機能性ペプチドセグメントに隣接し、少なくとも１種の制限酵素（ＲＥ）により認識される塩基配列を有するポリヌクレオチドである第２ＲＥ認識セグメントとを有しており、
上記第１キメラ遺伝子発現ベクターは、上記（ｂ）第１ＲＥ認識セグメントに第１タンパク質をコードする遺伝子を組み込むことで、上記第１キメラタンパク質を生産可能とするとともに、
上記第２キメラ遺伝子発現ベクターは、上記（ｄ）第２ＲＥ認識セグメントに第２タンパク質をコードする遺伝子を組み込むことで、上記第２キメラタンパク質を生産可能とすることを特徴とする請求項８に記載のタンパク質複合体検出キット。 - さらに、レポーター遺伝子を発現するレポーター遺伝子発現ベクターを含むことを特徴とする請求項８または９に記載のタンパク質複合体検出キット。
- 上記第１キメラ遺伝子発現ベクター、第２キメラ遺伝子発現ベクター、およびレポーター遺伝子発現ベクターのうち少なくとも何れかには、プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターが含まれていることを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質複合体検出キット。
- 上記第１キメラ遺伝子発現ベクター、第２キメラ遺伝子発現ベクター、およびレポーター遺伝子発現ベクターのうち少なくとも何れかには、ターミネーターとして、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターが含まれていることを特徴とする請求項１０または１１に記載のタンパク質複合体検出キット。
- 上記ＤＮＡ結合ペプチドとして、転写因子または転写因子に含まれるＤＮＡ結合ドメインが用いられることを特徴とする請求項８から１２の何れか１項に記載のタンパク質複合体検出キット。
- 上記ＤＮＡ結合ペプチドとして、酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが用いられることを特徴とする請求項１３に記載のタンパク質複合体検出キット。
- 上記レポーター遺伝子として、外観上その増減を相対的に確認することが可能なタンパク質をコードする遺伝子が用いられることを特徴とする請求項８から１４の何れか１項に記載のタンパク質複合体検出キット。
- 上記レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子が用いられることを特徴とする請求項１５に記載のタンパク質複合体検出キット。
- さらに、（ａ）植物細胞に発現ベクターを導入するための試薬群、
（ｂ）第１キメラ遺伝子発現ベクターまたは第２キメラ遺伝子発現ベクターに、第１タンパク質をコードする遺伝子または第２タンパク質をコードする遺伝子を組み込むための試薬群、および、
（ｃ）レポーター遺伝子の発現量の変化を確認するための試薬群のうち、少なくとも一つの試薬群を含むことを特徴とする請求項８から１６の何れか１項に記載のタンパク質複合体検出キット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004063236 | 2004-03-05 | ||
| JP2004063236 | 2004-03-05 | ||
| PCT/JP2005/003797 WO2005085467A1 (ja) | 2004-03-05 | 2005-03-04 | タンパク質複合体検出方法、およびタンパク質複合体検出キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2005085467A1 JPWO2005085467A1 (ja) | 2008-01-24 |
| JP4631003B2 true JP4631003B2 (ja) | 2011-02-16 |
Family
ID=34918149
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006510754A Expired - Fee Related JP4631003B2 (ja) | 2004-03-05 | 2005-03-04 | タンパク質複合体検出方法、およびタンパク質複合体検出キット |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4631003B2 (ja) |
| WO (1) | WO2005085467A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2224007B1 (en) | 2007-12-05 | 2015-07-29 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Gene capable of increasing the production of oil-and-fat in plant, and use thereof |
| WO2009072608A1 (ja) | 2007-12-05 | 2009-06-11 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | 植物の油脂を増産させる遺伝子及びその利用方法 |
| JP5299886B2 (ja) | 2008-03-04 | 2013-09-25 | トヨタ自動車株式会社 | 植物の油脂を増産させる遺伝子及びその利用方法 |
| JP5718554B2 (ja) | 2009-06-04 | 2015-05-13 | トヨタ自動車株式会社 | 植物の植物重量を増産させる遺伝子及びその利用方法 |
| JP5847991B2 (ja) | 2009-06-04 | 2016-01-27 | トヨタ自動車株式会社 | 種子における物質生産性を向上させる遺伝子及びその利用方法 |
| JP5519192B2 (ja) | 2009-06-04 | 2014-06-11 | トヨタ自動車株式会社 | 種子のタンパク質含量を増産させる遺伝子及びその利用方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001515718A (ja) * | 1997-09-09 | 2001-09-25 | ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア | タンパク質−タンパク質相互作用を特性決定するための抑制されたトランスアクチベーター系 |
| WO2003055903A1 (fr) * | 2001-12-26 | 2003-07-10 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Gene et peptide regulateurs de transcription |
| JP2005027654A (ja) * | 2003-06-20 | 2005-02-03 | Japan Science & Technology Agency | 転写因子を転写抑制因子に変換するペプチド及びこれをコードするポリヌクレオチド、並びにその利用 |
-
2005
- 2005-03-04 JP JP2006510754A patent/JP4631003B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-03-04 WO PCT/JP2005/003797 patent/WO2005085467A1/ja active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001515718A (ja) * | 1997-09-09 | 2001-09-25 | ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア | タンパク質−タンパク質相互作用を特性決定するための抑制されたトランスアクチベーター系 |
| WO2003055903A1 (fr) * | 2001-12-26 | 2003-07-10 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Gene et peptide regulateurs de transcription |
| JP2005027654A (ja) * | 2003-06-20 | 2005-02-03 | Japan Science & Technology Agency | 転写因子を転写抑制因子に変換するペプチド及びこれをコードするポリヌクレオチド、並びにその利用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005085467A1 (ja) | 2005-09-15 |
| JPWO2005085467A1 (ja) | 2008-01-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Meyer et al. | AtSUC3, a gene encoding a new Arabidopsis sucrose transporter, is expressed in cells adjacent to the vascular tissue and in a carpel cell layer | |
| EP2206723A1 (en) | Modular DNA-binding domains | |
| JP3829200B2 (ja) | 転写抑制遺伝子及びペプチド | |
| US8871468B2 (en) | Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins | |
| JP5794544B2 (ja) | ストレス耐性が付与された植物体の生産方法およびその利用 | |
| JP4631003B2 (ja) | タンパク質複合体検出方法、およびタンパク質複合体検出キット | |
| US20100261874A1 (en) | Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline rich glycoproteins | |
| US5773705A (en) | Ubiquitin fusion protein system for protein production in plants | |
| JP4283127B2 (ja) | 転写因子を転写抑制因子に変換するペプチド及びこれをコードするポリヌクレオチド、並びにその利用 | |
| CA2232736A1 (en) | Commercial production of avidin in plants | |
| JP3995211B2 (ja) | 転写抑制遺伝子及びペプチド | |
| TWI664193B (zh) | 植物轉錄活化交互作用之模體（ｍｏｔｉｆ）及其用途 | |
| US20070039073A1 (en) | Novel synthetic genes for plant gums | |
| AU748910B2 (en) | Novel synthetic genes for plant gums | |
| CN112010955B (zh) | 小麦抗赤霉病相关蛋白TaRBL及其编码基因与应用 | |
| JP2005013214A (ja) | 植物を宿主とする発現ベクターを構築するための構築用ベクター及びその利用方法 | |
| JP2006020607A (ja) | 葉の形態が改変された植物体の生産方法およびこれを用いて得られる植物体、並びにその利用 | |
| US5362864A (en) | Trans-activating factor-1 | |
| AU751370B2 (en) | Improvements relating to protein accumulation | |
| JP5207354B2 (ja) | 転写抑制ペプチド及びその遺伝子 | |
| JP2006055125A (ja) | 遺伝子の転写抑制機能を有する新規ペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチド、並びにその利用 | |
| JP5907483B2 (ja) | 脱分化または再分化が促進されるように改変された植物体の生産方法、形質転換体、ならびにその方法に用いられる、キメラタンパク質、キメラ遺伝子、ｄｎａ、組換え発現ベクタおよびキット | |
| Li | Development of a molecular reporter for cell-specific visualization of jasmonates | |
| KR20130015123A (ko) | 식물 이중-하이브리드 시스템을 이용한 단백질 상호작용 검출방법 및 검출키트 | |
| JPH08256777A (ja) | 翻訳エンハンサー配列およびその使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100202 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100331 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100518 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100816 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100901 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101005 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101015 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4631003 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131126 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |