DE69434624T2

DE69434624T2 - Chimäre regulatorische regionen und gen - kassetten zur genexpression in pflanzen

Info

Publication number: DE69434624T2
Application number: DE69434624T
Authority: DE
Inventors: B. Stanton West Lafayette GELVIN; Randal Aurora HAUPTMANN; Min Albany NI; Decai Taian City CUI
Original assignee: Biotechnology Research and Development Corp; Purdue Research Foundation
Current assignee: Biotechnology Research and Development Corp; Purdue Research Foundation
Priority date: 1993-11-19
Filing date: 1994-11-17
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2014-11-18
Also published as: RU2142998C1; JP3347736B2; AU1288595A; WO1995014098A1; CN1136825A; ATE317445T1; CA2174954A1; KR960705939A; AU687961B2; CA2174954C; BR9408093A; EP0729514A1; EP0729514B1; JPH09505205A; DE69434624D1; US5955646A; CN1061376C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft chimäre regulatorische Regionen, die zur Steuerung der Expression von Genen in Pflanzen nützlich sind. Diese chimären regulatorischen Regionen können von Opinsynthase-Genen des Pflanzenpathogens Agrobacterium tumefaciens sein.
Agrobacterium tumefaciens ist ein gramnegatives Bodenbakterium, das die meisten dikotylen und manche monokotylen Pflanzen befällt. Eine Infektion mit Agrobacterium tumefaciens führt häufig zur Bildung von Kronengallentumoren an der infizierten Pflanze.
Während des A.-tumefaciens-Infektionsprozesses wird ein bestimmtes DNA-Segment("T-DNA") des großen tumorinduzierenden Plasmids ("Ti-Plasmids") in eine empfängliche Pflanzenzelle transferiert und in das Kerngenom der Pflanze integriert, wodurch es zur Expression der T-DNA-Gene kommt. Manche T-DNA-Gene kodieren für Enzyme, die an der Synthese von Hormonen beteiligt sind, die in Pflanzen aktiv sind. Diese Hormone können in infizierten Pflanzen Tumore herbeiführen. Andere T-DNA-Gene lenken die Synthese und Sekretion von einzigartigen Aminosäure- und Zuckerderivaten, so genannten Opinen. Agrobacterium tumefaciens kann diese Opine als Kohlenstoff- und manchmal auch Stickstoffquelle nutzen. Siehe Gelvin, Plant Physiol. 92: 281-85 (1990); Gelvin, TRANSGENIC PLANTS (Academic Press 1993); Ream, Ann. Rev. Phytopathol. 27: 583-618 (1989); Zambryski, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 465-90 (1992).
T-DNA-Gene enthalten Regionen, die in pflanzlicher Umgebung funktionell sind und Ähnlichkeiten mit regulatorischen Regionen von Pflanzen aufweisen. Beispielsweise enthalten die meisten Pflanzenpromotoren cis-aktive Element wie stromaufwärts gelegene Aktivierungssequenzen ("UAS") (häufig auch "Enhancer" genannt), die über bindende trans-aktive Faktoren die Promotorstärke und das gewebespezifische Expressionsmuster festlegen oder beeinflussen. Atchison, Annu. Rev. Cell Biol. 4: 127-53 (1988). Die Gesamtstärke eines bestimmten Promotors sowie sein Expressionsmuster können durch die Kombination und räumliche Ausrichtung von cis-aktiven Elementen und die Anwesenheit der nuklearen Faktoren, die mit diesen Elementen wechselwirken, beeinflusst werden. Dynan, Cell 58: 1-4 (1989). Auch wenn anfänglich auf einem Prokaryontenplasmid vorhanden, besitzen T-DNA-Gene sämtliche Sequenzelemente (Promotoren und UAS), die für die Transkrip tion in Pflanzen erforderlich sind. Beispielsweise enthalten T-DNA-Gene TATA-Boxen, die die Transkriptionsstartstelle festlegen, und häufig stromaufwärts gelegene Elemente, die sich mehr als 100 bp von der Transkriptionsstartstelle befinden und die Transkriptionsniveaus modulieren. Siehe Gelvin, TRANSGENIC PLANTS (Academic Press 1993).
Zwei T-DNA-Gene, die stromaufwärts befindliche Aktivierungssequenzen besitzen, sind die Octopinsynthase-(ocs)- und Mannopinsynthase-(mas)-Gene. Die ocs-Gene kodieren für ein Produkt, das Arginin und Pyruvat zur Bildung von Octopin kondensiert.
Hack und Kemp, Plant Physiol. 65: 949-55 (1980). Ein 16-Basenpaar-Palindrom, das stromaufwärts des ocs-Gens liegt, kann einen heterologen Mais-adh1-Promotor in einem transienten Expressionssystem aktivieren. Ellis et al., EMBO J. 6: 11-16 (1987); Ellis et al., EMBO J. 6: 3203-08 (1987). Dieses Palindrom ist auch für die Aktivität des ocs-Promotors in dauerhaft transformierten Tabakkallussen essentiell. Leisner und Gelvin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2553-57 (1988); Leisner und Gelvin, Plant Cell 1: 925-36 (1989).
Die mas-1'- und -2'-Gene haben einen gemeinsamen dualen bidirektionalen Promotor und eine 479 bp große intergene Region. Diese Gene kodieren für Enzyme für einen zweistufigen Pfad für die Synthese von Mannopin. Ellis et al., Mol. Gen. Genet. 195: 466-73 (1984); Komro et al., Plant Mol. Biol. 4: 253-63 (1985). Die Transkription der mas-Gene verläuft divergent, und die intergene Region enthält alle cis-aktiven Elemente, die für die Transkription beider Gene notwendig sind. DiRita und Gelvin, Mol. Gen. Genet. 207: 233-41 (1987); Fox et al., Plant Mol. Biol. 20: 219-33 (1992); Leung et al., Mol. Gen. Genet. 230: 463-74 (1991); Guevara-Garcia et al., Plant J. 4: 495-505 (1993).
Die ocs- und mas-Genpromotoren werden zur Steuerung der Expression von verknüpften Genen in transgenen Pflanzen verwendet. Aufgrund von schwachen Expressionsniveaus in bestimmten Geweben transgener Pflanzen ist die Anwendung dieser Promotoren jedoch beschränkt. DiRita und Gelvin, supra; Harpster et al., Mol. Gen. Genet. 212: 182-90 (1988); Sanger et al., Plant Mol. Biol. 14: 933-43 (1990). Beispielsweise steuert der ocs-Promotor ein eigenes, zellspezifisches Expressionsmuster in transgenen Tabakpflanzen. Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27 (1992). Das mas-Gen zeigt in Blättern und Stielen eine schwache Expression, hat aber eine stärkere Expression in Wurzeln und zeigt eine Grad an Wund- und Auxininduzierbarkeit. Langridge et al., Proc. Natl. Acad. Sci 86: 7890-94 (1989); Teeri et al., EMBO J., 8: 343-50 (1989); Saito et al., Planta 184: 40-46 (1991); Guevara-Garcia et al., loc. cit.
Da Promotoren und andere regulatorische Regionen unterschiedliche Stärken und Gewebespezifitäten aufweisen, wurden bestimmte rekombinante regulatorische Regionen entwickelt. Beispielsweise können Enhancer-Elemente, die bestimmte trans-aktive Faktoren spezifisch binden, die Transkriptionsaktivität und das zellspezifische Expressionsmuster modulieren. Bienz und Pelham, Cell 45: 753-60 (1986).
Die Verwendung von bestimmten konstitutiven Promotoren wie Blumenkohlmosaikvirus-(CaMV)-35S-Konstrukten ist ebenfalls bekannt. Der CaMV-35S-Promotor hat Aktivatoren mit multiplen Domänen, die auf umwelt- und gewebespezifische Weise zur Aktivierung des 35S-Promotors funktionieren können. Siehe Benfey et al., EMBO J. 8: 2195-2202 (1989); Benfey et al., EMBO J. 9: 1677-1684 (1990); Benfey et al., EMBO J. 9: 1685-96.
Koziel et al., Bio/Technology 11: 194-199 (1993) betrifft im Allgemeinen Promotoren, die in einer Promotor-Stapelkonstruktion zur Erzielung einer gewebespezifischen Promotion eines heterologen Gens verwendet werden. Koziel zeigt die Konstruktion eines Genexpressionssystems mit einem trunkierten cryIA(b)-Gen (das verwendete Genfragment kodiert für die ersten 648 Aminosäuren eines insektiziden Proteins aus Bacillus thuringiensis mit 1155 Aminosäuren), das entweder mit einem CaMV-35S-Promotor oder einer Kombination von zwei aus Getreide abgeleiteten gewebespezifischen Promotoren (Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Promotor ("PEPC-Promotor") und einem pollenspezifischen Promotor) verbunden ist. Koziel berichtet über hohe Expressionsniveaus von beiden Promotorkonfigurationen. Koziel et al. verwendeten auch (1) den PEPC-Promotor, von dem man weiß, dass er eine grüne gewebespezifische Expression bewirkt, und (2) einen maispollenspezifischen Promotor. Die Expression des insektiziden Proteins reicht von beobachteten 1500-4000 ng/mg Protein, was scheinbar ein recht hohes Expressionsniveau ist. Darüber hinaus führte der Einsatz der PEPC/pollenspezifischen Promotoren zu einer gewebespezifischen Expression.
Andere versuchten die rekombinante Expression mittels anderer Techniken. Bevan et al., PCT/GB92/00566 (1992) betrifft im Allgemeinen die stapellose Anwendung eines einzigen, vom Promotor von Koziel et al. unterschiedlichen Promotors zur Erzielung einer gewebespezifischen Expression eines heterologen Gens. Diese Anwendung betrifft offenbar den Einsatz des Bohnen-Phenylalaninammoniak-Lyase-Promotors ("PAL-Promotors") zur Ermöglichung einer gewebespezifischen Expression. Es wurde ein Hybrid-Gen konstruiert, das die "vermeintlichen regulatorischen Transkriptionsregionen" eines genomischen Klons von PAL (d.h. eines Klons, der neben den kodierenden Sequenzen intervenierende Sequenzen enthält, die Teil der PAL-Gensequenz sind) und einen offenen Leserahmen ("ORF") mit 68 Aminosäuren des aminoterminalen PAL-Proteins mit dem gesamten ORF von β-Glucuronidase ("GUS"), gefolgt von einer Polyadenylierungs- und transkriptionellen Terminationsregion der Nopalinsynthase, verschmolz (die beiden letzteren Elemente verschmelzen typischerweise in den meisten eukaryontischen Pflanzenexpressionsvektoren zur Sicherung einer effizienten Expression). Während dieses anfängliche Konstrukt eine starke Aktivität in manchen Pflanzen zeigte, erzeugten die Forscher anschließend Deletionen in den PAL-Promotorregionen des Hybrid-Gens. Der für eine vollständige Expression nötige minimale PAL-Promotor wurde 253 Basenpaare von der Transkriptionsstartstelle von PAL gefunden. Durch Variieren der Deletionsmuster hauptsächlich innerhalb dieser minimalen Region fanden die Forscher, dass die gewebespezifische Expression zu einem gewissen Grad modifiziert werden konnte.
Die US 5,034,322 betrifft im Allgemeinen die Verwendung von Nopalinsynthase-Promotoren mit einem Gen einer kleinen Untereinheit einer Ribulose-1,5-bis-phosphat-Carboxylase.
Es wurde auch berichtet, dass ein chimärer Promotor, genannt "Mac", der die mas-Region von +65 bis –301 und die 35S-Enhancer-Region von –90 bis –941 inkorporiert, in transgenen Tabakpflanzen eine GUS-Aktivität auf einem Niveau zeigt, das um ein Vielfaches höher als von einem Doppel-CaMV-35S-Promotor ist, Comai et al., Plant Mol. Biol. 15: 373-81 (1990).
Die oben beschriebenen Konstrukte weisen mehrere Einschränkungen auf, was die Expressionseffizienz und Steuerbarkeit betrifft. Beispielsweise war es mittels früherer Ansätze nicht möglich, eine starke Expression auf konstitutive Weise dort zu erzielen, wo eine derartige Expression erwünscht war.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, chimäre regulatorische Regionen für eine verbesserte Expression von Genen in Pflanzen zu schaffen.
Es ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, chimäre regulatorische Regionen zu schaffen, die Promotoren und stromaufwärts befindliche Aktivierungssequenzen aus Agrobacterium tumefaciens aufweisen.
Es ist ein noch anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, Gen-Kassetten zu schaffen, die Gene enthalten, welche unter der Steuerung von chimären regulatorischen Regionen zu exprimieren sind, die Promotoren und stromaufwärts befindliche Aktivierungssequenzen aus Agrobacterium tumefaciens aufweisen.
Es ist ein noch anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, die induzierbare Expression von Fremdgenen in Pflanzen zu ermöglichen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Plasmide und transgene Pflanzen bereit zu stellen, die Gen-Kassetten enthalten.
Zur Erreichung dieser und anderer Ziele sind gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung chimäre regulatorische Regionen zur Expression eines Gens in einer Pflanze vorgesehen, umfassend eine stromaufwärts befindliche Aktivierungssequenz eines Agrobacterium-tumefaciens-Octopinsynthase-Gens, funktionell verknüpft mit einem Promotor einer Agrobacterium-tumefaciens-Mannopinsynthase.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind chimäre regulatorische Regionen zur Expression eines Gens in einer Pflanze vorgesehen, umfassend Vielfache von zwei stromaufwärts befindlichen Aktivierungssequenzen eines oder mehrerer Agrobacterium-tumefaciens-Octopinsynthase-Gene, funktionell verknüpft mit einem Promotor einer Agrobacterium-tumefaciens-Mannopinsynthase.
Gemäß einem noch anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Gen-Kassetten vorgesehen, enthaltend ein zu exprimierendes Gen, funktionell verknüpft mit einer chimären regulatorischen Region wie oben beschrieben. Eine Gen-Kassette kann auch Transkriptionsterminatoren und Polyadenylierungssignale wie das Nopalinsynthase-Polyadenylierungssignal enthalten.
Die chimäre regulatorische Region bzw. die Kassette zur in duzierbaren Expression eines Fremdgens, umfassend ein Fremdgen funktionell verknüpft mit einer regulatorischen Region umfassend einen Promotor eines Mannopinsynthase-Gens von Agrobacterium tumefaciens, kann vorzugsweise eine stromaufwärts befindliche Aktivierungssequenz eines Mannopinsynthase-Gens von Agrobacterium tumefaciens aufweisen.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Expression eines Gens in einer Pflanze vorgesehen, umfassend a) das Bilden einer chimären regulatorischen Region oder einer Kassette gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 durch funktionelles Verknüpfen des Gens mit dem Promotor der Agrobacterium-tumefaciens-Mannopinsynthase; b) das Insertieren des Gens und der chimären regulatorischen Region oder Kassette in die Pflanze; und c) das Ermöglichen der Expression des Gens durch die Pflanze.
Gemäß einem noch anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Plasmide und transgene Pflanzen umfassend chimäre regulatorische Regionen und Gen-Kassetten der vorliegenden Erfindung vorgesehen.
Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus den hierin enthaltenen Ausführungen, Daten und Figuren hervor.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt schematisch die Struktur von chimären regulatorischen Regionen auf mas- und ocs-Basis. Die Pfeile zeigen die Ausrichtung der stromaufwärts befindlichen Aktivierungssequenz in Bezug auf die mas- oder ocs-Promotoren an. Die Zahlen geben die Nukleotid-Position in Bezug auf die Transkriptionsstartstellen an. In den Konstrukten 3 und 4 wurde ein Trimer der stromaufwärts befindlichen ocs-Aktivierungssequenz verwendet. In den Konstrukten 5 und 6 wurde ein Monomer oder ein Trimer der stromaufwärts befindlichen ocs-Aktivierungssequenz verwendet.
2 zeigt die GUS-Aktivität von Konstrukten auf mas-Promotor-Basis in Extrakten von primären Tabaktransformanten. Die GUS-Aktivität wurde unter Verwendung von Gesamtprotein untersucht, das aus Geweben von Blättern (Diagramm A), Stielen (Diagramm B) bzw. Wurzeln (Diagramm C) hergestellt wurde. Jeder Balken repräsentiert die Aktivität eines einzelnen Transformanten. Die verschiedenen Konstrukte sind unterhalb des Diagramms angeführt. Die Anzahl der pro Konstrukt untersuchten, einzelnen transgenen Pflanzen ist mit "n" angegeben. Die durchschnittliche GUS-Aktivität für jedes Konstrukt ist mit "x" angegeben. A = Aktivierungssequenz; P = Promotor; (Aocs)₃ = Trimer der ocs-Aktivierungssequenz.
3 zeigt die GUS-Aktivität von Konstrukten auf Basis von mas-Promotoren plus Aktivierungssequenzen in Extrakten von primären Tabaktransformanten. Die GUS-Aktivität wurde unter Verwendung von Gesamtprotein untersucht, das aus Geweben von Blättern (Diagramm A), Stielen (Diagramm B) bzw. Wurzeln (Diagramm C) hergestellt wurde. Jeder Balken repräsentiert die Aktivität eines einzelnen Transformanten. Die Anzahl der pro Konstrukt untersuchten, einzelnen transgenen Pflanzen ist mit "n" angegeben. Die verschiedenen Konstrukte sind unterhalb des Diagramms angeführt. Die durchschnittliche GUS-Aktivität für jedes Konstrukt ist mit "x" angegeben. A = Aktivierungssequenz; P = Promotor; (AocsAmasPmas) = Monomer der ocs-Aktivierungssequenz verknüpft mit der mas-Aktivierungssequenz plus Promotor; (Aocs)₃AmasPmas = Trimer der ocs-Aktivierungssequenz verknüpft mit der mas-Aktiverungssequenz plus Promotor.
4 zeigt die GUS-Aktivität von Konstrukten auf ocs-Promotor-Basis in Extrakten von primären Tabaktransformanten. Die GUS-Aktivität wurde unter Verwendung von Gesamtprotein untersucht, das aus Geweben von Blättern (Diagramm A), Stielen (Diagramm B) bzw. Wurzeln (Diagramm C) hergestellt wurde. Jeder Balken repräsentiert die Aktivität eines einzelnen Transformanten. Die verschiedenen Konstrukte sind unterhalb des Diagramms angeführt. Die Anzahl der pro Konstrukt untersuchten, einzelnen transgenen Pflanzen ist mit "n" angegeben. Die durchschnittliche GUS-Aktivität für jedes Konstrukt ist mit "x" angegeben. A = Aktivierungssequenz; P = Promotor; Amas' = mas-Region –213 bis –318; Amas'' = mas-Region –111 bis –318.
5 zeigt die GUS-Aktivität von Konstrukten auf Basis eines ocs-Promotors und einer Aktivierungssequenz in Extrakten von primären Tabaktransformanten. Die GUS-Aktivität wurde unter Verwendung von Gesamtprotein untersucht, das aus Geweben von Blättern (Diagramm A), Stielen (Diagramm B) bzw. Wurzeln (Diagramm C) hergestellt wurde. Jeder Balken repräsentiert die Aktivität eines einzelnen Transformanten. Die verschiedenen Konstrukte sind unterhalb des Diagramms angeführt. Die Anzahl der pro Konstrukt untersuchten, einzelnen transgenen Pflanzen ist mit "n" angegeben. Die durchschnittliche GUS-Aktivität für jedes Konstrukt ist mit "x" angegeben. A = Aktivierungssequenz; P = Promotor; Amas' = mas-Region –213 bis –318; Amas'' = mas-Region –111 bis –318.
6 zeigt die approximativen Expressionsniveaus der GUS-Aktivität von Doppel-CaMV-35S- und Mac-Promotoren in den Blättern (Doppel-35SL, MacL), Stielen (Doppel-35SS, MacS) und Wurzeln (Doppel-35SR-MacR) mehrerer transgener Tabakpflanzen.
7 zeigt schematisch die in den Studien über induzierbare Expression verwendeten Konstrukte. "UAS" = stromaufwärts befindliche Aktivierungssequenz; "pmas" = mas-Promotor; "GUS" = β-Glucuronidase-Gen; und "NOS" = Nopalinsynthase-Polyadenylierungssignale.
8 zeigt das Niveau der GUS-Aktivität in gereinigten reifen Nematodeneiern. Die Versuche wurden bei pH 5,5 und 7,5 durchgeführt, um auf bakterielle oder tierische GUS-Aktivitäten zu überprüfen.
9 zeigt die Nematoden-induzierte GUS-Aktivität in verschiedenen transgenen Pflanzen. Feld A steht für transgene Pflanzen mit einem Pmas-Promotor, aber ohne Aktivierungssequenz. Feld B steht für transgene Pflanzen mit einem AmasPmas-Promotor. Feld C steht für transgene Pflanzen mit einem AocsAmasPmas-Promotor.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrifft chimäre regulatorische Regionen umfassend verschiedene stromaufwärts befindliche Aktivierungssequenzen und Promotoren eines Agrobacterium tumefaciens-Opinsynthase-Gens, die zur Steuerung der Expression von Fremdgenen nützlich sind. Ein Fremdgen enthält irgendeine DNA, die man in der transgenen Pflanze exprimieren will. Dabei wird das Gen, egal von welcher Quelle es stammt, in das pflanzliche Genom insertiert und ist somit an der Insertionsstelle für die Pflanze fremd, auch wenn das Gen von der Pflanze stammt, die transformiert wird. Erfindungskonstrukte gemäß der vorliegenden Erfindung sind auch in der US-Patentanmeldung Ser. Nr. 08/155,067 vom 19. November 1993 offenbart.
Für die vorliegende Erfindung eignet sich jede Art von Genkodiertem Produkt. In transgenen Pflanzen mit der vorliegenden Erfindung zu exprimierende Fremdgene sind beispielsweise, aber nicht ausschließlich β-Glucuronidase; Gene, die für insektizide und fungizide Toxine kodieren; gegen Krankheitserreger resistente Verbindungen; Verbindungen mit Überempfindlichkeitsreaktionen wie Peroxidasen, Glucanasen und Chitinasen, sowie Phytoalexine; Pestizid-, Herbizid- und Fungizid-Toleranzgene; Pflanzenenzyme wie jene in Zusammenhang mit Protein-, Stärke-, Zucker- und Fettgehalten; Pflanzenenzym-Inhibitoren wie Protease- und Amylase-Inhibitoren; Pflanzenhormone; Insektenhormone und -pheromone; pharmazeutische und Nahrungsmittelverbindungen wie β-Karotin; Vitamine und Antikörper einschließlich Fragmenten und einkettigen Derivaten von Antikörpern; und Antisense-Transkripte zur Interferenz mit in der Pflanze vorhandenen Nucleotidsequenzen. Siehe z.B. Kung und Wu, TRANSGENIC PLANTS, Bd. 1 (Academic Press 1993).
Im Allgemeinen ist der native Mannopinsynthase-Promotor plus Aktivierungssequenz oder der native Octopinsynthase-Promotor plus Aktivierungssequenz relativ schwach in den Geweben von transgenen Tabakpflanzen (die GUS-Aktivität von verknüpften gusA-Reportergenen beträgt einige hundert bis einige tausend GUS-Aktivitätseinheiten). Gemäß der vorliegenden Erfindung steigert die Stapelung der UAS aus diesen Genen zu einem Promotor plus Aktivierungssequenz die GUS-Aktivität aus einem verknüpften gusA-Gen merkbar um bis zu zwei Größenordnungen, was zu Aktivitäten von bis zu hunderttausend GUS-Aktivitätseinheiten führt. Die histochemische Untersuchung der Gewebe von transgenen Tabakpflanzen, die diese erfindungsgemäßen Promotor-gusA-Fusionsgene exprimieren, zeigt, dass die neuen, erfindungsgemäßen Kombinationen von Promotor und Aktivierungssequenz in den meisten Pflanzenzelltypen funktionieren. Diese Kombinationen (chimären regulatorischen Regionen) können daher viel konstitutiver sein als die aus dem Stand der Technik bekannten Promotoren.
Die Erfindung betrifft verbesserte regulatorische Regionen von Pflanzen, die zu einer starken und anhaltenden Förderung der Genexpression fähig sind. Darüber hinaus kann eine gewebeunspezifische und/oder gewebeverstärkte Expression erzielt werden. Die gewünschte Art der Expression ergibt sich aus der Wahl der Aktivierungssequenzen und Promotoren gemäß der Erfindung.
Die erfindungsgemäßen chimären regulatorischen Regionen zeigen in Tabak stärkere Expressionscharakteristika als jede andere bekannte regulatorische Region.
Tabak ist vielleicht das am meisten verwendete Modell für Pflanzentransformation. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen regulatorischen Regionen beinahe konstitutiv (ständig aktiviert) und potentiell nützlich bei einer größeren Anzahl von Pflanzengeweben als die regulatorischen Regionen des Standes der Technik sein.
Die Erfindung betrifft eine chimäre regulatorische Region zur Genexpression in Pflanzen, die eine stromaufwärts befindliche Aktivierungssequenz eines Agro-bacterium-tumefaciens-Octopinsynthase-Gens umfassen kann, funktionell verknüpft mit einer Promotorsequenz eines Agrobacterium-tumefaciens-Mannopinsynthase-Gens oder einer stromaufwärts befindlichen Aktivierungs- und Promotorsequenz eines Agrobacterium-tumefaciens-Mannopinsynthase-Gens.
Die erfindungsgemäßen chimären regulatorischen Regionen können mit einer Fremdgen-Sequenz funktionell verknüpft sein, die mit einer pflanzenfunktionellen Terminatorsequenz und dann mit einer pflanzenfunktionellen Polyadenylierungssignal-Sequenz funktionell verknüpft sein kann. Die chimäre regulatorische Region ist gemäß einem Aspekt der Erfindung in vielen Fällen hoch konstitutiv.
Eine stromaufwärts befindliche Aktivierungssequenz ist eine Sequenz, die im nativen Zustand üblicherweise mindestens 100 Basenpaare vor der nativen Transkriptionsstartstelle liegt und Einfluss auf die Expression nehmen kann. Die UAS von Octopin- und Mannopinsynthase-Genen sind diesbezüglich von besonderem Nutzen. Diese UAS können dann mit einer Promotorsequenz oder mit einer stromaufwärts befindlichen Aktivierungssequenz und Promotorsequenz eines Agrobacterium-tumefaciens-Mannopinsynthase-Gens funktionell verknüpft sein.
Der Ausdruck "abgeleitet" in Zusammenhang mit DNA-Regionen wie Promotoren und stromaufwärts befindlichen Aktivierungssequenzen bezieht sich auf Situationen, wo die "abgeleitete" DNA-Region aus einer natürlich vorkommenden DNA-Region oder anderen Quellen-DNA-Region erhalten ist oder auf dieser basiert. Die "abgeleitete" DNA-Region kann sich, üblicherweise durch bewusste Mutation, von der natürlich vorkommenden DNA-Region oder anderen Quellen-DNA-Region unterscheiden.
Der Passus "funktionell verknüpft" bezieht sich auf (eine) erste Sequenz(en), die ausreichend proximal zu (einer) zweiten Sequenz(en) angeordnet ist/sind, so dass die erste Sequenz(en) Einfluss auf die zweite(n) Sequenz(en) oder eine unter der Steuerung dieser zweiten Sequenz stehende Region nehmen kann/können. Beispielsweise kann eine UAS funktionell mit einem Promotor verknüpft sein, wodurch die UAS die Transkriptionsstärke des Promotors erhöht. Dabei liegen die UAS typischerweise 5' zum Promotor. Die UAS und der Promotor können ihrerseits funktionell mit einem Gen verknüpft sein, so dass das Gen unter der Steuerung der UAS/Promotor-Kombination exprimiert wird, die typischerweise 5' zum Gen liegt. Üblicherweise befindet sich ein Promotor innerhalb von etwa 30-50 Basenpaaren von der Startstelle der Transkription und innerhalb von einigen hundert Basenpaaren von der Startstelle der Translation. Eine Aktivierungssequenz befindet sich üblicherweise innerhalb von einigen hundert Basenpaaren eines Promotors. Beispielsweise liegen die meisten Aktivierungssequenzen innerhalb von etwa 300 bis 400 Basenpaaren des Promotors, der verstärkt wird. In Ausführungsformen der Erfindung, in denen mehr als eine Aktivierungssequenz verwendet wird, liegen die Aktivierungssequenzen üblicherweise innerhalb von etwa 100 bis 200 Basenpaaren voneinander.
Es kann eine erfindungsgemäße chimäre regulatorische Region konstruiert werden, worin sich die Quellen-Opinsynthase-Gene voneinander unterscheiden und vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe von Opinsynthase-Genen bestehend aus Mannopin-, Octopin-, Nopalin- und Agropinsynthase-Genen.
Die Expression der GUS-Aktivität, die durch die nativen mas- und ocs-Promotoren plus Aktivierungssequenzen gesteuert wird, ist auf spezifische Zelltypen beschränkt. Die funktionelle Verknüpfung einer ocs-Aktivierungssequenz mit dem mas-Promotor plus Aktivierungssequenz sowie die funktionelle Verknüpfung einer mas-Aktivierungssequenz mit dem ocs-Promotor plus Aktivierungssequenz zeigte ein moduliertes Expressionsmuster bei einem Vergleich mit nativen Konstrukten. Somit können gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung die GUS-Expression sowie andere Gene bei einer großen Anzahl von Zelltypen, einschließlich Xylemgefäßen und Blattepidermiszellen, erreicht werden. Andererseits können begrenzte Expressionsmuster ebenfalls gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung erhalten werden. Eine chimäre regulatorische Region, die funktionell mit einer ocs-UAS und einem minimalen mas- Promotor verknüpft ist, liefert eine verringerte Expression in Blattgefäßgewebe und eine auf das Phloemgewebe beschränkte Stielexpression.
Die Erfindung betrifft auch eine rekombinante Gen-Kassette, die für ein Fremdpolypeptid kodiert. Eine rekombinante Gen-Kassette kann eine stromaufwärts befindliche Aktivierungssequenz eines Agrobacterium-tumefaciens-Octopinsynthase-Gens und eine Promotorsequenz oder eine stromaufwärts befindliche Aktivierungs- und Promotorsequenz eines Agrobacterium-tumefaciens-Mannopinsynthase-Gens umfassen, die alle funktionell mit einer Fremdgensequenz verknüpft sind. Die Fremdgen-Sequenz des Konstrukts kann mit einer pflanzenfunktionellen Terminatorsequenz und/oder einer pflanzenfunktionellen Polyadenylierungssignalsequenz funktionell verknüpft sein, so dass die Terminatorsequenz und das Polyadenylierungssignal auf das Gen oder das Transkript des Gens Einfluss nehmen können. Die Terminatorsequenz und das Polyadenylierungssignal befinden sich 3' zum Gen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung bezieht sich auf Kombinationen aus Promotor und stromaufwärts befindlicher Aktivierungssequenz (regulatorische Regionen), die bei Verwundung oder Schädlingsfraß induzierbar sind. Eine entwickelte Kombination (AmasPmas) wird vorzugsweise im Wurzelgewebe exprimiert und bei Schädlingsattacken induziert, während eine andere (AocsAmasPmas) allgemeiner exprimiert wird, aber bei Schädlingsattacken weiter induziert wird. Diese Expressionssysteme sind nützlich für Gene, die auf Wurzelschädlinge wie Nematoden oder Pilze gerichtet sind, und können auch gegen Insektenschädlinge und Blattkrankheitserreger angewendet werden. Beispielsweise können für nematozide Toxine und Proteine kodierende Gene, die den Reproduktionszyklus von Nematoden stören, mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Ein Befall mit Krankheitserregern induziert die chimären regulatorischen Regionen unter Verwendung des Mannopinsynthase-Promotors mit entweder mas- oder ocs-Aktivierungssequenzen wie oben beschrieben. Eine Vielzahl von Genen, die für Pathogen-Resistenz nützlich sind, ist in Keen, Plant Molec. Biol. 19: 109-22 (1992) besprochen.
Transkriptionselemente, wie Promotoren und stromaufwärts befindliche Aktivierungssequenzen, der Opinsynthase-Gene sind auf der Basis von verfügbaren Sequenzinformationen einfach zu erhal ten. Transkriptionselemente für die Octopinsynthase-Gene sind zum Beispiel in Leisner et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 2553-57 (1988); Leisner et al., Plant Cell 1: 9025-36 (1989) offenbart. Transkriptionselemente für Mannopinsynthase-Gene sind in DiRita und Gelvin, supra, Fox et al., Plant Molec. Biol. 20: 219-33 (1992); Leung et al., Mol. Gen. Genet. 230: 463-74 (1991); Langridge et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 3219-23 (1989) offenbart. Transkriptionselemente für Nopalinsynthase-Gene sind in Ha et al., Nucl. Acids Res. 17: 215-23 (1989); Mitra et al., Mol. Gen. Genet. 215: 294-99 (1989); Ebert et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 5745-49 (1987), An et al., Mol. Gen. Genet. 203: 245-50 (1986) offenbart. Transkriptionelle Steuerelemente für das Agropinsynthase-Gen sind in Bandyopadhyay et al., J. Biol. Chem. 264: 19399-406 (1989) offenbart. Darüber hinaus ist die Gesamtsequenz einer T-DNA in Barker et al., Plant Molec. Biol. 2: 335-50 (1983) offenbart.
Durch Befolgen der darin enthaltenen Lehren können verschiedene Expressionsniveaus und -muster erhalten werden. Die Expressionsmenge und das Expressionsmuster, die durch eine bestimmte Ausführungsform erhalten werden, können mit Hilfe von Markersystemen wie gusA, die hierin beschrieben sind, evaluiert werden. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Diese Beispiele veranschaulichen die Erfindung, schränken diese jedoch in keiner Weise ein.
BEISPIEL 1 Die Zugabe einer stromaufwärts befindlichen ocs- oder mas-Aktivierungssequenz zu einem mas- oder ocs-Promotor plus Aktivierungssequenz erhöht die GUS-Expression stark
Es wurden neue Kombinationen von mas- und ocs-Promotoren und stromaufwärts befindlichen Aktivierungssequenzen geschaffen, wie in 1 gezeigt. Es wurden verschiedene Subdomänen von mas-UAS getestet, weil eine frühere Deletionsanalyse ergeben hat, dass Sequenzen innerhalb von 138 Basen stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle für den genauen Transkriptionsstart eines mas2'/nptII-Fusionsgens im Kronengallengewebe von Sonnenblumen ausreichend sind. Sequenzen zwischen –138 und –318 können jedoch auch an der Regulierung des quantitativen Niveaus der mas2'-Promotoraktivität beteiligt sein. DiRita und Gelvin, Mol. Gen. Genet. 207: 233-41 (1987). Die untersuchten mas-UAS waren: (i) UAS = –318 bis –138; (ii) UAS' = –318 bis –213; und (iii) UAS'' = –318 bis –111. Siehe 1.
Eine erste Gruppe von chimären regulatorischen Regionen wurde konstruiert und unter Verwendung zweier Deletionen des mas-Promotors –318 und –138 Basenpaare von der Transkriptionsstartstelle als Transkriptionsfusionen an ein uidA-(gusA)-Gen fixiert (Konstrukte 1 bis 6 der 1). Die erste Gruppe von chimären regulatorischen Regionen enthält (in jeder Ausrichtung) ein Monomer oder ein Trimer der ocs-Aktivierungssequenz (–116 bis –333) stromaufwärts der –138-mas-Promotor-Deletion (Konstrukte 3 und 4 der 1). Die zweite Gruppe von chimären regulatorischen Regionen enthält ähnliche Monomere oder Trimere von ocs-Aktivierungssequenzen stromaufwärts der –318-mas-Promotor-Deletion (Konstrukte 5 und 6 der 1). Diese ocs-Region enthält ein Palindrom mit 16 Basenpaaren sowie 5'- und 3'-Modulatorsequenzen, die bei der Aktivierung des ocs-Promotors in Tabakkallussen und -pflanzen wichtig sind, wenn sie auf Dauer im Pflanzengenom eingebaut sind. Leisner und Gelvin, 1988 und 1989 supra; Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27 (1992).
Eine zweite Gruppe von chimären regulatorischen Regionen wurde als Translationsfusionen an ein uidA-Gen konstruiert, basierend auf zwei ocs-Deletionen in den Positionen –333 und –116 von der Transkriptionsstartstelle (Konstrukte 8 bis 16 der 1). Es wurden zwei Regionen mit stromaufwärts befindlichen mas-Aktivierungssequenzen hergestellt. Eine kurze mas-Region mit der Sequenz von –213 bis –318 wurde in den Konstrukten 9 bis 12 der 1 verwendet. Eine lange mas-Region mit der Sequenz von –111 bis –318 wurde in den Konstrukten 13 bis 16 der 1 verwendet. Eine kurze oder eine lange mas-Region wurde stromaufwärts der beiden ocs-Deletionen hinzugefügt.
Die chimären Konstrukte wurden wie folgt hergestellt. Die Basis sämtlicher Konstrukte bildete der binäre Vektor pBI101.2 von Clontech. Das Plasmid pBI101.2 basiert auf dem Replikon pRK290. Das Plasmid pBI101.2 enthält T-DNA-Grenzen, ein chimäres nos-nptII-Gen für die Kanamycin-Selektion in Pflanzen und ein promotorloses Gus-Gen, gefolgt von einem Polyadenylierungssignal. Die mas-Promotorregion wurde aus einem EcoRV-XbaI-Fragment erhalten, welches eine Region enthält, die –138 bis +65 relativ zur Transkriptionsstartstelle (Basenpaare 20128 bis 20343) von pKan2-138 liegt. Barker et al., Plant Mol. Biol. 2: 335-50 (1983); DiRita und Gelvin, supra. Die mas-Aktivierungssequenz und Promotorregion, –318 bis +65 relativ zur Transkriptionsstartstelle (Basenpaare 20128 bis 20343) von pKan2-138, wurden zuerst in die SmaI-XbaI-Stellen von Cup31 (ein pUC13-Derivat mit einem pUC13-Rückgrat, das aber eine Polylinker-Ablesung 5' bis 3' als HindIII, PstI, SsstI, SmaI, BamH1, XbaI enthält) kloniert. Die resultierenden HindIII-XbaI-Restriktionsendonuclease-Fragmente aus CUp31 wurden anschließend neuerlich in die HindIII-XbaI-Stellen des Multilinkers von pBI101.2 kloniert, was zu den Plasmiden pNi1 und pNi2 führte (Konstrukte 1 bzw. 2).
Ein ocs-Enhancerfragment aus dem Plasmid pENΔ1 (Leisner und Gelvin (1988), supra) wurde mit HindIII-Linkern versehen. Dieses Fragment liegt –333 bis –116 relativ zur Transkriptionsstartstelle (Basenpaare 13774 bis 13991, Barker et al., supra) und wurde als Trimer in die HindIII-Stelle von pNi1 stromaufwärts des mas-Promotors in beiden Ausrichtungen kloniert, was zu den Konstrukten 3 und 4 der 1 führte. Zur Erzeugung der Konstrukte 5 und 6 wurde dasselbe ocs-Aktivierungssequenzfragment als Trimer oder als Monomer in die HindIII-Stelle von pNi2 stromaufwärts der mas-Aktivierungssequenz plus Promotor kloniert.
Ein BamHI-EcoRI-Fragment enthaltend die ocs-Promotorregion mit einem Teil des ocs-Strukturgens, das –116 bis +296 relativ zur Transkriptionsstartstelle (Basenpaare 13774 bis 13362) liegt, und ein XbaI-EcoRI-Fragment enthaltend die ocs-Aktivierungssequenz und Promotorregion, die –333 bis +296 relativ zur Transkriptionsstartstelle (Basenpaare 13991 bis 13362) von pEN1 liegt (Leisner und Gelvin, 1988, supra), wurden in die Bam-HI-EcoRI- bzw. XbaI-EcoRI-Stellen von pBluescriptII Sk⁺ (Stratagen) kloniert. XbaI-EcoRV-Fragmente aus den resultierenden pBluescript-Derivaten wurden anschließend in die XbaI-SmaI-Stellen von pBI101.2 kloniert, wodurch GUS-Translationsfusionen in den Plasmiden pLH3 (Konstrukt 7) und pNi3 geschaffen wurden (Konstrukt 8). Ein XhoI-HaeIII-Fragment enthaltend eine „kurze" mas-Aktivierungssequenz –318 bis –213 relativ zur Transkriptionsstartstelle (Basenpaare 20513 bis 20407) von pKan2-318 wurde in die XhoI-HincII-Stellen von pUX13 (ein pUC13-Derivat enthaltend das pUC13-Rückgrat, wobei aber die SmaI-Stelle zu einer XhoI-Stelle umgewandelt wurde) kloniert. Das resultierende XhoI-HindIII-Fragment wurde unter Verwendung des Klenow-Fragments mit zugesetzten XbaI-Linkern stumpf gemacht und das Fragment in beiden Ausrichtungen in die XbaI-Stellen von pLH3 (zur Herstellung der Konstrukte 9 und 10) und pNi3 (Konstrukte 11 und 12) kloniert. Desgleichen wurde ein längeres XhoI-MnlI-mas-Aktivierungssequenzfragment –318 bis –111 relativ zur Transkriptionsstartstelle (Basenpaare 20513 bis 20305) von pKan2-318 unter Verwendung des Klenow-Fragments stumpf gemacht. Linker für XbaI wurden zugegeben und das Fragment in beiden Ausrichtungen in die XbaI-Stellen von pLH3 (zur Erzeugung der Konstrukte 13 und 14) und pNi3 (zur Erzeugung der Konstrukte 15 und 16) kloniert.
Jedes der obigen Konstrukte wurde anschließend in E. coli DH5α transformiert, die bei 37°C in LB-Medium mit Kanamycin gezüchtet wurden. Die Ausrichtungen der Inserts wurden mittels Restriktionskartierung überprüft. Das Plasmid pBI121 (Clontech), das ein 800-bp-HindIII-BamHI-Fragment mit dem CaMV-35S-Promotor enthielt, wurde als Kontrolle für einen Vergleich der relativen Stärken der chimären regulatorischen Regionen verwendet.
Die Inserts enthaltende rekombinante Plasmide wurden durch ein triparentales Mating-Verfahren unter Verwendung von das mobilisierende Plasmid pRK2013 aufweisenden E. coli MM294 in A. tumefaciens LBA4904 mobilisiert. Hoekema et al., Nature 303: 179-80 (1983); Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 7347-51 (1980). In LBA4404 verbleiben die rekombinanten Plasmide als unabhängige Replikons („binäre Vektoren"), die in Pflanzen transferiert und danach in die nukleare DNA der Pflanzen integriert werden können. Andere Verfahren wie Elektroporation können ebenfalls zur Transformation von A.-tumefaciens-Zellen mit Plasmiden verwendet werden.
Agrobacterium-tumefaciens-Transkonjugate wurden auf AB-Minimalmedium-Platten enthaltend 0,5% Glucose, 10 μg/ml Rifampicin und 50 μg/ml Kanamycin selektiert. Liechtenstein und Draper, DNA ClONING: A PRACTICAL APPROACH (Glover ed., Oxford-IRL Press 1986). Die Einführung des mobilisierten Plasmids in den A. tumefaciens Empfängerstamm wurde mittels DNA-Blot-Analyse überprüft.
Blattscheiben aus sechs Wochen alten sterilen Keimspitzen-Kulturen von Nicotiana tabacum var. Wisconsin 38 wurden über A. tumefaciens enthaltend die Konstrukte unter Verwendung eines Blattscheiben-Transformationsverfahrens transformiert. Horsch et al., Science 227: 1229-31 (1985). Infizierte Blattscheiben wurden drei Tage lang auf MS3⁺-Medium in Abwesenheit von Antibiotika gezüchtet. Die Scheiben wurden dann in frisches Keiminduktionsmedium enthaltend 1250 mg/l Carbenicillin und 200 mg/l Kanamycin transferiert. Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27 (1992). Nach vier bis fünf Wochen wurde ein einzelner Keim von jeder Blattscheibe in Wurzelinduktionsmedium enthaltend 500 mg/l Carbenicillin und 50 mg/l Kanamycin transferiert. Nach zwei Wochen wurden die Keimspitzen in BGS-Medium (MS-Medium enthaltend 1 mg/l Folsäure, 10 mg/l Indolessigsäure und 30 mg/l Kinetin) enthaltend 50 mg/l Kanamycin transferiert, um Keimspitzen-Kulturen jeder Linie in vitro zu halten.
Die regenerierten transgenen Tabakpflanzen, die jedes dieser Konstrukte enthielten, wurden auf ihre GUS-Aktivität untersucht. Kleine Stückchen von Tabakgewebe wurden aus den vierten oder fünften voll entfalteten Blättern, den nahen Stielen und aktiv wachsenden jungen Wurzeln geerntet, als sich die Pflanzen im Stadium mit 10 bis 12 Blättern befanden. Die Gewebe wurden in 200 μl Extraktionspuffer gemahlen und bei –70°C aufbewahrt. Jefferson und Wilson, PLANT MOLECULAR BIOLOGY (Gelvin & Schilperoot eds., Kluwer Acad. Press 1991). Die GUS-Aktivität wurde nach Jefferson und Wilson unter Verwendung von 10 μl Extrakt (etwa 20 bis 30 μg Protein) und MUG (4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronid) als Substrat untersucht. Die Proteinkonzentration wurde nach Patterson, Analyt. Biochem. 83: 346-56 (1977) gemessen.
Einzelne transgene Pflanzen, die dasselbe Konstrukt enthielten, zeigten einen GUS-Aktivitätsbereich (siehe 2 bis 5). Durch Messung der GUS-Aktivität bei einer großen Anzahl von Pflanzen, die dasselbe Konstrukt enthielten, konnte jedoch die relative Stärke jeder chimären regulatorischen Region bestimmt werden. Da kein Unterschied im GUS-Aktivitätsbereich bei Verwendung von Konstrukten, in denen die Aktivierungssequenzelemente in entgegengesetzten Ausrichtungen kloniert wurden, nachgewiesen werden konnte, wurden die Daten aus jeder Konstrukt-Untergruppe mit zwei Mitgliedern gepoolt (3 und 4, 5 und 6, 9 und 10, 11 und 12, 13 und 14, und 15 und 16).
In allen untersuchten Geweben führte die durch die mas –138-Deletion gesteuerte Expression zu einem minimalen Hintergrundniveau der GUS-Aktivität (2, Konstrukt 1). Die Anlagerung der nativen mas-Aktivierungssequenz am minimalen mas-Promotor ergab das Konstrukt 2, welches ein niedriges Niveau der GUS-Aktivität von durchschnittlich etwa 1000 Einheiten sowohl in Blatt- als auch in Stielgeweben steuerte (2, Diagramm A und B). Für dieses Konstrukt wurde eine relativ starke GUS-Aktivität im Wurzelgewebe beobachtet, nämlich durchschnittlich etwa 12.000 Einheiten (2, Diagramm C). Diese Ergebnisse zeigen, dass dieser mas-Promotor plus Aktivierungsregion für die oben angesprochene wurzelpräferente Expression des mas2'-Promotors verantwortlich zeichnet. Ein Ersatz der mas-Aktivierungssequenz durch eine heterologe ocs-Aktivierungssequenz (als Trimer) stromaufwärts der –138-mas-Deletion (Konstrukte 3 und 4) änderte den Grad der GUS-Aktivität gegenüber den homologen Kombinationen aus mas-Aktivierungssequenz und Promotor sowohl im Blatt- als auch im Stielgewebe nicht wesentlich (2, Diagramm A und B). Zusammen mit den Daten, die aufzeigen, dass die Expression der ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor in der Wurzel nicht wesentlich höher als im Blatt ist (siehe nachstehend, Konstrukt 8), weisen die Daten darauf hin, dass die wurzelpräferente Expression des mas-Promotors durch ein Element innerhalb von 138 bp der mas-Transkriptionsstartstelle übertragen wird. Das quantitative Expressionsniveau dieses gewebespezifischen Musters kann entweder durch die ocs-Aktivierungssequenz oder durch die mas-Aktivierungssequenz weiter erhöht werden.
Ein Homolog des AS-1-Tandem-Repeat-Motivs (Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 7890-94 (1989)) wurde in der mas-Promotor-Region an Position –66 identifiziert. Dieses Element, wenn im CaMV-35S-Promotor zugegen, wechselwirkt mit dem transagierenden Faktor ASF-1 (Lam et al., loc. cit.), und es wurde festgestellt, dass es ein gewebespezifisches Expressionsmuster mit hoher Aktivität in Wurzeln steuert (Benfey et al., supra).
Die von chimären Konstrukten gesteuerte GUS-Aktivität wurde mit der durch den CaMV-35S-Promotor (–800 von pBI121) erzielten Aktivität verglichen. Die Mehrzahl von 35S-GUS-Transformanten zeigte eine GUS-Aktivität ähnlich jener von Pflanzen mit Konstrukten aus mas-Aktivierungssequenz und Promotor oder geringer als diese (2). Wie von Lam et al., supra, berichtet, wurde ein wurzelpräferentes Expressionsmuster des 35S-Promotors beobachtet.
Die Ergebnisse zeigen, dass ocs- und mas-Promotoren cis- Elemente enthalten, die die Transkription auf gewebespezifische Weise steuern. Kononowicz et al., Plant Cell 4: 17-27 (1992); Leung et al., Mol. Gen. Genet. 230: 463-74 (1991). Angesichts dieser Ergebnisse wurden Kombinationen von heterologen Aktivierungssequenzen untersucht um festzustellen, ob eine Kombination das Expressionsmuster ändern könnte, das ansonsten vom ocs- oder mas-Promotor allein gesteuert wird, und dadurch bei bestimmten Pflanzengeweben entweder zu einer erhöhten oder zu einer verminderten Promotoraktivität führen könnte. Zur Untersuchung dieser Hypothese wurden die in 1 gezeigten Konstrukte 5 und 6, die ein Trimer oder ein Monomer der stromaufwärts der mas-Aktivierungssequenz plus Promotor liegenden ocs-Aktivierungssequenz enthielten, in Tabak eingeführt und die GUS-Aktivität in verschiedenen Geweben gemessen (siehe 3). Die neuen chimären Regionen, die ein Monomer der ocs-Aktivierungssequenz enthielten, erhöhten die Expression der GUS-Aktivität im Blatt (um das 6,6-fache), im Stiel (um das 3,0-fache) und in der Wurzel (um das 3,4-fache) im Vergleich zum mas2'-Promotor plus Aktivierungssequenz (siehe 2 und 3). Konstrukte, die ein Trimer der ocs-Aktivierungssequenz enthielten, erhöhten die Expression der GUS-Aktivität stark im Blatt (um das 22-fache), im Stiel (um das 1,7-fache) und in der Wurzel (um das 9-fache) im Vergleich zum mas2'-Promotor plus Aktivierungssequenz (Konstrukt 2 der 1 und 2), aber ohne eigene ocs-Aktivierungssequenz. Diese Ergebnisse zeigen, dass zumindest in Blatt- und Wurzelgewebe die Zugabe von Mehrfachkopien der ocs-Aktivierungssequenz eine überraschend gewaltige Verstärkungswirkung auf die relative Aktivität des mas2'-Promotors plus Aktivierungssequenz hatte.
Untersuchungen zeigten, dass die Aktivität des CaMV-35S-Promotors in den Blättern von transgenen Pflanzen (durchschnittlich 200 pmol/min/mg Protein) mit den Daten von Comai et al., Plant Mol. Biol. 15: 373-81 (1990) vergleichbar war. Eine Duplizierung des 35S-Enhancers resultierte in einem doppelten Anstieg der GUS-Aktivität in den Blättern. Vergleicht man die Daten aus Comai et al., loc. cit., mit den mit den erfindungsgemäßen Konstrukten erhaltenen Daten, so steuerten die chimären Regionen der Konstrukte 5 und 6 eine 156-fach bzw. 26-fach stärkere GUS-Expression in Blättern als der 35S-Promotor bzw. der verstärkte Doppel-35S-Promotor.
Samen von Tabakpflanzen der T2-Generation, die Doppel-35S-GUS- oder Mac-Gus-Konstrukte enthielten, wurden ebenfalls getestet. Messungen der GUS-Aktivität in den Blättern dieser transgenen Pflanzen bestätigten die relative Stärke der oben besprochenen Promotoren. Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die durchschnittliche GUS-Aktivität in den Blättern transgener Tabakpflanzen mit verschiedenen Promotor-uidA-Fusionen. Tabelle 1

^a Durchschnittliche GUS-Aktivität aller primärer Transformanten
^b Durchschnittliche GUS-Aktivität der F1-Nachkommenschaft eines eine starke GUS-Aktivität exprimierenden primären Transformanten (Comai et al., supra).

Die nachstehende Tabelle 2 zeigt die durchschnittliche GUS-Aktivität, die bei Blättern der F1-Generation von transgenen Tabakpflanzen mit verschiedenen Promotor-uidA-Fusionen gefunden wurde.

^a Die erste Nummer gibt das bestimmte Konstrukt an. Die zweite Nummer repräsentiert einen einzelnen primären Transformanten
^b Samen von primären Transformanten wurden auf Agar enthalted Kanamycin keimen gelassen, und kleine Pflänzchen wurden auf Medium enthaltend Kanamycin übertragen und nach etwa 40 Tagen untersucht.

Eine Reihe von chimären Konstrukten basierend auf dem minimalen ocs-Promotor (–116 bis +296) wurde getestet, um die Stärke und Muster der gewebespezifischen Expression auszuwerten. Wie in 4 gezeigt, steuerte die ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor (Konstrukt 8, 1) ein niedriges und relativ gleichmäßiges GUS-Aktivitätsniveau (durchschnittlich zwischen 200 und 400 pmol/min/mg Protein) im Blatt-, Stiel- und Wurzelgewebe von transgenen Tabakpflanzen. Ein Austausch der ocs-Aktivierungssequenz durch eine kurze Version der mas-Aktivierungssequenz (von –213 bis –318; Konstrukte 9 und 10) resultierte in einem chimären Konstrukt, das nur ein geringes GUS-Aktivitätsniveau in sämtlichen untersuchten Geweben steuerte.
Eine längere Version der mas-Aktivierungssequenz (von –111 bis –318) stomaufwärts des minimalen ocs-Promotors (Konstrukte 13 und 14) wurde ebenfalls getestet. Diese Konstrukte steuerten ein leicht erhöhtes GUS-Aktivitätsniveau, aber nur in Wurzelgewebe. Neben dem bei –66 gefundenen AS-1-Homolog gibt es auch an der Position –290 eine Sequenz ähnlich dem AS-1-Element. Obwohl diese Sequenz ebenfalls in der Kurzversion der mas-Aktivierungssequenz vorhanden ist, sind offensichtlich andere Sequenzen zwischen –213 und –103 notwendig, um eine wurzelpräferente Expression zu steuern.
Eine Kurzversion der mas-Aktivierungssequenz (–318 bis –213; Konstrukte 11 und 12) war als nächste stromaufwärts der ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor platziert. Verglichen mit einem Konstrukt, das nur die ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor enthielt (Konstrukt 8), steuerten diese Konstrukte eine 6-fache, 2,5-fache bzw. 15-fache Steigerung der GUS-Aktivität im Blatt-, Stiel- bzw. Wurzelgewebe (siehe 5). Die Expression dieser Konstrukte war leicht wurzelpräferent, was auf eine mögliche Wechselwirkung des AS-1-ähnlichen Elements mit der ocs-Aktivierungssequenz hindeutete. Interessanterweise steuerten Konstrukte, die eine längere Version der mas-UAS enthielten (gebunden an die ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor; Konstrukte 15 und 16) ein etwas höheres GUS-Aktivitätsniveau als Konstrukte (11 und 12), die die kürzere mas-Aktivierungssequenz enthielten (siehe 5). Nichtsdestotrotz bewirkte die "Stapelung" der ocs- sowie der mas-Aktivierungssequenz 5' zum mas-Promotor eine starke Erhöhung der Promotorstärke gegenüber der ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor allein.
BEISPIEL 2 Korrelation zwischen T-DNA-Kopienzahl und GUS-Aktivität in transgenen Tabakpflanzen
Um den Zusammenhang zwischen T-DNA-Kopienzahl und GUS-Aktivität zu ermitteln, wurde genomische DNA aus sechzehn trans genen Pflanzen enthaltend entweder das Konstrukt 5 oder das Konstrukt 11 untersucht. Zuerst wurde genomische DNA aus Pflanzengewebe extrahiert und mit HindIII vollständig verdaut. Rogers und Bendich, PLANT MOLECULAR BIOLOGY (Gelvin und Schilperoot eds., Kluwer Acad. Pub., 1992). 10 μg DNA wurden mit HindIII verdaut, die Fragmente wurden mittels Elektrophorese durch 1,0% Agarosegel getrennt, und die DNA wurde auf einer Nylonmembran unter Verwendung eines Kapillartransferverfahrens eluiert. Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor 1982). Nucleinsäuren wurden durch Backen bei 80°C 2 Stunden lang unter Vakuum an der Membran fixiert. Eine Vorhybridisierung erfolgte 2 bis 4 h lang bei 65°C in 1,5x SSC (1x SSC in 0,15 M NaCl, 0.015 M Na-Citrat), 1,0% SDS, 0,5% Blotto und 0,5 mg/ml abgeschabter Lachssperma-DNA.
Die Hybridisierung erfolgte bei 65°C über Nacht in frischer Lösung mit einer Sonde enthaltend die Sequenz mit der für GUS kodierenden Region (ein XbaI-SstI-Restriktionsendonucleasefragment von pBI101.2), die mit ³²p-dCTP markiert war. Nach Beendigung der Hybridisierung wurde die Membran nacheinander 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in folgenden Lösungen gewaschen: 2x SSC/0,1% SDS, 0,5x SSC/0,1% SDS, 0,1x SSC/0,1% SDS. Die Endwaschung erfolgte 30 Minuten lang mit 0,1x SSC/1,0% SDS bei 50°C.
Unter Verwendung dieser Kombination von Restriktionsendonuclease und Hybridisierungssonde konnte die Anzahl der T-DNA-Kopien auf Basis der Anzahl und Intensität der Hybridisierungsbanden berechnet werden. Die Anzahl der integrierten Kopien variierte von eins bis mehrere in den einzelnen Transformanten. Die GUS-Aktivität korrelierte nicht mit der Anzahl der integrierten uidA-Gene. Beispielsweise zeigte eine Pflanze, die ein einziges integriertes uidA-Gen enthielt, in bestimmten Fällen eine beträchtlich höhere GUS-Aktivität in den Blättern als Pflanzen mit mehrfachen integrierten Kopien des uidA-Gens.
BEISPIEL 3 Korrelation zwischen GUS-Aktivität und uidA-mRNA in transgenen Tabakpflanzen
Da die GUS-Aktivität als Maß für die Expressionsstärke verwendet wurde, war es notwendig zu verifizieren, dass diese Aktivität das stationäre Niveau von uidA-mRNA wiedergab. Diese Korrelation ist von besonderer Bedeutung aufgrund eines Berichts, dass die GUS-Aktivität bei Verwendung des mas2'-Promo tors und eines uidA-Reportergens nicht mit einem uidA-mRNA-Überfluss korreliert. Hensgens et al., Plant Mol. Biol. 20: 921-38 (1992).
Dementsprechend wurde das stationäre Niveau von uidA-mRNA untersucht, die aus Blättern einzelner transgener Pflanzen isoliert worden war, welche vier verschiedene Konstrukte (Konstrukte 2, 5, 8 und 11) enthielt, untersucht. Zuerst wurde die Gesamt-RNA gemäß dem Verfahren von de Vries et al., PLANT MOLECULAR BIOLOGY (Gelvin und Schilperoot eds., Kluwer Acad. Pub., 1992) isoliert. Proben zu 5 mg wurden mittels Formaldehyd-Gelelektrophorese durch ein 1,2% Agarosegel in MOPS/EDTA-Puffer (50 mM MOPS, 1 mM EDTA, pH 7,0) fraktioniert, anschließend wurde auf eine Nylonmembran geblottet. Die Integrität der RNA wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung überprüft. Die Fluoreszenz der Nucleinsäuren diente auch der Bestätigung, dass identische Mengen RNA in jede Bahn geladen wurden. Die Hybridisierungsbedingungen waren dieselben, wie oben für die Analyse der genomischen DNA beschrieben.
Nach Beendigung der Hybridisierung wurde die Membran nacheinander 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in folgenden Lösungen gewaschen: 2x SSC/0,1% SDS, 0,5x SSC/0,1% SDS, 0,1x SSC/0,1% SDS. Die Endwaschung erfolgte 30 Minuten lang mit 0,1x SSC/1,0% SDS bei 60°C.
Die RNA-Blot-Analyse unter Verwendung einer aus der GUS-kodiersequenz abgeleiteten Hybridisierungssonde brachte ein Transkript von erwarteter Größe (etwa 2300 Nucleotide) zutage. Es bestand eine enge Korrelation zwischen der GUS-Aktivität und dem stationären Niveau von uidA-mRNA, was im Widerspruch zu den Berichten von Hensgens et al. steht.
BEISPIEL 4 Modulation von zellspezifischen GUS-Expressionsmustern durch verschiedene Kombinationen von ocs- und mas-Promotoren und Aktivierungssequenzen
Histologische Untersuchungen von transgenen Tabakgeweben zur Bestimmung der zellspezifischen Muster der GUS-Aktivität. Diese Expressionsmuster wurden mittels histochemischer Färbung dünner Abschnitte von Pflanzengewebe mit X-gluc nachgewiesen.
Diese histochemischen Studien wurden gemäß Jefferson und Wilson, supra, durchgeführt. Kurz zusammengefasst wurden die Pflanzenmaterialien 20 bis 40 min mit 0,1 bis 0,3% Formaldehyd, 0,1 M Triton X-100, 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) vorfixiert, mit 0,1 M Phosphatpuffer gespült und mit 1 bis 2 mM X-gluc (in 0,1 M Triton X-100, 0,1 M ETDA, 0,1 M Phosphatpuffer) 2 bis 14 Stunden lang gefärbt. Nach neuerlicher Fixierung während 2 Stunden unter Verwendung von 3-5% Formaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer wurden die Proben unter Verwendung von 70% Ethanol geklärt, in Paraffin eingebettet und unter Verwendung eines Rotationsmikrotoms geschnitten (12 bis 18 mm). Die Gewebeschnitte wurden mit 1,0% Periodsäure-0,5% Schiff'schem Reagens ("PAS") gegengefärbt.
Es gab keine nachweisbare GUS-Aktivität in den untersuchten Blattgewebe-Zelltypen aus Pflanzen, die den mas-Promotor, aber keine Aktivierungssequenz (Konstrukt 1) enthielten. Pflanzen mit einem chimären uidA-Gen unter der Steuerung der nativen mas-Aktivierungssequenz plus Promotor (Konstrukt 2) zeigten eine mäßige GUS-Aktivität in Blatt-Mesophyllzellen (einschließlich Palisadenzellen und schwammigen Parenchymzellen) und Schutzzellen, aber in den Epidermiszellen wurde keine GUS-Aktivität nachgewiesen. In Gefäßgeweben wurde eine mäßige Färbung in Xylem-Trachidzellen beobachtet, wohingegen eine relativ schwächere Färbung in Phloem- und Strahlenparenchymzellen zu sehen war. Ein ähnliches GUS-Aktivitätsmuster wurde in Blattspreiten beobachtet, die ein Trimer der ocs-Aktivierungssequenz und den mas-Promotor aufwiesen (Konstrukte 3 und 4). In Blattgefäßgeweben war jedoch die GUS-Aktivität bei allen Zelltypen stark reduziert. Eine "Stapelung" eines Trimers der ocs-Aktivierungssequenz auf die mas-Aktivierungssequenz plus Promotor (Konstrukt 5 und 6) führte zu einer starken GUS-Aktivität nicht nur in Blattmesophyll- und -schutzzellen, sondern auch in Epidermiszellen. Dieses Ergebnis zeigt, dass sowohl die distale als auch die proximale heterologe Aktivierungssequenz zur Modulation des Expressionsmusters wechselwirken. Bei Blattgefäßgeweben waren die Expressionsmuster ähnlich, u.zw. unabhängig davon, ob die trimeren ocs-Aktivierungssequenzen mit der mas-Aktivierungssequenz plus Promotor verknüpft waren oder nicht.
Keine GUS-Aktivität wurde in Blattgeweben nachgewiesen, die den minimalen ocs-Promotor enthielten (Konstrukt 7). Die Expression von durch die ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor (Konstrukt 8) gesteuerter GUS-Aktivität war ähnlich jener der mas-Aktivierungssequenz plus Promotor in Querschnitten der Blattspreize. Dieses GUS-Aktivitätsmuster wurde auch in Blatt spreizen von Pflanzen beobachtet, in denen das uidA-Gen unter der Kontrolle eines chimären Promotors stand, der aus einer kurzen mas-Aktivierungssequenz und der ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor zusammengesetzt war (Konstrukte 11 und 12). In Gefäßgeweben von Blattzweigen steuerte die ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor auch die GUS-Expression, aber nur in Trachidzellen. Im Gegensatz zur mas-Aktivierungssequenz plus Promotor steuerte die ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor ein moderates Expressionsniveau der GUS-Aktivität in Strahlen- und Phloemzellen und eine sehr schwache Expression in Parenchym- und Xylem-Trachidzellen in den Blatt-Hauptgefäßgeweben. Ein ähnliches GUS-Aktivitätsmuster wurde in Blattgefäßgeweben beobachtet, egal ob eine kurze mas-Aktivierungssequenz an der ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor angelagert war oder nicht. Die Aktivität war jedoch stark erhöht in Parenchym-, Strahlen- und Phloemzellen. Nicht nachweisbar war die GUS-Aktivität in Pflanzen, die eine mas-Aktivierungssequenz enthielten, welche mit einem ocs-Promotor verknüpft war (Konstrukte 9 und 10).
Die mas-Aktivierungssequenz plus Promotor (Konstrukt 2) steuerte eine schwache Expression der GUS-Aktivität in den Stielen von Drüsentrichomen, aber eine starke Expression in den Köpfen. Die funktionelle Verknüpfung eines Trimers der ocs-Aktivierungssequenz mit der mas-Aktivierungssequenz plus Promotor (Konstrukte 5 und 6) ergab ein ähnliches Expressionsmuster; das relative Niveau der GUS-Aktivität war jedoch bei den Stielzellen stark erhöht. Die Expression der GUS-Aktivität in Trichomen, die durch Konstrukte enthaltend eine kurze mas-Aktivierungssequenz verknüpft mit einer ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor (Konstrukte 11 und 12) gesteuert wurde, war stark in den Köpfen von Drüsentrichomen, aber schwach in den Stielzellen.
Im Strunk von transgenen Pflanzen steuerte die mas-Aktivierungssequenz plus Promotor (Konstrukt 2) eine schwache Expression der GUS-Aktivität in Kortexzellen. Eine starke GUS-Aktivität wurde in Strahlen- und Phloemzellen beobachtet, aber die Expression in Xylem-Trachidzellen war relativ schwach. Dieses Muster veränderte sich auch nicht, als ein Trimer der ocs-Aktivierungssequenz stromaufwärts der mas-Aktivierungssequenz plus Promotor kloniert wurde (Konstrukte 5 und 6). Als die mas-Aktivierungssequenz durch ein Trimer der ocs-Aktivierungssequenz ersetzt wurde (Konstrukte 3 und 9), wurde ein unterschiedliches Muster beobachtet. Die Expression der GUS-Aktivität war nach wie vor stark in Phloemzellen, war aber nunmehr schwach in Strahlen- und Xylem-Trachidzellen. Im Gegensatz zur mas-Aktivierungssequenz plus Promotor steuerte die ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor (Konstrukt 8) eine relativ schwächere Expression in Strahlen- und Phloemzellen, aber eine starke Expression in Trachidzellen. Bei Anlagerung eines kurzen mas-Promotors stromaufwärts der ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor (Konstrukt 11) blieb das Muster im Wesentlichen gleich.
Die durch die mas-Aktivierungssequenz plus Promotor (Konstrukt 2) gesteuerte GUS-Aktivität in Wurzelgewebe war etwas variabel. Es gab nämlich eine regenerierte Pflanze, in der die GUS-Aktivität in Wurzelkappenzellen, Epidermiszellen und in Wurzelhaaren sowie in Wurzelkortex-, Phloem- und Xylemzellen der Wurzelreifezone nachgewiesen werden konnte. Eine geringe GUS-Aktivität wurde jedoch in der Wurzelverjüngungszone nachgewiesen. Eine GUS-Aktivität wurde häufig, aber nicht immer in jedem Zelltyp der Wurzelreifezone nachgewiesen, wenn ein Trimer der ocs-Aktivierungssequenz an der mas-Aktivierungssequenz plus Promotor angelagert war (Konstrukte 5 und 6). Ein Ersatz der mas-Aktivierungssequenz durch ein Trimer der ocs-Aktivierungssequenz (Konstrukte 3 und 4) führte zu einer GUS-Aktivität nur in den peripheren Wurzelkortexzellen und den Endodermiszellen der Wurzelverjüngungszone. Ähnliche GUS-Aktivitätsmuster wurden beobachtet, als entweder der ocs-Promotor plus Aktivierungssequenz (Konstrukt 8) oder eine kurze mas-Aktivierungssequenz samt ocs-Aktivierungssequenz und Promotor (Konstrukte 11 und 12) die Expression des uidA-Gens steuerten.
BEISPIEL 5 Vergleich der erfindungsgemäßen chimären regulatorischen Regionen mit anderen regulatorischen Regionen
Die Aktivität der mas-Aktivierungssequenz plus Promotor ist am stärksten in Wurzelgeweben. Die Anlagerung eines Trimers der ocs-Aktivierungssequenz an der mas-Aktivierungssequenz plus Promotor steigerte das Niveau der GUS-Aktivität um das 2- bis 23-fache. Diese Steigerung der Aktivität ist am stärksten in Blattgewebe, ist aber auch in Stiel- und Wurzelgeweben zu sehen. Die Aktivität der ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor ist annähernd gleich in Blättern, Stielen und Wurzeln von transgenen Tabakpflanzen. Die Anlagerung einer "kurzen" Version der mas-Ak tivierungssequenz an der ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor steigerte das Niveau der GUS-Expression um das 2- bis 20-fache. Diese Steigerung der Aktivität war am größten in Blattgeweben. Eine Kombination mehfacher Kopien der ocs-Aktivierungssequenz mit der mas-Aktivierungssequenz plus Promotor führte zu einem transkriptionellen Regulationselement, das in Blättern etwa 156 mal stärker als der 35S-Promotor, 26 mal stärker als der "verstärkte" Doppel-CaMV-35S-Promotor und 4,2 mal stärker als der "Mac"- und der "Big Mac"-Promotor war, die in Comai et al., Plant Mol. Biol. 15: 373-81 (1990) beschrieben sind (siehe 2 und 3 und Tabelle 1). Daten betreffend den Doppel-35S- und den Mac-Promotor sind in 6 für Blatt ("L"), Stiel ("S") und Wurzel ("R") dargestellt. Es sei bemerkt, dass die stärkere Aktivität der durch die Konstrukte 5 und 6 repräsentierten chimären Promotoren gegenüber den Doppel-CaMV-35S-, Mac- und Big-Mac-Promotoren Mindestschätzungen sind. Darüber hinaus ergab eine histochemische Untersuchung der Zellen von transgenen Pflanzen, die diese Konstrukte aufwiesen, dass diese "gestapelten" Aktivierungssequenzen die Expression der GUS-Aktivität in fast allen Zelltypen steuerten. Eine starke Expression der GUS-Aktivität konnte beispielsweise in Xylem- und Blattepidermiszellen sowie in Blattmesophyll-, Schutz-, Trichom- und Phloemzellen nachgewiesen werden. Im Stiel wurde die Aktivität in Phloem-, Kortex- und Parenchymzellen nachgewiesen. In der Wurzel war die GUS-Aktivität in der Wurzelspitze und in den Wurzelhaaren sowie in den meisten Zellen in den reifen Teilen der Wurzel vorhanden.
Es musste der mögliche Einfluss von Pflanzenwachstumsbedingungen auf die verschiedenen chimären Promotor-uidA-Konstrukte in Betracht gezogen werden. Hensgens et al., Plant Mol. Biol. 20: 921-38 (1992) berichtete von drei- bis zehnfach höheren GUS-Aktivitäten in Pflanzen, die in vitro wuchsen (gewurzelt in sterilem Agar), im Vergleich zu Pflanzen, die im Boden in einem Glashaus wuchsen. Darüber hinaus wurde gefunden, dass die Blätter von Pflanzen, die im Boden unter umweltkontrollierten Bedingungen wachsen, niedrigere GUS-Aktivitätsniveaus exprimieren als in vitro wachsende Pflanzen. Die von den verschiedenen regulatorischen Regionen gesteuerten relativen GUS-Aktivitätsniveaus blieben jedoch annähernd gleich, unabhängig davon, wie die Pflanzen wuchsen (Tabelle 2, oben). Darüber hinaus waren die relativen Stärken der verschiedenen chimären regu latorischen Regionen in den Blättern der F1-Nachkommenschaft von selbstbestäubten transgenen Tabakpflanzen ähnlich jenen der ursprünglichen transformierten und regenerierten Pflanzen (Tabelle 2).
Eine enge Korrelation wurde zwischen dem stationären Zustand der mRNA- und der GUS-Aktivität einer bestimmten Pflanze gefunden. Dieses Ergebnis bestätigt die Verlässlichkeit der Verwendung von GUS-Aktivitätstests als Maß für die Expressionsstärke. Diese Erkenntnisse stehen jedoch in Widerspruch zu jenen von Hensgens et al., supra. Diese entgegengesetzten Erkenntnisse von Hensgens et al. könnten darauf zurückzuführen sein, dass dort keine denaturierenden Bedingungen für die RNA-Blot-Analysen verwendet wurden.
Comai et al., supra, fanden, dass, wenn Pflanzen in Erde wachsen, eine kürzere mas2'-Aktivierungssequenz und Promotorregion als hierin verwendet (–301 gegenüber –318) nur 10% der GUS-Aktivität steuert, ebenso wie der CaMV-35S-Promotor. Die Einführung von Sequenzen stromaufwärts von –301 erhöhte die relative GUS-Aktivität auf 40% jener des 35S-Promotors. Comai et al. schlossen daraus, dass für eine komplette mas2'-Promotoraktivität eine Region stromaufwärts, aber nahe bei –300 erforderlich ist. Die Aktivität des mas2'-Promotors (–318), der in hierin beschriebenen Versuchen verwendet wird, war etwas höher als die vom 35S-Promotor gesteuerte Aktivität.
Langridge et al., supra, zeigten, dass die Aktivität eines mas2'-lux-Fusionsgens durch Hormone mehrfach induziert werden kann. Auch wenn die ersten Versuche an Pflanzen vorgenommen wurden, die in vitro in Anwesenheit von Hormonen wuchsen, beeinflussten diese Wachstumsbedingungen die Ergebnisse nicht besonders stark, was anhand ähnlicher relativer GUS-Aktivitätsniveaus nachgewiesen wurde, die in im Boden wachsenden Pflanzen beobachtet wurden.
Langridge et al. zeigten auch, dass die mas2'-Promotor-Aktivität in Stielen von transgenen Tabakpflanzen am stärksten in Gefäßgeweben exprimiert wurde, wohingegen Saito et al., supra, eine starke Färbung in der Wurzelkappe und eine schwächere Färbung in Phloemzellen von Tabakwurzeln nachwiesen. Die hierin offenbarten Daten korrelieren gut mit diesen früheren Berichten. Saito et al. wiesen jedoch eine GUS-Aktivität in den Venen, nicht aber in den Mesophyllzellen von Blättern nach. In den hierin beschriebenen Versuchen wurde die GUS-Aktivität deutlich in den Mesophyllzellen von Blättern transgener Pflanzen nachgewiesen, die ein chimäres mas2'-uidA-Gen aufwiesen. Viele der hierin beschriebenen Ergebnisse korrelieren auch mit jenen von Leung et al., was die Expression des mas2'-Promotors in verschiedenen Geweben transgener Tabakpflanzen betrifft. Leung et al. wiesen jedoch keine GUS-Aktivität in Gefäßzellen des Stiels mit ihren Konstrukten nach.
Eine Kombination der heterologen ocs- oder mas-Aktivierungssequenz mit einer mas- oder ocs-Aktivierungssequenz plus Promotor erhöhte das GUS-Aktivitätsniveau bei sämtlichen untersuchten Tabakgeweben stark. Diese Daten zeigen, dass die erhöhte Expression dieser chimären regulatorischen Regionen auf eine kooperative und synergistische Wechselwirkung und nicht bloß auf additive Wirkungen zwischen den positiven regulatorischen Elementen zurückzuführen sind, die in diesen chimären regulatorischen Regionen zu finden sind.
BEISPIEL 6 Verwendung von chimären regulatorischen Regionen bei induzierbarer Expression
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Kombinationen aus einem Promotor und einer stromaufwärts befindlichen Aktivierungssequenz, die bei Verwundung oder Schädlingsfraß induzierbar sind. Eine entwickelte Kombination (AmasPmas) wird vorzugsweise in Wurzelgewebe exprimiert und bei Befall durch Krankheitserreger induziert, während eine andere (AocsAmasPmas) mehr allgemein exprimiert, aber bei Schädlingsbefall weiter induziert wird. Diese Expressionssysteme sind nützlich für Gene, deren Ziel Wurzelschädlinge wie Nematoden oder Pilze sind, und finden Anwendung bei Insekten und anderen Blattpathogenen.
Chimäre regulatorische Regionen wurden unter Verwendung der Mannopinsynthase-Kernpromotorregion, die zu –138 deletiert worden war, konstruiert. Dieser Kernpromotor wurde mit einer für GUS kodierenden Sequenz verschmolzen und mit Nopalinsynthase("NOS")-Polyadenylierungssignalen terminiert. Siehe 7, Konstrukt 1.
Die UAS von –318 bis –138 des Mannopinsynthase-Promotors wurde zusammen mit dem Mannopinsynthase-Kernpromotor zur Herstellung des Konstrukts 2 der 7 verwendet. Die Konstrukte 5 und 6 der 7 enthielten ein Trimer der UAS des Octopinsynthase-Gens von –333 bis –116 in beiden Ausrichtungen. Diese Kon strukte wurden unter Verwendung einer Agrobacterium-tumefaciens-Transformation in Tabak transfiziert. Die GUS-Aktivität wurde in Blättern, Stielen und Wurzeln einer großen Anzahl von einzelnen transgenen Pflanzen gemessen. Die Aktivität des mas-Promotors und der Aktivierungssequenz (7, Konstrukt 2) ist am stärksten in der Wurzel und erheblich schwächer in den Blättern und Stielen. Die Anlagerung der ocs-Aktivierungssequenz an der mas-Aktivierungssequenz plus Promotor (7, Konstrukte 5 und 6) steigerte die GUS-Aktivität um das 10-fache in den Wurzeln und um das 50- bis 100-fache in den Stielen und Blättern im Vergleich zum Konstrukt 2. Die Ausrichtung der ocs-Aktivierungssequenz hatte keinerlei Auswirkung.
Die Wundinduzierbarkeit des mas-Promotors plus Aktivierungssequenz ist um das 30-fache in Blättern, das 17-fache in Stielen und das 3-fache in Wurzeln von transgenen Tabakpflanzen induzierbar.
Zur Untersuchung der Induzierbarkeit der verschiedenen chimären regulatorischen Regionen bei einem Befall mit Pathogenen wurden einzelne transgene Pflanzen, die die Konstrukte 1, 2, 5 und 6 enthielten, mit Nematoden infiziert und auf die Induktion der GUS-Aktivität überwacht. Um zu gewährleisten, dass keine endogene Expression der GUS-Aktivität in Nematoden stattfand, wurden gereinigte Präparationen von entwickelten Nematodeneiern analysiert. Die Nematodenart, die verwendet wurde, waren aus Tomatenwurzeln isolierte Meloidogyne incognita, Rasse 3. Die reifen Eier wurden isoliert, indem infizierte Wurzeln 4 min lang in eine 10% Chlorox-Lösung unter ständigem Rühren gelegt wurden. Die Lösung wurde dann zur Entfernung von Wurzelwerk durch ein 200-Mesh-Sieb gespült, und die Eier wurden auf einem 500-Mesh-Sieb gesammelt. Die Eier wurden gewaschen und unter Verwendung eines Nematodenzählglases (Olympic Equine Products) mit Nummern versehen. Zur Kontrolle wurden dann die Eier zwecks Überprüfung der Anwesenheit von endogener GUS-Aktivität in Nematoden bei pH 5,5 und pH 7,5 untersucht. Die GUS-Aktivität bei pH 5,5 besteht aufgrund einer endogenen Expression, die von tierischen Formen des Gens stammt, was als Hintergrundaktivität angesehen wird. Die GUS-Aktivität bei pH 7,5 geht auf eine bakterielle Genexpression zurück. Die GUS-Aktivität in reifen Nematodeneiern erwies sich als minimal bei beiden pH-Werten (8). Meloidogyne incognita enthält daher weder bakterielle noch tierische GUS-Aktivitäten, die im Versuch zu signifikanten Hintergrundaktivitätsproblemen aufgrund der Anwesenheit von Nematodeneiern führen würden.
Transgene Pflanzen wurden mit 10.000 gereinigten Nematodeneiern infiziert und in sandigem Boden unter Glashausbedingungen mehrere Monate wachsen gelassen. Die Wurzeln von reifen Pflanzen wurden geerntet und Stellen mit Nematodeninfektion visuell identifiziert. Meloidogyne-incognita-Infektionsstellen können aufgrund der Bildung eines Wurzelknotens visuell identifiziert werden, der den Nematoden- und Eisack enthält, während nicht infizierte Stellen ein normales Aussehen haben. Wurzelknoten wurden zur Messung der GUS-Aktivität für infizierte Bereiche und normale Wurzelregionen wurden als nicht infizierte Kontrollen verwendet. Sämtliche Vergleiche zwischen nicht infizierten und infizierten Wurzeln basierten auf denselben Pflanzen und unterliegen daher keinen Positionseinflüssen und Abweichungen bei der Genexpression von Pflanze zu Pflanze. Die Induktion der GUS-Aktivität wurde im Konstrukt 1 unter Verwendung der Pflanzennummer 7 (1-7) bei pH 5,5 und 7,5 gemessen (9, Feld A).
Die Expressionsniveaus waren niedrig im Vergleich zu transgenen Pflanzen, die die Konstrukte 2, 5, 6 enthielten, was darauf hinweist, dass der Pmas-Promotor allein nur Basis-Aktivitätsniveaus exprimiert und bei Nematodeninfektion nicht induzierbar ist.
Enthält der Pmas-Promotor die mas-Aktivierungssequenz Amas (Konstrukt 2), ist die Expression der GUS-Aktivität hoch und bei Nematodeninfektion induzierbar (9, Feld B). Die Anlagerung von UAS des ocs-Promotors (Aocs) ergab eine ähnliche Induktion bei Nematodeninfektion (9, Feld C). Eine Pflanze (5-5) zeigte keine induzierbare Expression. Dies könnte auf das Alter des verwendeten Wurzelgewebes oder auf die Insertion des Gens an einer Stelle im Chromosom zurückzuführen sein, die zu einer Veränderung der Expression führte, da ein anderer Transformant (5-2) die Induktionsantwort gab.
Diese Ergebnisse zeigen, dass der Befall mit Pathogenen die chimären regulatorischen Regionen unter Verwendung des Mannopinsynthase-Promotors mit entweder der mas- oder der ocs-Aktivierungssequenz induziert. Diese Regionen können zur Expression von Genen für nematizide Toxine oder Hormonverbindungen verwendet werden, die Nematodenfraß und -vermehrung unterbrechen. Es wurde zum Beispiel gefunden, dass bestimmte Toxine von Bacillus thuringiensis ("Bt-Toxine") wirksam gegen Nematoden sind. Siehe Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131-45 (1993). Aminosäuresequenzen für diese Toxine und Nucleotidsequenzen für Gene, die für diese Toxine kodieren, sind in der US 5,281,530 ; US 5,322,932 ; PCT WO92/04453 und EP 0 517 367 A1 beschrieben.
Die Verwedung dieser induzierbaren regulatorischen Regionen ist nicht auf nematizide Anwendungen beschränkt. Diese regulatorischen Regionen wären genauso effizient gegen andere, Verwundungen herbeiführende Pathogene.
BEISPIEL 7 Chimäre regulatorische Regionen, die die Expression von insektiziden Toxinen steuern
Die chimären regulatorischen Regionen der vorliegenden Erfindung können zur Steuerung der Expression von insektiziden Toxinen in transgenen Pflanzen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können Bt-Toxine unter die Steuerung von erfindungsgemäßen regulatorischen Regionen gestellt werden.
Modifizierte Gene, die für Bt-Toxine kodieren, wurden entwickelt, um die Expressionsniveaus in transgenen Pflanzen zu verbessern. Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324-28 (1991) offenbart Modifikationen am cryIA-Gen als Ersatz für Sequenzen, die in Pflanzen nicht willkommen sind. Es zeigte sich, dass diese Modifikationen die Niveaus von aktivem CryIA-Toxin erhöhten. Desgleichen offenbaren Adang et al., supra, Modifikationen am cryIIIA-Gen für eine verbesserte Expression. Andere Mitglieder der Bt-Toxin-Familie wären ebenfalls für eine Modifikation sowie den Einsatz bei der vorliegenden Erfindung geeignet. Es können auch Gene verwendet werden, die mit Überempfindlichkeitsreaktionen in Zusammenhang stehen. Siehe Keen, supra. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf irgendeine spezielle Toxin- oder Verbindungsart beschränkt. Es kann jede Art von insektizidem Toxin oder Insekten tötender Verbindung, für die Gene kodieren, oder die durch Enzyme oder andere Entitäten produziert werden, für die Gene kodieren, mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
BEISPIEL 8 Chimäre regulatorische Regionen, die die Expression von Genen für Herbizidtoleranz steuern
Die chimären regulatorischen Regionen der vorliegenden Erfindung können zur Expression in transgenen Pflanzengenen verwendet werden, die eine Toleranz gegenüber Herbiziden verleihen. Es gibt drei elementare Ansätze zur Verleihung einer Herbizidtoleranz: (i) pflanzenvermittelte Detoxikation von Herbiziden; (ii) erhöhte Expression von Herbizid-Targets; und (iii) Mutation von Herbizid-Bindungsstellen. Siehe Schulz et al., Crit. Rev. Plant Sci. 9: 1-15 (1990). Jeder der obigen Ansätze kann für die vorliegenden Erfindung herangezogen werden, auch wenn sich die ersten beiden Ansätze für die vorliegende Erfindung besser eignen.
Es sind mehrere Enzyme bekannt, die viele der üblicherweise eingesetzten Herbizide entgiften können. Glutathion-S-transferasen verleihen beispielsweise eine Toleranz gegenüber S-Triazin- und Chloracetamid-Herbizide. Siehe z.B. Schulz et al., supra; Shah et al., Plant Molec. Biol. 6: 203-11 (1986); Weigand et al., Plant Molec. Biol. 7: 235-43 (1986). Phosphinothricin wird bei Verwendung eines Gens aus Streptomyces hygroscopicus inaktiviert. De Block et al., EMBO J. 6: 2513-18 (1987); Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-23 (1987). Es zeigte sich, dass Nitrilasegene Bromoxynil detoxifizieren können. Stalker et al., Science 242: 419-23 (1988). Andere Detoxikationsenzyme können ebenfalls mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Ein anderer elementarer Toleranzansatz basiert auf einer erhöhten Expression des Empfängers eines Herbizids. Glyophosphat ist beispielsweise ein konkurrierender Inhibitor von 5-Enol-pyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase ("EPSP-Synthase"). Eine Glyophosphat-Toleranz kann durch eine erhöhte EPSP-Synthase-Expression verliehen werden. Eine erhöhte EPSP-Synthase-Expression kann bei Verwendung von starken konstitutiven Promotoren der vorliegenden Erfindung erzielt werden, um die Expression von EPSP-Synthase-Sequenzen zu steuern. Darüber hinaus können vielfache Kopien von EPSP-Synthase-Sequenzen mit erfindungsgemäßen Promotoren in transgene Pflanzen eingesetzt werden, um noch höhere Expressionsniveaus zu erreichen. Sequenzen, die für EPSP-Synthase aus verschiedenen Quellen kodieren, sind bekannt. Siehe Duncan et al., FEBS Lett. 170: 59 (1984); Stalker et al., J. Biol. Chem. 260: 4724-28 (1985); Shah et al., Science 233: 478-81 (1986).
Schließlich kann auch eine Änderung der Herbizidbindungsstelle zur Verleihung von Herbizidtoleranz verwendet werden. Stalker et al. und Shah et al. fanden, dass Aminosäure-ver änderungen in der EPSP-Synthase eine Glyophosphat-Resistenz verleihen können. Desgleichen können Veränderungen der Acetohydroxysäuresynthase eine Resistenz gegen Sulfonylharnstoffe und Imidazolinone verleihen. Siehe Schulz et al., supra; siehe auch Wek et al., Nucl. Acid. Res. 13: 3995-4010 (1985).
BEISPIEL 9 Chimäre regulatorische Regionen, die die Expression von Genen für Virusresistenz steuern
Virusresistenz kann in Pflanzen durch die Expression von viralen Genen oder Antisense-Gegenstücken von viralen Genen verliehen werden. Die elementaren Ansätze zur Verleihung von Virusresistenz erfolgen über (i) Protein-vermittelte Resistenz, üblicherweise Hüllproteine und (ii) Antisense-RNA-vermittelte Resistenz. Beachy et al., Annu. Rev. Phytopathol. 28: 451-74 (1990) geben einen Überblick über beide Ansätze. Transgene Pflanzen, die ein virales Hüllprotein anstatt einer Antisense-RNA exprimieren, neigen dazu, eine stärkere Resistenz gegenüber Viren zu zeigen. Beachy et al., supra; Cuozzo et al., Bio/technology 6: 549-57 (1988).
Die regulatorischen Regionen der vorliegenden Erfindung können zur Expression jedes Gens verwendet werden, das transgene Pflanzen mit einer Virusresistenz versehen kann. Zum Beispiel sind die Aminosäuresequenzen vieler Pflanzenvirus-Hüllproteine bekannt, wodurch es möglich ist, eine Nucleotidsequenz abzuleiten. Darüber hinaus sind die Nucleotidsequenzen von Genen bekannt, die für Virus-Hüllproteine kodieren, was die Synthese von genauen Antisense-RNA-Sequenzen gestattet. Diese Sequenzen können zur Erzielung einer Resistenz in einer transgenen Pflanze exprimiert werden.
Cuozzo et al., supra, offenbaren Sequenz-Hüllproteinsequenzen für das Gurkenmosaikvirus. Transgene Pflanzen, die andere Virussequenzen enthalten, wurden konstruiert. Beispielsweise offenbaren Anderson et al., Phytopath. 79: 1284-90, transgene Pflanzen, die Hüllproteine des Tabakmosaikvirus und Alfalfamosaikvirus exprimieren. Hemenway et al., EMBO J. 7: 1273-80 (1988) offenbaren transgene Pflanzen, die Hüllproteine und Gegensinn-RNA für das Kartoffelvirus X exprimieren. Huisman et al., J. Gen. Biol. 69: 1789-98 (1988) offenbaren eine Sequenz für dieses Virus. Gerlach et al., Nature 328: 802-05 (1987) offenbaren transgene Pflanzen, die die Satelliten-RNA des Tabak-Ringfleckenvirus exprimieren. Diese Satelliten-RNA verbessert die Krankheitssymptome des Ringfleckenvirus. Eggenberger et al., J. Gen. Virol. 70: 1853-60, offenbaren eine Sequenz aus dem Sojabohnenmosaikvirus. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf einen speziellen Virustyp beschränkt. Mit der vorliegenden Erfindung können Sequenzen aus jedem Virustyp verwendet werden.
Selbstverständlich sind die Beschreibung, speziellen Beispiele, Figuren und Daten, die bevorzugte Ausführungsformen darstellen, zur Veranschaulichung und als Beispiele angeführt und sollen die vorliegende Erfindung in keiner Weise einschränken. Für den Fachmann werden verschiedene Änderungen und Modifikationen im Rahmen der vorliegenden Erfindung aus der hierin enthaltenen Erörterung und Offenbarung ersichtlich.

Claims

Chimäre regulatorische Region oder Kassette, die für die Expression eines Gens in einer Pflanze nützlich ist, umfassend eine stromaufwärts befindliche aktivierende Sequenz eines Agrobacterium-tumefaciens-Octopinsynthase-Gens, funktionell verknüpft mit einem Promotor einer Agrobacterium-tumefaciens-Mannopinsynthase.
Chimäre regulatorische Region oder Kassette, die für die Expression eines Gens in einer Pflanze nützlich ist, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie Vielfache von zwei stromaufwärts befindlichen aktivierenden Sequenzen eines oder mehrerer Agrobacterium-tumefaciens-Octopinsynthase-Gene, funktionell verknüpft mit einem Promotor einer Agrobacterium-tumefaciens-Mannopin-Synthase aufweist.
Chimäre regulatorische Region oder Kassette nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor eine Deletion zur Nukleotid-Position –138 eines Agrobacterium-tumefaciens-Mannopinsynthase-Gens ist.
Chimäre regulatorische Region oder Kassette nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie weiters eine funktionell verknüpfte, stromaufwärts befindliche aktivierende Sequenz eines Agrobacterium-tumefaciens-Mannopinsynthase-Gens aufweist.
Chimäre regulatorische Region oder Kassette nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die chimäre regulatorische Region oder Kassette weiters ein Nopalinsynthase-Polyadenylierungssignal aufweist.
Plasmid, nützlich für die Expression eines Gens in einer Pflanze, umfassend eine chimäre regulatorische Region oder Kassette nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Verfahren zur Expression eines Gens in einer Pflanze, umfassend: a) Bilden einer chimären regulatorischen Region oder Kassette nach einem der Ansprüche 1 bis 5, durch funktionelles Verknüpfen des Gens mit dem Promotor der Agrobacterium-tumefaciens-Mannopinsynthase; b) Insertieren des Gens und der chimären regulatorischen Region oder Kassette in die Pflanze; und c) Ermöglichen der Expression des Gens durch die Pflanze.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des Gens durch einen Insekten- oder Nematoden-Angriff auf die Pflanze induziert wird.
Transgene Pflanze, umfassend eine chimäre regulatorische Region oder Kassette nach einem der Ansprüche 1 bis 5.