KR20010081917A - 구성적 식물 프로모터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상보적 발현 형태를 가지는 프로모터 세트의 요소로부터 만들어진 새로운 프로모터에 관한 것이다.

Description

구성적 식물 프로모터 {Constitutive Plant Promoters}

두가지 발견, 즉 첫째로는 이종 유전 물질로 식물 세포를 형질전환하는 가능성(박테리아인 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)또는 관련 균주에 의한 형질전환이 가장 효율적임)의 발견 및 둘째로는 이종 유전 물질을 발현시킬 수 있는 식물 프로모터의 존재의 발견에 의해 식물 유전공학이 가능하게 되었다.

통상의 식물 프로모터는 특이적 요소들로 이루어진다. 전사를 개시할 수 있는 최소 프로모터 요소로 기초가 형성되고, 여기에 흔히 전사 개시 요소의 결합 부위 역할을 하는 서열인 TATA-박스라고도 불리는 서열이 수반된다. 대부분의 프로모터에서, 이 TATA-박스의 존재는 적합한 전사 개시에 중요하다. 통상적으로 TATA-박스는 전사 개시 부위에서 상류로 35 내지 25번 염기쌍(bp)에 위치한다. 이 프로모터의 다른 부분은 DNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 요소로 이루어져 있다. 6개의 뉴클레오티드인 CACGTG 모티프를 토대로 한 G-박스 결합 요소가 알려져 있다. 이 요소는 결합하여 이합체를 이루는 bZIP DNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 것으로 알려져 있다[존슨(Johnson) 및 맥나이트(Mcknight)의 문헌[Ann. Rev. Biochem,58, 799-839, 1989]]. 다른 G-박스 관련 모티프, 예를 들어 Iwt 및 PA 모티프가 개시되어 있다(WO 94/12015). 이 모티프는 식물의 조직-특이적 프로모터 발현에 관여하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어 Iwt 사합체의 존재는 배-특이적인 발현을 나타내는 반면, PA 사합체의 존재는 높은 수준의 뿌리 발현, 낮은 수준의 잎 발현을 부여하나 종자 발현은 나타내지 않는다. 또한, GT-1 유사 결합 부위(보통의 컨센서스 서열인 GGT^A/pA를 기준으로 분류함)도 개시되어 있다. 이 결합 부위는 흰꽃다지(Arabidopsis) 플라스토시아닌 프로모터의 훨씬 상류 프로모터 영역에 있고 주간의 전사 활성화에 관여하는 것으로 보인다[피셔(Fisscher, U) 등의 문헌[Plant Mol. Biol.26, 873-886, 1994]].

식물 프로모터에서 흔히 발견되는 또다른 서열-관련 현상은 Z-DNA를 형성할 수 있는 서열이 존재한다는 것이다. Z-DNA는 디뉴클레오티드인 GC 또는 AC의 반복에 의해 생성된 왼쪽으로 도는 헬릭스로 폴딩된 DNA이다. Z-형태로의 폴딩은RNA중합효소 분자가 DNA에 접근할 수 있는 가능성에 영향을 주고, 따라서 전사 속도를 저해하는 것으로 생각된다.

식물 단백질 발현 분야에서 최초이자 가장 중요한 발명 중의 하나는 유전자 변형 식물에서 이종 유전자의 강력하고 구성적 발현을 제공하는 (식물) 바이러스성인 아그로박테리움(Agrobacterium)-유래 프로모터를 사용하게 된 것이다. 상기 프로모터의 몇가지는 식물 유전 연구에서 매우 집중적으로 사용되어 왔으며, 빠르고 간단하고 위험도가 낮은 발현 연구법이라는 이유로 여전히 선택되는 프로모터이다. 1984년(유럽 특허 제0 131 623호)에 실제로 유용한 것으로 이미 밝혀진 양배추 모자이크 바이러스(CaMV)로 부터의 35S 및 19S 프로모터가 가장 유명하며 이 프로모터는 노파린 신타제(nos), 만노핀 신타제(mas) 및 옥토핀 신타제(ocs) 프로모터와 마찬가지로 아그로박테리움 T-DNA에 있다[유럽 특허 제0 122 791호, 유럽 특허 제0 126 546호, 유럽 특허 제0 145 338호]. 유사한 특성이 있는 식물-유래 프로모터는 유비퀴틴 프로모터이다[유럽 특허 제342 926호].

따라서, 이들 프로모터의 발현 수준을 높이기 위한 수 차례의 시도가 있었다. 이에 대한 예는 두배로 강화된 35S 프로모터[미국 특허 제5,164,316] 및, 보다 최근으로는 아그로박테리움 프로모터의 부분들을 결합시킨 수퍼프로모터[유럽 특허 제729 514호]가 있다.

그러나, 많은 경우에 이 프로모터는 이상적인 프로모터의 기준을 충족시키지 못한다. 상기 기재된 모든 프로모터는 분명한 형태의 조직- 또는 생장-특이적인 발현을 나타내지만, 빈번하게 이 프로모터에서 나타나는 발현 형태는 몇가지 예의 경우 이상적이지 못하다. 특히 식물 생장의 정확한 위치와 정확한 시간프레임에 발현해야 하는, 진균 및 곤충 내성에 대한 조작과 같은 생물공학 분야의 경우, 엄밀하게 정확한 시간 및 위치에서 높은 수준으로 형질전환 유전자를 발현시킬 수 있는 새로운 구성적 프로모터가 요구된다.

<발명의 요약>

본 발명은 1) 최소 프로모터 및 2) 식물에서 상보적 형태 및 수준의 전사를 유도하는, 프로모터 세트의 전사 활성화 요소를 포함함을 특징으로 하는 새로운 식물 프로모터를 제공한다.

보다 구체적으로는, 이 식물 프로모터는 프로모터 내의 각 전사-활성 요소가 절대적인 조직-특이성을 나타내는 것이 아니라, 대부분의 식물 부분에서 전사가 가장 활발한 식물 부분에서 도달된 수준의 1 % 이상 수준으로 전사 활성을 매개하는 구성적 프로모터이다. 이 프로모터 쌍의 예는 한 프로모터는 식물의 녹색 부분에서 가장 활성이고, 다른 한 프로모터는 식물의 땅속 부분에서 가장 활성인 프로모터 세트이다. 보다 구체적으로는 새로운 프로모터는 페레독신 및 RolD 프로모터의 조합이다. 바람직하게는, 이 구조물 중의 최소 프로모터 요소는 페레독신 프로모터로부터 유래하고 이 페레독신 프로모터는 흰꽃다지(Arabidopsis thaliana)로부터 유래한다. rolD 프로모터는 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)로부터 유래한다.

또한, 본 발명의 일부는 플라스토시아닌 및 S-아데노실-메티오닌-1 프로모터 조합인 식물 프로모터에 관한 것이고, 여기서 바람직하게는 최소 프로모터 요소는 S-아데노실-메티오닌-1 프로모터로부터 유래되고 플라스토시아닌 프로모터 및 S-아데노실-메티오닌-1 프로모터 모두는 흰꽃다지로부터 유래한다.

본 발명의 또 다른 일부는 상기 기재된 프로모터 함유 식물 유전자를 발현시키는 키메라 유전자 구조물에 관한 것이다.

본 발명은 새로운 식물 프로모터에 관한 것이고, 보다 구체적으로는 상보적 특이성을 지닌 프로모터의 부분들을 조립하여 제작할 수 있는 프로모터에 관한 것이다.

도 1: pMOG410 및 pMOG1059의 개략도

도 2: 구조물 pMOG1059 및 pMOG410을 지닌 형질전환된 감자 라인의 GUS 발현 분포. 본 발명자들의 랩에서 GUS 염색법으로 시각적으로 판단하였고 최고 GUS 발현도에 대해 상대적으로 발현 종류를 측정하였다(도 4에 기재됨). 수치 0은 가시적인 발현이 없음을 나타낸다.

도 3: 토마토, 평지 및 감자 주요 형질전환체에 있어서 GUS 효소의 평균 발현도에 대한 그래프. GUS 발현을 시각적으로 측정하는데 높은 수준으로 발현되는 4점으로 기록된 35S GUS 유전자도입된 담배 식물과 비교하였다. 측정값의 표준편차는 각 막대그래프 상에 표시되어 있다.

도 4: SAM-1-, Pc35S- 및 PcSAM1-GUS 구조물을 포함하는, 여러가지 수준의 GUS 발현 분포에 대한 그래프. 잎의 엽육조직, 잎의 도관계, 줄기 및 뿌리에서의 발현이 점수로 기록되어 있다.

본 명세서에 관하여는 하기 정의가 유효하다.

프로모터는 DNA 상의 RNA 중합효소 결합 부위로 이루어져 있고, 기능적 전사 개시 시작 부위를 형성한다. 일반적으로 프로모터는 최소한 TATA 박스와 아마도 전사 개시 부위(개시자) 주위의 다른 서열로 이루어져 있으며, 단리되어 사용될 수 있거나(최소 프로모터) 또는 전사 개시 속도를 증가시키거나 또는 감소시킬 수 있는 전사-활성화 요소, 사일렌서 또는 인핸서의 결합 부위에 연결시켜 사용할 수 있으며, 프로모터는 각 생장 단계, 또는 외부 또는 내부 자극에 작용할 수 있다.

개시 부위는 전사되는 서열의 일부인 첫번째 뉴클레오티드 주위에 위치하고, 또한 개시 부위는 +1 위치로 정의된다. 이 부위에 대해 상대적으로, 유전자 및 그를 조절하는 영역의 모든 다른 서열에 번호를 매긴다. 하류 서열(즉, 3' 방향의 다른 단백질 암호화 서열임)을 +로 부르고, 상류 서열(대부분 5' 방향의 조절 영역임)을 -로 부른다.

최소 프로모터는 전사 개시에 필요한 모든 기초 요소, 예를 들어 TATA-박스 및(또는) 개시자만으로 이루어진 프로모터이다.

인핸서는 프로모터 근처에 존재하게 되면 전사 개시 속도를 증가시킬 수 있는 DNA 요소이다.

프로모터는 식물의 모든 또는 거의 모든 생장 단계 동안에 모든 또는 거의 모든 식물 조직에서 그가 유전자 발현을 조절할 수 있을 때구성적이라고 한다.

특이적 발현은 한가지 또는 몇가지 식물 조직(공간적 제한) 및(또는) 한단계 또는 몇단계 식물 생장 단계(시간적 제한)에 제한된 유전자 산물의 발현이다. 프로모터는 일부 조직에서는 우세하게 작용하게되나, 다른 조직에서는 아예 활성이 없거나 또는 단지 조금 밖에 없는 것인 정확한 특이성은 거의 존재하지 않는 것으로 알려져 있다. 이 현상은누출 발현으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명에서 특이적 발현이란 한가지 또는 몇가지 식물 조직에서의 우세한 발현을 의미한다.

프로모터(인핸서가 있거나 또는 없는 프로모터)의발현 형태는 식물의 어느 부위에서, 어느 생장 단계에서 이 프로모터에 의해 전사가 개시되는지를 보여주는 발현 수준의 형태이다.

프로모터 세트의 발현 형태는 한 프로모터의 발현 형태가 다른 프로모터의 발현 형태와 거의 중첩되지 않을 때 상보적인 것으로 언급된다.

전사된 표준 리포터 mRNA의 '안정 상태' 농도를 측정하여 프로모터의 발현 수준을 결정할 수 있다. 리포터 mRNA의 농도는 그의 합성 속도뿐 아니라 mRNA가 분해되는 속도에 따라 좌우되기 때문에 이 측정법은 간접적인 방법이다. 따라서, 안정 상태의 발현 수준은 합성 속도와 분해 속도의 곱이다. 그러나 전사된 서열이 동일하면 분해 속도는 일정한 속도로 진행하는 것으로 생각되고, 따라서 이 수치는 합성 속도에 대한 척도로 쓸 수 있다. 이런 방식으로 프로모터들을 비교할 때, 당업자가 쓸 수 있는 기법은 혼성화 S1-RNAse 분석, 노던 블롯 및 경쟁적 RT-PCR이다. 이런 종류의 기법 목록이 쓸 수 있는 전부를 나타내는 것은 결코 아니며 mRNA의 전사 활성 및 발현 수준을 분석하는데 통상적으로 사용되는 방법을 기재한 것이다.

상기 분석에서 맞닥뜨리는 기술적인 어려움 중 하나는 전사 활성화 부분을 리포터 서열만이 전사되는 방식으로 리포터 RNA 분자에 융합시켜야지만 정량적으로 가장 좋은 결과를 얻을 수 있다는 점이다. 이를 위해서는 RNA 합성 시작 부위의 정확한 결정 및 그 지점에 리포터 mRNA 서열의 연결이 요구된다.

이 요건은 많은 이유로 중요하다. 첫째, 실제적으로 모든 프로모터의 전사 개시 지점을 분석하여 보면 전사는 일반적으로 단일 염기에서 시작되는 것이 아니라, 오히려 다소 밀집된 개시 부위 세트에서 시작되며, 이 부위 각각은 mRNA의 몇개의 시작 부위 역할을 한다. 이 분포는 프로모터마다 변하기 때문에, 각각의 군마다 각 리포터 mRNA 서열은 서로 다를 것이다. 각 mRNA 종은 다소간의 분해 경향이 있으므로, 여러 리포터 mRNA들간에 단일한 분해 속도를 예상할 수 없다. 둘째, 여러가지 진핵생물 프로모터 서열의 경우, 개시 부위('개시자') 주위의 이 서열은 이 특이적 프로모터에 의해 유도되는 RNA 발현의 수준을 결정하는데 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이에는 전사되는 서열의 일부가 포함된다. 따라서 프로모터와 리포터 서열의 직접적인 융합은 최적에 훨씬 못미치는 수준의 전사를 초래한다.

전사되는 서열 중에 리포터 서열이 남아있음으로 해서 전사 속도의 측정이 가능하나, 잠재적으로는 리포터 mRNA의 안정성을 변화시켜 결국 오픈 리딩 프레임의 번역 개시 속도에 영향을 준다.

그러나, 상기 분석의 역할은 이종 단백질의 구성적 발현의 상대적인 수준을 측정하는 것이고, 이는 생물공학 분야에서 가장 자주 사용되는 예이다. 따라서, 가장 중요한 파라메타는 이종 리포터 단백질의 높은 수준의 발현을 유도하는 시험 서열의 능력이다.

이는 리포터 단백질의 코딩 서열을 특성이 시험되는 유전자의 전사 활성화 부분, 프로모터 및 5'의 번역되지 않는 서열에 연결시키는 것을 포함한다. 이 방법으로, 복잡한 요인(전사 속도의 조합, mRNA 안정성(및 mRNA의 분해 속도) 및 번역 개시 속도)들이 생물공학 분야에서 시험 유전자 요소의 유용성 결정에 매우 유용한 하나의 값으로 줄어든다.

이 값을 나타내는 기존의 말 또는 구절은 없다. 본 출원 명세서 중에 '발현치'라는 용어에 이어서 '발현 수준' 및 '전사 활성'이라는 용어가 사용되었다. 본 발명자들은 이 용어가 다소 혼란을 일으킬 수도 있음을 알고 있다. 모든 경우에 있어서, 상기 용어 및 이에 관련된 용어는 직전에 언급한 수치를 나타낸다. 발현 형태 및 발현 수준 분석에 통상적으로 이용되는 방법은 세포 중에 '안정 상태'의 단백질 축적물 수준의 측정에 의한다. 당업자에 공지된, 리포터 유전자로 통상적으로 사용되는 후보에는 β-글루쿠로니다제(GUS), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CAT) 및 형광 특성이 있는 단백질, 예를 들어 아쿠오라 빅토리아(Aequora victoria)에서 유래한 녹색 형광 단백질(GFP)이 있다. 그러나 원칙적으로는, 그 단백질이 필수적인 식물 기능을 저해하지 않는다면 보다 많은 단백질이 상기 목적에 적합하다. 위치 결정에 있어서의 정량화 및 결정의 경우, 적합한 도구가 많다. 예를 들어 면역화학적, 효소적, 형광 검출 및 정량화를 기본으로 하는 검출 시스템을 용이하게 제작할 수 있거나 또는 이용할 수 있다. 단백질 발현의 in situ 분석을 이용하여 식물 조직 추출물 또는 무상 조직 중의 단백질 함량을 측정할 수 있다.

일반적으로는, 한개의 키메라 프로모터-리포터 구조물로 형질전환된 라인 각각은 그의 리포터 유전자의 발현 수준이 다를 것이다. 또한 이 형질전환체가 임의 검출가능한 생성물(RNA 또는 단백질)을 발현시키지 않는 현상이 자주 관찰된다. 이 실활화의 기초를 이루는 분자 메카니즘이 보통 명확하지 않음에도, 발현에서 변화는 통상적으로 '위치 효과' 때문이다.

본 명세서에서평균 발현이라는 용어는 리포터 유전자를 검출가능한 양으로발현한 모든 라인에서 구한 평균 발현 수준의 의미로 사용되며, 임의 검출가능한 리포터 mRNA 또는 단백질을 발현시키지 않는 식물은 분석대상에서 제외된다.

뿌리 발현 수준이라는 용어는 완전한 식물 뿌리의 단백질 추출물에서 나타나는 발현 수준을 의미한다. 마찬가지로, 잎 및 줄기로부터의 전체 추출물을 사용하여 '잎' 및 '줄기 발현 수준'을 측정한다. 그러나, 앞서 기술한 각 식물 부분에서는, 프로모터의 활성이 변할 수 있는 가변적인 기능을 가지는 세포가 존재할 수 있는 것으로 알려져 있다.

본 출원서에 기재되어 있는 프로모터의 경우, 여러가지 기능을 가지는 세포를 포함하는 큰 식물 부분의 발현 수준을 측정한다. 그러나, 식물 부분 내에서 보다 많은 세포유형이 고려됨을 생각하여, 보다 상세한 분석으로 '보다 구성적' 프로모터 제작에 기여할 수 있다.

발현 수준 판단의 기준으로는, 꽃 양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터가 편리하고 표준으로서 폭넓게 사용된다. 이 프로모터의 평균 발현 수준은 중간 또는 높은 수준으로 분류될 수 있다.

본 발명으로, 특이적 발현을 유도하는 한 프로모터의 요소와 상보적 발현 형태를 유도하는 다른 프로모터의 요소를 조합하여 결과적으로 두 프로모터 모두의 발현 형태의 일부를 이루는 조직 및 생장 단계에서 발현하는 하나의 프로모터를 제작하는 것이 가능함이 밝혀냈다. 이런 상보성을 통해 식물의 (거의) 모든 세포에서의 활성이 나타나게 되면, 이러한 상보성을 통해 구성적 프로모터가 만들어질 것이다. 그러나, 두 프로모터 모두는 다른 한 프로모터에게 특이적인 조직 및 생장단계에서는 낮은 발현치를 가지는 것이 불가피한듯 하다. 적합하게는, 발현도가 낮은 식물 부분의 전사 활성이 바람직하게는 전사 활성이 높은 식물 부분에서 도달된 전사 수준의 1 % 이상이어야 한다고 입증되어 있다.

이는 새로운 구성적 프로모터를 제작하기 위한 프로모터 및 프로모터 요소의 이용가능성을 제한한다. 상기 언급된 기준을 충족하는 적합한 프로모터의 쌍에는 rolD 프로모터와 페레독신 프로모터 및 플라스토시아닌 프로모터와 S-아데노실 메티오닌 프로모터가 있다. 또한, 보완적이고 다른 프로모터에게 특정적인 조직 및 생장 단계에서 적어도 다소의 발현을 나타내는 다른 프로모터 쌍을 이용할 수도 있다.

요구되는 프로모터 및(또는) 인핸서 부분에 대한 기술

특히 진핵 생물에서, 전사-조절 요소는 프로모터 및 전사 개시 부위로부터 먼 거리에 존재할 수 있고, 개시 부위의 하류 또는 상류 부위 모두에 존재할 수 있지만, 많은 식물 유전자는 프로모터의 바로 상류 부위에 그의 조절 요소의 대부분을 가지고 있다. 프로모터의 주요 전사-활성화 요소를 확인하기 위해, 프로모터의 상류(및 하류)에 있는 비-전사 부위의 일부를 리포터 유전자에 연결하여 각각의 끝이 잘린 DNA 요소가 이 리포터 유전자의 발현을 유도하는 능력을 분석하는 것이 통상의 방법이다. 보다 프로모터에 근접한 서열의 기술을 위해, 전사 조절 연구 중인 유전자로부터 유래할 수 있는 전사 조절에 관여하는 인핸서 서열의 단편이 가장 통상적으로 프로모터에 결합된다. 또는, 전사 개시 부위에 대해 -46 내지 +4의 35S 프로모터 서열과 같은 이종 프로모터를 상기 기재된 리포터 유전자에 기능적으로 연결시켜 사용할 수 있다.

당업자들에게 잘 알려진 방법으로, 대부분 유전자의 전사 활성화 요소를 기술하는 것이 가능하다.

다수의 유전자 전사 조절 요소가 이러한 방식으로 분석되었고, 과학 간행물을 통해 당업자는 상기 분석에 관련된 데이타를 직접 얻을 수 있다.

적어도 식물 일부분에서 대략적으로 35S 프로모터의 평균 수준(상기 수준의 50% 이상)으로 발현을 유도할 수 있고, 또한 식물의 다른 부분에서 (35S 발현 수준의) 0.5% 이상 전사를 유도할 수 있는 전사 활성화 요소를 추가의 사용을 위해 선택하였다.

반드시 그렇지는 않지만, 최소 프로모터 요소는 통상적으로 프로모터-쌍 중의 한개의 프로모터로부터 유래한다. 이 최소 요소는 제3의 프로모터로부터 유래하거나 또는 합성에 의해 제조하는 것도 고려할 수 있다.

상기 기재된 분석 결과를 기준으로, 상보적 활성이 있는 전사 활성화 부분을 선택하였다. 예를 들어, 식물 전체에서 발현을 유도하는 프로모터, 뿌리에서 높은 수준의 발현을 유도하고 잎 및 줄기에서는 더 낮은 수준의 발현을 유도하는 전사 활성화 DNA 단편을 잎 및 줄기에서 주로 발현을 유도하고 뿌리에서는 더 낮은 발현을 유도하는 요소와 결합시킨다. 상보적 전사 활성화 부분들의 다른 조합도 예측가능한 것이다.

바람직하게는, 발현 수준이 가장 낮은 부분의 발현 수준은 발현 수준이 가장 높은 부분 수준의 1% 아래로 떨어지지는 않는다. 식물 부분 사이의 가장 낮은 발현과 가장 높은 발현의 관계가 5% 보다 큰 경우가 보다 바람직하다.

이러한 연결은 공지된 유전공학 기술로 아주 쉽게 수행할 수 있다. 새로운 구성적 프로모터에 의해 발현되어야 하는 유전자를 프로모터 뒤에 클로닝할 수 있다. 프로모터에 부착된 '5의 번역되지 않는 연결 서열에 유일한 NcoI-클로닝 부위를 만들어 넣어 오픈 리딩 프레임(ORF)이 정확하게 접합되도록 하고 프로모터의 '3 말단에 관심있는 유전자를 삽입하는 것이 바람직하다.

페레독신-rolD의 쌍

본 발명의 바람직한 조합 중 하나는 페레독신 프로모터 및 rolD-프로모터 모두를 포함하는 구성적 식물 프로모터이다. 바람직하게는, 페레독신 프로모터는 광합성에 관여하는 유전자인 페레독신 A 유전자를 조절하는 흰꽃다지(Arabidopsis thaliana)로부터 얻은 것이다. 이 유전자의 발현 및 빛에 대한 그 프로모터의 반응성이 보고되었다[보스트(Vorst, O.) 등의 문헌[Plant Mol. Biol. 14, 491-499, 1990], 보스트(Vorst, O.) 등의 문헌[The Plant J. 3(6), 793-803, 1993], 디키(Dickey, L.F.) 등의 문헌[The Plant Cell 6, 1171-1176, 1994]]. 페레독신 유전자는 광합성에 관여하므로, 프로모터는 녹색 조직에서 가장 활성이 크다. 엽록체를 포함하는 기관, 예를 들어 줄기, 잎 및 포엽 뿐 아니라 어린 생장조직, 예를 들어 꽃 전체 및 묘목에서 이 유전자의 mRNA 수준이 높은 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 식물의 토양에 속한 부위에서도 이보다는 작지만 상당한 발현이 나타났다. 프로모터 서열은 G-박스 및 I-박스 함유 영역을 포함한다. 또한, -182 위치에 잠재적인 z-폴딩 DNA 서열도 있다.

rolD 프로모터는 뿌리에서 강한 발현을 유도하는 것으로 보고되었고, 아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)로부터 얻을 수 있다. 기원 생물은 박테리아이지만, 이 박테리아가 식물에서 털뿌리병을 유발하는 식물성 병원체이기 때문에 그의 프로모터는 식물에서의 발현에 매우 적합하다. 이 박테리아는 질병 유발을 위해 식물 뿌리의 길이 생장을 담당하는 rolD 유전자가 있는 곳으로 DNA를 전달한다. 식물에서 상기 유전자를 발현가능케 하려면 식물 중에서 기능하는 강력한 프로모터가 필요하다. GUS에 대한 연구 결과, rolD-프로모터 조절하의 발현은 주로 뿌리에 특이적이라는 사실을 알아냈다[리치(Leach, F.) 및 아오야기(Aoyagi, K)의 문헌[Plant Sci. 79, 69-76, 1991]]. 또한, 잎에서도 약간의 발현이 관찰되었다.

페레독신 및 rolD 프로모터의 조합은 최소 프로모터 요소와 5'의 번역되지 않은 서열을 어느 프로모터로부터 얻느냐에 따라 두가지 방법으로 얻을 수 있다. 본 발명의 예에서는 페레독신 프로모터로부터 유래한 최소 프로모터 요소를 사용하였지만, rolD 프로모터로부터 유래한 최소 프로모터 요소도 동등하게 충분히 가능하다.

S-아데노실-메티오닌 신테타제 및 플라스토시아닌의 쌍

다른 바람직한 프로모터는 S-아데노실-메티오닌 신테타제(SAM) 프로모터 및 플라스토시아닌 프로모터의 특이적 부분의 조합으로부터 얻을 수 있다. 바람직하게는, 두 프로모터는 모두 흰꽃다지(Arabidopsis thaliana)로부터 얻은 것이다.

SAM 프로모터는 폴리아민 및 에틸렌 합성 활성이 있는 효소인 S-아데노실-메티오닌 신테타제의 발현을 조절한다. 연구 결과, 상기 프로모터는 도관 조직, 유합 조직, 후막 조직에서 강한 발현을 유도하고, 뿌리 피층[펠레만(Peleman, J.) 등의 문헌[The Plant Cell 1, 81-93, 1989]]에서 이 효소가 목질화에 관여하기 때문인 것으로 판단되는 약간의 활성을 유도하는 것으로 밝혀졌다.

페레독신 프로모터와 마찬가지로, 플라스토시아닌 프로모터도 또한 광합성 경로에서 활성을 나타내는 프로모터이다. mRNA 수준은 녹색의 엽록체 함유 구조물, 예를 들어 잎, 줄기에 나는 잎, 줄기 및 전체 묘목에서 높다. 또한, 프로모터는 꽃에서도 아주 활성이 크다. 장각과, 씨 및 뿌리에서는 발현이 거의 검출되지 않는다[보스트(Vorst, O.) 등의 문헌[The Plant J. 4(6), 933-945, 1993]]. 상기 특이적 요소의 조합에 의해, 잎 및 줄기의 광합성 부위 뿐 아니라 광합성에 관여하지 않는 부위, 예를 들어 잎 및 줄기의 도관계를 형성하고 둘러싸는 세포에서 발현을 잘 유도하는 키메라 프로모터의 제작이 가능하다.

프로모터의 다른 쌍

상기 기재된 프로모터의 쌍의 예는 두 경우 모두에서 광합성 중에 활성인 프로모터가 있는 경우이다. 광합성 활성에 필요한 유전자 발현을 조절하는 다른 프로모터가 rolD 또는 다른 뿌리-우세성 프로모터와의 조합에 적합할 수도 있다고 생각된다.

식물 전체에서 발현을 유도하는 프로모터의 작제에 있어서, 프로모터의 쌍 중 하나가 녹색 부분에 다소 특이적이라면, 자동으로 이 쌍의 다른 프로모터는 뿌리 및 다른 비-광합성 기관에서 우세하게(그러나 배타적이지는 않음) 발현을 유도하는 것이어야 한다. 식물의 잎 및 줄기 전체 부분에서 발현을 유도하는 프로모터의 작제에서는, 녹색의 부분에 다소 특이적인 프로모터 및 도관계에서 주로 발현을 유도하는 프로모터를 사용하여 조합할 수 있다.

그러나, 본 발명은 뿌리-우세성 프로모터 및 녹색 부분-우세성 프로모터의 조합과 녹색 부분-우세성 프로모터 및 도관계-우세성 프로모터의 조합에 제한되지는 않는다. 각 프로모터의 발현 형태가 상보적이라면 모든 프로모터의 조합을 사용할 수 있다.

또한, 예를 들어 조립된 새로운 구성적 프로모터가 2개 이상의 프로모터를 가지는 세트로부터 유래한 경우의 프로모터 요소도 가능하다. 또한, 상기 논의한 상보성이 존재해야 한다.

실시예 1: Fd-rolD 키메라 프로모터의 클로닝

페레독신 오픈 리딩 프레임의 ATG 개시코돈에 대해 -512 내지 +4 위치 범위의 흰꽃다지(Arabidopsis thaliana) 페레독신 프로모터 단편 512 bp[보스트(Vorst, O.) 등의 문헌[1990, PMB 14, 491-499]]를 HincⅡ 및 NcoI로 분해하여 단리하였다. 상기 단편에는 페레독신 프로모터의 전사 조절 서열 대부분, 프로모터 서열 및 페레독신 전사물의 리더가 포함되어 있었다. 클로닝 목적으로, ATG에 대해 -5 내지 -10 위치에 XbaI 부위를 도입하였다[보스트(Vorst, O.) 등의 문헌[1990, PMB 14, 491-499]]. 클론의 원래 서열이 ACAAAA에서 TCTAGA로 바뀌었다(SEQ ID NO: 1).

아그로박테리움 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes) rolD 상류 서열의 일부(SEQ ID NO: 2)(리치(Leach) 등의 문헌[1991, Plant Sci. 79, 69-76])를 상기에 기재한 페레독신 프로모터 서열과 융합하였다. 아그로박테리움 리조게네스의 개시 코돈에 대해 -385 내지 -86 위치의 뉴클레오티드를 포함하는 HindⅢ-RsaI 단편을, 페레독신 단편의 HindⅡ 부위가 HindⅢ-RsaI 단편의 RsaI 부위와 연결되도록 페레독신 단편 옆에 클로닝하였다. 페레독신 유전자의 프로모터 및 활성화 서열 일부를 포함하고 rolD 유전자의 상류 활성화 서열을 포함하는 상기 키메라 요소를 이후의 전사-촉진 특성에 대한 연구에 사용하였다(SEQ ID NO: 3).

실시예 2: GUS-융합

Fd-rolD 키메라 프로모터 및 활성화 부위를 인트론 유전자를 포함하도록 설계된 GUS 유전자와 결합시켰다[제퍼슨(Jefferson) 등의 문헌[(1987), EMBO J. 6: 3901-3907]]. ATG 개시 코돈 상의 NcoI 제한효소 부위를 사용하여 단백질 분해효소 억제제Ⅱ(PI-Ⅱ)의 3'의 번역되지 않는 전사 종결 서열을 포함하는 265bp의 단편에 연결된 GUS 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)에 프로모터를 연결시켰다[쏜버그(Thornburg) 등의 문헌[1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA84, 744-748], 안(An) 등의 문헌[Plant Cell1, 115-122]].

프로모터, GUS 유전자 및 3' PI-Ⅱ 서열을 포함하는 전체 발현 카세트를 BamHI 및 Eco0RI을 이용하여 잘라내고, 동일한 제한효소로 잘린 이원 벡터 pMOG800(네덜란드의 미생물 기탁기관인 CBS(Centraal Bureau voor Schimmelcultures)에 CBS 414.93호로 1993년 8월 12일 기탁됨)에 클로닝하였다. 그 결과 생성된 구조물(pMOG1059)을 다양한 식물의 형질전환에 사용하였다. 대조군으로서 35S CaMV 프로모터에 의해 조절되는 GUS 유전자를 사용하였다. 이 구성물은 pMOG410이었다. 두 구조물 모두의 도식 표현은 도 1에 나타나 있다.

실시예 3: 식물 형질전환 초기 단계 동안의 발현 수준 및 프로모터 활성 형태

우선, 상기의 두 구조물로 흰꽃다지(Arabidopsis thaliana) 형질전환체를 만들고, 형질전환 과정 동안의 시간에 맞춰 GUS를 발현시켰다. GUS의 발현 수준을 외관상 0 내지 5 등급으로 결정하였다(여기서, 0 등급은 검출가능하지 않은 발현이고, 5 등급은 유전자 도입 식물(35S-GUS 유전자가 이식된 드문 담배, 계통 96306)의 잎에서 본 발명자들이 관찰한, 가장 높은 수준의 GUS 발현임). 이 식물의 잎에서 채취한 시료를 모든 실험에서 내부 기준으로 포함시켰다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 함께 배양하고 몇 시간 후에 나타나는, 흰꽃다지(Arabidopsis thaliana) 체외 배양편에서의 상대적인 GUS 발현 정도를 표 1에 나타내었다(DAC란 함께 배양한 후 지난 날짜를 의미함).

흰꽃다지 뿌리 체외 배양편의 상대적인 GUS 활성

구조물:분석 시간	pMOG1059	pMOG410
DAC 0DAC 2DAC 5DAC 7DAC 9DAC 12	233444	333333

상기 비교에서 알 수 있듯이, 키메라 프로모터에 의해 유도되는 GUS의 발현은 함께 배양한 후 조금 뒤에 개시되었으나, 7일 부터는 35S 프로모터를 기준으로 얻어진 발현 수준을 초과하였다. GUS 발현으로 브라시카 나푸스(Brassica napus)의 체외 배양편에 대한 점수를 기록했을 때 역시 매우 유사한 데이타가 얻어졌다. 함께 배양한 후 5일이 지나서는 35S 프로모터가 약간 높은 수준의 발현을 유도하였지만, 함께 배양한지 20일 이후에는 상황이 반전되었다. 또한, 토마토의 경우에서도 유사한 데이타가 얻어졌다. 최초 분석 단계에서 조차, pMOG1059-유전자 도입식물의 발현은 pMOG410-유전자 도입 식물의 발현을 초과하였다.

실시예 4: 시험관 내에서 생장시킨 식물의 발현 수준 및 형태

식물을 더 생장시켰을 때, 상기 프로모터들 사이의 차이는 보다 명확했다. 완전하게 재생된 식물의 잎 샘플의 GUS 발현을 분석하였다. 구조물에 따라, 11 내지 48개의 식물로부터 평균값을 구하였다. 시험관 내에서만 배양된 흰꽃다지(Arabidopsis thaliana)의 경우, pMOG1059 및 pMOG410-유전자 도입 식물의 GUS 발현 사이의 차이는 크지 않은 것으로 관찰되었다.

시험된 모든 작물의 잎 샘플에 대한 상대적인 평균 GUS 활성

구조물: pMOG1059 pMOG410작물:

감자 4.0 2.1브라시카 나푸스(brassica napus) 3.7 2.8흰꽃다지(arabidopsis)4.0 4.1토마토 2.2 2.1

도 2에 나타나 있는 데이타로부터, 상당수의 35S-GUS 유전자 도입 라인(본 발명의 실험에서는 약 50 %가 반복적으로 나타남)이 GUS를 가시적인 수준으로 발현시키지는 않음이 또한 분명하다. 최대 및 평균 발현은 Fd-rolD-GUS 유전자 도입 식물에서 보다 높았을 뿐 아니라, 유전자 도입 식물이 GUS를 발현시키는 빈도가 크게 증가하였다. Fd-rolD-GUS 구조물을 가지는 약 50 개의 유전자 도입 감자 식물에 있어서, 본 발명자들은 약한 발현체를 관찰할 수 없었는데, 이는 유전자 도입 라인의 98 % 이상에서 신뢰할만한 높은 발현이 이루어졌음을 시사한다.

실시예 5: 여러 작물의 프로모터 성능 비교

추가로 프로모터 성능을 비교하기 위해 평지 및 토마토에 pMOG410(35S-GUS) 및 pMOG1059(Fd-rolD-GUS) 구조물을 또한 도입하였다. 또한, 본 명세서에는 감자에 대한 데이타가 포함되어 있다. 도 3A에 나타나 있는 바와 같이, 토마토에서 Fd-rolD 프로모터의 전체적인 발현 수준은 시험관 내 생장의 최종 단계와 4 주 및 7 주 지난 식물의 잎 모두에서 보다 높았다. 또한, 7 주 지난 줄기에서도 상기 결과와 마찬가지였으나, 뿌리의 경우 35S 프로모터보다는 Fd-rolD 프로모터의 경우 평균적으로 더 약한 발현이 관찰되었다. 또한, 평지와 감자에서 유사한 결과가 얻어졌으나, 주목할 만한 예외는 감자 뿌리에서 Fd-rolD 프로모터에 의한 발현 수준이 35S 프로모터에 의한 발현 수준을 초과한 것이었다. 도 3B 및 도 3C에 나타나 있는 바와 같이, 두 그림 모두에서 Fd-rolD 프로모터의 평균 발현은 더 높았으며 또한, 발현의 변화는 훨씬 더 낮았다. 결론적으로, 본 발명자들은 세가지 주요 작물에서 35S 프로모터와는 비교되지 않는 우수한 프로모터를 용이하게 생성시켰다고 할 수 있다.

실시예 6: nptⅡ 형질전환 유전자의 발현

다른 목적으로의 Fd-rolD 프로모터 유용성을 또한 확인하기 위해, 이 프로모터를 nptⅡ 유전자에 연결시켰는데, 이 구조물 중에 nptⅡ 유전자 생성물의 발현으로 식물에는 항생제인 가나마이신에 대한 내성이 부여된다. 이 T-DNA의 좌측 및 우측 경계 사이에 상기 요소를 위치시켰고, 이는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 매개로하여 식물로의 전달이 가능하다. 대조군으로는 유사한 구조물(이 구조물에서 nptⅡ 유전자의 발현은 nos 프로모터의 조절 하에 있음)이 사용되었다. 배양 배지 중에 가나마이신이 사용되는 표준 형질전환 과정 중에 유전자 도입 캘러스 및 가지 생장에 의해 가나마이신에 대한 유전자 도입 감자 식물의 내성이 나타난다. 평균적으로는 nos-nptⅡ 선택 카세트를 가진 구조물의 경우, 감자의 형질전환 빈도는 45 %였고 Fd-rolD-nptⅡ 선택 카세트를 가진 구조물의 경우, 감자의 형질전환 빈도는 평균하여 61 %였다. 본 발명자들도 현재는 형질전환 빈도 증가가 이 구조물과 얼마나 관련되는지 모르지만, 이는 최소한 Fd-rolD 프로모터가 nos와 같이 통상적으로 사용되는 구성적 프로모터처럼 nptⅡ와 같은 이종 유전자 유도에 적합함을 알 수 있다.

실시예 7: 시각 평가 점수와 정량적 수치와의 비교

1) 조직화학적 분석 및 내부 기준에 대한 점수 기록 및 2) GUS 효소 활성에 대한 정량 분석을 기본으로 하는 GUS 발현 분석으로, 본 발명자들은 두방법 모두 재현할 수 있는 정량적인 값을 제공함을 알아냈다. 토마토 및 평지의 잎 및 뿌리에 대한 점수를 모두 철저히 분석한 결과로 35S의 수치에 가장 비견할 만한 값인 수치 3은 정량 분석으로 얻은 약 2000 pmol MU/분.mg과 동일하다는 결론에 이르렀다. 수치 1 및 2에서는 평균이 각각 1000 및 1500이었고, 이는 35S의 50 %에 해당하는 값이다. 이 수준의 약 1 % 발현은 때로 GUS 발현으로 인한 매우 연한 파란색 염색법으로 검출가능하기도 하지만, 흔히 조직화학적 검출의 검출 수준에 못미치는 100 pmol MU/분.mg과 동등한 것이었다. 그러므로, 파란색 염색의 수준을 측정함으로써 조직화학적 염색을 프로모터 효율에 대한 표식으로 사용할 수 있으며, 이 데이터를 사용하여 유용한 프로모터 요소를 선별할 수 있다.

실시예 8: SAM1 프로모터 작제 및 GUS로의 융합

SAM1 프로모터 작제를 위해, CTAB 추출 방법을 사용하여 흰꽃다지 랜즈버그 에렉타(Arabidopsis thalianaLandsberg erecta)의 잎으로부터 게놈 DNA(SEQ ID NO:4)를 단리하였다. 흰꽃다지(Arabidopsis thaliana) K85[펠레만(Peleman) 등의 문헌[(1998) Gene 84, 359-369]]에서 유래한 SAM1 유전자의 공개된 서열을 토대로 프라이머를 설계하였다. PCR(95℃에서 45 초, 50 ℃에서 45 초, 72 ℃에서 1 분으로 30 주기 반복함. 실시예에 기재된 다른 모든 PCR에서 동일한 프로그램을 사용함)에서, 프라이머 FR-Psam-143 5' AGA TTT GTA TTG CAG CGA TTT CAT TTT AG 3'(SEQ ID NO:5) 및 FR-Psam-216 5' ATC TGG TCA CAG AGC TTG TC 3'(SEQ ID NO:6)를 사용하여 이 프로모터 요소를 증폭시켜 약 550 bp 단편을 생성시켰다. 아가로스 겔로부터 DNA 단편을 단리하고 pGEM-T 벡터(미국 위스콘신주 메디슨 소재 프로메가 코포레이션사(Promega Corp)에서 시판함)에 클로닝하였다. 이 클론을 주형으로 사용하여 프라이머 FR-Psam-144 5' GTC TCC ATG GTG CTA CAA AGA ATA G 3'(SEQ ID NO:7) 및 FR-Psam-143을 사용한 PCR에 의해 전사 개시 부위에 NcoI 부위를 도입하였다. 생성된 500 bp 단편을 pGEM-T 벡터에 클로닝하였다. 이 클론을 주형으로 사용하여 PCR로 두단계로 프로모터 영역에 위치한 EcoRI 및 HindⅢ 부위를 제거하였다. 이러한 PCR에서 BamHI 부위를 SAM1 프로모터의 상류에 도입하고, HindⅢ 부위를 이 프로모터의 3' 위치에 도입하였다. 제1 PCR 단계에서 세개의 프로모터 단편이 생성되었다. 프라이머 FR-Psam-248 5' CGG GAT CCT GCA GCG ATT TCA TTT TAG 3'(SEQ ID NO:8) 및 FR-Psam-249 5' ACA TGA ACG AAT GCA AAA TCT C 3' (SEQ ID NO:9)를 사용하면 제1 단편 (1)은 5' BamH I 부위 및 변이된 EcoRI 부위를 포함할 것이다. 프라이머 FR-Psam-250 5' AGA TTT TGC ATT CGT TCA TGT G 3'(SEQ ID NO:10) 및 FR-PSam-251 5' TGT AAG CAT TTC TTA GAT TCT C 3'(SEQ ID NO:11)를 이용하여 중간 단편 (2)를 얻었다. 이 단편은 단편 1 및 3과 부분적으로 중첩되며 EcoRI 및 HindⅢ 부위가 변이된 것이다. 제3 PCR 단편 (3)은 변이된 내부 HindⅢ 부위를 포함하며 전사 개시 부위의 NcoI 부위를 포함하는 프로모터의 3' 말단에 HindⅢ 부위를 도입하고 프라이머 FR-Psam-252 5' AAG AAA TGC TTA CAG GAT ATG G 3'(SEQ ID NO:12) 및 FR-Psam-253 5' GAC AAG CTT GAT CCC ATG GTG CTA CAA AGA ATA G 3'(SEQ ID NO:13)을 사용하여 생성하였다. 제2 PCR 단계에서, 세 단편 1, 2 및 3을 한개의 튜브 중에 함께 혼합하고 프라이머 FR-Psam-248 및 FR-Psam-253을 사용하여 증폭시켰다. 단편 1 과 2 및 2 와 3 사이의 중첩으로 인해, 상기 PCR로는 완전히 변이된 프로모터가 생성되었다. BamHI 및 HindⅢ로 분해한 후에, 생성된 SAM1 프로모터를 pBSK+ 벡터에 클로닝하였다. 그 후에, BamHI 및 NcoI 제한 부위를 사용하여 상류 영역을 교환함으로써, GUS인트론-TPI-Ⅱ 리포터 카세트를 포함하는 벡터에 SAM1 프로모터를 클로닝하였다. 이는 BamHI 및 NcoI로 SAM1 클론을 분해하고 아가로스 겔로부터 프로모터 단편을 단리하여 행하였다. 동일한 효소로 GUS 벡터를 분해하고, 그 후에, 벡터를 아가로스 겔로부터 단리하여 원래의 상류 서열 프로모터를 제거하였다. 그 후에, BamHI 및 EcoRI 분해에 의해 SAM1 프로모터-GUS인트론-TPI-Ⅱ 리포터 카세트를 벡터로부터 잘라내고 이후에 리포터 카세트를 아가로스 겔로부터 단리하고 BamHI 및 EcoRI로 분해시킨 이원 벡터 pMOG800으로 클로닝하였다. 감자 형질전환을 위해 생성된 이원 벡터 pMOG1402를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주에 도입하였다.

실시예 9: Pc-SAM1 키메라 프로모터 작제 및 GUS 유전자로의 융합

PCR 에 의해 흰꽃다지 Col-0로부터 플라스토시아닌 인핸서 (Pc)를 얻었다. 따라서, 인핸서 상류의 KpnI 제한 부위 및 플라스토시아닌 인핸서 하류의 HindⅢ 제한 부위를 도입하는 프라이머 FR-Pc-146(5'agt ggt acc atc ata ata ctc atc ctc ctt ca3')(SEQ ID NO:14) 및 프라이머 FR-Pc-247(5'cga agc ttt aca aat cta att tca tca cta aat cgg a3')(SEQ ID NO:15)를 개발했다. 클로닝한pfuDNA 중합 효소(stratagene)를 사용하여 95℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 4분 동안 30 주기 및 95℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 10분 동안 1 주기 반복하여 PCR을 수행하였다. KpnI 및 HindⅢ를 사용하여 생성된 PCR 단편을 하이 카피 클로닝 벡터 중에 접합시켜 구조물 pPM15.1을 생성시켰다.

프라이머 FR-Pc-145 5' GCT GCA ATA CAA ATC TAA TTT CAT CAC TAA ATC GG 3'(SEQ ID NO:16) 및 FR-Pc-146 5' AGT GGT ACC ATC ATA ATA CTC ATC CTC CTT C3'(SEQ ID NO:14)를 사용하는 PCR (95℃에서 1분, 50℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 30 주기 반복)에서 주형으로 상기 클론을 사용하였다. 이 PCR로 상류 KpnI 부위를 포함하고 SAM1 프로모터의 5' 측면에 중첩되는 Pc 인핸서(SEQ ID NO:17)를 포함하는 약 850 bp 단편이 생성되었다(실시예 8 참조). 그 후에, 실시예 8에 기재된 조절된 SAM1 프로모터를 포함하는 pBKS+ 클론을 사용하여 프라이머 FR-Psam-143 및 FR-Psam-144로 생성시킨 SAM1 프로모터의 PCR 단편과 상기 PCR 단편을 혼합하였다. 이 혼합물에 대한 PCR에서는 프라이머 FR-Psam-144 및 FR-Pc-146을 사용하여 PcSAM 키메라 프로모터를 생성하였다. 약 1.3 kb(SEQ ID NO:18)의 생성된 프로모터 단편을 kpnI 및 NcoI로 분해한 후에, 아가로스 겔로부터 단리하고, 그 후에 동일한 효소로 분해한 하이 카피 클로닝 벡터(pUC28)에 클로닝하였다. 그 후에, BamHI 및 NcoI으로 분해하여 이 벡터로부터 프로모터 단편을 잘라 내고, 상기 실시예 8에 기술된 바와 같이 GUS 인트론 유전자의 앞쪽에 클로닝하였다. 그 후에, 실시예 8의 SAM1-GUS-TPI-Ⅱ 리포터 카세트에 대해 기재된 바와 같이 pMOG800에 완전한 Pc-SAM-GUS-TPI-Ⅱ 리포터 카세트를 클로닝하였다. 감자 형질전환을 위해, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 EHA105에 생성된 이중 벡터 pMOG1400을 도입하였다.

실시예 10: Pc 인핸서 -35S 프로모터 제작 및 GUS 유전자로의 융합

PCR에 의해 흰꽃다지(Arabidopsis thaliana) Col-0의 플라스토시아닌 인핸서(Pc)를 얻었다(상기 참조).

프라이머 FR-Pc-291 5' GTC TTG TAC AAA TCT AAT TTC ATC ACT AAA TCG G3'(SEQ ID NO:19) 및 FR-Pc-146 5' AGT GGT ACC ATC ATA ATA CTC ATC CTC CTT C 3'(SEQ ID NO:14)을 사용하는 PCR(95℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분 동안 30 주기 반복. 이 부분에 기재된 기타 모든 PCR 반응을 동일한 프로그램으로 수행하였음)에서 주형으로 상기 클론을 사용하였다. 이 PCR로 상류 KpnI 부위를 포함하고 최소 35S 프로모터의 5' 측면에 중첩되는 Pc 인핸서를 포함하는 약 850 bp 단편이 생성되었다. 주형(35S 프로모터 및 오메가 5' UTR을 포함)으로 pMOG971 및 프라이머 FR-35S-292 5' TTA GAT TTG TAC AAG ACC CTT CCT CTA TAT AAG G 3'(SEQ ID NO:20) 및 ls19(SEQ ID NO:21)을 사용하는 PCR로 최소 35S 프로모터를 얻었다. 생성된 단편은 Pc 인핸서와 중첩되며 전사 개시 부위의 내부 NcoI 부위를 포함하였다. 그 후에, 두 개의 PCR 단편을 혼합하고, 프라이머 FR-Psam-146 및 Is19를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 후에, 생성된 단편을 kpnI 및 NcoI로 분해하고 아가로스 겔로부터 단리시켜 동일한 효소로 분해된 pUC28에 클로닝하였다. 생성된 클론을 이후에 BamHI 및 NcoI로 분해하고 프로모터 단편 (SEQ ID NO:22)을 아가로스 겔로부터 단리시켜 실시예 7에 기재된 GUS 유전자 상류에 클로닝하였다. 그 후에, 실시예 7에 기재된 바와 같이 이중 벡터 pMOG800에 완전한 리포터 카세트를 도입하였다. 감자 형질전환을 위해, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 EHA105에 생성된 이원 벡터 pMOG1401을 도입하였다.

실시예 11: 시험관 내 생장시킨 식물의 발현 수준 및 형태

형질전환된 식물을 생장시키고, 완전하게 재발생된 식물의 잎 샘플을 GUS 발현으로 분석하였다. 도 4에는 잎의 엽육조직, 잎의 도관계, 줄기 및 뿌리에서의발현 분석이 나타나 있다. 점수기록에서 GUS 발현 수준이 0인 것으로 나타났음에도, SAM1 형질전환 식물 잎의 엽육조직 부분에서는 매우 낮은 수준으로 GUS 염색이 관찰되었다.

Claims (15)

1. 프로모터 세트로부터의 최소 프로모터 및 식물에서 상보적 전사 형태 및 수준을 가지는 전사-활성화 요소를 포함함을 특징으로 하는 식물 프로모터.
2. 제1항에 있어서, 각 전사-활성화 요소가 절대적인 조직-특이성을 나타내는 것이 아니라, 대부분의 식물 부분에서 전사가 가장 활성인 식물 부분에서 도달되는 수준의 1 % 이상의 수준으로 전사 활성을 매개함을 특징으로 하는 식물 프로모터.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로모터 세트 중의 한 프로모터는 식물의 녹색 부분에서 특이적으로 활성이나, 다른 프로모터는 식물의 땅속 부분에서 특이적으로 활성임을 특징으로 하는 식물 프로모터.
4. 제3항에 있어서, 페레독신 및 RolD 프로모터의 조합임을 특징으로 하는 구성적 식물 프로모터.
5. 제4항에 있어서, 최소 프로모터 요소는 페레독신 프로모터로부터 유래함을 특징으로 하는 구성적 식물 프로모터.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 페레독신 프로모터가 흰꽃다지(Arabidopsisthaliana)에서 유래함을 특징으로 하는 구성적 식물 프로모터.
7. 제6항에 있어서, SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2의 서열을 포함함을 특징으로 하는 구성적 식물 프로모터.
8. 제7항에 있어서, SEQ ID NO:3의 서열을 포함함을 특징으로 하는 구성적 프로모터.
9. 제3항에 있어서, 플라스토시아닌 및 S-아데노실-메티오닌-1 프로모터의 조합임을 특징으로 하는 식물 프로모터.
10. 제9항에 있어서, 최소 프로모터 요소가 S-아데노실-메티오닌-1 프로모터로부터 유래함을 특징으로 하는 식물 프로모터.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 플라스토시아닌 프로모터가 흰꽃다지(Arabidopsis thaliana)로부터 유래함을 특징으로 하는 식물 프로모터.
12. 제9항, 제10항 또는 제11항에 있어서, S-아데노실-메티오닌-1 프로모터가 흰꽃다지(Arabidopsis thaliana)로부터 유래함을 특징으로 하는 식물 프로모터.
13. 제12항에 있어서, SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:17의 서열을 포함함을 특징으로 하는 식물 프로모터.
14. 제13항에 있어서, SEQ ID NO:21의 서열을 포함함을 특징으로 하는 식물 프로모터.
15. 식물 중에 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 프로모터를 포함하는 유전자를 발현시키는 키메라 유전자 구조물.