JP4283127B2

JP4283127B2 - 転写因子を転写抑制因子に変換するペプチド及びこれをコードするポリヌクレオチド、並びにその利用

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Publication number: JP4283127B2
Application number: JP2004016105A
Authority: JP
Inventors: 優高木; 圭一郎平津; 知嗣小山
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-06-20
Filing date: 2004-01-23
Publication date: 2009-06-24
Anticipated expiration: 2024-01-23
Also published as: JP2005027654A

Description

本発明は、転写因子を転写抑制因子に変換するペプチド及びこれをコードするポリヌクレオチド、並びにその利用方法に関するものであり、例えば、特定の遺伝子の転写を抑制することで、新規な植物の創出等植物への応用が可能であり、さらには、ガン遺伝子の転写抑制によるヒトも含む動物への応用の可能性も見出される、各種遺伝子の転写抑制方法に好適に利用することができる転写因子を転写抑制因子に変換するペプチド及びこれをコードするポリヌクレオチド、並びにその利用方法に関するものである。

生体において、遺伝子発現調節又は転写制御は、種々の遺伝子の機能を解析することに有用であるだけでなく、様々な産業にも応用が期待される。特に転写制御のうち、転写抑制については、応用分野として、例えば、がん遺伝子等疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する等の医療産業や、植物の改良等のアグリビジネス産業等が挙げられる。上記転写抑制の具体的な手段としては、従来より、アンチセンス法又はリボザイム法が知られている。

アンチセンス法では、転写を抑制しようとする標的遺伝子、又はこれを転写したｍＲＮＡ等の特異部位と結合させるため、当該特異部位と相補的な配列を有するポリヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ）を用いる。しかしながら、この方法では、調製されたアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡは上記標的遺伝子以外の遺伝子の発現を抑制することには使用できない。それゆえ、他の標的遺伝子に対してはその配列に合わせて新たにアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを調製する必要がある。従って、アンチセンス法は、転写抑制の方法としては汎用性に欠けるという課題を有している。

一方、リボザイム法では、リボザイムすなわち酵素活性を有するＲＮＡ分子を用いる。しかしながら、この方法でも、アンチセンス法と同様に、リボザイムは、特異部位と結合させるための相補的な配列を有する必要があり、さらには、所定の位置で特異部位を切断可能なようにリボザイムを設計する必要がある。従って、リボザイム法も、転写抑制の方法としては汎用性に欠けるという課題を有している。

加えてリボザイム法では、リボザイムを実際にホスト細胞中に導入すると、転写されたリボザイムに余分な配列が付加されてリボザイム活性が失われる場合がある。具体的には、例えば、植物をホスト細胞とする場合、標的遺伝子を切断するように設計されたリボザイムを用いたとする。このとき、当該リボザイムをプロモーター（カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター等）及びターミネーター（転写終結配列）に連結してベクターを構築し、実際に植物細胞中に導入した場合、上記のようなリボザイム活性が失われるという現象が生じる場合がある。従って、リボザイム法では、条件によっては再現性が低いという課題も有している。

また、上記各方法では、当然のことながら、標的遺伝子の特定及び塩基配列の決定が不可欠となっている。

ところで、本発明者らは、シロイヌナズナ由来のＡｔＥＲＦ３、ＡｔＥＲＦ４、ＡｔＥＲＦ７、及びＡｔＥＲＦ８タンパク質を転写因子に結合させたタンパク質が、遺伝子の転写を顕著に抑制するとの知見を得た。そこで、上記タンパク質をそれぞれコードする遺伝子及びこれから切り出したＤＮＡを含むエフェクタープラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより、実際に遺伝子の転写を抑制することに成功した（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３、及び特許文献４参照）。

さらに本発明者らは、Class II ＥＲＦ（ethylene responsive element binding factor）遺伝子群の一つであるタバコＥＲＦ３（例えば特許文献５参照）、イネＯｓＥＲＦ３タンパク質をコードする遺伝子（特許文献６参照）、及びＺｎフィンガータンパク（Zinc finger Protein）の遺伝子群の一つであるシロイナズナＺＡＴ１０、同ＺＡＴ１１をコードする遺伝子についてもまた、上記と同様な試験を行ったところ、遺伝子の転写を抑制することを見出している。

上記各遺伝子の塩基配列はまちまちであるが、これらの遺伝子がコードするタンパク質又はペプチドには、７つのアミノ酸からなる共通のモチーフが存在することを明らかにした（例えば非特許文献１、２参照）。

なお、このようなキメラ遺伝子を用いた遺伝子の転写抑制の技術は、上記と同様、幾つかの植物で報告されており（非特許文献３、４参照）、さらに動物でも報告されている（非特許文献５〜９）。
特開２００１−２６９１７７号公報（公開日：平成１３（２００１）年１０月２日）特開２００１−２６９１７８号公報（公開日：平成１３（２００１）年１０月２日）特開２００１−２９２７７６号公報（公開日：平成１３（２００１）年１０月２３日）特開２００１−２９２７７７号公報（公開日：平成１３（２００１）年１０月２３日）特開２００１−２６９１７６号公報（公開日：平成１３（２００１）年１０月２日）特開２００１−２６９１７９号公報（公開日：平成１３（２００１）年１０月２日） Ohta. M., Matsui. K., Hiratsu, K., Shinshi, H., and Ohme-Takagi, M., The Plant Cell, Vol.13, 1959-1968, August, 2001 Hiratsu. K., Ohta. M., Matsui. K., and Ohme-Takagi, M., FEBS letter, Vol.514, 351-354, 2002 Guan, X., Stege, J., Kim, M., Dahmani, Z., Fan, N., Heifetz, P., Barbas, C.F. III. and Briggs, S.P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.99, 13296-13301, 2002 Markel, H., Chandler, J. and Werr, W., Nuclelic Acids Res. Vol.30, 4709-4719. 2002 Badiani, P., Corbella, P., Kioussis, D., Marvel, J. and Weston, K., Genes Dev. Vol.8, 1994 Beerli, R.R., Segal, D.J., Dreier, B. and Barbas, C.F. III., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol.95, 14628-14633, 1998 Beerli, R.R., Dreier, B. and Barbas, C.F. III., Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Vol.97, 1495-1500, 2000 de Haan, G., Chusacultanachai, S., Mao, C., Katzenellenbogen, B.S. and Shapiro, D.J., J. Biol. Chem. Vol.275, 13493-13501, 2000 John, A., Smith, S.T. and Jaynes, J.B., Development Vol.121, 1801-1813, 1995

上記アンチセンス法又はリボザイム法等の転写制御方法では、上述したように、汎用性が欠ける、条件によっては再現性が低い、塩基配列まで特定された遺伝子にしか利用できない等の課題を有している。そのため、その用途が限られるといった問題点が生じる。

これに対して、本発明者らによって見出された、上記タンパク質から得られる知見を利用すれば、汎用性や再現性の向上を図ることが可能である。

従って、本発明は上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、従来のアンチセンス法又はリボザイム法のように標的遺伝子の塩基配列に合わせて、その都度ＤＮＡ又はＲＮＡの設計を行なう必要がなく、簡便でかつ広く適用可能な遺伝子の転写を抑制する技術と、その利用方法とを提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号４１）のアミノ酸配列からなる極めて単純な構造のペプチドが、上記遺伝子の転写を抑止するという事実を発見した。この知見に基づき、種々のアミノ酸配列からなるペプチドについて、さらに検討を重ねた結果、以下に記載するごとく単純な構造を有するペプチドが、転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するという驚くべき発見をし、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。

（Ａ）：次に示す一般式（１）
α¹−Ｌｅｕ−β¹−Ｌｅｕ−γ¹−Ｌｅｕ・・・（１）
（但し、式中α¹は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β¹は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ¹は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有しており、転写因子を転写抑制因子に変換するペプチド。

（Ｂ）：次に示す一般式（２）、（３）又は（４）
α¹−Ｌｅｕ−β¹−Ｌｅｕ−γ²−Ｌｅｕ・・・（２）
α¹−Ｌｅｕ−β²−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ・・・（３）
α²−Ｌｅｕ−β¹−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ・・・（４）
（但し、各式中α¹は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α²は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β¹は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β²はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ²はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有している上記（Ａ）のペプチド。

（Ｃ）：配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、３１、３４、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６９、７２又は７５で表されるアミノ酸配列を有しており、転写因子を転写抑制因子に変換するペプチド。

（Ｄ）：配列番号６３又は６６で表されるアミノ酸配列を有しており、転写因子を転写抑制因子に変換するペプチド。

（Ｅ）：上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）のペプチドと転写因子とを融合させてなることを特徴とするキメラタンパク質。

（Ｆ）：上記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）のペプチドをコードするポリヌクレオチド。

（Ｇ）：上記（Ｆ）のポリヌクレオチドと転写因子をコードする遺伝子とを連結してなるキメラ遺伝子。

（Ｈ）：上記（Ｆ）のポリヌクレオチドと、これに隣接する１つ以上の制限酵素認識部位とを含む組換え発現ベクター。

（Ｉ）：上記（Ｇ）のキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクター。

（Ｊ）：上記（Ｈ）又は（Ｉ）の組換え発現ベクターを導入した形質転換体。

（Ｋ）：上記組換え発現ベクターが導入されるホストが植物である（Ｊ）に記載の形質転換体。

（Ｌ）：上記（Ｆ）のポリヌクレオチドと、転写因子をコードする遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを得る工程と、
得られた組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して、転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドと転写因子とを融合させたキメラタンパク質を発現させる工程とを含んでいる遺伝子の転写抑制方法。

（Ｍ）：上記宿主が植物である上記（Ｌ）の遺伝子の転写抑制方法。

上記の構成によれば、これまで困難であった特定の遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。それゆえ、たとえば、癌遺伝子の発現抑制や植物の優良品種、新品種の作出等の広範な分野において有用な手段を提供することができる。

本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。

本発明は、少なくとも６つのアミノ酸残基からなるＥＡＲ（ＥＲＦ-associated Amphihilic Repression）モチーフを含むものである。このＥＡＲモチーフは極めて短いペプチドであるため、合成が容易であり、標的遺伝子の転写抑制を効率的に行なうことができる。そのため、本発明は、転写抑制を利用した様々な用途に用いることができる。

以降の説明では、本発明に係るＥＡＲモチーフ、その有用性、並びにその利用についてそれぞれ説明する。なお、以下の説明では、説明の便宜上、適宜略称を用いることがある。同じく説明の便宜上、例えば、配列番号Ｘで示されるアミノ酸配列を有するペプチドを、適宜、「配列番号Ｘのペプチド」と略すことがある。塩基配列についても同様である。

（Ｉ）ＥＡＲモチーフ
本発明者は、植物特異的なＥＲＦ転写因子群（非特許文献１参照）及びＴＦＩＩＩＡ−ＴｙｐｅＺｉｎｃＦｉｎｇｅｒ転写（ＳＵＰＥＲＭＡＮを含む、非特許文献２参照）の中で、転写抑制因子（リプレッサー）として機能する因子のカルボキシル基末端に共通して存在するアミノ酸配列を見出した。このアミノ酸配列、すなわちＥＡＲモチーフは、７〜１２のアミノ酸からなっている。さらに、本発明者は、これらＥＡＲモチーフの構造について鋭意検討した結果、新たに６つのアミノ酸からなる新規なＥＡＲモチーフを見出した。

＜ＥＡＲモチーフの構造＞
本発明に係る新規なＥＡＲモチーフは、具体的には、次に示す一般式（１）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。

α¹−Ｌｅｕ−β¹−Ｌｅｕ−γ¹−Ｌｅｕ・・・（１）
但し、上記式（１）中α¹は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β¹は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ¹は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。

なお、本発明では、上記一般式（１）で表されるペプチドを、便宜上、次に示す一般式（２）、（３）、（４）又は（５）で表されるアミノ酸配列を有しているペプチドに分類する。

α¹−Ｌｅｕ−β¹−Ｌｅｕ−γ²−Ｌｅｕ・・・（２）
α¹−Ｌｅｕ−β²−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ・・・（３）
α²−Ｌｅｕ−β¹−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ・・・（４）
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−β³−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ・・・（５）
但し、上記各式中、α¹は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、α²は、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示す。また、β¹は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β²はＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、β³は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ又はＧｌｎを示す。さらに、γ²は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。

本発明に係る新規なＥＡＲモチーフのより具体的な例としては、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、３１、３４、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６９、７２又は７５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。このうち、配列番号３１、３４、４５、５１、６９、７２又は７５のペプチドは、一般式（２）に示されるペプチドに相当し、配列番号１、１０、５４、５７又は６０のペプチドは、一般式（３）に示されるペプチドに相当し、配列番号１３、１６、１９、４２、又は４８のペプチドは、一般式（４）に示されるペプチドに相当し、配列番号４又は７のペプチドは、一般式（５）に示されるペプチドに相当する。

また、上記一般式（１）〜（５）に示されるペプチド以外にも配列番号６３又は６６が、ＥＡＲモチーフの例としてあげることができる。

後述する実施例に示すように、これらＥＡＲモチーフは、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有している。それゆえ、本発明に係るＥＡＲモチーフは、キメリックリプレッサーサイレンシング技術（ＣＲＥＳ−Ｔ）に利用することができる。

＜ＥＡＲモチーフをコードするポリヌクレオチド＞
上記ＥＡＲモチーフは、任意の転写因子をコードする遺伝子（説明の便宜上、転写因子遺伝子と称する）と連結することによりキメラ遺伝子を構築して、ホスト（宿主）細胞に導入することにより、当該転写因子を転写抑制因子に変換することができる。ここで、上記ＥＡＲモチーフをコードするポリヌクレオチド（説明の便宜上、ＥＡＲポリヌクレオチドと称する）の具体的な構成は特に限定されるものではなく、遺伝暗号表に基づいて、上記一般式（１）に示されるアミノ酸配列、配列番号６３、又は６６の配列のペプチドをコードする塩基配列を有していればよい。

上記ＥＡＲポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、７８、７９又は８０又はで表される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。

なお、配列番号１のペプチドは、配列番号８１又は８２の塩基配列にコードされており、配列番号４のペプチドは、配列番号８３又は８４の塩基配列にコードされており、配列番号７のペプチドは、配列番号８５又は８６の塩基配列にコードされており、配列番号１０のペプチドは、配列番号８７又は８８の塩基配列にコードされており、配列番号１３のペプチドは、配列番号８９又は９０の塩基配列にコードされており、配列番号１６のペプチドは、配列番号９１又は９２の塩基配列にコードされており、配列番号１９のペプチドは、配列番号９３又は９４の塩基配列にコードされており、配列番号３１のペプチドは、配列番号９５又は９６の塩基配列にコードされており、配列番号３４のペプチドは、配列番号９７又は９８の塩基配列にコードされており、配列番号４２のペプチドは、配列番号９９又は１００の塩基配列にコードされており、配列番号４５のペプチドは、配列番号１０１又は１０２の塩基配列にコードされており、配列番号４８のペプチドは、配列番号１０３又は１０４の塩基配列にコードされており、配列番号５１のペプチドは、配列番号１０５又は１０６の塩基配列にコードされており、配列番号５４のペプチドは、配列番号１０７又は１０８の塩基配列にコードされており、配列番号５７のペプチドは、配列番号１０９又は１１０の塩基配列にコードされており、配列番号６０のペプチドは、配列番号１１１又は１１２の塩基配列にコードされており、配列番号６３のペプチドは、配列番号１１３又は１１４の塩基配列にコードされており、配列番号６６のペプチドは、配列番号１１５又は１１６の塩基配列にコードされており、配列番号６９のペプチドは、配列番号１１７又は１１８の塩基配列にコードされており、配列番号７２のペプチドは、配列番号１１９又は７８の塩基配列にコードされており、配列番号７５のペプチドは、配列番号７９又は８０の塩基配列にコードされている。

なお、上記ＥＡＲポリヌクレオチドは、必要により、転写因子をコードする遺伝子と連結するための連結部位となる塩基配列を含むものであってもよい。また、上記一般式（１）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列のアミノ酸読み枠と転写因子をコードする遺伝子の読み枠とが一致しないような場合に、これらを一致させるための付加的な塩基配列を含むものであってもよい。

本発明では、例えば、後述する実施例で具体的に説明するように、上記ＥＡＲポリヌクレオチドとして、配列番号２、３、５、６、８、９、１１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、２１、３２、３３、３５、３６、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５５、５６、５８、５９、６１、６２、６４、６５、６７、６８、７０、７１、７３、７４、７６又は７７で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。これら塩基配列には、酵母ＧＡＬ４タンパク質ＤＮＡ結合ドメインをコードする塩基配列のアミノ酸読み枠と、ＥＡＲポリヌクレオチドの読み枠とを一致させるために、付加的な塩基配列を含んでいる。

なお、配列番号１のペプチドは、配列番号２又は３の塩基配列にコードされており、配列番号４のペプチドは、配列番号５又は６の塩基配列にコードされており、配列番号７のペプチドは、配列番号８又は９の塩基配列にコードされており、配列番号１０のペプチドは、配列番号１１又は１２の塩基配列にコードされており、配列番号１３のペプチドは、配列番号１４又は１５の塩基配列にコードされており、配列番号１６のペプチドは、配列番号１７又は１８の塩基配列にコードされており、配列番号１９のペプチドは、配列番号２０又は２１の塩基配列にコードされており、配列番号３１のペプチドは、配列番号３２又は３３の塩基配列にコードされており、配列番号３４のペプチドは、配列番号３５又は３６の塩基配列にコードされており、配列番号４２のペプチドは、配列番号４３又は４４の塩基配列にコードされており、配列番号４５のペプチドは、配列番号４６又は４７の塩基配列にコードされており、配列番号４８のペプチドは、配列番号４９又は５０の塩基配列にコードされており、配列番号５１のペプチドは、配列番号５２又は５３の塩基配列にコードされており、配列番号５４のペプチドは、配列番号５５又は５６の塩基配列にコードされており、配列番号５７のペプチドは、配列番号５８又は５９の塩基配列にコードされており、配列番号６０のペプチドは、配列番号６１又は６２の塩基配列にコードされており、配列番号６３のペプチドは、配列番号６４又は６５の塩基配列にコードされており、配列番号６６のペプチドは、配列番号６７又は６８の塩基配列にコードされており、配列番号６９のペプチドは、配列番号７０又は７１の塩基配列にコードされており、配列番号７２のペプチドは、配列番号７３又は７４の塩基配列にコードされており、配列番号７５のペプチドは、配列番号７６又は７７の塩基配列にコードされている。

なお、本発明における「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡであっても、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖であってもよい。

＜ＥＡＲモチーフおよびＥＡＲポリヌクレオチドの取得（生産）方法＞
本発明に係るＥＡＲモチーフの取得（生産）方法は特に限定されるものではなく、ＥＡＲモチーフを含むタンパク質からＥＡＲモチーフを切断して得てもよい。特に、本発明に係るＥＡＲモチーフは６つのアミノ酸残基からなっているので、シンセサイザーにより合成することでも容易に生産することができる。

同様に、本発明に係るＥＡＲポリヌクレオチドの取得（生産）方法も特に限定されるものではなく、ＥＡＲポリヌクレオチドを含む遺伝子からＥＡＲポリヌクレオチドのみを切断して得てもよいし、シンセサイザーにより合成して得てもよい。また、得られたＥＡＲポリヌクレオチドを鋳型としてＰＣＲ等により増幅することで、ＥＡＲポリヌクレオチドを大量に取得してもよい。

従来の転写制御方法であるアンチセンス法やリボザイム法等では、前述したように、特定の塩基配列の遺伝子にしか利用できないため汎用性が欠ける、条件によっては再現性が低い等の課題があった。

これに対して、本発明では、転写因子を転写抑制因子に換えるため、その転写制御下の遺伝子であれば特に限定されることなく、効率的にその転写を抑制することが可能である。またＥＡＲモチーフが短いペプチドであるため、その合成が容易である。それゆえ、転写抑制方法としての汎用性や利便性を高めることが可能となる。また、本発明では、リボザイム法のように、余分な配列が付加されてリボザイム活性が失われるといった事態も回避されるので、再現性が低くなる等の課題も回避することができる。

（ＩＩ）ＥＡＲモチーフの有用性
本発明に係るＥＡＲモチーフ又はＥＡＲポリヌクレオチドを用いれば、各種遺伝子の転写抑制方法に好適に利用することができる。すなわち、本発明を用いることで、特定の遺伝子の転写を抑制することが可能となるので、新規な植物の創出等植物への応用が可能となり、さらには、ガン遺伝子の転写抑制によるヒトも含む動物への応用の可能性も見出すことができる。

＜植物における転写抑制の例＞
本発明に係る転写制御方法の一例としては、各種植物の転写因子を転写抑制因子（リプレッサー）に変換する例を挙げることができる。

具体的な転写因子としては、例えば、ＥＩＮ３タンパク質（Chao. Q., Rothenberg. M., Solano. R., Roman. G., Terzaghi. W., Echer. J. R., Cell, Vol.89, 1133-1144, 1997参照）、ＣＵＣ１タンパク質（Takada. S., Hibara. K., Ishida. T., Tasaka. M., Development Vol.128, 1127-1135, 2001参照）・ＣＵＣ２タンパク質（Aida. M., Ishida. T., Fukaki. H., Fujisawa. H., Tasaka. M., Plant Cell, Vol.9, 841-857, 1997参照）、ＰＡＰ１タンパク質（Borevitz. J. O., Xia. Y., Blount. J., Dixon. R. A., Lamb. C., Plant Cell, Vol.12, 2383-2393, 2000参照）、ＡｔＭＹＢ２３タンパク質（Kirik. V., Schnittger. A., Radchuk. V., Alder. K., Hulskamp. M., Baumlein. H., Development Biology Vol.235, 366-377, 2001参照）等を挙げることができる。

上記各転写因子のリプレッサーへの変換は、本発明に係るＥＡＲポリヌクレオチドと、これら転写因子をコードする転写因子遺伝子とを連結させて、最終的にキメラタンパク質（キメラリプレッサー）を作製することにより実現される。

より具体的に説明すると、上記転写因子遺伝子のアミノ酸コード領域を、開始コドンＡＴＧを含むプライマーおよび終始コドンを除くように設計したプライマーを用いて増幅し、ＤＮＡ断片を得る。これにＥＡＲモチーフを含むペプチドをコードする相補鎖ＤＮＡ（ＥＡＲポリヌクレオチド）を合成し、２本鎖にしたものとライゲーションする。このＤＮＡ断片を、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓタンパク質遺伝子のプロモーター（３５Ｓと略す）と、Ｎｏｓターミネーターを組み込んだ植物形質転換ベクターに挿入する。これによって、キメラリプレッサーを発現するプラスミドを構築する。このプラスミドを用いてホストとなる植物、例えばシロイヌナズナを形質転換する。

上記各転写因子のキメラリプレッサーを発現させた植物体についての具体的な結果を次に示す。なお、以下の結果では、説明の便宜上、例えば、ＥＩＮ３タンパク質のキメラリプレッサーをＥＩＮ３リプレッサーと略す。他の転写因子も同様である。

(a)ＥＩＮ３タンパク質の場合
植物ホルモンであるエチレン存在下で植物を生育させると、細胞伸張が抑制され、結果として矮性の植物となる。転写因子ＥＩＮ３タンパク質はエチレンのシグナル伝達を制御する機能を有している。それゆえ、ＥＩＮ３リプレッサーを発現させた植物は、エチレンに対して感受性を持たない植物体となる。同時に、ＥＩＮ３で制御されていた遺伝子の発現が抑制される。

(b)ＣＵＣ１タンパク質（ＣＵＣ２タンパク質も含む）の場合
ＣＵＣ１タンパク質およびＣＵＣ２タンパク質は、何れも転写因子として機能的に重複している。それゆえ、ＣＵＣ１リプレッサーを発現した植物は、ＣＵＣ１タンパク質及びＣＵＣ２タンパク質が制御する遺伝子の発現を、これら内在性の転写因子に優先して抑制する。その結果、ＣＵＣ１遺伝子およびＣＵＣ２遺伝子がともに不活性なＣＵＣ１／ＣＵＣ２二重変異体と同様な表現型が発現する。この表現型は、子葉が融合したcup shaped cotyledon型の表現型となる。

(c)ＰＡＰ１タンパク質の場合
ＰＡＰ１タンパク質は、フェニルプロパノイド合成関連遺伝子の発現を活性化させる転写因子である。フェニルプロパノイド合成関連遺伝子としては、例えば、ＣＨＳ遺伝子、ＰＡＬ遺伝子、ＤＦＲ遺伝子等が挙げられ、これら遺伝子の発現はストレス存在下で上昇する。ＰＡＰ１リプレッサーを発現した植物は、野生型では見られる、ストレス存在下でのＣＨＳ遺伝子、ＰＡＬ遺伝子、ＤＦＲ遺伝子等の発現上昇が見られない。また、ＰＡＰ１リプレッサーを発現した植物は、３％のショ糖存在下で生育させた場合に野生型植物で観察されるアントシアニンの蓄積も起こらない。

(d)ＡｔＭＹＢ２３タンパク質の場合
ＡｔＭＹＢ２３タンパク質は、葉の表面で発達するトリコームの発生に関連する転写因子であると考えられている。ＡｔＭＹＢ２３リプレッサーを発現した植物は、野生型では見られるトリコームが無い植物体となる。また、トリコーム発生に関与している遺伝子の内、ＧＬ２遺伝子の発現抑制に関わっていることが明らかになった。

＜産業上の有用性＞
このように、本発明は、これまでの技術では困難であった遺伝子の発現抑制を可能とする技術である。それゆえ、本発明を用いれば、遺伝子を発現させないことによって有用な効果をもたらす各種産業分野に利用することが可能となる。

具体的には、植物を用いた産業分野としては、例えば、本発明を用いてエチレン非感受性植物、すなわち枯れにくい植物や切り花を創製する用途を挙げることができる。

また、これまでにない色・形をもつ植物や園芸作物や、特定のタンパク質の含量を抑制した植物を創製することも可能となる。例えば、色素代謝系の酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することによって、これまでには得られなかった色違いの花弁を有する花を創製することが可能になる。また、アレルゲンとなるタンパク質の発現を抑制することで、アレルゲンの少ない食物（例えば、低アレルゲン米）を創製することが可能になる。また、特定のタンパク質の発現を抑制することで、雑味の無い米（吟醸米等）を創製することも可能となる。

さらには、本発明を用いて、リグニン合成の遺伝子の発現を抑制することもできる。これによって、リグニン含量の少ない木を創製し、高品質のパルプを生産することも可能となる。

さらに本発明は、有用物質等の効率的生産への応用が可能である。植物が産生する二次代謝物質には、医療分野、食糧分野並びに工業的応用に有用とされている物質が数多く存在する。例えば、フラボノイドおよびテルペノイドの一部は、健康を促進する食品として、またある種のアルカロイドは、薬理作用を持つことが知られ、医薬品として利用されている。

植物の二次代謝産物の生合成経路を人為的に操作し、目的とする物質の収量を増加させる試みは、これまでにも多くなされている。しかし、多くの場合は、目的の物質生合成に関わる合成酵素を強発現させる等の方法であり、収量も十数パーセントの増加といったもので高効率の物質生産に結びつかないものが多い（Sato et al., PNAS, 98, 367-372 (2001)参照）。

このような問題を解決し、目的とする植物の二次代謝産物をより効率的且つ簡便に生産する方法においても本発明を応用することが可能である。

その手法の一例を図１に示した。これはシロイヌナズナにおけるAnthocyanins, Flavonols およびProanthocyanidinsといったフラボノイド生合成経路を示している（Plant Cell, 13, 2099-2114 (2001): Nesi et al. から引用）。

例えば、Flavonolsのみを選択的に大量に生産したい場合、 AnthocyaninsやProanthocyanidinsに分岐する経路に関わる酵素を制御する遺伝子を本発明により抑制する。つまり、TT2やTT8といった転写因子を、本発明を用いてレプレッサーに変換させ、dihyfroflavonolsをleucoanthocyanidinsに変換する酵素であるDFR(dihydroflavonol4-reductase)の発現を抑制する。このことによりフラボノイド生合成経路の中間産物であるdehydroflavonolsが、AnthocyaninsやProanthocyanidins生合成に利用されず、図１の矢印で示すように、より選択的にFlavonols生合性系に利用されるといった手法である。

つまり、生合成に関わる初期物質を増やしてやれば（インプット量）効率的および計画的に目的物質（アウトプット）を得ることができると考えられる。

上述した例では、主に、植物を用いた産業分野を挙げたが、本発明はもちろんこれに限定されるものではなく、動物を用いた産業分野にも好適に用いることができる。

具体的には、例えば、医薬産業・医療産業分野の一例として、ガン遺伝子抑制が挙げられる。動物において遺伝子の発現抑制に関与する他の因子を同定し、それらの複合体（キメラリプレッサー）を作製して動物細胞に作用させれば、より特異的な制ガン効果が期待できる。特に、本発明に係るＥＡＲモチーフおよびキメラリプレッサーは、植物由来であり動物には存在しないので、この特異性を利用すれば動物に内在する因子と競合せず、標的遺伝子あるいは細胞（ガン等）に対する特異性を向上させることも可能となる。

（ＩＩＩ）ＥＡＲモチーフの利用
本発明に係るＥＡＲモチーフの具体的な利用方法は特に限定されるものではないが、上記（ＩＩ）の項で述べた有用性から明らかなように、例えば、次に示すような利用方法を挙げることができる。
（ア）ＥＡＲモチーフと転写因子とを融合させてなるキメラタンパク質。
（イ）ＥＡＲポリヌクレオチドと転写因子遺伝子とを連結してなるキメラ遺伝子。
（ウ）ＥＡＲポリヌクレオチドと、これに隣接する１つ以上の制限酵素認識部位とを含む組換え発現ベクター。
（エ）上記（ウ）のキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクター。
（オ）上記（ウ）又は（エ）の組換え発現ベクターを導入した形質転換体。
（カ）上記組換え発現ベクターが導入されるホストが植物である形質転換体、すなわち形質転換植物。

＜キメラタンパク質＞
上記キメラタンパク質は、公知の方法で作製・生産することができるが、一般的には、上記キメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを用いて、ホスト（宿主）細胞中で発現させることにより容易に生産することができる。したがって、本発明に係るキメラタンパク質を用いる場合、任意のホストを選択することによって、キメラタンパク質を大量に発現・生産させて、これを回収して本発明に係るキメラタンパク質として用いてもよいし、最初から上記組換え発現ベクターをホスト細胞に導入することで、細胞内で発現させる形で用いてもよい。

また、上記キメラタンパク質には、付加的なポリペプチドが含まれていてもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、HisやMyc、Flag等によって上記キメラタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。

＜組換え発現ベクター＞
上記組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、上記組換え発現ベクターには、種々のＤＮＡセグメントが含まれていてもよい。ＤＮＡセグメントとしては、例えば、キメラタンパク質を発現させるために公知のプロモーターを含んでいると好ましい。また、必要に応じてターミネーターを含んでいてもよい。

さらに、ＥＡＲポリヌクレオチドのみを含タイプの組換え発現ベクターであれば、ＤＮＡセグメントとして、ＥＡＲポリヌクレオチドに隣接する位置に、マルチクローニングサイトのような制限酵素認識部位が設けられていればよい。これによって、後に任意の転写因子遺伝子を導入することで、キメラ遺伝子を含む組換え発現ベクターを構築することができる。

上記組換え発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌細胞内で増殖させればよい。このときベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。

＜形質転換体＞
上記形質転換体は、上記キメラタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体であればよい。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。従って、本発明に係る形質転換体には、上記キメラ遺伝子を含む上記組換え発現ベクターをホストとなる各種生物に導入したものを挙げることができる。

上記「形質転換体」とは、細胞のみならず、各種生物の組織・器官、さらには植物や動物等の個体も含む意味である。対象となる生物としては、特に限定されるものではなく、例えば、未知の遺伝子又は塩基配列の特定されていない遺伝子を標的として転写抑制により機能を解析する用途であれば、どのような生物あってもよい。実験用に用いられる生物としては、植物であればシロイヌナズナ等を、動物であれば、マウス、ラット、ショウジョウバエ、線虫等を挙げることができる。

あるいは、前述した植物を用いた産業分野に本発明を適用する場合、各種作物（農林水産業で生産される植物、農作物）を挙げることができる。具体的には、例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ等の穀物；各種野菜・花卉類；マツ、スギ、ヒノキ等の材木類；等を挙げることができる。さらに、医薬産業・医療産業分野では、ヒト又はヒト由来の培養細胞等を対象とすることもできる。

＜転写抑制方法＞
本発明には、上記ＥＡＲモチーフをコードするＥＡＲポリヌクレオチドを用いて実施される遺伝子の転写抑制方法も含まれる。より具体的には、本発明に係る転写抑制方法には、上記ＥＡＲポリヌクレオチドと、転写因子遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを得る工程（組換え発現ベクター作製工程）と、得られた組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して、転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドと転写因子とを融合させたキメラタンパク質を発現させる工程（キメラタンパク質発現工程）とを含んでいればよい。

上記発現ベクター作製工程の具体的な方法は特に限定されるものではなく、ＥＡＲポリヌクレオチドおよび転写因子遺伝子、並びにプロモーター等のＤＮＡセグメントを公知のベクターに公知の方法で導入すればよい。また、得られた組換え発現ベクターを増殖する方法も特に限定されるものではなく、大腸菌等をホストとして用いて公知の方法により増殖すればよい。

上記キメラタンパク質発現工程の具体的な方法も特に限定されるものではなく、ホストの種類に応じた適切な形質転換方法を用いて、上記組換え発現ベクターをホストに導入すればよい。本発明では、ホスト（宿主）として特に植物を好ましく用いることができるが、この場合の形質転換方法も特に限定されるものではなく、パーティクルガンによる方法、プロトプラスト／スフェロプラスト法、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。

本発明にかかる遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとしてホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明にかかるタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ(Green Fluorescent Protein)をマーカーとして用い、本発明にかかるタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。さらに、上記組換え発現ベクターには、形質転換植物における発現部位を可視化してモニターするための遺伝子を導入することもできる。このような遺伝子の一例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を挙げることができる。

なお、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。それゆえ、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以下、本発明を実施例および図２〜図４に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

以下の実施例においては、種々の合成した遺伝子断片について、酵母のＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードしている領域と連結し、さらに植物細胞で機能するカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの下流につないで、エフェクタープラスミドを構築するとともに、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターのエンハンサー領域とＧＡＬ４タンパク質結合ＤＮＡ配列とさらにカリフラワーモザイクウィルス３５ＳプロモーターのＴＡＴＡ領域をプロモーター領域に結合した、ルシフェラーゼ遺伝子からなるレポーター遺伝子を構築し、これらエフェクターとレポーター遺伝子を同時に、シロイヌナズナ葉にパーティクルガンを用いて導入し、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子の活性を測定することによって調べたものである。

〔実施例１：転写抑制因子として機能するペプチド配列の同定〕
〔エフェクタープラスミドpGAL4DBD-RDの構築〕
図２に示すように、クローンテック社製(Clontech社,米国)のプラスミドpBI221を制限酵素XhoIとSacIで切断し、Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端処理した後、アガロースゲル電気泳動でＧＵＳ遺伝子を除き、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（以下ＣａＭＶ３５Ｓと略す）とノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域（Ｎｏｓターミネーター、以下Ｎｏｓ−ｔｅｒと略す）を含む３５Ｓ−Ｎｏｓプラスミド断片ＤＮＡを得た。

クローンテック社製のpAS2-1ベクターを制限酵素HindIIIで消化し、酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合領域(1−１４７アミノ酸残基)をコードする７４８ｂｐのＤＮＡ断片（以下GAL4DBDと称する）をアガロースゲル電気泳動によって単離した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理をした。このGAL4DBDを含むＤＮＡ断片を、上記ＣａＭＶ３５ＳとＮｏｓ−ｔｅｒと間の平滑末端にした部位に挿入し、ＣａＭＶ３５Ｓに対して酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合領域のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が順方向に並んでいるものを選抜してp35S-GAL4DBDベクターを構築した。

GAL4DBDのアミノ酸読み枠と、読み枠（フレーム）が一致するように設計した調査対象ペプチドをコードする両鎖のＤＮＡを合成した。以下に合成したアミノ酸配列と、それらがコードしている塩基配列を示す。

アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１）
配列番号１に対応する塩基配列：
AGATCTAAACCTCCGTCTGTAAG（配列番号２）
TCGACTTACAGACGGAGGTTTAGATCT（配列番号３）
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号４）
配列番号４に対応する塩基配列：
AGATCTAGACCTCCGTCTGTAAG（配列番号５）
TCGACTTACAGACGGAGGTCTAGATCT（配列番号６）
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号７）
配列番号７に対応する塩基配列：
AGATCTACAGCTCCGTCTGTAAG（配列番号８）
TCGACTTACAGACGGAGCTGTAGATCT（配列番号９）
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ―Ｌｅｕ（配列番号１０）
配列番号１０に対応する塩基配列：
AGATCTACGACTCCGTTTGTAAG（配列番号１１）
TCGACTTACAAACGGAGTCGTAGATCT（配列番号１２）
アミノ酸配列：Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１３）
配列番号１３に対応する塩基配列：
AGAGCTAGAACTCCGTTTGTAAG（配列番号１４）
TCGACTTACAAACGGAGTTCTAGCTCT（配列番号１５）
アミノ酸配列：Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１６）
配列番号１６に対応する塩基配列：
AAACCTAGAACTCCGTTTGTAAG（配列番号１７）
TCGACTTACAAACGGAGTTCTAGGTTT（配列番号１８）
アミノ酸配列：Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１９）
配列番号１９に対応する塩基配列：
ACAGCTAGAACTCCGTTTGTAAG（配列番号２０）
TCGACTTACAAACGGAGTTCTAGCTGT（配列番号２１）
アミノ酸配列：Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号２２）
配列番号２２に対応する塩基配列：
ACGACTAGAACTCCGTTTGTAAG（配列番号２３）
TCGACTTACAAACGGAGTTCTAGTCGT（配列番号２４）
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（配列番号２５）
配列番号２５に対応する塩基配列：
AGATCTAGAACTCGAGTTGTAAG（配列番号２６）
TCGACTTACAACTCGAGTTCTAGATCT（配列番号２７）
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ（配列番号２８）
配列番号２８に対応する塩基配列：
AGATCTAGAACTCGACTTGTAAG（配列番号２８）
TCGACTTACAAGTCGAGTTCTAGATCT（配列番号２９）
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ（配列番号３１）
配列番号３１に対応する塩基配列：
AGATCTAGAACTCAACTTGTAAG（配列番号３２）
TCGACTTACAAGTTGAGTTCTAGATCT（配列番号３３）
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ（配列番号３４）
配列番号３４に対応する塩基配列：
AGATCTAGAACTCCAGTTGTAAG（配列番号３５）
TCGACTTACAACTGGAGTTCTAGATCT（配列番号３６）
アミノ酸配列：Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番４２）
配列番号４２に対応する塩基配列：
AACGCTTGAATTAAGACTCTAAG(配列番号４３)
TCGACTTAGAGTCTTAATTCAAGCGTT（配列番号４４）
アミノ酸配列：Ａｓｐ− Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ（配列番号４５）
配列番号４５に対応する塩基配列：
AGATCTTGAATTAACGCTCTAAG（配列番号４６）
TCGACTTAGAGCGTTAATTCAAGATCT（配列番号４７）
アミノ酸配列：Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号４８）
配列番号４８に対応する塩基配列：
（配列番号４９）AAGCCTTGAATTAAGACTCTAAG
（配列番号５０）TCGACTTAGAGTCTTAATTCAAGGCTT
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（配列番号５１）
配列番号５１に対応する塩基配列：
AGATCTTGAATTAAGCCTCTAAG（配列番号５２）
TCGACTTAGAGGCTTAATTCAAGATCT（配列番号５３）
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号５４）
配列番号５４に対応する塩基配列：
AGATCTTACCTTAAGACTCTAAG（配列番号５５）
TCGACTTAGAGTCTTAAGGTAAGATCT（配列番号５６）
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号５７）
配列番号５７に対応する塩基配列：
AGATCTTAGCTTAAGACTCTAAG（配列番号５８）
TCGACTTAGAGTCTTAAGCTAAGATCT（配列番号５９）
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号６０）
配列番号６０に対応する塩基配列：
AGATCTTCACTTAAGACTCTAAG（配列番号６１）
TCGACTTAGAGTCTTAAGTGAAGATCT（配列番号６２）
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号６３）
配列番号６３に対応する塩基配列：
AGATCTCGAATTTCGTCTCTAAG（配列番号６４）
TCGACTTAGAGACGAAATTCGAGATCT（配列番号６５）
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号６６）
配列番号６６に対応する塩基配列：
AGATTTCGAACTACGTCTCTAAG（配列番号６７）
TCGACTTAGAGACGTAGTTCGAAATCT（配列番号６８）
アミノ酸配列：Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（配列番号６９）
配列番号６９に対応する塩基配列：
ATCGCTTGATCTACACCTGTAAG（配列番号７０）
TCGACTTACAGGTGTAGATCAAGCGAT（配列番号７１）
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号７２）
配列番号７２に対応する塩基配列：
AGATCTTACGCTAAAGCTGTAAG（配列番号７３）
TCGACTTACAGCTTTAGCGTAAGATCT（配列番号７４）
アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号７５）
配列番号７５に対応する塩基配列：
AGATCTTAGCCTAAAGCTGTAAG（配列番号７６）
TCGACTTACAGCTTTAGGCTAAGATCT（配列番号７７）
上記各ペプチドをコードするＤＮＡ断片（前記ＥＡＲポリヌクレオチド又はその候補）を、制限酵素SmaIとSalIで予め消化しておいたp35S-GAL4DBDベクターに組み込み、各p35S-GAL4DBDにつないだエフェクタープラスミドを構築した。

〔35S-GAL4-LUCレポーター遺伝子の構築〕
図３に示すように、プラスミドpUC18を制限酵素EcoRIとSstIで消化した。次に、pBI221プラスミド（クローンテック社）を制限酵素EcoRIとSstIで消化し、Ｎｏｓ−ｔｅｒを含む２７０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって単離した。得られた断片を制限酵素EcoRIとSstIで消化しておいたプラスミドpUC18のEcoRI-SstI部位に挿入した。ＣａＭＶ３５ＳのＴＡＴＡボックスを含む相補鎖のＤＮＡ１（配列番号３７）及びＤＮＡ２（配列番号３８）を合成した。
ＤＮＡ１：AGCTTAGATCTGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTG（配列番号３７）
ＤＮＡ２：GATCCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCAGATCTA（配列番号３８）
合成したＤＮＡを９０℃で２分加熱した後、６０℃で１時間加熱し、その後室温（２５℃）で２時間静置してアニーリングさせ２本鎖を形成させた。次に、Ｎｏｓ−ｔｅｒを持つpUC18プラスミドを制限酵素HindIIIとBamHIで消化した。合成した２本鎖ＤＮＡをpUC18のHindIII−BamHI部位に挿入し、ＴＡＴＡ−ＢｏｘとＮｏｓ−ｔｅｒを含むプラスミドを構築した。このプラスミドを制限酵素SstIで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。

ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）をもつプラスミドベクターpGV-CS2（商品名：東洋インキ社製）を制限酵素XbaIとNcoIで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動によって、ルシフェラーゼ遺伝子を含む１．６５ｋｂのＤＮＡ断片を単離精製した。このＤＮＡ断片を上記のＴＡＴＡボックスとＮｏｓ−ｔｅｒを含むプラスミドに挿入しpTATA-LUCレポーター遺伝子を構築した。

次に、図４に示すように、酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列を５コピー持つプラスミドpG5CAT（商品名：クローンテック社製）を制限酵素SmaIとXbaIで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、５コピーのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列含むＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。pTATA-LUCベクターを制限酵素BglIIで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。この部位に平滑末端化した５コピーのＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列含むＤＮＡ断片を挿入し、得られたプラスミドのうちＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合配列が順方向に向いているものを選抜し、レポーター遺伝子pGAL4-LUCを構築した。

プラスミドpBI121を鋳型としてＰＣＲを行い、ＣａＭＶ３５Ｓの塩基配列のうち−８００〜−４６番目の領域を含むＤＮＡ断片を得た。このときＰＣＲに用いた５末アッパープライマー（プライマー１、配列番号３９）及び３末ローワープライマー（プライマー２、配列番号４０）を次に示す。
プライマー１：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号３９）
プライマー２：AAGGGTAAGCTTAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATC（配列番号４０）
上記ＤＮＡ断片を制限酵素HindIIIで消化した後、上記−８００〜−４６番目の領域を含む７６０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって単離した。このHindIII断片を、あらかじめ制限酵素HindIIIで消化しておいたレポーター遺伝子pGAL4-LUCに挿入し、ＣａＭＶ３５ＳプロモーターＤＮＡが順方向に向いているものを選抜し、p35S-GAL4-LUCレポーター遺伝子を構築した。

〔リファレンス遺伝子pPTRLの構築〕
ウミシイタケ由来のルシフェラーゼ遺伝子をもつカセットベクター pRL-null（商品名：プロメガ社製）を制限酵素NheIとXbaI制限酵素で切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動でウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子を含む９４８ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。このＤＮＡ断片をエフェクタープラスミドの構築の際に用いたＧＵＳ遺伝子を除いたpBI221ベクターのＧＵＳ遺伝子があった領域に挿入した。得られたプラスミドのうち、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子が順方向に向いているものを選抜した。

〔レポーター遺伝子の活性測定法〕
シロイヌナズナに、レポーター遺伝子とエフェクタープラスミドをパーティクルガン法にて導入し、エフェクターの効果を、レポーター遺伝子の活性を測定することによって調べた。

〔パーティクルガンによる遺伝子導入〕
pGAL4-LUCレポーター遺伝子１．６μｇと、エフェクタープラスミドのＤＮＡを１．２μｇと、リファレンス遺伝子プラスミド０．３２μｇを直径１μｍの金粒（バイオラッド社製）５１０μｇにコーティングした。生育期間２１日目のシロイヌナズナ葉４〜７枚を、水でしめらせた濾紙をおいた９ｃｍシャーレにならべ、バイオラッド社製ＰＤＳ−１０００／Ｈｅボンバートメント機をもちいてＤＮＡを打ち込んだ。なお、バイオラッド社製ＰＤＳ−１０００／Ｈｅボンバートメントを用いたシロイヌナズナ葉へのDNAの導入は、以下の条件でおこなった。金粒子を葉に導入するためのガス圧を調節するラプチャーディスクは、１１００ｐｓｉ用をもちいた。金粒子を打ち込むシロイヌナズナの葉を並べたサンプル台は、ラプチャーディスクの位置より約２０ｃｍ下の位置にセットするため、器機の高さを調節する段の下から3段目に設置した。それ以外の条件は、器機の操作マニュアルに従った。金粒子を打ち込んだ葉は２２℃、６時間明所で静置した後、レポーター遺伝子の活性を測定した。

〔ルシフェラーゼ活性測定〕
６時間静置したシロイヌナズナ葉を、液体窒素中で粉砕し、Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System （プロメガ社製）に添付されているPassive Lysis Buffer２００μｌに懸濁した後、遠心して上清を回収した。この細胞抽出液２０μｌをDual-LuciferaseTM Reporter Assay System（プロメガ社製）に添付されている測定バッファー１００μｌに混合し、ルミノメーター（TD20/20,Turener Design社製）を用いてルシフェラーゼ活性測定を行った。ホタル・ルシフェラーゼ及びウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を、測定キットの説明書に従って１０秒間の発光を積分モードでカウントして測定した。リファレンス遺伝子の活性値をレポーター遺伝子の活性値で割り、その相対値であるRelative lucifarase activityを測定値として求めた。

実験は、エフェクタープラスミドの種類ごと３回個別にトランジェントアッセイ実験を行い、平均値と標準偏差を求めた。エフェクタープラスミドを入れない場合の、p35S-GAL4-LUCレポーター遺伝子の活性の相対値を１００として、エフェクタープラスミドを同時に細胞に導入したときにレポーター遺伝子の活性値の変動によってエフェクターの効果を調査した。

すなわち、p35S-GAL4-LUCレポーター遺伝子と各ペプチド配列のＤＮＡを組み込んだpGAL4DBD-RDエフェクタープラスミドを導入したとき、レポーターの活性値が減少すれば、そのペプチドは、レポーター遺伝子の活性を抑制する効果（リプレッサー機能）があることを示している。以下、レポーターの活性値を測定して、p35S-GAL4-LUCレポーターの相対活性値が１００以下になる場合に、導入したエフェクターにはリプレッサー機能が存在するので、どのエフェクターがリプレッサーとして機能するのかをレポーターの活性を測定することによって調べた。

〔リプレッサードメインの同定〕
上記に示した、ペプチド配列のうち、転写抑制効果をもつペプチドを解析するため、レポーター遺伝子p35S-GAL4-LUCとGAL4 DNA結合ドメインと結合したペプチドのエフェクタープラスミドを、パーティクルガンを用いてシロイヌナズナ葉に導入し、レポーター遺伝子の活性を調べた。その結果を表１に示す。

以上の結果から、上記Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号４）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号７）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ―Ｌｅｕ（配列番号１０）、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１３）、Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１６）、Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１９）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ（配列番号３１）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ（配列番号３４）、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番４２）、Ａｓｐ− Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ（配列番号４５）、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号４８）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ（配列番号５１）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号５４）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号５７）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号６０）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号６３）、Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号６６）、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（配列番号６９）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号７２）、Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（配列番号７５）なるペプチド配列が、レポーター遺伝子の活性を、エフェクターを導入しないレポーター遺伝子のみの場合（コントロール）に比べ、４８％〜９８％減少させる。よって、次に示す一般式（１）
α¹−Ｌｅｕ−β¹−Ｌｅｕ−γ¹−Ｌｅｕ・・・（１）
（但し、式中α¹は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示し、β¹は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ又はＨｉｓを示し、γ¹は、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｓｐを示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、および配列番号６３と６６のアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが、転写抑制能を持つ機能ペプチドとして作用することを証明した。コントロール実験としておこなったペプチド配列を含まないp35S-GAL4DBDは、レポーター遺伝子の活性を低下さなかった。このことは、GAL4DNA結合ドメインに結合したペプチドが、転写を抑制するリプレッサーとして機能していることを示している。

本発明の転写因子を転写抑制因子に変換する機能を有するペプチドは、極めて短いサイズであるため、その合成は極めて簡単であり、しかも効果的に遺伝子の転写を抑制することができるという効果を奏する。

その結果、本発明では、特定の遺伝子の転写を制御することによって、研究用試薬や試料等の生産に関わる産業分野に好適に用いることができるだけでなく、例えば、生物の品種改良、種苗産業、家畜水産業等の応用可能性が見いだされ、さらには医学的・薬学的な分野の応用可能性も見出される。

本発明において、産業上の有用性の一例として、シロイヌナズナにおけるフラボノイド生合成経路の概要を示す模式図である。試験対象の各種ＤＮＡ断片を含むpGAL4DBD-RDエフェクタープラスミドを構築する手順を示す工程図である。レポーター遺伝子p35S-GAL4-LUCを構築する手順の前半部を示す工程図である。レポーター遺伝子p35S-GAL4-LUCを構築する手順の後半部を示す工程図である。

Claims

配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、３１、３４、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６９、７２又は７５で表されるアミノ酸配列を有しており、転写因子を転写抑制因子に変換するペプチド。
請求項１に記載のペプチドと転写因子とを融合させてなることを特徴とするキメラタンパク質。
請求項１に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項３に記載のポリヌクレオチドと転写因子をコードする遺伝子とを連結してなるキメラ遺伝子。
請求項３に記載のポリヌクレオチドと、これに隣接する１つ以上の制限酵素認識部位とを含む組換え発現ベクター。
請求項４に記載のキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクター。
請求項５又は６に記載の組換え発現ベクターを導入した形質転換体。
上記組換え発現ベクターが導入されるホストが植物である請求項７に記載の形質転換体。
請求項３に記載のポリヌクレオチドと、転写因子をコードする遺伝子と、プロモーターとを含む組換え発現ベクターを得る工程と、
得られた組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して、転写因子を転写抑制因子に変換するペプチドと転写因子とを融合させたキメラタンパク質を発現させる工程とを含んでいることを特徴とする遺伝子の転写抑制方法。
上記宿主が植物であることを特徴とする請求項９に記載の遺伝子の転写抑制方法。