DE112011100940T5 - Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Steigerung verschiedener ökonomisch wichtiger Ertragsmerkmale in Pflanzen. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid oder ein Bax-Inhibidor-1(BI-1)-Polypeptid oder ein SEC22-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid oder ein BI-1-Polypeptid oder ein SEC22-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierende Nukleinsäuren enthaltende Konstrukte bereit, die bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung von Nutzen sind. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte, für ein BI-1-Polypeptid codierende Nukleinsäuren und Konstrukte, die diese enthalten, bereit, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte, für ein SEC22-Polypeptid codierende Nukleinsäuren und Konstrukte, die diese enthalten, bereit, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Steigerung verschiedener ökonomisch wichtiger Ertragsmerkmale in Pflanzen. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein BI-1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein BI-1-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte, für ein BI-1-Polypeptid codierende Nukleinsäuren und Konstrukte, die diese enthalten, bereit, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
  • Die stetig anwachsende Weltbevölkerung und die schwindende Reserve an anbaufähigem Land, das für die Landwirtschaft zur Verfügung steht, treibt die Forschung hin zur Erhöhung der Effizienz der Landwirtschaft. Herkömmliche Methoden für Verbesserungen bei Nutzpflanzen und Gartenpflanzen wenden selektive Züchtungstechniken zum Identifizieren von Pflanzen mit wünschenswerten Merkmalen an. Allerdings weisen derartige selektive Züchtungstechniken mehrere Nachteile dahingehend auf, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, welche häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, welche nicht immer dazu führen können, dass die erwünschte Eigenschaft von Elternpflanzen weitergegeben wird. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben es der Menschheit erlaubt, das Keimplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die gentechnische Manipulation von Pflanzen beinhaltet die Isolierung und Manipulierung von genetischem Material (typischerweise in der Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einbringung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Diese Technologie weist das Vermögen auf, Nutzpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, landwirtschaftlichen oder gärtnerischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.
  • Eine Eigenschaft von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist ein erhöhter Ertrag. Der Ertrag ist normalerweise als der messbare Gewinn von ökonomischem Wert aus einer Nutzpflanze definiert. Dies kann in Bezug auf die Quantität und/oder Qualität definiert sein. Der Ertrag ist direkt von mehreren Faktoren, wie zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel der Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blatt-Seneszenz und sonstigem, abhängig. Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Jungpflanzenvitalität können ebenfalls bedeutende Faktoren bei der Bestimmung des Ertrags sein. Das Optimieren der oben erwähnten Faktoren kann daher zu einer Erhöhung des Nutzpflanzenertrags beitragen.
  • Der Samenertrag ist ein besonders wichtiges Merkmal, da die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Nutzpflanzen, wie Mais, Reis, Weizen, Canola und Sojabohne machen über die Hälfte der gesamten menschlichen Kalorienaufnahme aus, ob durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch Verzehr von Fleischprodukten, welche auf Grundlage verarbeiteter Samen erzeugt wurden. Sie stellen ebenfalls eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Metaboliten, die in industriellen Verfahren verwendet werden, dar. Samen enthalten einen Embryo (die Quelle von neuen Sprossen und Wurzeln) sowie ein Endosperm (die Quelle von Nährstoffen für das Embryowachstum während der Keimung und während des frühen Wachstums der Setzlinge). Die Entwicklung eines Samens beteiligt zahlreiche Gene und erfordert den Transfer von Metaboliten aus den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Das Endosperm assimiliert im Besonderen die Stoffwechselvorläufer von Kohlenhydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert sie zu Speichermakromolekülen, um das Korn auszufüllen.
  • Eine andere bedeutende Eigenschaft für viele Nutzpflanzen ist die Jungpflanzenvitalität. Die Verbesserung der Jungpflanzenvitalität ist ein wichtiges Ziel bei modernen Reis-Züchtungsprogrammen sowohl in gemäßigten als auch tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind wichtig für eine korrekte Bodenverankerung bei in Wasser ausgesätem Reis. Falls Reis direkt in überflutete Ackerfelder ausgesät wird und falls die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen müssen, stehen längere Sprosse mit der Wuchskraft in Zusammenhang. Wo eine Aussaat mit Drillvorrichtung praktiziert wird, sind längere Mesokotyle und Koleoptile für eine günstige Setzlingsemergenz bedeutsam. Die Fähigkeit, Jungpflanzenvitalität künstlich in Pflanzen einzubringen, wäre für die Landwirtschaft von großer Bedeutung. Zum Beispiel war eine geringe Jungpflanzenvitalität eine Einschränkung bei der Einführung von Mais-(Zea Mais L.)-Hybriden auf der Basis von ”Corn Belt”-Keimplasma im europäischen Atlantikraum.
  • Ein weiteres wichtiges Merkmal ist das einer verbesserten Toleranz gegenüber abiotischem Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweiten Ernteverlust, wobei die Durchschnittserträge für die meisten wichtigen Nutzpflanzen um mehr als 50% reduziert werden (Wang et al., Planta 218, 1–14, 2003). Abiotische Stressfaktoren können durch Dürre, Salzgehalt, Temperaturextreme, chemische Toxizität und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit zur Verbesserung der Pflanzentoleranz gegenüber abiotischem Stress wäre weltweit für Landwirte von großem wirtschaftlichen Vorteil und würde den Anbau von Nutzpflanzen während ungünstiger Bedingungen sowie in Territorien, auf welchen eine Kultivierung von Nutzpflanzen ansonsten nicht möglich sein kann, gestatten.
  • Der Nutzpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben erwähnten Faktoren erhöht werden.
  • Abhängig von der Endanwendung kann die Modifikation bestimmter Ertragseigenschaften gegenüber anderen bevorzugt sein. Beispielsweise kann für Anwendungen wie Futtermittel- oder Holzproduktion oder Biotreibstoff-Ressourcen ein Zuwachs bei den vegetativen Teilen einer Pflanze wünschenswert sein, und für Anwendungen wie Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann ein Zuwachs hinsichtlich der Samenparameter besonders erwünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können, abhängig vom Verwendungszweck, manche gegenüber anderen bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Erhöhung des Samenertrags beitragen, ungeachtet dessen, ob diese in Form einer erhöhten Samengröße oder einer erhöhten Samenzahl vorliegen.
  • Ein möglicher Ansatz zur Erhöhung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann durch Modifikation der inhärenten Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie etwa dem Zellzyklus oder verschiedenen Signalleitungswegen, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind.
  • Weiterhin wurde jetzt auch gefunden, dass sich verschiedene Ertragsmerkmale in Pflanzen verbessern lassen, indem man in einer Pflanze die Expression einer in einer Pflanze für ein CLE-Typ-2- oder Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid oder ein Homolog davon oder ein SEC22 codierenden Nukleinsäure moduliert.
  • Hintergrund
  • CLE-Typ-2-Polypeptid
  • CLE-Polypeptide stellen eine pflanzenspezifische Familie kleiner Proteine (< 15 kDa) mit einem putativen N-terminalen Sezernierungssignal dar, die, wie berichtet wurde, an Signalprozessen beteiligt sind (Whitford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(47): 18625–30, 2008). Sie teilen sich miteinander eine konservierte Domäne von 12 bis 14 Aminosäuren am oder in der Nähe des C-Terminus. Whitford et al. teilen die Gruppe der CLE-Peptide in eine Gruppe A und eine Gruppe B, wobei die Gruppe A die Polypeptide vom CLE-Typ 2 umfasst. In der WO 2007/138070 ist ein CLE-Polypeptid offenbart, welches, wenn man seine Expression in Samen herunterregulierte, im Vergleich zu Pflanzen, denen das CLE-ähnliche Transgen fehlte, einen höheren Samenertrag hatte, ausgedrückt als Anzahl gefüllter Samen, Samengesamtgewicht, Gesamtanzahl an Samen und Ernteindex; das verwendete CLE-Polypeptid gehörte jedoch nicht zur Gruppe der CLE-Typ-2-Polypeptide. In der WO 01/96582 wird offenbart, dass die ektopische Expression verschiedener das Aminosäuremotiv KRXXXXGXXPXHX (wobei X für eine beliebige Aminosäure stehen kann) umfassender LLPs zu sterilen transgenen Pflanzen führen kann, oder bestenfalls zu Pflanzen mit verminderter Fruchtbarkeit.
  • Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid
  • Bax-Inhibitor-1-Proteine (BI-1) sind membranüberspannende Proteine mit 6 bis 7 transmembranen Domänen und einem zytoplasmatischen C-terminalen Ende im endoplasmatischen Retikulum (ER) und nukleärer Hülle (Hückelhoven, 2004, Apoptosis 9(3): 299–307). Sie sind allgegenwärtig und sowohl in eukaryotischen als auch prokaryotischen Organismen vorhanden. Bei den Pflanzen zählen sie zu einer kleinen Genfamilie, z. B. bis zu drei Mitglieder in Arabidopsis, und werden in verschiedenen Geweben exprimiert, während der Alterung und als Reaktion auf abiotischen und biotischen Stress.
  • Es wurde gezeigt, dass BI-1-Proteine eine schützende Rolle gegen den durch eine Dysfunktion der Mitochondrien oder mit ER-Stress in Zusammenhang stehenden Mechanismen induzierten Zelltod haben könnten. Außerdem wurde eine Rolle von BI-1 während Pflanzenpathogenwechselwirkungen beschrieben, und seine Aktiviät könnte durch Ca2+ über CaM-Bindung reguliert werden (Kamai-Yamada et al. 2009 J Biol Chem. 284(41): 27998–8003; Watanabe und Lam, 2009, Int J. Mol. Sci. 10(7): 3149–67). Weiterhin haben Nagano et al. (2009, Plant J., 58(1): 122–134) ein mit BI-1 wechselwirkendes Protein (ScFAH1) identifiziert, das am Sphingolipidmetabolismus beteiligt ist und sich ebenfalls an der ER-Membran befindet. Angesichts der Rolle, die Sphingolipid bei der Aktivierung von PCD spielt, ist dieser Befund sehr konsistent mit einer Rolle von BI-1 als Rheostat, der PCD stromabwärts vom ER-Stress-Pfad moduliert (Watanabe und Lam, 2008, Plant Signal Behavior. 3(8): 564–6).
  • SEC22-Polypeptid
  • In allen eukaryontischen Zellen ist der vesikuläre Transport von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung von Zell- und Organellfunktionen. Die Superfamilie der N-Ethylmaleimid-empfindlichen Faktoradaptorproteinrezeptoren (Soluble N-ethylmaleimidesensitive-factor Attachment REceptors, SNAREs) spielt eine Schlüsselrolle bei der Identität und dem Austausch von Vesikeln/Organellen. Die Transportvesikel tragen verschiedene zu transportierende Proteine aus einem Donor-Kompartiment zu einem Ziel-Kompartiment und laden die Ladung im Zielkompartiment ab, indem sie mit der Membran des Zielkompartiments fusionieren. SNARE-Molekülen kommt eine zentrale Rolle beim Einleiten der Membranfusion zwischen Transportvesikeln und Zielmembranen durch die Ausbildung eines spezifischen Trans-SNARE-Komplexes bei den einzelnen Transportschritten zu. Die SNARE-Polypeptide bilden spontan hochstabile Protein-Protein-Wechselwirkungen aus, die helfen, die für die Membranfusion erforderliche Energiebarriere zu überwinden. Im Vergleich zu anderen Eukaryonten codieren höhere Pflanzen in ihrem Genom für eine größere Anzahl von SNARE-Proteinen. Pflanzen fehlen bestimmte SNARE-Protein-Unterfamilien, sie haben jedoch auch einige neue Arten von SNAREs entwickelt. So fehlen Pflanzen zum Beispiel Synaptobrevine, eine Klasse von SNARE-Proteinen mit einer kurzen N-terminalen regulatorischen Domäne. SNAREs können entweder auf der Basis ihrer subzellulären Lokalisierung (funktionelle Klassifikation) oder nach dem Vorkommen invarianter Aminosäurereste im Zentrum des SNARE-Motivs (strukturelle Klassifikation) klassifiziert werden. Bei der funktionellen Klassifikation werden SNAREs in vehikelassoziierte und zielmembranassoziierte SNAREs (v- beziehungsweise t-SNAREs) eingeteilt. Alternativ dazu können bei der strukturelle Klassifikation SNAREs gemäß dem Vorkommen entweder eines konservierten Glutamin- oder eines konservierten Argininrests im Zentrum der SNARE-Domäne in Q- und R-SNAREs gruppiert werden. Im Allgemeinen entsprechen t-SNAREs Q-SNAREs, und v-SNAREs entsprechen R-SNAREs. Die in Vehikeln residierenden R-SNAREs werden häufig als VAMPs (Vesicle-Associated Membrane Proteins) bezeichnet. R-SNAREs können entweder eine kurze oder eine lange N-terminale regulatorische Region aufweisen, anhand derer sie weiter in Brevine (lat. brevis, short) und Longine (lat. longus, long) unterteilt werden. Alle bekannten R-SNAREs zählen zur Longin-Kategorie (Uemura et al. 2005; FEBS Lett. 579: 2842–46). Weiterhin sind die SNARE-Proteine kleine (ungefähr 200–400 Aminosäuren) Polypeptide, die durch das Vorhandensein einer bestimmten Peptiddomäne, des SNARE-Motivs, gekennzeichnet sind (Jahn & Scheller 2006 Nature Reviews 631–643). Bei der SNARE-Domäne handelt es sich um eine Strecke von 60–70 Aminosäuren, welche aus einer Heptad-Wiederholungseinheit besteht, die über hetero-oligomere Wechselwirkungen eine Doppelwendel-(”coiled-coil”)-Struktur ausbilden kann. Die Assoziation von SNAREs mit Lipiddoppelschichten wird gewöhnlich durch C-terminale transmembrane Domänen (Synaptobrevindomäne) vermittelt. Einige SNAREs sind jedoch über Lipidanker an Membranen gebunden. Zusätzlich zur SNARE-Domäne und der C-terminalen transmembranen Domäne (Synaptobrevindomäne) enthalten viele SNAREs N-terminale regulatorische Sequenzmotive, die in vivo die SNARE-Proteinaktivität zusammen mit einer Reihe von unterstützenden Polypeptiden kontrollieren.
  • Die vom Pflanzengenom codierten R-SNAREs können zu drei Haupt-Unterfamilien, den VAMPs, YKT6s und SEC22s, gruppiert werden (Lipka et al. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2007. 23: 147–74). Alle Pflanzen-R-SNAREs sind sogenannte Longine, die eine ausgedehnte N-terminale Strecke (die Longin-Domäne) umfassen, die, ausgehend von Daten von humanen R-SNAREs, vielleicht an der subzellulären Lokalisierung und SNARE-Komplex-Bildung beteiligt sein könnten, z. B. durch Wechselwirkung mit regulatorischen Polypeptiden (Uemura et al. 2005; FEBS Lett. 579: 2842–46). Mit Ausnahme eines vor kurzem entdeckten Salzresitenz-Phänotyps (Leshemet al. 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 18008–13) wurde in keinem Arabidopsis-RSNARE-Mutanten ein weiterer Phänotyp gefunden, was nahelegt, dass die meisten R-SNAREs zumindest teilweise redundant wirken, wodurch es schwierig ist, auf ihre Funktion in Pflanzen zu schließen. Überexpressionsstudien in Pflanzenprotoplast legen nahe, dass Sec22 und Memb11 am anterograden Proteintransport an der ER-Golgi-Grenzfläche beteiligt sind (Chatre et al. Plant Physiology, 2005, Band 139, S. 1244–1254).
  • Kurze Darstellung der Erfindung
  • CLE-Typ-2-Polypeptid
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, erhält. Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert.
  • Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und ganz insbesondere einem erhöhten Samenertrag und/oder einer erhöhten Biomasse im Vergleich zu Kontrollpflanzen, erhält. Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen wie hier bereitgestellt in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein wie hier definiertes Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert.
  • SEC22-Polypeptid
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein SEC22-Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein SEC22-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert.
  • Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei dem interessierenden Protein (Protein of Interest, POI) um ein CLE-Typ-2-Polypeptid. Gemäß einer zweiten Ausführungsform handelt es sich bei dem interessierenden Protein (POI) um ein Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid. Gemäß einer dritten Ausführungsform handelt es sich bei dem interessierenden Protein (POI) um ein SEC22-Polypeptid.
  • Definitionen
  • Die folgenden Definitionen werden in der gesamten vorliegenden Erfindung verwendet.
  • Polypeptid(e)/Protein(e)
  • Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet und betreffen Aminosäuren in einer polymeren Form von beliebiger Länge, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
  • Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
  • Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül” werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden, in einer polymeren unverzweigten Form von beliebiger Länge.
  • Homolog(e)
  • ”Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme, welche Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zum betreffenden unmodifizierten Protein aufweisen und eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind, besitzen.
  • Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
  • Eine Insertion bezieht sich darauf, dass ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorherbestimmte Stelle in einem Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Intra-Sequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren umfassen. Im Allgemeinen werden Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Resten, sein. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.
  • Eine Substitution bezieht sich auf die Ersetzung von Aminosäuren des Proteins mit anderen Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie etwa einer ähnlichen Hydrophobizität, Hydrophilizität, Antigenizität, Neigung zur Bildung oder Aufbrechung von α-helikalen Strukturen oder β-Blatt-Strukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise an Einzelresten vorhanden, aber können abhängig von den funktionellen Erfordernissen, welche dem Polypeptid auferlegt sind, gehäuft vorliegen und können im Bereich von 1 bis 10 Aminosäuren liegen; Insertionen werden üblicherweise eine Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten aufweisen. Die Aminosäuresubstitutionen sind vorzugsweise konservative Aminosäuresubstitutionen. Tabellen mit konservativen Substitutionen sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) und Tabelle 1 unten). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen
    Rest Konservative Substitutionen Rest Konservative Substitutionen
    Ala Ser Leu Ile; Val
    Arg Lys Lys Arg; Gln
    Asn Gln; His Met Leu; Ile
    Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr
    Gln Asn Ser Thr; Gly
    Cys Ser Thr Ser; Val
    Glu Asp Trp Tyr
    Gly Pro Tyr Trp; Phe
    His Asn; Gln Val Ile; Leu
    Ile Leu, Val
  • Aminosäuresubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen können mit Hilfe von auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Peptidsynthesetechniken, wie etwa der Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, leicht ausgeführt werden. Verfahren für die Manipulierung von DNA-Sequenzen zur Erzeugung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel sind Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange-ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige ortsgerichtete Mutagenese-Protokolle ein.
  • Derivate
  • ”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche im Vergleich zur Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie dem Protein von Interesse, Substitutionen von Aminosäuren mit nicht natürlich vorkommenden Aminosäureresten, oder Additionen von nicht-natürlich vorkommenden Aminosäureresten, umfassen können. ”Derivate” eines Proteins beinhalten außerdem Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche natürlich vorkommende, veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte etc.) oder nicht-natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann außerdem eine oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder -Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, aus der es abgeleitet ist, wie zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, der kovalent oder nicht-kovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie etwa ein Reportermolekül, das gebunden ist, um dessen Nachweis zu erleichtern, sowie nicht-natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zur Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins, umfassen. Ferner zählen zu ”Derivaten” ebenfalls Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Übersichtsartikel über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
  • Ortholog(e)/Paralog(e)
  • Orthologe und Paraloge umfassen evolutionäre Konzepte, die zur Beschreibung der anzestralen Beziehungen von Genen zur Anwendung kommen. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Spezies, welche aus der Duplikation eines anzestralen Gens hervorgegangen sind; Orthologe sind Gene aus unterschiedlichen Organismen, welche durch Speziation hervorgegangen sind, und sind ebenfalls von einem gemeinsamen anzestralen Gen abgeleitet.
  • Domäne, Motiv/Consensus-Sequenz/Signatur
  • Der Begriff ”Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen evolutionär verwandter Proteine konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen variieren können, deuten Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen hochkonserviert sind, auf Aminosäuren hin, die wahrscheinlich in der Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins wesentlich sind. Identifiziert durch das hohe Ausmaß ihrer Konservierung in alignierten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen können sie als Identifikatoren verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein beliebiges betreffendes Polypeptid einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie angehört.
  • Der Begriff ”Motiv” oder ”Consensus-Sequenz” oder ”Signatur” bezieht sich auf eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionär verwandten Proteinen. Motive sind häufig hochkonservierte Teile von Domänen, aber können ebenfalls lediglich einen Teil der Domäne einschließen oder außerhalb einer konservierten Domäne liegen (wenn alle Aminosäuren des Motives außerhalb einer definierten Domäne liegen).
  • Es gibt Spezialdatenbanken für die Identifizierung von Domänen, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Hrsg., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hub et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Eine Auswahl an Werkzeugen für die Analyse von Proteinsequenzen in silico ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Schweizer Institut für Bioinformatik; Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788 (2003)) verfügbar. Domänen oder Motive können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA zu derartigen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständigen Sequenzen überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welches die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403–10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem zum Beispiel der ClustalW-Multiple-Sequenz-Alignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen paarweisen Alignment-Parametern und einer Bewertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10. Juli 2003; 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences) verfügbar sind. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können, anstatt der Verwendung von Volllängensequenzen zur Identifizierung von Homologen, auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, wobei die oben erwähnten Programme unter Anwendung der Standardparameter verwendet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol. 147(1); 195–7).
  • Reciprocal BLAST
  • In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Abfragesequenz abgeleitet ist, zurückgeBLASTet. Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Abfragesequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Abfragesequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Abfragesequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Abfragesequenz zu den höchsten Treffern zählt.
  • Hoch eingestufte Übereinstimmungstreffer sind diejenigen mit einem niedrigen E-Wert. Je niedriger der E-Wert, umso signifikanter die Wertung (oder in anderen Worten, umso niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer durch Zufall gefunden wurde). Wie man den E-Wert berechnet, ist im Stand der Technik bekannt. Zusätzlich zu E-Werten werden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. Im Fall von großen Familien kann ClustalW eingesetzt werden, gefolgt von einem Nachbarkopplungs- bzw. ”Neighbour joining”-Baum, um bei der Visualisierung der Clusterung verwandter Gene zu helfen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Hybridisierung
  • Der Begriff ”Hybridisierung”, wie hierin definiert, ist ein Verfahren, in dem im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen sich aneinander anlagern. Das Hybridisierungsverfahren kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Das Hybridisierungsverfahren kann ebenfalls stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an eine Matrix, wie magnetische Kügelchen, Sepharose-Kügelchen oder ein beliebiges anderes Harz, immobilisiert ist. Das Hybridisierungsverfahren kann ferner stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an einem festen Träger immobilisiert ist, wie etwa einer Nitrozellulose- oder Nylonmembran, oder z. B. durch Photolithographie beispielsweise an einem silikatischen Glasträger immobilisiert ist (wobei man letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder Mikroarrays oder als Nukleinsäure-Chips kennt). Um zu ermöglichen, dass eine Hybridisierung stattfindet, werden die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufzuschmelzen und/oder Haarnadeln oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen.
  • Der Begriff ”Stringenz” bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz einer Hybridisierung wird von Bedingungen, wie der Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und der Hybridisierungspuffer-Zusammensetzung, beeinflusst. Im Allgemeinen werden Niederstringenzbedingungen so gewählt, dass sie um etwa 30°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert sind. Mittlere Stringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 20°C unterhalb von Tm liegt, und Hochstringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 10°C unterhalb von Tm liegt. Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen werden in der Regel zum Isolieren von hybridisierenden Sequenzen angewandt, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweisen. Allerdings können Nukleinsäuren hinsichtlich der Sequenz abweichen und aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes immer noch ein im Wesentlichen identisches Polypeptid codieren. Deshalb können manchmal mittelstringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich sein, um derartige Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren.
  • Der Tm ist die Temperatur bei definierter Ionenstärke und pH, bei welcher 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Der Tm ist von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung sowie der Länge der Sonde abhängig. Zum Beispiel hybridisieren längere Sequenzen spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Rate der Hybridisierung wird bei etwa 16°C bis 32°C unter dem Tm erhalten. Das Vorhandensein von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung verringert die elektrostatische Abstoßung zwischen den zwei Nukleinsäure-Strängen, wodurch die Hybridbildung gefördert wird; dieser Effekt ist für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M sichtbar (für höhere Konzentrationen kann dieser Effekt vernachlässigt werden). Formamid senkt die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen um 0,6 bis 0,7°C für jedes Prozent an Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid gestattet, dass die Hybridisierung bei 30 bis 45°C durchgeführt werden kann, obwohl die Rate der Hybridisierung vermindert wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die thermische Stabilität der Duplices. Im Durchschnitt, und für große Sonden, sinkt der Tm um etwa 1°C je Prozent an Basenfehlpaarung. Der Tm kann mit Hilfe der folgenden Gleichungen, abhängig von den Typen der Hybride, berechnet werden:
    • 1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): Tm = 81,5°C + 16,6 × log10[Na+]a + 0,41 × %[G/Cb] – 500 × [Lc]–1 – 0,61 × % Formamid
    • 2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: Tm = 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 11,8 (%G/Cb)2 – 820/Lc
    • 3) Oligo-DNA- oder Oligo-RNAd-Hybride: Für < 20 Nukleotide: Tm = 2 (ln) Für 20–35 Nukleotide: Tm = 22 + 1,46 (ln)
    a
    oder für ein sonstiges einwertiges Kation, aber nur exakt im Bereich von 0,01–0,4 M.
    b
    nur exakt für %GC im Bereich von 30% bis 75%.
    c
    L = Länge des Duplex in Basenpaaren.
    d
    Oligo, Oligonukleotid; ln = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. v. G/C) + (Anz. v. A/T).
  • Nicht-spezifische Bindung kann unter Anwendung einer von vielen bekannten Techniken reguliert werden, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusetzungen von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nicht-homologe Sonden kann eine Serie von Hybridisierungen durchgeführt werden mittels Variieren von (i) progressivem Senken der Annealing-Temperatur (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) progressivem Senken der Formamidkonzentration (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während einer Hybridisierung verändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung in der Regel auch von der Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten ab. Um den aus nicht-spezifischer Hybridisierung resultierenden Hintergrund zu entfernen, werden Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu den kritischen Faktoren bei derartigen Waschschritten zählen die Ionenstärke und Temperatur der letztendlichen Waschlösung: je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur, umso höher ist die Stringenz des Waschschritts. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unter der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, welches mindestens das Zweifache von demjenigen des Hintergrundes ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays oder Genamplifikations-Nachweisverfahren wie oben angegeben beschaffen. Auch können mehr oder weniger stringente Bedingungen gewählt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während des Waschens abgeändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Zum Beispiel umfassen typische Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC. Beispiele für Mittelstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die vorhergesehene Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Wenn Nukleinsäuren von bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge bestimmt werden durch Alignieren der Sequenzen und Identifizieren der hierin beschriebenen konservierten Regionen. 1 × SSC steht für 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,5% Natriumpyrophosphat enthalten.
  • Für die Zwecke des Definierens der Höhe der Stringenz kann auf Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York oder auf Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Aktualisierungen) Bezug genommen werden.
  • Spleißvariante
  • Der Begriff ”Spleißvariante”, wie hierin verwendet, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in welchen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verschoben oder hinzugefügt worden sind, oder in welchen Introns verkürzt oder verlängert worden sind. Derartige Varianten werden solche sein, in denen die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleibt; dies kann durch selektives Beibehalten von funktionellen Segmenten des Proteins bewirkt werden. Derartige Spleißvarianten können in der Natur vorgefunden werden oder vom Menschen erzeugt sein. Verfahren zum Vorhersagen und Isolieren derartiger Spleißvarianten sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
  • Allelvariante
  • Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines gegebenen Gens, welche an der gleichen chromosomalen Position lokalisiert sind. Allelvarianten umfassen Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), sowie ”kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen” (INDELs). Die Größe von INDELs beträgt in der Regel weniger als 100 Bp. SNPs und INDELs bilden die größte Gruppe von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
  • Endogenes Gen
  • Die Bezugnahme hierin auf ein ”endogenes” Gen bezieht sich nicht nur auf das betreffende Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form (d. h. ohne dass irgendein menschlicher Eingriff stattgefunden hat) vorgefunden wird, sondern bezieht sich außerdem auf das gleiche Gen (oder ein(e) im Wesentlichen homologe(s) Nukleinsäure/Gen) in einer isolierten Form, welches anschließend in eine Pflanze (wieder)eingeführt wird (ein Transgen). Zum Beispiel kann eine transgene Pflanze, die ein derartiges Transgen enthält, eine erhebliche Reduktion der Transgen-Expression und/oder eine erhebliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder vom Menschen, zum Beispiel durch chemische Synthese, erzeugt werden.
  • Gen-Shuffling/gerichtete Evolution
  • Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution besteht aus Iterationen des DNA-Shuffling, gefolgt von einem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Abschnitten davon zu erzeugen, welche Proteine mit einer modifizierten biologischen Aktivität codieren (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151–4; U.S.-Patente 5 811 238 und 6 395 547 ).
  • Konstrukt
  • Zusätzliche Steuerungselemente können Transkriptions- sowie Translationsverstärker einschließen. Dem Fachmann werden für eine Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignete Terminator- und Verstärkersequenzen bekannt sein. Zur Erhöhung der Menge an reifer Nachricht, die sich im Zytosol anreichert, kann man in der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der Codierungssequenz außerdem eine Intronsequenz einfügen, wie im Definitionsabschnitt beschrieben. Bei anderen Steuerungssequenzen (neben Promotor, Verstärker, Silencer, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) kann es sich um Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente handeln. Solche Sequenzen sollten dem Fachmann bekannt sein oder sollten sich von diesem leicht in Erfahrung bringen lassen.
  • Die genetischen Konstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprung-Sequenz enthalten, welche für die Beibehaltung und/oder Replikation in einem spezifischen Zelttyp erfordert wird. Ein Beispiel besteht in dem Fall, dass ein genetisches Konstrukt in einer Bakterienzelle als ein episomales genetisches Element (z. B. Plasmid- oder Cosmid-Molekül) gehalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge schließen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, den f1-ori und colE1 ein.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
  • Regulatorisches Element/Steuerungssequenz/Promotor
  • Die Begriffe ”regulatorisches Element”, ”Steuerungssequenz” und ”Promotor” werden hierin alle austauschbar verwendet und beziehen sich, wobei sie in einem weiten Kontext zu verstehen sind, auf regulatorische Nukleinsäuresequenzen, die zum Bewirken der Expression der Sequenzen in der Lage sind, an welche sie ligiert sind. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäure-Steuerungssequenz, welche sich stromaufwärts vom transkriptionellen Start eines Gens befindet und welche an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verbundenen Nukleinsäure gesteuert wird. Bei den zuvor erwähnten Begriffen sind transkriptionelle regulatorische Sequenzen eingeschlossen, die aus einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen abgeleitet sind (einschließend die TATA-Box, welche für eine exakte Transkriptionsinitiation erforderlich ist, mit einer CCAAT-Box-Sequenz oder ohne), sowie weitere regulatorische Elemente (d. h. ”Upstream-aktivierende Sequenzen”, ”Enhancer” und ”Silencer”), welche die Genexpression als Reaktion auf entwicklungsmäßige und/oder externe Stimuli oder in einer gewebespezifischen Weise verändern. Ebenfalls innerhalb des Begriffs eingeschlossen ist eine transkriptionelle regulatorische Sequenz eines klassischen prokaryontischen Gens, wobei er in diesem Fall eine –35-Box-Sequenz und/oder transkriptionsregulierende –10-Box-Sequenzen einschließen kann. Der Begriff ”regulatorisches Element” beinhaltet außerdem ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, welches die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ herbeiführt, aktiviert oder steigert.
  • Ein ”Pflanzenpromotor” umfasst regulatorische Elemente, welche die Expression eines codierenden Sequenzsegments in Pflanzenzellen vermitteln. Folglich muss ein Pflanzenpromotor nicht von pflanzlichem Ursprung sein, sondern kann aus Viren oder Mikroorganismen stammen, beispielsweise aus Viren, welche Pflanzenzellen angreifen. Der ”Pflanzenpromotor” kann auch aus einer Pflanzenzelle stammen, z. B. aus der Pflanze, welche mit der Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden soll und hierin beschrieben ist. Dies gilt auch für andere regulatorische ”Pflanzen”-Signale, wie etwa ”pflanzliche” Terminatoren. Die Promotoren stromaufwärts der Nukleotidsequenzen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -insertion(en) und/oder -deletion(en) modifiziert sein, ohne die Funktionalität oder Aktivität von entweder den Promotoren, dem offenen Leserahmen (ORF) oder der 3'-regulatorischen Region, wie Terminatoren oder sonstigen 3'-regulatorischen Regionen, welche sich entfernt vom ORF befinden, zu stören. Es ist ferner möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht wird, oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar Promotoren aus heterologen Organismen, ersetzt werden. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder diesen umfassen, welcher das Gen zum richtigen Zeitpunkt und mit dem erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
  • Für die Identifizierung von funktionell äquivalenten Promotoren können die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, zum Beispiel durch funktionsfähiges Verknüpfen des Promotors mit einem Reportergen und Testen des Expressionsspiegels und -musters des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze. Zu geeigneten, allgemein bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase. Die Promotoraktivität wird durch Messen der enzymatischen Aktivität der Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase getestet. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit denjenigen eines Referenzpromotors verglichen werden (wie etwa jenem, der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren von mRNA-Spiegeln oder durch Vergleich von mRNA-Spiegeln der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Haushaltsgenen, wie etwa 18S-rRNA, untersucht werden, wobei im Fachgebiet bekannte Verfahren, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994) zur Anwendung kommen. Mit ”schwacher Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor bezeichnet, der die Expression einer codierenden Sequenz auf einem geringen Spiegel antreibt. Mit ”geringer Spiegel” sind Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis etwa 1/100000 Transkripten, bis etwa 1/5000000 Transkripten pro Zelle gemeint. Demgegenüber treibt ein ”starker Promotor” die Expression einer codierenden Sequenz bei einem hohen Niveau oder bei etwa 1/10 Transkripten bis etwa 1/100 Transkripten bis etwa 1/1000 Transkripten pro Zelle an. Mit ”mittelstarker Promotor” ist im Allgemeinen ein Promotor gemeint, der die Expression einer codierenden Sequenz bei einem niedrigeren Spiegel als ein starker Promotor antreibt, insbesondere bei einem Spiegel, welcher in allen Fällen unterhalb von demjenigen liegt, der unter der Steuerung eines 35S-CaMV-Promotors erhalten wird.
  • Funktionsfähig verbunden
  • Der Begriff ”funktionsfähig verbunden”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine funktionale Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem Gen von Interesse, so dass die Promotorsequenz in der Lage ist, die Transkription des Gens von Interesse zu initiieren.
  • Konstitutiver Promotor
  • Ein ”konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der während der meisten, aber nicht notwendigerweise allen, Phasen des Wachstums und der Entwicklung, sowie unter den meisten Umweltbedingungen, in mindestens einer/einem Zelle, Gewebe oder Organ transkriptionell aktiv ist. Die nachstehende Tabelle 2a gibt Beispiele für konstitutive Promotoren an. Tabelle 2a: Beispiele für konstitutive Promotoren
    Genquelle Literaturstelle
    Actin McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990
    HMGP WO 2004/070039
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    V-ATPase WO 01/14572
    Super-Promotor WO 95/14098
    G-Box-Proteine WO 94/12015
  • Ubiquitärer Promotor
  • Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
  • Entwicklungsmäßig regulierter Promotor
  • Ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor ist während bestimmter Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, die entwicklungsbedingten Änderungen unterliegen, aktiv.
  • Induzierbarer Promotor
  • Ein induzierbarer Promotor zeigt induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation als Reaktion auf eine Chemikalie (ein Übersichtsartikel findet sich bei Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen umweltmäßigen oder physikalischen Stimulus, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt wird, oder ”pathogeninduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze der Exposition an verschiedene Pathogene ausgesetzt wird.
  • Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
  • Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein solcher, der fähig ist, die Transkription in bestimmten Organen oder Geweben präferentiell zu initiieren, wie etwa Blättern, Wurzeln, Samengewebe etc. Zum Beispiel ist ein ”wurzelspezifischer Promotor” ein Promotor, der vorwiegend in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluss beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Promotoren, die zum Initiieren der Transkription nur in bestimmten Zellen fähig sind, werden hierin als ”zellspezifisch” bezeichnet.
  • Beispiele für wurzelspezifische Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2b aufgeführt: Tabelle 2b: Beispiele für wurzelspezifische Promotoren
    Genquelle Literaturstelle
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    ALF5 (Arabidopsis) Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
    NRT2;1Np (N. plumbaginifolia) Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)
  • Ein samenspezifischer Promotor ist hauptsächlich in Samengewebe transkriptionell aktiv, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in Samengewebe (in Fällen von Leckexpression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch sein. Beispiele samenspezifischer Promotoren (Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch) sind in Tabelle 2c bis Tabelle 2f nachstehend gezeigt. Weitere Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) beschrieben, deren Offenbarung hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist, als ob sie vollständig dargestellt wäre. Tabelle 2c: Beispiele für samenspezifische Promotoren
    Genquelle Literaturstelle
    samenspezifische Gene Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
    Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.;
    Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
    Paranuss-Albumin Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992.
    Legumin Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988.
    Glutelin (Reis) Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
    Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987.
    Zein Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32 1990
    napA Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996.
    Weizen LMW- und HMW-Glutenin-1 Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
    Weizen SPA Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
    Weizen, α, β, γ-Gliadine EMBO J. 3: 1409–15, 1984
    Gerste Itr1-Promotor Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
    Gerste B1, C, D, Hordein Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
    Gerste DOF Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
    blz2 EP99106056.7
    synthetischer Promotor Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998.
    Reis Prolamin NRP33 Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
    Reis a-Globulin Glb-1 Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
    Reis OSH1 Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
    Reis a-Globulin REB/OHP-1 Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
    Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase Trans. Res. 6: 157-68, 1997
    Mais ESR-Genfamilie Plant J. 12: 235–46, 1997
    Sorghum α-Kafirin DeRose et al., Plant Mol. Biol 32: 1029–35, 1996
    KNOX Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
    Reis-Oleosin Wu et al, J. Biochem. 123: 386, 1998
    Sonnenblumen-Oleosin Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
    PRO0117, putatives Reis 40S-ribosomales Protein WO 2004/070039
    Reis Alanin-Aminotransferase unveröffentlicht
    Trypsininhibitor ITR1 (Gerste) unveröffentlicht
    PRO0151, Reis W5118 WO 2004/070039
    PRO0175, Reis RAB21 WO 2004/070039
    PRO005 WO 2004/070039
    PRO0095 WO 2004/070039
    α-Amylase (Amy32b) Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
    Cathepsin β-ähnliches Gen Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
    Gerste Ltp2 Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
    Chi26 Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
    Mais B-Peru Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998
    Tabelle 2d: Beispiele für endospermspezifische Promotoren
    Genquelle Literaturstelle
    Glutelin (Reis) Takaiwa et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 208: 15–22 Takaiwa et al. (1987) FEBS Letts. 221: 43–47
    Zein Matzke et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32
    Weizen LMW- und HMW-Glutenin-1 Colot et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 216: 81–90 Anderson et al. (1989) NAR 17: 461–2
    Weizen SPA Albani et al. (1997) Plant Cell 9: 171–184
    Weizen Gliadine Rafalski et al. (1984) EMBO 3: 1409–15
    Gerste Itr1-Promotor Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
    Gerste B1, C, D, Hordein Cho et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 98: 1253-62; Muller et al. (1993) Plant J. 4: 343-55; Sorenson et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
    Gerste DOF Mena et al., (1998) Plant J. 116(1): 53–62
    blz2 Onate et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(14): 9175–82
    synthetischer Promotor Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J. 13: 629–640
    Reis Prolamin NRP33 Wu et al., (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
    Reis Globulin Glb-1 Wu et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
    Reis Globulin REB/OHP-1 Nakase et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33: 513–522
    Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase Russell et al. (1997) Trans. Res. 6: 157–68
    Mais ESR-Genfamilie Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J. 12: 235–46
    Sorghum Kafirin DeRose et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1029–35
    Tabelle 2e: Beispiele für embryospezifische Promotoren:
    Genquelle Literaturstelle
    Reis OSH1 Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
    KNOX Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
    PRO0151 WO 2004/070039
    PRO0175 WO 2004/070039
    PRO005 WO 2004/070039
    PRO0095 WO 2004/070039
    Tabelle 2f: Beispiele für aleuronspezifische Promotoren:
    Genquelle Literaturstelle
    α-Amylase (Amy32b) Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
    Cathepsin β-ähnliches Gen Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
    Gerste Ltp2 Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
    Chi26 Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
    Mais B-Peru Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998
  • Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie hierin definiert, ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluss beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird.
  • Beispiele für für grünes Gewebe spezifische Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2g gezeigt. Tabelle 2: Beispiele für für grünes Gewebe spezifische Promotoren
    Gen Expression Literaturstelle
    Mais, Orthophosphat-Dikinase blattspezifisch Fukavama et al., 2001
    Mais, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase blattspezifisch Kausch et al., 2001
    Reis, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase blattspezifisch Liu et al., 2003
    Reis, kleine Rubisco-Untereinheit blattspezifisch Nomura et al., 2000
    Reis, beta-Expansin EXBP9 sprossspezifisch WO 2004/070039
    Straucherbse, kleine Rubisco-Untereinheit blattspezifisch Panguluri et al., 2005
    Erbse RBCS3A blattspezifisch
  • Ein weiteres Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist ein meristemspezifischer Promotor, der vorwiegend in meristematischem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluss beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine gewisse Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Beispiele für für grünes Meristem spezifische Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2h gezeigt. Tabelle 2h: Beispiele für meristemspezifische Promotoren
    Genquelle Expressionsmuster Literaturstelle
    Reis OSH1 Spross-Apikalmeristem, vom globulären Embryostadium bis zum Setzlingsstadium Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
    Reis Metallothionein meristemspezifisch BAD87835.1
    WAK1 & WAK 2 Spross- und Wurzel-Apikalmeristeme, und in expandierenden Blättern und Kelchblättern Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318
  • Terminator
  • Der Begriff ”Terminator” beinhaltet eine Steuerungssequenz, welche eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit ist, welche die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines Primärtranskripts und die Termination der Transkription signalisiert. Der Terminator kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel aus den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Genen oder alternativ aus einem anderen Pflanzengen oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abgeleitet sein.
  • Selektierbares Marker(gen)/Reportergen
  • Unter ”selektierbarer Marker”, ”selektierbares Markergen” oder ”Reportergen” ist ein beliebiges Gen eingeschlossen, welches einer Zelle, in der es exprimiert wird, einen Phänotyp verleiht, so dass die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen erleichtert wird, die mit einem Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung transfiziert oder transformiert sind. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuremoleküle durch eine Reihe unterschiedlicher Prinzipien. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, welche Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz vermitteln, welche eine neue metabolische Eigenschaft einbringen oder welche eine visuelle Selektion zulassen. Zu Beispielen von selektierbaren Markergenen zählen Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie etwa nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, welche Resistenz zum Beispiel gegen Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin vermitteln) sowie gegen Herbizide vermitteln (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta® vermittelt; aroA oder gox, welche Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, welche zum Beispiel Resistenz gegen Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff vermitteln), oder Gene, die ein metabolisches Merkmal bereitstellen (wie etwa manA, das Pflanzen gestattet, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, oder Xylose-Isomerase für die Verwertung von Xylose, oder antinutritive Marker, wie die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Erzeugung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit seinen gefärbten Substraten, beispielsweise X-Gal), Lumineszenz (wie etwa das Luciferin/Luciferase-System) oder Fluoreszenz (grünfluoreszierendes Protein, GFP, und Derivate davon). Diese Liste repräsentiert nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit derartigen Markern vertraut. Es werden, abhängig von dem Organismus und dem Selektionsverfahren, unterschiedliche Marker bevorzugt.
  • Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie diejenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionsfähig sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die für einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben).
  • Da die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich oder unerwünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, wendet das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuren in vorteilhafter Weise Techniken an, welche die Entfernung oder Exzision dieser Markergene ermöglichen. Ein derartiges Verfahren ist die sogenannte Co-Transformation. Das Co-Transformations-Verfahren verwendet zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und ein zweiter das/die Markergen(e) trägt. Ein großer Anteil an Transformanten empfängt oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Im Fall der Transformation mit Agrobakterien empfangen die Transformanten in der Regel nur einen Teil des Vektors, d. h. die von der T-DNA flankierte Sequenz, welche üblicherweise die Expressionskassette repräsentiert. Die Markergene können anschließend durch Ausführen von Kreuzungen aus der transformierten Pflanze entfernt werden. In einem anderen Verfahren werden in ein Transposon integrierte Markergene für die Transformation gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (bekannt als Ac/Ds-Technologie). Die Transformanten können mit einer Transposase-Quelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt, welches die Expression einer Transposase vermittelt, transient oder stabil transformiert. In einigen Fällen (ungefähr 10%) springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle heraus, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen durch Ausführen von Kreuzungen eliminiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, welche das Detektieren derartiger Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen; deren Vorteil besteht darin, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieses Typs ist das sogenannte Cre/lox-System. Cre1 ist eine Rekombinase, welche die zwischen den loxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Wenn das Markergen zwischen den loxP-Sequenzen integriert ist, wird es entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und zwar durch die Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Selbstverständlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewandt werden.
  • Transgen/Transgen/Rekombinant
  • Für die Zwecke der Erfindung bedeuten ”transgen”, ”Transgen” oder ”rekombinant”, zum Beispiel in Hinsicht auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, der die Nukleinsäuresequenz umfasst, oder einen Organismus, der mit den Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren gemäß der Erfindung transformiert ist, alle diejenigen Konstruktionen, die durch rekombinante Verfahren bewerkstelligt werden, in welchen entweder
    • (a) die Nukleinsäuresequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützliche Proteine codieren, oder
    • (b) genetische Steuerungssequenz(en), welche funktionsfähig mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verknüpft ist/sind, wie beispielsweise ein Promotor, oder
    • (c) a) und b),
    nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung lokalisiert sind oder durch rekombinante Verfahren modifiziert worden sind, wobei es möglich ist, dass die Modifikation zum Beispiel die Form einer Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotidresten annimmt. Es versteht sich, dass mit der natürlichen genetischen Umgebung der natürliche genomische oder chromosomale Genort in der Ursprungspflanze oder das Vorhandensein in einer genomischen Bibliothek gemeint ist. Im Falle einer genomischen Bibliothek wird die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest teilweise beibehalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz mindestens auf einer Seite und besitzt eine Sequenzlänge von mindestens 50 Bp, vorzugsweise mindestens 500 Bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 Bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 Bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der Nukleinsäuresequenzen mit der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, welche ein in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliches Polypeptid codiert, wie oben definiert – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese Expressionskassette durch nicht-natürliche, synthetische (”künstliche”) Verfahren, wie zum Beispiel mutagene Behandlung, modifiziert wird. Geeignete Verfahren sind zum Beispiel in US 5 565 350 oder WO 00/15815 beschrieben.
  • Es versteht sich daher, dass mit einer transgenen Pflanze für die Absichten der Erfindung, wie oben, gemeint ist, dass die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Genort im Genom der Pflanze vorliegen, wobei es möglich ist, dass die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Wie erwähnt, bedeutet ”transgen” jedoch ebenfalls, dass, obwohl die erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren an ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz im Hinblick auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Es versteht sich, dass ”transgen” vorzugsweise die Expression der Nukleinsäuren gemäß der Erfindung an einem unnatürlichen Genort im Genom, d. h. homolog, bedeutet, oder dass vorzugsweise eine heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen sind hierin erwähnt. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung befindet sich eine ”isolierte” Nukleinsäuresequenz in einer nicht nativen chromosomalen Umgebung.
  • Modulierung
  • Der Begriff ”Modulierung” bedeutet in Bezug auf Expression oder Genexpression ein Verfahren, in welchem der Expressionsspiegel durch die Genexpression im Vergleich zur Kontrollpflanze verändert wird, wobei der Expressionsspiegel erhöht oder verringert werden kann. Die ursprüngliche, nicht modulierte Expression kann jede Art von Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann die ursprüngliche, nicht modulierte Expression auch das Fehlen jeglicher Expression bedeuten. Der Begriff ”Modulieren der Aktivität” bzw. der Begriff ”Modulieren der Expression” soll jedwede Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder codierten Proteine bedeuten, welche zu einem erhöhten Ertrag und/oder erhöhten Wachstum der Pflanzen führt.
  • Die Expression kann von null (nicht vorhandene oder nicht messbare Expression) auf eine bestimmte Menge zunehmen oder von einer bestimmten Menge auf unmessbar kleine Mengen oder null abnehmen.
  • Expression
  • Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet insbesondere die Transkription von einem Gen oder Genen oder einem genetischen Konstrukt zu struktureller RNA (rRNA, tRNA) oder zu mRNA mit oder ohne anschließende Translation der Letzteren in ein Protein. Das Verfahren beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des resultierenden qmRNA-Produkts.
  • Erhöhte Expression/Überexpression
  • Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie hierin verwendet, bedeutet eine beliebige Art von Expression, welche zusätzlich zum ursprünglichen Wildtyp-Expressionsniveau erfolgt.
  • Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert und beinhalten zum Beispiel die durch geeignete Promotoren angetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder von Translations-Enhancern. isolierte Nukleinsäuren, welche als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (typischerweise stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, welche das Polypeptid von Interesse codiert, hochreguliert wird. Beispielsweise können endogene Promotoren in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5 565 350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der richtigen Orientierung und im richtigen Abstand zu einem Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
  • Wenn eine Polypeptidexpression gewünscht wird, ist es im Allgemeinen wünschenswert, eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer codierenden Polynukleotidregion einzuschließen. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Die 3'-End-Sequenz, welche hinzugefügt werden soll, kann zum Beispiel aus den Genen für Nopalin-Synthase oder Octopin-Synthase oder alternativ dazu aus einem anderen Pflanzengen, oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen sonstigen eukaryontischen Gen abgeleitet sein.
  • Auch eine Intronsequenz kann an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder die codierende Sequenz der partiellen codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert. Der Einschluss eines spleißbaren Introns in der Transkriptionseinheit sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Expressionskonstrukten erhöht gezeigtermaßen die Genexpression sowohl auf der mRNA- als auch der Protein-Ebene bis zu 1000-fach (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183–1200). Eine derartige Intron-Verstärkung der Genexpression ist typischerweise am größten bei Platzierung nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S-Intron 1, 2 und 6, sowie des Bronze-1-Introns sind im Fachgebiet bekannt. Für allgemeine Informationen siehe: The Maize Handbook, Kapitel 116, Freeling und Walbot, Hrsg., Springer, N. Y. (1994).
  • Verringerte Expression
  • Eine Bezugnahme hierin auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” von Expression wird verwendet, um eine Verringerung der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptidspiegel und/oder der Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen zu bezeichnen. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung beträgt, mit zunehmender Präferenz, mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Verringerung im Vergleich zu derjenigen von Kontrollpflanzen.
  • Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze wird eine ausreichende Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz benötigt. Um ein ”Gensilencing” durchzuführen, kann diese so gering wie 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide sein, wobei sie alternativ so groß sein kann wie das gesamte Gen (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder zum Teil oder insgesamt). Die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden kann aus der Nukleinsäure, welche das Protein von Interesse codiert (Zielgen), oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist, abgeleitet sein. Vorzugsweise ist die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden in der Lage, Wasserstoffbrücken mit dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang) zu bilden, und weiter bevorzugt besitzt die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, mit zunehmender Präferenz, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zum Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, welche ein (funktionales) Polypeptid codiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen hierin erörterten Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
  • Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann unter Anwendung von routinemäßigen Hilfsmitteln und Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung von endogener Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, eines genetischen Konstrukts, in welches die Nukleinsäure (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von einem beliebigen Protein von Interesse in der Lage ist) als ein invertierter Repeat (teilweise oder vollständig), getrennt durch einen Abstandhalter (nicht-codierende DNA), einkloniert ist.
  • In einem derartigen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im Wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines ”Inverted Repeat” einer Nukleinsäure oder eines Teils davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur fähig ist. Der ”Inverted Repeat” wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Steuerungssequenzen umfasst. Eine nicht-codierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Abstandhalter, zum Beispiel ein Matrix-Anheftungs-Region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker etc.) befindet sich zwischen den zwei invertierten Nukleinsäuren, welche den ”Inverted Repeat” bilden. Nach der Transkription des ”Inverted Repeat” wird eine chimäre RNA mit einer selbstkomplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als die Haarnadel-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, welche in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet die mRNA-Transkripte weiter, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die zu Polypeptiden translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Für weitere allgemeine Details siehe zum Beispiel Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 .
  • Die Ausführung der Verfahren der Erfindung beruht nicht auf dem Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem genetischen Konstrukt, in welches die Nukleinsäure als ein ”Inverted Repeat” einkloniert ist, sondern es können ein oder mehrere beliebige von einigen, allgemein bekannten ”Gen-Silencing”-Verfahren zur Anwendung kommen, um die gleichen Effekte zu erzielen.
  • Ein derartiges Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing von Genexpression (Herunterregulieren). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze von einer doppelsträngigen RNA-Sequenz (dsRNA) ausgelöst, welche im Wesentlichen ähnlich zum endogenen Zielgen ist. Diese dsRNA wird von der Pflanze zu etwa 20 bis etwa 26 Nukleotiden weiterprozessiert, welche als kurze interferierende RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, welcher das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
  • Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense-Orientierung” bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche homolog zu einem mRNA-Transkript davon ist. Deswegen wird man in eine Pflanze mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz einführen. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens verringern, was zur Entstehung eines Phänomens führt, welches als Co-Suppression bekannt ist. Die Reduktion der Genexpression wird noch erheblicher sein, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und der Auslösung von Co-Suppression besteht.
  • Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein codiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem endogenen Gen, welches abgeschaltet werden soll. Die Komplementarität kann in der ”codierenden Region” und/oder in der ”nicht-codierenden Region” eines Gens lokalisiert sein. Der Begriff ”codierende Region” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff ”nicht-codierende Region” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die codierende Region flankieren und welche transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (ebenfalls bezeichnet als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen).
  • Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß den Regeln der Watson-und-Crick-Basenpaarung entworfen werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zur gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) komplementär sein, aber kann ebenfalls ein Oligonukleotid sein, welches den Antisense zu lediglich einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der 5'- und 3'-UTR der mRNA) darstellt. Zum Beispiel kann die Antisense-Oligonukleotidsequenz komplementär zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid codiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotidsequenz ist im Fachgebiet bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kann unter Anwendung von chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedenartig modifizierte Nukleotide verwendet werden, entworfen zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildeten Duplex, wobei z. B. Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden können. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Cyclisierung und 'Caps' sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, wie etwa Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
  • Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in welchen eine Nukleinsäuresequenz in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h., die von der insertierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird bezüglich einer Zielnukleinsäure von Interesse eine Antisense-Orientierung aufweisen). Vorzugsweise findet die Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäurekonstrukts statt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verbundenes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
  • Die zum Silencing in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküle (ob in eine Pflanze eingeführt oder in situ erzeugt) hybridisieren oder binden an für ein Polypeptid codierende genomische DNA und/oder mRNA-Transkripte, um dadurch die Expression des Proteins zu inhibieren, z. B. durch Inhibieren von Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex erfolgen, oder, zum Beispiel im Fall einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, welche an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer spezifischen Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ dazu können Antisense-Nukleinsäuresequenzen modifiziert sein, um ausgewählte Zellen anzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Für die systemische Verabreichung können Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, welche an Zelloberflächen-Rezeptoren oder Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können Zellen auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren zugeführt werden.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann außerdem ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327–330) umfassen.
  • Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung von endogener Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen durchgeführt werden. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, wie einer mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, in der Lage sind. Somit können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme; beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) verwendet werden, um ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, wodurch die Anzahl an mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entworfen werden (siehe zum Beispiel: Cech et al. US-Patent Nr. 4 987 071 ; und Cech et al. US-Patent Nr. 5 116 742 ). Alternativ dazu können mRNA-Transkripte, welche einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist im Fachgebiet bekannt (z. B. Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (19q97) WO 97/13865 und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
  • Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden.
  • Gen-Silencing kann auch auftreten, wenn eine Mutation auf einem endogenen Gen und/oder eine Mutation auf einem/einer isolierten Gen/Nukleinsäure, welche(s) anschließend in eine Pflanze eingebracht wird, vorhanden ist. Die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzung(en) können daher ein Polypeptid vorsehen, das noch zum Binden an interagierende Proteine (wie etwa Rezeptorproteine) in der Lage ist, aber seine normale Funktion nicht aufzeigen kann (wie etwa Signalleitungs-Ligand).
  • Ein weiteres Vorgehen für das Gen-Silencing besteht im Targeting von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens (z. B. dem Promotor und/oder Enhancern) komplementär sind, wodurch tripelhelikale Strukturen gebildet werden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992; und Maher, L. J. Bioassays 14, 807–15, 1992.
  • Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zum Inhibieren von dessen Funktion in planta oder zum Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Insbesondere mag es in Betracht gezogen werden, dass vom Menschen geschaffene Moleküle zum Inhibieren der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder zur Störung des Signalleitungsweges, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
  • Alternativ dazu kann ein Screening-Programm angesetzt werden, um natürliche Varianten eines Gens in einer Pflanzenpopulation zu identifizieren, wobei die Varianten Polypeptide mit verringerter Aktivität codieren. Solche natürlichen Varianten können beispielsweise auch zur Ausführung von homologer Rekombination angewandt werden.
  • Künstliche und/oder natürliche MicroRNAs (miRNAs) können verwendet werden, um Genexpression und/oder mRNA-Translation auszuknocken. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19–24 Nukleotiden. Sie funktionieren vorwiegend zum Regulieren der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen MicroRNAs (miRNAs) weisen eine perfekte oder beinahe perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Allerdings gibt es natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Sie werden aus längeren nicht-codierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch doppelstrangspezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Nach der Prozessierung werden sie in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) durch Binden an dessen Hauptkomponente, ein Argonaut-Protein, eingebaut. MiRNAs dienen als die Spezifitätskomponenten des RISC, da sie mit Zielnukleinsäuren, vorwiegend mRNAs, im Cytoplasma eine Basenpaarung eingehen. Anschließende regulatorische Ereignisse beinhalten die Ziel-mRNA-Spaltung und Zerstörung und/oder die Translationsinhibition. Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich deshalb häufig in verringerten mRNA-Spiegeln von Zielgenen wider.
  • Artifizielle MikroRNAs (amiRNAs), welche typischerweise eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, können in spezifischer Weise gentechnisch erzeugt werden, um die Genexpression von einzelnen oder mehreren Genen von Interesse negativ zu regulieren. Determinanten der Pflanzen-MikroRNA-Zielauswahl sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können angewandt werden, um beim Entwurf von spezifischen amiRNAs zu helfen (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Zweckdienliche Hilfsmittel für den Entwurf und die Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorläufern sind ebenfalls öffentlich verfügbar (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
  • Für eine optimale Leistung erfordern die Gen-Silencing-Techniken, die zum Reduzieren der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze angewandt werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotylen Pflanzen für die Transformation monokotyler Pflanzen, und aus dikotylen Pflanzen für die Transformation dikotyler Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer beliebigen gegebenen Pflanzenspezies in dieselbe Spezies eingebracht. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Allerdings ist es kein absolutes Erfordernis, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz aus derselben Pflanzenspezies stammt, wie die Pflanze, in welche sie eingeführt wird. Es ist ausreichend, dass eine wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäure besteht.
  • Beispiele verschiedener Verfahren für die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze sind oben beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne weiteres in der Lage sein, die oben genannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch Verwenden eines geeigneten Promotors.
  • Transformation
  • Der Begriff ”Einbringung” oder ”Transformation”, wie hierin darauf Bezug genommen wird, beinhaltet den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des für den Transfer angewandten Verfahrens. Pflanzengewebe, das zur anschließenden klonalen Vermehrung in der Lage ist, ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem genetischen Konstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert, und eine gesamte Pflanze daraus regeneriert werden. Das gewählte jeweilige Gewebe wird abhängig von den klonalen Propagationssystemen variieren, welche für die zu transformierende jeweilige Spezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele schließen Blattscheiben, Pollen, Embryos, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Callusgewebe, existierendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotylmeristem und Hypokotylmeristem) ein. Das Polynukleotid kann transient oder stabil in eine Wirtszelle eingebracht und kann nicht-integriert, zum Beispiel als ein Plasmid, beibehalten werden. Alternativ dazu kann es in das Wirtsgenom integriert werden. Die resultierende transformierte Pflanzenzelle kann dann zum Regenerieren einer transformierten Pflanze auf eine Weise, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, verwendet werden.
  • Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenspezies ist heutzutage eine durchaus routinemäßige Technik. In vorteilhafter Weise kann ein beliebiges von mehreren Transformationsverfahren angewandt werden, um das Gen von Interesse in eine geeignete Vorfahrenzelle einzubringen. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren können für transiente oder für stabile Transformationen angewandt werden. Transformationsverfahren beinhalten die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme freier DNA erhöhen, direkte Injektion der DNA in die Pflanze, Beschuss mit einer Partikelkanone, Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen sowie Mikroprojektion. Man kann Verfahren auswählen unter dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72–74; Negrutiu, I., et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 363–373); der Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al. (1985) Bio/Technol. 3, 1099–1102); der Mikroinjektion in Pflanzenmaterial hinein (Crossway, A., et al., (1986) Mol. Gen. Genet., 202: 179–185); dem Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Teilchen (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), der Infektion mit (nicht-integrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, einschließlich transgener Nutzpflanzen, werden vorzugsweise durch Agrobacterium-vermittelte Transformation hergestellt. Ein vorteilhaftes Transformationsverfahren ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck ist es zum Beispiel möglich, den Agrobakterien zu gestatten, auf Pflanzensamen einzuwirken, oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien zu inokulieren. Es hat sich gemäß der Erfindung als besonders zweckmäßig erwiesen zu gestatten, dass eine Suspension transformierter Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest auf die Blütenanlagen einwirkt. Die Pflanze wird anschließend weiter wachsen gelassen, bis die Samen der behandelten Pflanze erhalten werden (Clough und Bent, Plant J. (1998) 16, 735–743). Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis schließen allgemein bekannte Verfahren für die Reistransformation ein, wie etwa diejenigen, welche in einem beliebigen von Folgenden beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Im Falle von Mais-Transformation ist das bevorzugte Verfahren beschaffen, wie entweder in Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745–50, 1996) oder Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Die Verfahren sind beispielhaft ferner in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128–143 und in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die Nukleinsäuren oder das Konstrukt, welche(s) exprimiert werden soll/sollen, wird/werden vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der zum Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie etwa Pflanzen, welche als Modell herangezogen werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung nicht als Nutzpflanze betrachtet) oder Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, beispielsweise durch Eintauchen von zerquetschten Blättern oder zerhackten Blättern in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acids Res. (1988) 16, 9877, beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38, bekannt.
  • Zusätzlich zur Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, ist es ebenfalls möglich, die Zellen von Pflanzenmeristemen und insbesondere diejenigen Zellen, welche sich zu Gameten entwickeln, zu transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung, wodurch es zur Entstehung transgener Pflanzen kommt. So werden beispielsweise Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und Samen werden aus den sich entwickelnden Pflanzen erhalten, von denen ein gewisser Anteil transformiert und somit transgen ist [Feldman, KA, und Marks, MD (1987). Mol. Gen. Genet. 208: 274–289; Feldmann, K., (1992). In: C. Koncz, N-H. Chua und J. Shell (Hrsg.), Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren basieren auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Schnittstelle im Zentrum der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch in ähnlicher Weise transformierte Samen zu einem späteren Zeitpunkt erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen. Genet., 245: 363–370). Ein besonders effektives Verfahren ist jedoch das Vakuuminfiltrationsverfahren mit seinen Modifikationen, wie dem ”Floral dip”-Verfahren. Im Falle von Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N. (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], wohingegen im Fall des ”Floral dip”-Verfahrens das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer tensidbehandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ, und Bent, AF (1998) The Plant J. 16, 735–743]. In beiden Fällen wird ein gewisser Anteil an transgenen Samen geerntet, und diese Samen können von nicht-transgenen Samen durch Kultivieren unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen unterschieden werden. Darüber hinaus besitzt die stabile Transformation von Plastiden Vorteile, weil Plastide in den meisten Nutzpflanzen maternal vererbt werden, was das Risiko eines Transgen-Flusses durch Pollen verringert oder eliminiert. Die Transformation des Chloroplastengenoms wird im Allgemeinen durch ein Verfahren bewirkt, das in Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] schematisch geschildert worden ist. Kurz gesagt werden die zu transformierenden Sequenzen zusammen mit einem selektierbaren Markergen zwischen flankierende Sequenzen, die homolog zum Chloroplastengenom sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen lenken die ortsspezifische Integration in das Plastom. Plastidale Transformation ist für viele verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden, und eine Übersicht findet man in Bock (2001) "Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology". J. Mol. Biol. 21. Sep. 2001; 312 (3): 425–38, oder Maliga, P. (2003) "Progress towards commercialization of plastid transformation technology". Trends Biotechnol. 21, 20–28. In jüngster Zeit ist über einen weiteren biotechnologischen Fortschritt in Form von markerfreien Plastidentransformanten, welche mittels eines transienten, cointegrierten Markergens hergestellt werden können, berichtet worden (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren können in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer gefunden werden.
  • Nach einer Transformation werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen im Allgemeinen hinsichtlich Gegenwart von einem oder mehreren Markern selektiert, welche von pflanzlich exprimierbaren Genen codiert werden, die mit dem Gen von Interesse co-transferiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nicht-transformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und nach einer anfänglichen Wachstumsperiode einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Wachsenlassen der Samen, zutreffendenfalls nach Sterilisation, auf Agarplatten unter Anwendung eines geeigneten Selektionsmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen hinsichtlich der Gegenwart eines selektierbaren Markers, wie derjenigen, die oben beschrieben sind, gescreent.
  • Im Anschluss an DNA-Transfer und Regeneration können vermeintlich transformierte Pflanzen auch, zum Beispiel unter Anwendung von Southern-Analyse, hinsichtlich der Gegenwart des Gens von Interesse, der Kopienzahl und/oder der genomischen Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können Expressionsspiegel der neu eingeführten DNA unter Anwendung von Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
  • Die erzeugten, transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder Ti) geselbstet und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten, transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen; klonale Transformanten (wobei z. B. alle Zellen transformiert sind, um die Expressionskassette zu enthalten); Propfungen von transformierten und nicht-transformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock an einen nicht-transformierten Spross gepfropft wird) sein.
  • In der gesamten Anmeldung ist eine mit einem Konstrukt transformierte – oder austauschbar transformierte – oder mit einer Nukleinsäure transformierte Pflanze, ein mit einem Konstrukt transformierter – oder austauschbar transformierter – oder mit einer Nukleinsäure transformierter Pflanzenteil, ein mit einem Konstrukt transformierter – oder austauschbar transformierter – oder mit einer Nukleinsäure transformierter Samen bzw. eine mit einem Konstrukt transformierte – oder austauschbar transformierte – oder mit einer Nukleinsäure transformierte Pflanzenzelle so zu verstehen, dass damit eine Pflanze, ein Pflanzenteil, ein Samen bzw. eine Pflanzenzelle gemeint ist, die das Konstrukt bzw. die Nukleinsäure als Resultat der Einführung des Konstrukts bzw. der Nukleinsäure durch biotechnologische Mittel trägt. Die Pflanze, der Pflanzenteil, der Samen bzw. die Pflanzenzelle umfasst daher das rekombinante Konstrukt bzw. die rekombinante Nukleinsäure. Alle Pflanzen, Pflanzenteile, Samen und Pflanzenzellen, die das rekombinante Konstrukt bzw. die rekombinante Nukleinsäure nach einer Einführung in der Vergangenheit nicht mehr umfassen, werden als null-segregant, nullizygot oder Nullkontrolle bezeichnet, werden jedoch nicht als mit dem Konstrukt bzw. der Nukleinsäure transformierte Pflanzen, Pflanzenteile, Samen bzw. Pflanzenzellen innerhalb der Bedeutung dieser Anmeldung angesehen.
  • T-DNA-Aktivierungs-Tagging
  • T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, üblicherweise enthaltend einen Promotor (es kann sich auch um einen Translations-Enhancer oder ein Intron handeln), in die genomische Region des Gens von Interesse oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der codierenden Region eines Gens in einer derartigen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Typischerweise wird die Regulierung der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor gestört, und das Gen kommt unter die Kontrolle des neu eingebrachten Promotors. Der Promotor ist typischerweise in einer T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom insertiert, zum Beispiel durch Agrobacterium-Infektion, und führt zur modifizierten Expression von Genen nahe der insertierten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression von Genen nahe dem eingebrachten Promotor.
  • TILLING
  • Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die zum Erzeugen und/oder Identifizieren von Nukleinsäuren nützlich ist, welche Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität codieren. TILLING erlaubt auch die Selektion von Pflanzen, welche derartige Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufzeigen, entweder hinsichtlich Stärke oder Lokalisierung oder Zeitgebung (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufzeigen als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. TILLING vereinigt Hochdichte-Mutagenese mit Hochdurchsatz-Screeningverfahren. Die beim TILLING typischerweise befolgten Schritte sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei, GP und Koncz, C (1992), in: Methods in Arabidopsis Research, Koncz, C, Chua, NH, Schell, J (Hrsg.) Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) in: Meyerowitz. EM, Somerville. CR (Hrsg.), "Arabidopsis". Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner, J. und Caspar, T. (1998) in: J. Martinez-Zapater, J. Salinas, (Hrsg.), Methods in Molecular Biology, Band 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Poolen der Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer Region von Interesse; (d) Denaturieren und Annealen, um die Bildung von Heteroduplexen zu gestatten; (e) DHPLC, wobei die Gegenwart eines Heteroduplex in einem Pool als ein Extra-Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifikation des Mutanten-Individuums; und (g) Sequenzieren des Mutanten-PCR-Produkts. Verfahren für TILLING sind im Fachgebiet allgemein bekannt (McCallum et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18: 455–457; übersichtmäßig zusammengefasst von Stemple (2004) Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50).
  • Homologe Rekombination
  • Homologe Rekombination gestattet die Einbringung einer gewählten Nukleinsäure in einem Genom an einer definierten gewählten Position. Homologe Rekombination ist eine Standardtechnologie, die in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe oder das Moos Physcomitrella, routinemäßig angewandt wird. Verfahren zur Durchführung homologer Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen beschrieben worden (Offringa et al. (1990) EMBO J. 9(10): 3077–84), sondern auch für Nutzpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al. (2002) Nat. Biotech. 20(10): 1030–4; Iida und Terada (2004) Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132–8), und es existieren Vorgehensweisen, welche, ungeachtet des Zielorganismus, allgemein anwendbar sind (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
  • Ertragsmerkmale
  • Ertragsmerkmale umfassen eine oder mehrere aus Ertrag, Biomasse, Samenertrag, Früh-Wuchskraft, Grünheitsindex, erhöhter Wachstumsrate, verbesserten agronomischen Eigenschaften (wie verbesserter Wasserausnutzungseffizienz (Water Use Efficiency, WUE), Stickstoffausnutzungseffizienz (Nitrogen Use Efficiency, NUE) usw. ausgewählte Eigenschaften.
  • Ertrag
  • Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen einen messbaren Gewinn von wirtschaftlichem Wert, typischerweise in Bezug auf eine spezifizierte Nutzpflanze, ein Gebiet und eine Zeitperiode. Individuelle Pflanzenteile tragen auf Basis ihrer Anzahl, Größe und/oder ihres Gewichts direkt zum Ertrag bei, oder die tatsächliche Ausbeute ist der Ertrag pro Quadratmeter für eine Nutzpflanze und pro Jahr, was mittels Dividieren der Gesamtproduktion (einschließend sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion) durch die bepflanzten Quadratmeter bestimmt wird.
  • Die Begriffe ”Ertrag” einer Pflanze und ”Pflanzenertrag” werden hier austauschbar verwendet und sollen sich auf vegetative Biomasse wie Wurzel- und/oder Sprossbiomasse, auf die reproduktiven Organe und/oder auf Verbreitungseinheiten wie Samen dieser Pflanze beziehen.
  • Nimmt man Mais als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem in einem oder mehreren der Folgenden zeigen: einer Erhöhung der Anzahl an Pflanzen, welche pro Quadratmeter hervorgebracht werden, einer Erhöhung der Anzahl von Ähren pro Pflanze, einer Erhöhung der Anzahl an Ackerreihen, der Anzahl der Kerne pro Reihe, des Kerngewichts, des Tausendkerngewichts, der Ährenlänge/des Ährendurchmessers, einer Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist). Nimmt man Reis als Beispiel, so kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem als Erhöhung eines oder mehrerer der Folgenden zeigen: Anzahl an Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl von Rispen pro Pflanze, Rispenlänge, Anzahl an Ährchen pro Rispe, Anzahl an Blüten (Blütchen) pro Rispe, einer Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist), einer Erhöhung des Tausendkerngewichts. Bei Reis kann auch eine Toleranz gegenüber Untertauchen zu einem erhöhten Ertrag führen.
  • Frühe Blütezeit
  • Pflanzen mit einer ”frühen Blütezeit”, so wie der Begriff hier verwendet wird, sind Pflanzen, die eher zu blühen beginnen als Vergleichspflanzen. Dieser Ausdruck bezieht sich daher auf Pflanzen, die eher zu blühen beginnen. Die Blütezeit von Pflanzen lässt sich abschätzen, indem man die Anzahl an Tagen, d. h. die ”Zeit bis zur Blüte”, zwischen dem Säen und dem Erscheinen einer ersten Blüte zählt. Die ”Blütezeit” bzw. die ”Zeit bis zur Blüte” bzw. ”das Erscheinen einer ersten Blüte” einer Pflanze lässt sich zum Beispiel unter Anwendung des in WO 2007/093444 beschriebenen Verfahrens bestimmen.
  • Jungpflanzenvitalität
  • ”Jungpflanzenvitalität” bezieht sich auf aktives gesundes, gut ausgewogenes Wachstum, insbesondere während der frühen Stadien des Pflanzenwachstums, und kann aus einer erhöhten Pflanzenfitness resultieren, beispielsweise aufgrund dessen, dass die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. Optimieren der Verwendung von Energieressourcen und der Aufteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Jungpflanzenvitalität zeigen außerdem erhöhtes Setzling-Überleben und eine bessere Hervorbringung der Nutzpflanze, was häufig zu sehr gleichmäßigen Feldern (wobei die Nutzpflanze in gleichmäßiger Weise wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen die verschiedenen Stadien der Entwicklung im Wesentlichen zur gleichen Zeit erreicht) und oftmals zu einem besseren und höheren Ertrag führt. Deshalb kann die Jungpflanzenvitalität durch Messen verschiedener Faktoren, wie etwa Tausendkerngewicht, Prozentsatz der Keimung, Prozentsatz der Emergenz, Setzlingswachstum, Setzlingshöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und vielen anderen, bestimmt werden.
  • Erhöhte Wachstumsrate
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen überall in der gesamten Pflanze herrschen. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Der Lebenszyklus einer Pflanze kann so verstanden werden, dass die Zeit gemeint ist, welche benötigt wird, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, in welchem die Pflanze trockene reife Samen erzeugt hat, die ähnlich zum Ausgangsmaterial sind. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Keimschnelligkeit, Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, Grünheits-Index, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann an einer oder mehreren Stufen im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Pflanzenlebenszyklus stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der frühen Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann eine gesteigerte Wuchskraft reflektieren. Die Erhöhung in der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, was gestattet, dass Pflanzen später ausgesät und/oder früher geerntet werden, als es sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt kann mit einer früheren Blütezeit erreicht werden). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie das weitere Aussäen von Samen derselben Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel Säen und Ernten von Reispflanzen, gefolgt von Säen und Ernten weiterer Reispflanzen, alle innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht wird, kann sie, in ähnlicher Weise, das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel das Säen und Ernten von Maispflanzen, gefolgt zum Beispiel von Aussaat und gegebenenfalls Ernte von Sojabohne, Kartoffel oder einer beliebigen anderen geeigneten Pflanze). Im Falle mancher Nutzpflanzen kann auch das mehrmalige Abernten vom gleichen Wurzelstock möglich sein. Das Ändern des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (aufgrund einer Erhöhung der Mehrmaligkeit (z. B. in einem Jahr), bei der eine beliebige jeweilige Pflanze angebaut und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch die Kultivierung transgener Pflanzen in einem weiteren geographischen Gebiet als bei ihren Wildtyp-Gegenstücken zulassen, da die territorialen Eingrenzungen für den Anbau einer Nutzpflanze häufig von nachteiligen Umweltbedingungen entweder zur Zeit des Pflanzens (frühe Jahreszeit) oder zur Zeit des Erntens (späte Jahreszeit) bestimmt werden. Derartige nachteilige Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt wird. Die Wachstumsrate lässt sich durch Ableiten verschiedener Parameter aus den Wachstumskurven bestimmen, wobei es sich bei den Parametern unter anderem um die folgenden handeln kann: T-Mid (die Zeit, die Pflanzen zum Erreichen von 50% ihrer Maximalgröße benötigen) und T-90 (die Zeit, die Pflanzen zum Erreichen von 90% ihrer Maximalgröße benötigen).
  • Stressresistenz
  • Eine Erhöhung des Ertrags und/oder der Wachstumsrate tritt ungeachtet dessen, ob sich die Pflanze unter Nichtstressbedingungen befindet oder ob die Pflanze verschiedenen Stressformen ausgesetzt ist, im Vergleich zu Kontrollpflanzen auf. Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35%, 30% oder 25%, weiter bevorzugt weniger als 20% oder 15%, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Auf Grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) werden starke Stressfaktoren bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig angetroffen. Als eine Konsequenz ist das von mäßigem Stress induzierte beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressfaktoren sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressfaktoren, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressfaktoren können zurückzuführen sein auf Dürre oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen.
  • Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (insbesondere wegen Dürre), Salzstress, oxidativem Stress oder einem ionischen Stress verursacht wird. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise diejenigen Stressarten, welchen von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden.
  • Biotische Stressfaktoren sind typischerweise diejenigen Stressarten, welche von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (z. B. wegen Dürre), Salzstress oder einem Froststress verursacht wird. Bei abiotischem Stress kann es sich auch um oxidativen Stress oder Kältestress handeln. ”Froststress” soll sich auf Stress aufgrund von Frosttemperaturen, d. h. Temperaturen, bei denen verfügbare Wassermoleküle gefrieren und zu Eis werden, beziehen. ”Kältestress”, der auch als ”Kühlstress” bezeichnet wird, soll sich auf kalte Temperaturen, z. B. Temperaturen unter 10°, oder vorzugsweise unter 5°C, bei denen Wassermoleküle jedoch nicht gefrieren, beziehen.
  • Wie von Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und Produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen Proteinen und Strukturproteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen Umwelt-Stressfaktoren häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stressproteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nichtstress”bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Pflanzen mit optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen kultiviert wurden) ergeben typischerweise, mit zunehmender Präferenz, mindestens 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Grundlage von Ernte und/oder Saison berechnet werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Durchschnittsertrags-Produktionen einer Nutzpflanze.
  • Insbesondere können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Nichtstressbedingungen oder unter Bedingungen mit milder Dürre durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Wie von Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und Produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen Proteinen und Strukturproteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen Umwelt-Stressfaktoren häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stressproteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nichtstress”bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Pflanzen mit optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen kultiviert wurden) ergeben typischerweise, mit zunehmender Präferenz, mindestens 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Grundlage von Ernte und/oder Saison berechnet werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Durchschnittsertrags-Produktionen einer Nutzpflanze.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können insbesondere unter Nichtstressbedingungen durchgeführt werden. In einem Beispiel können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Nichtstressbedingungen wie milder Dürre durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
  • Bei einer anderen Ausführungsform können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Stressbedingungen durchgeführt werden.
  • In einem Beispiel können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Stressbedingungen wie Dürre durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
  • In einem anderen Beispiel können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Stressbedingungen wie Nährstoffmangel durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
  • Ein Nährstoffmangel kann aus einem Mangel an Nährstoffen wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor resultieren.
  • In noch einem anderen Beispiel können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Stressbedingungen wie Salzstress durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Kochsalz (NaCl) beschränkt, sondern kann sich unter anderem auch auf eine oder mehrere der folgenden Substanzen beziehen: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2.
  • Erhöhen/Verbessern/Steigern
  • Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind austauschbar und sollen im Sinne der Patentanmeldung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, weiter bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wie hierin definiert, bedeuten.
  • Samenertrag
  • Erhöhter Samenertrag kann sich als eines oder mehrere der Folgenden manifestieren:
    • a) eine Zunahme bei der Samenbiomasse (Gesamtsamengewicht), welche auf Einzelsamenbasis und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter bezogen sein kann;
    • b) eine erhöhte Anzahl an Blüten pro Pflanze;
    • c) eine erhöhte Anzahl an Samen und/oder eine erhöhte Anzahl an gefüllten Samen;
    • d) eine erhöhte Samenfüllrate (welche als das Verhältnis zwischen der Anzahl an gefüllten Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen ausgedrückt wird);
    • e) ein erhöhter Ernteindex, welcher als ein Verhältnis des Ertrags an erntefähigen Teilen, wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse der oberirdischen Pflanzenteile, ausgedrückt wird; und
    • f) ein erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW), welches aus der gezählten Anzahl an gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKW kann aus erhöhter Samengröße und/oder erhöhtem Samengewicht resultieren, und kann auch aus einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße resultieren.
  • Eine Erhöhung im Samenertrag kann sich auch als eine Erhöhung in Samengröße und/oder Samenvolumen manifestieren. Ferner kann sich eine Erhöhung des Samenertrags auch als eine Erhöhung bei Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder Samenumfang manifestieren. Erhöhter Ertrag kann auch zu modifizierter Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur auftreten.
  • Grünheits-Index
  • Der ”Grünheits-Index”, wie hierin verwendet, wird aus Digitalbildern von Pflanzen berechnet. Für jedes Pixel, das zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehört, wird das Verhältnis des Grünwerts gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell zum Codieren von Farbe) berechnet. Der Grünheits-Index wird als der Prozentsatz an Pixeln ausgedrückt, für den das Grün-zu-Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit wird der Grünheits-Index von Pflanzen in der letzten Abbildung vor dem Aufblühen gemessen. Im Gegensatz dazu wird der Grünheits-Index von Pflanzen unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen in der ersten Abbildung nach der Dürre gemessen.
  • Biomasse
  • Der Ausdruck ”Biomasse” soll sich, so wie er hier verwendet wird, auf das Gesamtgewicht einer Pflanze beziehen. Bei der Definition von Biomasse kann man einen Unterschied zwischen der Biomasse eines oder mehrerer Teile einer Pflanze machen, welche Folgendes einschließen können:
    • – oberirdische (erntbare) Teile wie z. B., jedoch nicht darauf beschränkt, Sprossbiomasse, Samenbiomasse, Blattbiomasse usw. und/oder
    • – unterirdische (erntbare) Teile wie z. B., jedoch nicht darauf beschränkt, Wurzelbiomasse usw., und/oder
    • – erntbare Teile, die teilweise in den Boden gesteckt wurden oder sich im Kontakt mit dem Boden befinden, wie z. B., jedoch nicht darauf beschränkt, Rüben und andere hypokotyle Regionen einer Pflanze, Rhizomen, Stolonen oder kriechende Wurzelstöcke;
    • – vegetative Biomasse wie Wurzelbiomasse, Sprossbiomasse usw., und/oder
    • – Fortpflanzungsorgane und/oder
    • – Diasporen wie Samen.
  • Markerunterstützte Züchtungsprogramme
  • Solche Züchtungsprogramme erfordern machmal das Einbringen von allelischer Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von Allelvarianten mit unabsichtlich verursachtem sogenanntem ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung von Allelvarianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen Allelvarianten der betreffenden Sequenz, welche erhöhten Ertrag ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene Allelvarianten der betreffenden Sequenz enthalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige Allelvariante identifiziert worden ist, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
  • Verwendung als Sonden beim Genkartieren
  • Die Verwendung von für das interessierende Protein codierenden Nukleinsäuren zur genetischen und physikalischen Kartierung der Gene erfordert lediglich eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Diese Nukleinsäuren können als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J., Fritsch, EF., und Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsverdauter pflanzlicher genomischer DNA können mit den für das interessierende Protein codierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181) unterzogen werden, um eine genetische Karte zu erstellen. Darüber hinaus können die Nukleinsäuren verwendet werden, um Southern-Blots zu sondieren, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs aus einer Auswahl von Individuen enthalten, welche Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und verwendet, um die Position der für das interessierende Protein codierenden Nukleinsäure in der genetischen Karte zu berechnen, welche zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Anwendung von pflanzengenabgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41 beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwendung der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Intercross-Populationen, Rückkreuzungs-Populationen, wahllos gekreuzte Populationen, beinahe isogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. in: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346, und darin zitierte Literaturstellen).
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden bei der direkten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH)-Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl derzeitige Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (mehrere kb bis einige hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), können Verbesserungen der Empfindlichkeit eine Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
  • Eine Vielzahl von auf Nukleinsäure-Amplifikation basierenden Verfahren zur genetischen und physikalischen Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotid-Verlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping bzw. Bestrahlungs-Hybridkartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure verwendet, um Primerpaare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen zu entwerfen und herzustellen. Das Entwerfen derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. In Verfahren unter Anwendung von PCR-basierter genetischer Kartierung kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
  • Pflanze
  • sDer Begriff ”Pflanze”, wie hierin verwendet, beinhaltet ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen sowie Pflanzenteile, einschließlich Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der Zuvorgenannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst. Der Begriff ”Pflanze” beinhaltet außerdem Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Callusgewebe, Embryos, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der Zuvorgenannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst.
  • Zu Pflanzen, welche in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen, einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher, die aus der Liste ausgewählt sind, die unter anderem Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp., Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölsamenraps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp. umfasst.
  • Was die erfindungsgemäßen Sequenzen betrifft, so ist eine Nukleinsäure oder eine Polypeptidsequenz pflanzlichen Ursprungs durch eine für eine Expression in Pflanzen optimierte Codonverwendung beziehunsgweise die Verwendung von in Pflanzen üblichen Aminosäuren und Regulationsstellen gekennzeichnet. Bei der Ursprungspflanze kann es sich um eine beliebige Pflanze handeln; bevorzugt sind jedoch die im vorherigen Absatz beschriebenen Pflanzen.
  • Kontrollpflanze(n)
  • Die Auswahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein routinemäßiger Teil eines experimentellen Ansatzes und kann entsprechende Wildtyp-Pflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das Gen von Interesse einschließen. Die Kontrollpflanze stammt typischerweise aus der gleichen Pflanzenart oder sogar aus der gleichen Varietät wie die zu untersuchende Pflanze. Die Kontrollpflanze kann auch eine Nullizygote der zu untersuchenden Pflanze sein. Nullizygoten, die auch als Nullkontrollpflanzen bezeichnet werden, sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Weiterhin wurde eine Kontrollpflanze unter den gleichen Wachstumsbedingungen wie den Wachstumsbedingungen der erfindungsgemäßen Pflanzen herangezogen.
  • Typischerweise wird die Kontrollpflanze unter den gleichen Wachstumsbedingungen und somit in der Nachbarschaft der erfindungsgemäßen Pflanzen und zur gleichen Zeit herangezogen. Eine ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, einschließlich Samen und Samenteile.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • CLE-Typ-2-Polypeptid
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen erhält, die gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert und gegebenenfalls auf Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen selektioniert.
  • Bei einem bevorzugten Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure bringt man eine für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierende Nukleinsäure in eine Pflanze ein und exprimiert sie dort.
  • Im Folgenden soll jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes CLE-Typ-2-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches CLE-Typ-2-Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als” CLE-Typ-2-Nukleinsäure” oder ”CLE-Typ-2-Gen” bezeichnet wird.
  • Ein wie hier definiertes ”CLE-Typ-2-Polypeptid” bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, das mindestens eine CLE-Domäne aus Gruppe 2 (wie von Oelkers, K. et al. (2008) – Bioinformatic analysis of the CLE signaling peptide family. BMC Plant Biology 2008, 8:1. (doi:10.1186/1471-2229-8-1) definiert) mit einer konservierten Strecke von 12 durch Motiv 1 wiedergegebenen Aminosäuren nahe dem oder am C-Terminus umfasst. Typischerweise handelt es sich bei CLE-Typ-2-Polypeptiden um pflanzenspezifische Peptide, die an der Signalübertragung beteiligt sind, klein mit einer Größe von weniger als 15 kDa sind und ein Sezernierungssignal im N-Terminus umfassen.
  • Vorzugsweise hat eine CLE-Polypeptiddomäne eines CLE-Typ-2-Polypeptids, mit zunehmender Präferenz, mindestens 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zu der Sequenz SEQ ID NR 2.
  • Zusätzlich und/oder alternativ dazu umfasst das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete CLE-Typ-2-Polypeptid ein Sequenzmotif mit, mit zunehmender Präferenz, 4 oder weniger Fehlpaarungen im Vergleich zur Sequenz von Motiv 1, 3 oder weniger Fehlpaarungen im Vergleich zur Sequenz von Motiv 1, 2 oder weniger Fehlpaarungen im Vergleich zur Sequenz von Motiv 1, 1 oder keine Fehlpaarung im Vergleich zur Sequenz von Motiv 1; und/oder hat mindestens, mit zunehmender Präferenz, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zum Motiv 1: RXSPGGP[ND]PXHH (SEQ ID NR: 23). Die hier in eckigen Klammern angegebenen Aminosäuren stehen für alternative Aminosäuren für eine bestimmte Position, X kann für eine beliebige Aminosäure stehen. Motiv 1 findet sich typischerweise in einem CLE-Typ-2-Polypeptid. Vorzugsweise handelt es sich bei Motiv 1 um R(R/UF/V)SPGGP(D/N)P(Q/R)HH (SEQ ID NR: 24). Besonders bevorzugt steht Motiv 1 kein Lysinrest voran.
  • Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete CLE-Typ-2-Polypeptid ein Sequenzmotif mit, mit zunehmender Präferenz, 4 oder weniger Fehlpaarungen im Vergleich zur Sequenz von Motiv 2, 3 oder weniger Fehlpaarungen im Vergleich zur Sequenz von Motiv 2, 2 oder weniger Fehlpaarungen im Vergleich zur Sequenz von Motiv 2, 1 oder keine Fehlpaarung im Vergleich zur Sequenz von Motiv 2; und/oder hat mindestens, mit zunehmender Präferenz, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder mehr Sequenzidentität zum Motiv 2: RLSPGGPDPQHH (SEQ ID NR: 25).
  • Es versteht sich, dass das Motiv 1, so, wie hier darauf verwiesen wird, eine Konsensussequenz der in CLE-Typ-2-Polypeptiden vorhandenen Motive, wie sie in Tabelle A wiedergegeben sind, darstellt. Es versteht sich jedoch auch, dass das wie hier definierte Motiv 1 nicht auf seine jeweilige Sequenz eingeschränkt ist, sondern dass es auch die entsprechenden in beliebigen CLE-Typ-2-Polypeptiden vorhandenen Motive einschließt. Die Motive wurden von der Sequenzanalyse abgeleitet, die in Oelkers et al. (2008) gezeigt ist.
  • Zusätzlich und/oder alternativ dazu hat das Homolog eines CLE-Typ-2-Proteins mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zur Aminosäure gemäß SEQ ID NR: 2, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein eines oder mehrere der wie oben umrissenen konservierten Motive umfasst. Die Gesamtsequenzidentität kann unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt werden. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden. Vorzugsweise haben die Motive in einem CLE-Typ-2-Polypeptid mit zunehmender Präferenz mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu den durch SEQ ID NR: 23 und SEQ ID NR: 25 wiedergegebenen Motiven (Motive 1 und 2).
  • Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert.
  • Weiterhin verfügen CLE-Typ-2-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise über eine signalvermittelnde Aktivtät. Werkzeuge und Verfahren zum Messen der signalvermittelnden Aktivität sind im Stand der Technik gut bekannt, siehe zum Beispiel Whitford et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(47): 18625–30, 2008. Weitere Details finden sich in Beispiel 4.
  • Darüber hinaus liefern CLE-Typ-2-Polypeptide, wenn sie gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung wie in den Beispielen 7 und 8 umrissen in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhter Wurzel- und Sprossbiomasse, Anzahl an Blüten und Anzahl an Rispen.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 1, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten CLE-Typ-2-Polypeptid durchführen.
  • Beispiele für für CLE-Typ-2-Polypeptide codierende Nukleinsäuren sind hier in Tabelle A des Beispielteils angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des CLE-Typ-2-Polypeptids gemäß SEQ ID NR: 2, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche, wie sie im Definitionsabschnitt beschrieben ist, identifiziert werden; handelt es sich bei der Abfragesequenz um SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2, erfolgt der zweite BLAST (back-BLAST) daher gegen Arabidopsis-Sequenzen.
  • Auch Nukleinsäurevarianten können bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Zu Beispielen solcher Varianten zählen Nukleinsäuren, welche für Homologe und Derivate von einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Außerdem sind Nukleinsäuren in den Verfahren der Erfindung nützlich, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, besitzen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind. Weitere für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeignete Varianten sind Varianten, bei denen der Codon-Einsatz optimiert ist oder bei denen miRNA-Targetstellen entfernt sind.
  • Ferner zählen zu den bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlichen Nukleinsäurevarianten Abschnitte von Nukleinsäuren, die für CLE-Typ-2-Polypeptide codieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die für CLE-Typ-2-Polypeptide codieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die für CLE-Typ-2-Polypeptide codieren, Allelvarianten von Nukleinsäuren, die für CLE-Typ-2-Polypeptide codieren, sowie Varianten von Nukleinsäuren, die für CLE-Typ-2-Polypeptide codieren, welche durch Gen-Shuffling erhalten werden. Die Begriffe Hybridisierungssequenz, Spleißvariante, Allelvariante und Gen-Shuffling sind wie hierin beschrieben beschaffen.
  • Nukleinsäuren, die für CLE-Typ-2-Polypeptide codieren, müssen nicht Volllängennukleinsäuren sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf der Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit voller Länge beruht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einem Abschnitt von einer für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codierenden Nukleinsäure.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäure hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere codierende (oder nicht-codierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere codierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
  • Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, codieren für ein wie hier definiertes CLE-Typ-2-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 400, 450, 500 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1.
  • Eine andere für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäurevariante ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen verringerter Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein wie hier definiertes CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, oder mit einem wie hier definierten Abschnitt in der Lage ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angeführten Nukleinsäuren fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert, oder bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer der in Tabelle A des Beispielteils angeführten Nukleinsäuresequenzen codiert, fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert.
  • Hybridisierungssequenzen, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind und für ein wie hier definiertes CLE-Typ-2-Polypeptid codieren, haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren mit dem Komplement einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils aufgeführten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt einer beliebigen dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, in der Lage, oder die Hybridisierungssequenz ist zum Hybridisieren mit dem Komplement einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen codiert, fähig. Ganz besonders bevorzugt ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 1 oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist eine Spleißvariante, die für ein wie hier definiertes CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Spleiß-Variante von einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einer Spleißvariante von einer für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codierenden Nukleinsäure.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, wobei eine Allelvariante wie hier definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Allelvariante einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
  • Die von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Allelvarianten codierten Polypeptide haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das CLE-Typ-2-Polypeptid von SEQ ID NR: 2 und beliebige der in Tabelle A des Beispielteils gezeigten Aminosäuren. Allelvarianten kommen in der Natur vor, und zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung gehört auch die Verwendung dieser natürlichen Allele.
  • Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls zur Anwendung kommen, um Varianten von Nukleinsäuresequenzen zu erzeugen, welche für wie oben definierte CLE-Typ-2-Polypeptide codieren, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” wie hier definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, wobei die Nukleinsäurevariante durch Gen-Shuffling erhalten wird.
  • Weiterhin lassen sich Nukleinsäurevarianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten. Zum Erzielen einer ortsgerichteten Mutagenese sind mehrere Verfahren verfügbar, wobei die üblichsten PCR-basierte Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, Hrsg.).
  • Für CLE-Typ-2-Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden.
  • Vorzugsweise stammt die für das CLE-Typ-2-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen. Insbesondere erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, insbesondere einem erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
  • Ein Verweis auf gesteigerte Ertragsmerkmale soll hier eine Erhöhung der Jungpflanzenvitalität und/oder der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile im Erdboden einschließen kann. Insbesondere beziehen sich derartige erntefähige Teile auf die Biomasse, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche eine erhöhte Spross- und Wurzelbiomasse und/oder eine erhöhte Anzahl an Blüten und Ähren im Vergleich zum Biomassenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Biomassenertrags von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Da die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung einen erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen eine erhöhte Wachstumsrate (wenigstens während eines Teils ihres Lebenszyklus) im Vergleich zur Wachstumsrate von Kontrollpflanzen bei einem entsprechenden Stadium in ihrem Lebenszyklus aufzeigen.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen liefert herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform liefert die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Salzstressbedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Salzstressbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
  • Die Erfindung stellt außerdem genetische Konstrukte und Vektoren zum Erleichtern des Einbringens und/oder der Expression von für CLE-Typ-2-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren in Pflanzen bereit. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren in Pflanzen hinein geeignet sind und für die Expression des Gens von Interesse in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines wie hier definierten Genkonstrukts in den Verfahren der Erfindung vor.
  • Genauer sieht die vorliegende Erfindung ein Konstrukt vor, umfassend:
    • (a) eine Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes CLE-Typ-2-Polypeptid codiert;
    • (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierende Nukleinsäure ist vorzugsweise wie oben definiert. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der jedwede der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, welche auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig mit einer oder mehreren Steuerungssequenzen (mindestens mit einem Promotor) verbunden.
  • Vorteilhafterweise kann zur Steuerung der Expression der Nukleinsäuresequenz ein beliebiger Promotortyp verwendet werden, gleich ob natürlich oder synthetisch, vorzugsweise ist der Promotor jedoch pflanzlichen Ursprungs. Ein konstitutiver Promotor eignet sich besonders für die Verfahren. Vorzugsweise handelt es sich bei dem konstitutiven Promotor um einen ubiquitären konstitutiven Promotor mittlerer Stärke. Definitionen der verschiedenen Promotortypen finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die für CLE-Typ-2-Polypeptide codierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 1 beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors beschränkt.
  • Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen von Pflanzen abgeleiteten Promotor wie einen GOS2-Promotor oder einen Promotor mit im Wesentlichen der gleichen Stärke und im Wesentlichen dem gleichen Expressionsmuster (einem funktionell äquivalenten Promotor); besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um den GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 26 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 26 wiedergegeben. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gegebenenfalls können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere Terminatorsequenzen eingesetzt werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die einen GOS2-Promotor umfasst, im Wesentlichen ähnlich SEQ ID NR: 26, und die für das CLE-Typ-2-Polypeptid codierende Nukleinsäure. Weiterhin können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere für selektierbare Marker codierende Sequenzen vorhanden sein.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung ist die modulierte Expression eine erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
  • Wie oben erwähnt, wird ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, durchgeführt, indem man eine für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierende Nukleinsäure in eine Pflanze einbringt und dort exprimiert; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von Ertragsmerkmalen, auch unter Verwendung anderer gut bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologer Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
  • Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Einführung und Expression einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt genauer gesagt ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhter Biomasse, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einbringen und Exprimieren, einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codiert in einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen sein, die zum Codieren eines CLE-Typ-2-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” hierin beschrieben.
  • Gemäß einer Ausführungsform erstreckt sich die vorliegende Erfindung in deutlicher Weise auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime davon. Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das für ein wie oben definiertes CLE-Typ-2-Polypeptid codiert. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primären transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, welche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung darin besteht, dass die Nachkommen dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform in den Verfahren gemäß der Erfindung hervorgebracht werden.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf eine andere Ausführungsform, auf transgene Pflanzenzellen und Samen, die das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül in einer Pflanzenexpressionskassette oder einem Pflanzenexpressionskonstrukt enthalten.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Samen die erfindungsgemäßen Expressionskassetten, die erfindungsgemäßen (Expressions)konstrukte, die oben beschriebenen Nukleinsäuren und/oder die von den wie oben beschriebenen Nukleinsäuren codierten Proteine.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erstreckt sich auf Pflanzenzellen, die die wie oben beschriebene Nukleinsäure in einer rekombinanten Pflanzenexpressionskassette umfassen.
  • Gemäß noch einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen um nicht propagierende Zellen, z. B. Zellen, mit denen es nicht möglich ist, eine ganze Pflanze aus dieser Zelle als Ganzes unter Anwendung von standardgemäßen Zellkulturmethoden, worunter Zellkulturmethoden, jedoch unter Ausschluss von In-vitro-verfahren zum Übertragen von Kernen, Organellen oder Chromosomen, zu verstehen sind, zu regenerieren. Während Pflanzenzellen im Allgemeinen durch Totipotenz gekennzeichnet sind, lassen sich einige Pflanzenzellen nicht dazu verwenden, intakte Pflanzen aus diesen Zellen zu regenerieren bzw. zu propagieren. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen um solche Zellen.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen um Pflanzenzellen, die sich selbst nicht durch Photosynthese erhalten, imdem sie Kohlenhydrat und Protein aus anorganischen Substanzen wie Wasser, Kohlendioxid und Mineralsalz synthetisieren, d. h. sie können als Nicht-Pflanzen-Variante angesehen werden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen um Nicht-Pflanzen-Varianten, die sich nicht propagieren.
  • Die Erfindung schließt auch Wirtszellen ein, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, welche für ein CLE-Typ-2-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert. Erfindungsgemäße Wirtszellen können beliebige, aus einer aus Bakterienzellen wie E. coli-Zellen oder Zellen der Art Agrobacterium, Hefezellen, Pilzzellen, Algenzellen, Cyanobakterienzellen oder Pflanzenzellen bestehenden Gruppe ausgewählte Zellen sein. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Wirtszellen um Pflanzenzellen, Hefe, Bakterien oder Pilze. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder der Vektor sind im Prinzip in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
  • Gemäß einer Ausführungsform überexprimieren die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül.
  • Die Erfindung schließt außerdem Verfahren zur Herstellung eines Produktes ein, bei denen man a) die erfindungsgemäßen Pflanzen kultiviert und b) das Produkt aus bzw. von den erfindungsgemäßen Pflanzen oder Teilen einschließlich der Samen dieser Pflanzen herstellt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfassen die Verfahren die Schritte a) Kultivieren der erfindungsgemäßen Pflanzen, b) Entfernen der wie oben definierten erntefähigen Teile von den Pflanzen und c) Herstellen des Produkts aus bzw. von den erfindungsgemäßen erntefähigen Teilen.
  • Beispiele für solche Verfahren wären das Kultivieren von erfindungsgemäßen Maispflanzen, das Ernten der Maiskolben und das Entnehmen der Körner. Diese können als Futtermittel verwendet werden oder zu Stärke und Öl als landwirtschaftliche Produkte verarbeitet werden.
  • Das Produkt kann an der Stelle hergestellt werden, an der die Pflanze kultiviert wurde, oder die Pflanzen oder Teile davon können von der Stelle, an der die Pflanzen kultiviert wurden, entfernt werden, um das Produkt herzustellen. Typischerweise wird die Pflanze kultiviert, die gewünschten erntefähigen Teile werden aus der Pflanze entnommen, falls möglich wiederholt, und die Produkte werden aus den erntefähigen Teilen der Pflanze hergestellt. Der Schritt des Kultivierens der Pflanze kann bei jeder Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nur einmal durchgeführt werden, was ein Wiederholen der Schritte der Produktherstellung, z. B. durch wiederholtes Entnehmen von erntefähigen Teilen der erfindungsgemäßen Pflanzen und, falls erforderlich, weiteres Verarbeiten dieser Teile zum Erhalt des Produkts ermöglicht. Es ist auch möglich, den Schritt des Kultivierens der erfindungsgemäßen Pflanzen zu wiederholen und Pflanzen oder erntefähige Teile zu lagern, bis dann die Herstellung des Produkts für alle angesammelten Pflanzen oder Pflanzenteile durchgeführt wird. Die Schritte der Kultivierung der Pflanzen und der Herstellung des Produkts können außerdem zeitlich überlappend erfolgen, sogar zu einem großen Teil gleichzeitig, oder aufeinanderfolgend. Im Allgemeinen werden die Pflanzen einige Zeit vor der Herstellung des Produktes kultiviert.
  • Vorteilhafterweise sind die erfindungsgemäßen Verfahren effizienter als die bekannten Verfahren, da die erfindungsgemäßen Pflanzen einen erhöhten Ertrag und/oder eine erhöhte Stresstoleranz gegenüber Umweltstress im Vergleich zu einer in vergleichbaren Verfahren verwendeten Kontrollpflanze haben.
  • Gemäß einer Ausführungsform sind die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Produkte Pflanzenprodukte wie zum Beispiel, jedoch nicht darauf beschränkt, Nahrungsmittel, Futtermittel, Nahrungsergänzungsmittel, Futterergänzungsmittel, Fasern, Kosmetika oder Pharmazeutika. Nahrungsmittel werden als für die Ernährung oder zum Ergänzen der Ernährung verwendete Zusammensetzungen angesehen. Tierfuttermittel und Tierfutterergänzungsmittel werden insbesondere als Nahrungsmittel angesehen.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren zur Herstellung von landwirtschaftlichen Produkten wie zum Beispiel, jedoch nicht darauf beschränkt, Pflanzenextrakten, Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten, Fetten, Ölen, Polymeren, Vitaminen und dergleichen eingesetzt. Es ist möglich, dass ein Pflanzenprodukt zu einem großen Teil aus einem oder mehreren landwirtschaftlichen Produkten besteht.
  • Gemäß noch einer anderen Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Polynukleotidsequenzen oder die erfindungsgemäßen Polypeptidsequenzen in einem landwirtschaftlichen Produkt enthalten.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und Proteinsequenzen als Produktmarker eingesetzt, zum Beispiel in einem landwirtschaftlichen Produkt nach den erfindungsgemäßen Verfahren. Mit einem solchen Marker lassen sich Produkte identifizieren, die durch ein vorteilhaftes Verfahren hergestellt wurden, was nicht nur zu einer größeren Effizienz des Verfahrens führt, sondern auch zu einer verbesserten Qualität des Produkts aufgrund einer erhöhten Qualität des Pflanzenmaterials und der erntefähigen Teile, das/die in dem Verfahren verwendet wird/werden. Solche Marker lassen sich durch verschiedene im Stand der Technik bekannte Methoden nachweisen, zum Beispiel, jedoch nicht darauf beschränkt, auf PCR basierende Methoden zum Nachweis von Nukleinsäure oder auf Antikörpern basierende Methoden zum Nachweis von Proteinen.
  • Die Verfahren der Erfindung sind in vorteilhafter Weise auf eine beliebige Pflanze anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Nutzpflanze. Zu Beispielen von Nutzpflanzen zählen Sojabohne, Rübe, Zuckerrübe, Sonnenblume, Canola, Luzerne, Raps, Endivie, Karotte, Maniok, Klee, Leinsamen, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt ist die Pflanze eine monokotyle Pflanze. Zu Beispielen von monokotylen Pflanzen zählt Zuckerrohr. Weiter bevorzugt ist die Pflanze ein Getreide. Beispiele für Getreide schließen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ein.
  • Gemäß einer Ausführungsform sind die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Pflanzen aus der aus Mais, Weizen, Reis, Sojabohne, Baumwolle, Raps einschließlich Canola, Zuckerrohr, Zuckerrübe und Luzerne bestehenden Gruppe ausgewählt.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen Pflanzen und die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Pflanzen Zuckerrübenpflanzen mit erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Zuckergehalt der Rüben.
  • Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, wobei diese erntefähigen Teile eine rekombinante Nukleinsäure enthalten, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codiert. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet sind bzw. daraus produziert werden, vorzugsweise direkt abgeleitet sind bzw. daraus produziert werden, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die für CLE-Typ-2-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser CLE-Typ-2-Polypeptide bei der Steigerung beliebiger der oben erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen. Zum Beispiel können die hierin beschriebenen Nukleinsäuren, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codieren, oder die CLE-Typ-2-Polypeptide selbst Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die CLE-Typ-2-Polypeptide selbst können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren. Weiterhin können Allelvarianten einer für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure/eines für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Gens in markergestützten Zuchtprogrammen Anwendung finden. Nukleinsäuren, die für CLE-Typ-2-Polypeptide codieren, können auch als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, sowie als Marker für mit diesen Genen gekoppelte Merkmale verwendet werden. Derartige Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln.
  • Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein wie hier bereitgestelltes Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid oder ein wie hier bereitgestelltes Homolog davon codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleihen kann.
  • Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein wie hier bereitgestelltes Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid oder ein wie hier bereitgestelltes Homolog davon codierenden Nukleinsäure moduliert und gegebenenfalls auf Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen selektiert. Vorzugsweise wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid oder ein Homolog davon codiert, in einer Pflanze, wobei das BI-1-Polypeptid bzw. das Homolog davon eine mit einem Bax-Inhibitor in Zusammenhang stehende Domäne umfasst, bereitgestellt.
  • Ein bevorzugtes Verfahren für das Modulieren der Expression und vorzugsweise das Erhöhen der Expression einer für ein wie hier bereitgestelltes Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid oder ein Homolog davon codierenden Nukleinsäure ist die Einbringung und Expression einer für dieses Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid oder dieses Homolog codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen und vorzugsweise einen erhöhten Samenertrag und/oder eine erhöhte Biomasse im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Bedingungen osmotischen Stresses wie zum Beispiel Dürrestress, Kältestress und/oder Salzstress oder unter Bedingungen von Stickstoffmangel erhalten werden.
  • Im Folgenden soll jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid oder ein wie hier definiertes Homolog davon gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für solch ein Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid oder ein Homolog davon zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als ”Bax-Inhibitor-1-Nukleinsäure” oder ”BI-1-Nukleinsäure” oder ”Bax-Inhibitor-1-Gen” oder ”BI-1-Gen” bezeichnet wird.
  • Ein wie hier definiertes ”Bax-Inhibitor-1-Polypeptid” oder ”BI-1-Polypeptid” bezieht sich auf ein evolutionär konserviertes Protein, welches mehrere membranüberspannende Segmente enthält und sich vorwiegend an intrazellulären Membranen lokalisiert befindet. Ganz insbesondere handelt es sich bei Bax-Inhibitor-1-Proteinen (BI-1) um membranüberspannende Proteine mit 6 bis 7 transmembranen Domänen und einem zytoplasmatischen C-terminalen Ende im endoplasmatischen Retikulum (ER) und nukleärer Hülle. Sie wurden bereits als Regulatoren von Zelltodpfaden beschrieben. Die wie hier verwendeten Begriffe ”Bax-Inhibitor-1-Polypeptid” oder ”BI-1-Polypeptid” sollen auch wie hier unter ”Bax-Inhibitor-1-Polypeptide” definierte Homologe einschließen.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein wie hier eingesetztes Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid eine mit einem Bax-Inhibitor in Zusammenhang stehende Domäne. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform entspricht eine mit einem Bax-Inhibitor in Zusammenhang stehende Domäne Pfam PF01027.
  • Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind wie im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das BI-1-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive:
    • i) Motiv 3a: [DN]TQxxxE[KR][AC]xxGxxDY[VIL]xx[STA] (SEQ ID NR: 131). Vorzugsweise handelt es sich bei dem Motiv um DTQ[ED]IIE[KR]AH[LH]GD[LRM]DY[VI]KH[SA] (Motiv 3b; SEQ ID NR: 132).
    • ii) Motiv 4a: xxxxxISPx[VS]xx[HYR][LI][QRK]x[VFN][YN]xx[LT] (SEQ ID NR: 133). Vorzugsweise handelt es sich bei dem Motiv um KNFRQISP[AV]VQ[TNS]HLK[LRQ]VYL[TS]L (Motiv 4b; SEQ ID NR: 134);
    • iii) Motiv 5a: FxxFxxAxxxxxRRxx[LMF][YF][LH]x (SEQ ID NR: 135). Vorzugsweise handelt es sich bei dem Motiv um F[GA]CFS[AG]AA[ML][LV]A[RK]RREYLYLG (Motiv 5b; SEQ ID NR: 136).
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das BI-1-Polypeptid auch eines oder mehrere der folgenden Motive:
    • i) Motiv 6a: DTQxI[VI]E[KR]AHxGDxDYVKHx (SEQ ID NR: 137). Vorzugsweise handelt es sich bei dem Motiv um: DTQ[ED]IIE[KR]AH[LF]GD[LR]DYVKHA (Motiv 6b; SEQ ID NR: 138);
    • ii) Motiv 7a: x[QE]ISPxVQxHLK[QK]VY[FL]xLC[FC] (SEQ ID NR: 139). Vorzugsweise handelt es sich bei dem Motiv um: [RH]QISP[VL]VQ[TN]HLKQVYL[TS]LCC (Motiv 7b; SEQ ID NR: 140);
    • iii) Motiv 8a: F[AG]CF[SP][AG]AA[ML][VL][AG]RRREYLYL[AG]G (SEQ ID NR: 141). Vorzugsweise handelt es sich bei dem Motiv um: F[GA]CFS[AG]AA[ML][VL]ARRREYLYLGG (Motiv 8b; SEQ ID NR: 142); iv) Motiv 9: [IF]E[VL]Y[FL]GLL[VL]F[VM]GY[VIM][IV][VYF] (SEQ ID NR: 143);
    • v) Motiv 10: [MFL][LV]SSG[VLI]SxLxW[LV][HQ][FL]ASxIFGG (SEQ ID NR: 144);
    • vi) Motiv 11: H[ILV][LIM][FLW][NH][VI]GG[FTL]LT[AVT]x[GA]xx[GA]xxxW[LM][LM] (SEQ ID NR: 145);
    • vii) Motiv 12: Rx[AST][LI]L[ML][GAV]xx[LVF][FL][EKQ]GA[STY]IGPL[IV] (SEQ ID NR: 146);
  • Diese zusätzlichen Motive 6 bis 12 liegen im Wesentlichen in BI-1-Polypeptiden der hier beschriebenen RA/BI-1-Gruppe von Polypeptiden vor.
  • Gemäß noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das BI-1-Polypeptid auch eines oder mehrere der folgenden Motive:
    • i) Motiv 13a: DTQx[IVM][IV]E[KR][AC]xxGxxDxx[KRQ]Hx (SEQ ID NR: 147). Vorzugsweise handelt es sich bei dem Motiv um: DTQEIIE[RK]AH[HL]GDMDY[IV]KH[AS] (Motiv 13b; SEQ ID NR: 148);
    • ii) Motiv 14: E[LVT]Y[GLF]GLx[VLI][VF]xGY[MVI][LVI]x (SEQ ID NR: 149);
    • iii) Motiv 15: KN[FL]RQISPAVQ[SN]HLK[RL]VYLT (SEQ ID NR: 150);
    • iv) Motiv 16a: Fx[CS]F[ST]xA[AS]xx[AS]xRR[ESH][YFW]x[FY][LH][GS][GA]xL (SEQ ID NR: 151). Vorzugsweise handelt es sich bei dem Motiv um: F[AGV]CF[ST][GCA]AA[ILM][LVI]A [KR]RREYL[YF]LG (Motiv 16b; SEQ ID NR: 152)
  • Diese zusätzlichen Motive 11 bis 14 liegen im Wesentlichen in BI-1-Polypeptiden der hier beschriebenen EC/BI-1-Gruppe von Polypeptiden vor.
  • Die oben aufgeführten Motive 3b, 4b, 5b, 6a, 7b, 8b, 13b, 15 und 16b wurden unter Anwendung des MEME-Algorithmus (Bailey und Elkan, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, S. 28–36, AAAI Press, Menlo Park, Kalifornien, 1994) abgeleitet. Bei den einzelnen Positionen innerhalb eines MEME-Motivs sind die Reste gezeigt, die in einem abgefragten Satz von Sequenzen mit einer Häufigkeit von mehr als 0,2 vorhanden sind. Die anderen oben angeführten Motive wurden im Wesentlichen auf der Basis eines Sequenz-Alignments abgeleitet. Reste in eckigen Klammern stellen Alternativen dar.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein wie hier angewendetes BI-1-Polypeptid mit zunehmender Präferenz mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9 oder alle 10 Motive ausgewählt aus der die Motive 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9, 10, 11 und 12, wie oben angegeben, umfassenden Gruppe. Alternativ dazu oder zusätzlich umfasst gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ein wie hier angewendetes BI-1-Polypeptid mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5 oder alle 6 Motive ausgewählt aus der die Motive 3b, 4b, 5b, 6b, 7b und 8b, wie oben angegeben, umfassenden Gruppe.
  • Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein wie hier angewendetes BI-1-Polypeptid mit zunehmender Präferenz mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6 oder alle 7 Motive ausgewählt aus der die Motive 3a, 4a, 5a, 13a, 14, 15 und 16a, wie oben angegeben, umfassenden Gruppe. Alternativ dazu oder zusätzlich umfasst gemäß einer anderen Ausführungsform ein wie hier angewendetes BI-1-Polypeptid mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4 oder alle 5 Motive ausgewählt aus der die Motive 3b, 4b, 5b, 13b und 16b, wie oben angegeben, umfassenden Gruppe.
  • Zusätzlich oder alternativ dazu hat das Homolog eines BI-1-Proteins mit zunehmender Präferenz mindestens 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zur Aminosäure gemäß SEQ ID NR: 30, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein eines oder mehrere der wie oben umrissenen konservierten Motive 3 bis 5 umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden. Vorzugsweise haben die Motive in einem BL-1-Polypeptid mit zunehmender Präferenz mindestens 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einem beliebigen oder mehreren der durch SEQ ID NR: 131 bis SEQ ID NR: 136 dargestellten Motive (Motive 3a, 3b, 4a, 4b, 5a und 5b).
  • Mittels phylogenetischen Analysen lässt sich ein phyllogenetischer Baum erstellen, der zwei Gruppen von mit BI-1 in Zusammenhang stehenden Proteinen zeigt (8):
    • – die erste Gruppe umfasst BI-1 aus Samenpflanzen einschließlich Monokotylen und Dikotylen und Nichtsamenpflanzen einschließlich Farnen und Moosen. Mitglieder dieser Gruppe scheinen evolutionär konserviert zu sein und stammen wahrscheinlich von einem gemeinsamen Vorfahren ab. Diese Gruppe wird hier auch als EC/BI-1-Gruppe oder Gruppe der evolutionär konservierten BI-1-Polypeptide bezeichnet. Eine separate phyllogenetische Analyse zeigte, dass sie sich mit Hefe und Bakterien einen gemeinsamen Vorfahren teilen, was einen gemeinsamen Ursprung nahelegt.
    • – die zweite Gruppe umfasst BI-1-Proteine, die spezifischer für zwei große Gruppen von Eudikotylen sind: Asteridae und Rosidae. Diese Gruppe wird hier auch als RA/BI-1-Gruppe oder Gruppe der mit Rosiden und Asteriden (RA) verwandten BI-1-Polypeptide bezeichnet. Interessanterweise haben einige der Spezies in dieser Gruppe während der Evolution eine Genomverdoppelung durchgemacht, z. B. Glycine max und Populus trichocarpa, was am Ursprung einer spezifischen Gruppe von mit BI-1 verwandten Proteinen stehen könnte.
  • Gemäß einer Ausführungsform bildet die Polypeptidsequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 8 abgebildet ist, verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe der Rosid-und-Asterid(RA)/BI-1-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 30 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform bildet die Polypeptidsequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 8 abgebildet ist, verwendet wird, lieber Cluster mit der Gruppe der Gruppe der evolutionär konservierten (EC)/BI-1-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 37 wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein BI-1-Polypeptid entsprechend SEQ ID NR: 34 und 35 codierenden Nukleinsäure moduliert.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein BI-1-Polypeptid entsprechend SEQ ID NR: 32 codierenden Nukleinsäure moduliert.
  • Weiterhin wurden BI-1-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) als Regulatoren des programmierten Zelltods beschrieben, sie wurden insbesondere als Modulatoren des ER-Stress-vermittelten programmierten Zelltods beschrieben, und noch mehr bevorzugt sind sie dazu in der Lage, den durch Bax induzierten Zelltod in Hefe oder in Zellkultur zu unterdrücken, z. B. wie von Chae et al. (2009, Gene 323, 101–13) beschrieben. BI-1-Polypeptide zeigen außerdem eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber einer Behandlung mit Tunicamycin (Watanabe und Lam, 2007, J. Biol. Chem. 283(6): 3200–10). Es wurde weiterhin gezeigt, dass BI-1-Polypeptide mit AtCb5 in Wechselwirkung treten (Nagano et al. 2009). Werkzeuge und Methoden zum Messen der Aktivität von Regulatoren des programmierten Zelltods wie BI-1-Proteine sind im Stand der Technik gut bekannt. Ein Beispiel dafür wird in Beispiel 14 bereitgestellt.
  • Darüber hinaus liefern BI-1-Polypeptide, wenn sie gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung wie in den Beispielen 15, 16, 17 und 19 umrissen in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, insbesondere einem erhöhten Samenertrag und/oder einer erhöhten Biomasse. BI-1-Polypeptide liefern, wenn sie wie in Beispiel 20 umrissen gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung in Arabidopsis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, insbesondere einer erhöhten Biomasse.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 29, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 30 codiert, veranschaulicht. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 31, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 32 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für BI-1 codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten BI-1-Polypeptid durchführen.
  • Andere Beispiele für für BI-1-Polypeptide codierende Nukleinsäuren sind hier in Tabelle C des Beispielteils angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle C des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des BI-1-Polypeptids gemäß SEQ ID NR: 30, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche, wie sie im Definitionsabschnitt beschrieben ist, identifiziert werden; handelt es sich bei der Abfragesequenz um SEQ ID NR: 29 oder SEQ ID NR: 30, erfolgt der zweite BLAST (back-BLAST) daher gegen Pappelsequenzen.
  • Die Erfindung stellt außerdem bislang unbekannte, für das BI-1-Polypeptid codierende Nukleinsäuren und BI-1-Polypeptide, die sich dazu eignen, Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen gesteigerte Ertragsmerkmale zu verleihen, bereit.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül aus der folgenden Reihe bereitgestellt:
    • i) eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 43;
    • ii) das Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 43;
    • iii) eine Nukleinsäure, die für ein BI-1-Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 44 codiert, und die zusätzlich oder alternativ dazu ein oder mehrere Motive mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu einem beliebigen oder mehreren der Motive in SEQ ID NR: 131 bis SEQ ID NR: 136 (Motive 3a, 3b, 4a, 4b, 5a und 5b) umfasst und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt;
    • iv) ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iii) unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein isoliertes Polypeptid aus der folgenden Reihe bereitgestellt:
    • i) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 44;
    • ii) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 44, die zusätzlich oder alternativ dazu ein oder mehrere Motive mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu einem beliebigen oder mehreren der Motive in SEQ ID NR: 131 bis SEQ ID NR: 136 (Motive 3a, 3b, 4a, 4b, 5a und 5b) umfasst und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt;
    • iii) Derivate von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (i) oder (ii) oben.
  • Gemäß noch einer anderen weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül aus der folgenden Reihe bereitgestellt:
    • i) eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 89;
    • ii) das Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 89;
    • iii) eine Nukleinsäure, die für ein BI-1-Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 90 codiert, und die zusätzlich oder alternativ dazu ein oder mehrere Motive mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu einem beliebigen oder mehreren der Motive in SEQ ID NR: 131 bis SEQ ID NR: 136 (Motive 3a, 3b, 4a, 4b, 5a und 5b) umfasst und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt;
    • iv) ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iii) unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht.
  • Gemäß noch einer anderen weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein isoliertes Polypeptid aus der folgenden Reihe bereitgestellt:
    • i) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 90;
    • ii) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 90 codiert, und die zusätzlich oder alternativ dazu ein oder mehrere Motive mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu einem beliebigen oder mehreren der Motive in SEQ ID NR: 131 bis SEQ ID NR: 136 (Motive 3a, 3b, 4a, 4b, 5a und 5b) umfasst und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt;
    • iii) Derivate von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (i) oder (ii) oben.
  • Auch Nukleinsäurevarianten können bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Zu Beispielen solcher Varianten zählen Nukleinsäuren, welche für Homologe und Derivate von einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Außerdem sind Nukleinsäuren in den Verfahren der Erfindung nützlich, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, besitzen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind. Weitere für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeignete Varianten sind Varianten, bei denen der Codon-Einsatz optimiert ist oder bei denen miRNA-Targetstellen entfernt sind.
  • Ferner zählen zu den bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlichen Nukleinsäurevarianten Abschnitte von Nukleinsäuren, die für BI-1-Polypeptide codieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die für BI-1-Polypeptide codieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die für BI-1-Polypeptide codieren, Allelvarianten von Nukleinsäuren, die für BI-1-Polypeptide codieren, sowie Varianten von Nukleinsäuren, die für BI-1-Polypeptide codieren, welche durch Gen-Shuffling erhalten werden. Die Begriffe Hybridisierungssequenz, Spleißvariante, Allelvariante und Gen-Shuffling sind wie hierin beschrieben beschaffen.
  • Nukleinsäuren, die für BI-1-Polypeptide codieren, müssen nicht Volllängennukleinsäuren sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf der Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit voller Länge beruht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einem Abschnitt von einer für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codierenden Nukleinsäure.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäure hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere codierende (oder nicht-codierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere codierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
  • Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, codieren für ein wie hier definiertes BI-1-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle C des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 650, 700, 750, 800, 850, 900 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 29. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 8 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der RA/BI-1-Gruppe von Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 30 umfassen, bildet, als mit einer beliebigen anderen Gruppe und/oder mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9 oder alle 10 Motive ausgewählt aus der die Motive 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9, 10, 11 und 12 umfassenden Gruppe, wie oben angeführt, umfasst und/oder mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5 oder alle 6 Motive ausgewählt aus der die Motive 3b, 4b, 5b, 6b, 7b und 8b umfassenden Gruppe, wie oben angeführt, umfasst.
  • Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 31. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 8 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der EC/BI-1-Gruppe von Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 32 umfassen, bildet, als mit einer beliebigen anderen Gruppe und/oder mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6 oder alle 7 Motive ausgewählt aus der die Motive 3a, 4a, 5a, 13a, 14, 15 und 16a umfassenden Gruppe, wie oben angeführt, umfasst und/oder mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4 oder alle 5 Motive ausgewählt aus der die Motive 3b, 4b, 5b, 13b und 16b umfassenden Gruppe, wie oben angeführt, umfasst.
  • Eine andere für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäurevariante ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen verringerter Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein wie hier definiertes BI-1-Polypeptid codiert, oder mit einem wie hier definierten Abschnitt in der Lage ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in einer Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angeführten Nukleinsäuren fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert, oder bei dem man in einer Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angeführten Nukleinsäuresequenzen codiert, fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert.
  • Hybridisierungssequenzen, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind und für ein wie hier definiertes BI-1-Polypeptid codieren, haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle C des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren mit dem Komplement einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils aufgeführten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt einer beliebigen dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, in der Lage, oder die Hybridisierungssequenz ist zum Hybridisieren mit dem Komplement einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen codiert, fähig. Ganz besonders bevorzugt ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 29 oder an einen Abschnitt davon in der Lage. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 31 oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
  • Vorzugsweise codiert die Hybridisierungssequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie vollständig ist und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 8 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der RA/BI-1-Gruppe von Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 30 umfassen, bildet, als mit einer beliebigen anderen Gruppe und/oder mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9 oder alle 10 Motive ausgewählt aus der die Motive 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9, 10, 11 und 12 umfassenden Gruppe, wie oben angeführt, umfasst und/oder mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5 oder alle 6 Motive ausgewählt aus der die Motive 3b, 4b, 5b, 6b, 7b und 8b umfassenden Gruppe, wie oben angeführt, umfasst.
  • Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform codiert die Hybridisierungssequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie vollständig ist und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 8 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der EC/BI-1-Gruppe von Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 32 umfassen, bildet, als mit einer beliebigen anderen Gruppe und/oder mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6 oder alle 7 Motive ausgewählt aus der die Motive 3a, 4a, 5a, 13a, 14, 15 und 16a umfassenden Gruppe, wie oben angeführt, umfasst und/oder mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4 oder alle 5 Motive ausgewählt aus der die Motive 3b, 4b, 5b, 13b und 16b umfassenden Gruppe, wie oben angeführt, umfasst.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist eine Spleißvariante, die für ein wie hier definiertes BI-1-Polypeptid codiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Spleiß-Variante von einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einer Spleißvariante einer für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codierenden Nukleinsäure.
  • Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei bevorzugten Spleißvarianten um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 29 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 30 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die Spleißvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 8 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der RA/BI-1-Gruppe von Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 30 umfassen, als mit einer beliebigen anderen Gruppe und/oder umfasst mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9 oder alle 10 Motive ausgewählt aus der die Motive 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9, 10, 11 und 12 umfassenden Gruppe, wie oben angeführt, und/oder umfasst mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5 oder alle 6 Motive ausgewählt aus der die Motive 3b, 4b, 5b, 6b, 7b und 8b umfassenden Gruppe, wie oben angeführt.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei bevorzugten Spleißvarianten um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 31 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 32 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die Spleißvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 8 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der EC/BI-1-Gruppe von Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 32 umfassen, als mit einer beliebigen anderen Gruppe und/oder umfasst mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6 oder alle 7 Motive ausgewählt aus der die Motive 3a, 4a, 5a, 13a, 14, 15 und 16a umfassenden Gruppe, wie oben angeführt, und/oder umfasst mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4 oder alle 5 Motive ausgewählt aus der die Motive 3b, 4b, 5b, 13b und 16b umfassenden Gruppe, wie oben angeführt.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes BI-1-Polypeptid codiert, wobei eine Allelvariante wie hier definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Erhöhen von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze einer Allelvariante einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze einer Allelvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
  • Die von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Allelvarianten codierten Polypeptide weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das BI-1-Polypeptid von SEQ ID NR: 30 und beliebige der in Tabelle C des Beispielteils gezeigten Aminosäuren auf. Allelvarianten kommen in der Natur vor, und zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung gehört auch die Verwendung dieser natürlichen Allele. Vorzugsweise ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 29 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 30 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die Allelvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 8 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der RA/BI-1-Gruppe von Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 30 umfassen, als mit einer beliebigen anderen Gruppe und/oder umfasst mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9 oder alle 10 Motive ausgewählt aus der die Motive 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9, 10, 11 und 12 umfassenden Gruppe, wie oben angeführt, und/oder umfasst mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5 oder alle 6 Motive ausgewählt aus der die Motive 3b, 4b, 5b, 6b, 7b und 8b umfassenden Gruppe, wie oben angeführt.
  • Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 31 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 32 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die Allelvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 8 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der EC/BI-1-Gruppe von Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 32 umfassen, als mit einer beliebigen anderen Gruppe und/oder umfasst mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6 oder alle 7 Motive ausgewählt aus der die Motive 3a, 4a, 5a, 13a, 14, 15 und 16a umfassenden Gruppe, wie oben angeführt, und/oder umfasst mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4 oder alle 5 Motive ausgewählt aus der die Motive 3b, 4b, 5b, 13b und 16b umfassenden Gruppe, wie oben angeführt.
  • Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls zur Anwendung kommen, um Varianten von Nukleinsäuresequenzen zu erzeugen, welche für wie oben definierte BI-1-Polypeptide codieren, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” wie hier definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle C des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, wobei die Nukleinsäurevariante durch Gen-Shuffling erhalten wird.
  • Vorzugsweise bildet die von der durch Gen-Shuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 8 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der RA/BI-1-Gruppe von Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 30 umfassen, als mit einer beliebigen anderen Gruppe und/oder umfasst mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, mindestens 8, mindestens 9 oder alle 10 Motive, ausgewählt aus der die Motive 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9, 10, 11 und 12 umfassenden Gruppe, wie oben angeführt, und/oder umfasst mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5 oder alle 6 Motive ausgewählt aus der die Motive 3b, 4b, 5b, 6b, 7b und 8b umfassenden Gruppe, wie oben angeführt.
  • Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform bildet die von der durch Gen-Shuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 8 gezeigten verwendet wird, lieber Cluster mit der EC/BI-1-Gruppe von Polypeptiden, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 32 umfassen, als mit einer beliebigen anderen Gruppe und/oder umfasst mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6 oder alle 7 Motive ausgewählt aus der die Motive 3a, 4a, 5a, 13a, 14, 15 und 16a umfassenden Gruppe, wie oben angeführt, und/oder umfasst mindestens 2, mindestens 3, mindestens 4 oder alle 5 Motive ausgewählt aus der die Motive 3b, 4b, 5b, 13b und 16b umfassenden Gruppe, wie oben angeführt.
  • Weiterhin lassen sich Nukleinsäurevarianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten. Zum Erzielen einer ortsgerichteten Mutagenese sind mehrere Verfahren verfügbar, wobei die üblichsten PCR-basierte Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, Hrsg.).
  • Für BI-1-Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Gemäß einer Ausführungsform stammt die für ein BI-1-Polypeptid oder ein Homolog davon codierende Nukleinsäure vorzugsweise aus einer Pflanze.
  • Gemäß einer Ausführungsform stammt die für ein Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid oder ein Homolog davon codierende Nukleinsäure aus einer dikotylen Pflanze. Bei einem Beispiel stammt die für ein Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid oder ein Homolog davon codierende Nukleinsäure aus der Brassicaceae-Familie, besonders bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana. Bei einem anderen Beispiel stammt die für ein Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid oder ein Homolog davon codierende Nukleinsäure aus der Salicaceae-Familie, besonders bevorzugt aus der Gattung Populus, ganz besonders bevorzugt aus Populus trichocarpa.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform stammt die für ein Bax-Inhibitor-1(BI-1-)-Polypeptid oder ein Homolog davon codierende Nukleinsäure aus einer monokotylen Pflanze, vorzugsweise aus der Familie Poaceae, besonders bevorzugt aus der Gattung Oryza, ganz besonders bevorzugt aus Oryza sativa.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen. Insbesondere erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, insbesondere einem erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden daher Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen bereitgestellt, wobei diese gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen. Vorzugsweise umfasst der erhöhte Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, der in den erfindungsgemäßen Pflanzen bereitgestellt wird, aus der einen erhöhten Samenertrag und/oder eine erhöhte Biomasse umfassenden Gruppe ausgewählte Parameter. Gemäß einer Ausführungsform soll ein Verweis auf gesteigerte Ertragsmerkmale hier eine Ertragserhöhung einschließlich einer Erhöhung des Samenertrags und/oder eine Erhöhung der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile im Erdboden einschließen kann. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntefähigen Teilen um Samen, oder derartige erntefähige Teilen umfassen Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen und insbesondere zum Erhöhen des Ertrags im Vergleich zu Kontrollpflanzen und ganz insbesondere zum Erhöhen des Samenertrags und/oder zum Erhöhen der Biomasse im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein wie hier definiertes BI-1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein BI-1-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Nichtstressbedingungen oder unter Stressbedingungen wie milden Dürrebedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Nichtstressbedingungen oder unter Stressbedingungen wie milden Dürrebedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein wie hier definiertes BI-1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein wie hier definiertes BI-1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Salzstressbedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Salzstressbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein wie hier definiertes BI-1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
  • Die Erfindung stellt außerdem genetische Konstrukte und Vektoren zum Erleichtern des Einbringens und/oder der Expression von für wie hier definierte BI-1-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren in Pflanzen bereit. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren in Pflanzen hinein geeignet sind und für die Expression des Gens von Interesse in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung eines wie hier definierten Genkonstrukts in den Verfahren der Erfindung bereit.
  • Genauer stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, umfassend:
    • (a) eine Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes BI-1-Polypeptid codiert;
    • (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Die für ein BI-1-Polypeptid codierende Nukleinsäure ist vorzugsweise wie oben definiert. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert.
  • Die Erfindung stellt weiterhin mit einem wie oben beschriebenen Konstrukt transformierte Pflanzen bereit. Die Erfindung stellt insbesondere mit einem wie oben beschriebenen Konstrukt transformierte Pflanzen bereit, die wie hier beschriebene erhöhte Ertragsmerkmale haben.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der jedwede der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, welche auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig mit einer oder mehreren Steuerungssequenzen (mindestens mit einem Promotor) verbunden.
  • Vorteilhafterweise kann zur Steuerung der Expression der Nukleinsäuresequenz ein beliebiger Promotortyp verwendet werden, gleich ob natürlich oder synthetisch, vorzugsweise ist der Promotor jedoch pflanzlichen Ursprungs. Ein konstitutiver Promotor eignet sich besonders für die Verfahren. Vorzugsweise handelt es sich bei dem konstitutiven Promotor um einen ubiquitären konstitutiven Promotor. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem konstitutiven Promotor um einen ubiquitären konstitutiven Promotor mittlerer Stärke. Definitionen der verschiedenen Promotortypen finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die für das BI-1-Polypeptide codierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 29 beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für ein BI-1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors beschränkt. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen von Pflanzen abgeleiteten Promotor wie einen GOS2-Promotor oder einen Promotor mit im Wesentlichen der gleichen Stärke und im Wesentlichen dem gleichen Expressionsmuster (einem funktionell äquivalenten Promotor).
  • Ein anderes Beispiel eines von Pflanzen abgeleiteten Promotors, der gemäß der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen kann, ist ein Ubiquitinpromotor, z. B. aus Petersilie.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Promotor um den GOS-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 153 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 153 wiedergegeben.
  • Gegebenenfalls können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere Terminatorsequenzen eingesetzt werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die einen GOS2-Promotor umfasst, im Wesentlichen ähnlich SEQ ID NR: 153, und die für das BI-1-Polypeptid codierende Nukleinsäure. Gemäß einem anderen Beispiel umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die einen Ubiquitinpromotor und die für das BI-1-Polypeptid codierende Nukleinsäure umfasst. Weiterhin können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere für selektierbare Marker codierende Sequenzen vorhanden sein.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung ist die modulierte Expression eine erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
  • Wie oben erwähnt, wird ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, die für ein BI-1-Polypeptid codiert, durchgeführt, indem man eine für ein BI-1-Polypeptid codierende Nukleinsäure in eine Pflanze einbringt und dort exprimiert; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von Ertragsmerkmalen, auch unter Verwendung anderer gut bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologer Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
  • Die Erfindung stellt außerdem Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Einführung und Expression einer Nukleinsäure, die für ein BI-1-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt genauer gesagt ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag und/oder einer erhöhten Biomasse im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einbringen und Exprimieren in einer Pflanzenzelle oder Zelle einer für ein wie hier definiertes Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder eines wie hier definierten genetischen Konstrukts, welches eine für ein wie hier definiertes Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codierende Nukleinsäure umfasst; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines BI-1-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” hierin beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich in deutlicher Weise auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime davon. Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das für ein wie oben definiertes Polypeptid codiert. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primären transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, welche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung darin besteht, dass die Nachkommen dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform in den Verfahren gemäß der Erfindung hervorgebracht werden.
  • Die Erfindung schließt auch Wirtszellen ein, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, welche für ein BI-1-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder der Vektor sind im Prinzip in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
  • Gemäß einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung weiterhin eine transgene Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag und/oder einer erhöhten Biomasse, herrührend von einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein wie hier definiertes Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codiert, oder eine von dieser transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle bereit. Anders gesagt betrifft die Erfindung auch eine transgene Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag und/oder einer erhöhten Biomasse, wobei in der transgenen Pflanze die Expression einer Nukleinsäure, die für ein wie hier definiertes Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codiert, moduliert ist.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren sind vorteilhaft auf alle Pflanzen, insbesondere auf alle wie hier definierten Pflanzen, anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Nutzpflanze. Beispiele für Kulturpflanzen schließen Endivie, Karotte, Maniok, Klee, Sojabohne, Rübe, Zuckerrübe, Sonnenblume, Canola, Luzerne, Raps, Flachs, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine monokotyle Pflanze. Zu Beispielen von monokotylen Pflanzen zählt Zuckerrohr.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze ein Getreide. Beispiele für Getreide schließen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ein.
  • Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, wobei diese erntefähigen Teile eine rekombinante Nukleinsäure enthalten, die für ein BI-1-Polypeptid codiert. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet, sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die für BI-1-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser BI-1-Polypeptide bei der Steigerung beliebiger der oben erwähnten Ertragsmerkmale in Pflanzen. Zum Beispiel können die hierin beschriebenen Nukleinsäuren, die für ein BI-1-Polypeptid codieren, oder die BI-1-Polypeptide selbst Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein für ein BI-1-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die BI-1-Polypeptide selbst können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren. Weiterhin können Allelvarianten einer für ein BI-1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure/eines für ein BI-1-Polypeptid codierenden Gens in markergestützten Zuchtprogrammen Anwendung finden. Nukleinsäuren, die für BI-1-Polypeptide codieren, können auch als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, sowie als Marker für mit diesen Genen gekoppelte Merkmale verwendet werden. Derartige Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln.
  • SEC22-Polypeptid
  • Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein SEC22-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein SEC22-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert und gegebenenfalls auf Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen selektiert.
  • Bei einem bevorzugten Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer für ein SEC22-Polypeptid codierenden Nukleinsäure bringt man eine für ein SEC22-Polypeptid codierende Nukleinsäure in eine Pflanze ein und exprimiert sie dort.
  • Im Folgenden soll jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes SEC22-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches SEC22-Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als ”SEC22-Nukleinsäure” oder ”SEC22-Gen” bezeichnet wird.
  • Ein wie hier definiertes ”SEC22-Polypeptid” bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, welches eine Longin-ähnliche Domäne umfasst, entsprechend dem Interpro-Datenbankeintrag IPR101012 und gegebenenfalls eine Synaptobrevindomäne, entsprechend dem Interpro-Datenbankeintrag IPR001388 auf Version 25.0 vom 10. Februar 2010, wie von Hunter et al. 2009 (Hunter et al. InterPro: the integrative protein signature database (2009). Nucleic Acids Res. 37 Database Issue: D224–228) beschrieben.
  • Vorzugsweise umfasst das für die Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignete SEC22-Polypeptid eine Longin-ähnliche Domäne mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 100% Sequenzidentität zu:
    • (i) einer Longin-ähnlichen Domäne in SEQ ID NR: 156 gemäß der Sequenz, die sich zwischen den Aminosäuren 1 und 131 von SEQ ID NR: 156 (SEQ ID NR: 221) befindet;
    • (ii) einer Longin-ähnlichen Domäne in SEQ ID NR: 158 gemäß der Sequenz, die sich zwischen den Aminosäuren 1 und 131 in SEQ ID NR: 158 (SEQ ID NR: 222) befindet.
  • Alternativ dazu und vorzugsweise umfasst das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete SEC22-Polypeptid eine Longin-ähnliche Domäne mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NR: 221 oder SEQ ID NR: 222, wobei mit abnehmender Präferenz mindestens 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, bis zu 30 Aminosäuren durch eine beliebige andere Aminosäure, vorzugsweise eine halbkonservierte, besonders bevorzugt eine konservierte Aminosäure ersetzt sind.
  • Vorzugsweise weist die in dem für die Verfahren der vorliegenden Erfindung geeigneten SEC22-Polypeptid enthaltene Synaptobrevindomäne, mit zunehmender Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu: 223 (der Synaptobrevindomäne von SEQ ID NR: 156) auf.
  • Alternativ dazu und vorzugsweise umfasst das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete SEC22-Polypeptid eine Synaptobrevindomäne mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NR: 223, wobei mit abnehmender Präferenz mindestens 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, bis zu 30 Aminosäuren durch eine beliebige andere Aminosäure, vorzugsweise eine halbkonservierte, besonders bevorzugt eine konservierte Aminosäure ersetzt sind.
  • Weiterhin bevorzugt umfasst das für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete SEC22-Polypeptid eine Londin-ähnliche Domäne und eine Synaptobrevindomäne, noch mehr bevorzugt umfasst das SEC22-Polypeptid eine Longin-ähnliche Domäne, und ihm fehlt eine Synaptobrevindomäne.
  • Die Longin-ähnlichen und die Synaptobrevindomänen sind wie oben beschrieben. Weiterhin sind solche Domänen im Stand der Technik gut bekannt (Longin-ähnliche Domänen: Rossi et al. 2004. Trends in Biochemical Sciences Band 29, Seiten 682–688; Synaptobrevindomäne: Sacher et al. The Journal of Biological Chemistry, 272, 17134–17138) und in Datenbanken von Proteindomänen wie Interpro und/oder Pfam hinterlegt (Hunter et al. 2009; Finn et al. Nucleic Acids Research (2010) Database Issue 38: D211–222). Die Synaptobrevin-Eintragsreferenznummer in Pfam (Pfam 24.0 (Oktober 2009, 11912 Familien) ist PF00957. Werkzeuge zum Identifizieren einer Longin-ähnlichen Domäne oder einer Synaptobrevindomäne sind im Stand der Technik ebenfalls gut bekannt; InterproScan zum Beispiel erlaubt die Suche auf das Vorhandensein solcher Domänen in einem Protein mit bekannter Sequenz (Zdobnov E. M. und Apweiler R. Bioinformatics, 2001, 17(9): S. 847–8). Alternativ dazu erlaubt ein Vergleich der Sequenz des Abfrageproteins mit den Proteinsequenzen von Tabelle A die Feststellung des Vorhandenseins einer Longin-ähnlichen Domäne bzw. einer Synaptobrevindomäne. Weitere Details finden sich im Beispielteil.
  • Zusätzlich oder alternativ dazu hat das für die Verfahren der Erfindung geeignete SEC22-Polypeptid oder ein Homolog davon mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 100% Gesamtsequenzidentität zur Aminosäure gemäß einem der Polypeptide der Tabelle A, vorzugsweise gemäß SEQ ID NR: 156 oder SEQ ID NR: 158, mit der Maßgabe, dass das Polypeptid die wie oben umrissenen konservierten Domänen umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
  • Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die/das für die Verfahren der Erfindung geeignete SEC22-Nukleinsäure und/oder -Polypeptid natürlichen Ursprungs, besonders bevorzugt pflanzlichen Ursprungs, ganz besonders bevorzugt dikotylen oder monokotylen Ursprungs, wie von Tomate beziehungsweise Reis.
  • Alternativ dazu oder zusätzlich bildet die für die Verfahren der Erfindung geeignete SEC22-Polypeptidsequenz, wenn sie zur Konstruktion eines phylogenetischen Baums wie dem in 12 von Uemura et al. 2004 (CSF, Cell Structure and Function Bd. 29 (2004), Nr. 2 S. 49–65; welche hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung wird) gezeigten verwendet wird, Cluster mit der Gruppe von R-SNAREs-VAPMs, ganz besonders bevorzugt mit AtSEC22 und/oder AtYKT61 und AtYKT62 umfassend AtSEC22, ein zu SEQ ID NR: 156 und SEQ ID NR: 158 orthologes Protein. Die 12 aus Uemura et al. 2004 ist hier in 13 wiedergegeben.
  • Alternativ dazu oder zusätzlich bildet die für die Verfahren der Erfindung geeignete SEC22-Polypeptidsequenz, wenn sie zur Konstruktion eines phylogenetischen Baums auf der Basis eines multiplen Alignments des Protein in Tabelle H bis zu SEQ ID NR: 220 verwendet wird, Cluster mit S.Lycopersicum_XXXXXXXXXXX_153 (SEQ ID NR: 156) oder mit O.Sativa_XXXXXXXXXXXXXXXXX_75 (SEQ ID NR: 158). Ein Beispiel für ein geeignetes multiples Alignment und Methoden zur Konstruktion von Bäumen sind weiterhin im Beispielteil detailliert ausgeführt.
  • Weiterhin haben SEC22-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form, das heißt, wenn sie die Longing- und die Snaptobrevin-Domäne umfassen) typischerweise eine proteintansportierende Aktivität, die durch Vesikel vermittelt wird, vorzugsweise zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat. Werkzeuge und Techniken zum Messen der durch Vesikel vermittelten proteintransportierenden Aktivität sind im Stand der Technik gut bekannt. Die Stellen, an denen sich ein mit einem Reporter wie GFP (dem Green Fluorescence Protein) kondensiertes SEC22-Protein auf Pflanzenzellen befindet, lassen sich beispielsweise mikroskopisch lokalisieren (Chatre et al. Plant Physiol. Band 139, 2005, 1244–1254). Darüber hinaus oder zusätzlich dazu kann man spezifische Marker einsetzen, die den Transport zwischen den verschiedenen Kompartiments des zellulären sekretorischen Systems verfolgen.
  • Vorzugsweise befinden sich die SEC22-Polypeptide, die sich für die erfindungsgemäßen Verfahren eignen, bei einer Expression in einer Pflanzenzelle an Membranen, besonders bevorzugt an Membranen des endoplasmatischen Retikulums oder des Golgi-Apparats.
  • Darüber hinaus oder alternativ dazu liefern SEC22-Polypeptide, wenn sie wie hier im Beispielteil umrissen gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung in Reis exprimiert werden, im Vergleich zu Kontrollpflanzen Pflanzen mit erhöhten Ertragsmerkmalen, insbesondere einem erhöhtem Samenertrag, einem erhöhten Ernteindex, einer höheren Anzahl an Blüten und/oder einer erhöhten Blattbiomasse, wenn sie unter Dürrestressbedingungen oder unter Stickstoffmangelbedingungen herangezogen werden. Weitere Details zu solchen Verfahren finden sich im Beispielteil.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 155, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 156 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit SEQ ID NR: 157, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 158 codiert, oder einer beliebigen für SEC22 codierenden Nukleinsäure oder einem SEC22-Polypeptid, wie hier definiert, vorzugsweise einem der in Tabelle H bereitgestellten, durchführen.
  • Beispiele für für SEC22-Polypeptide codierende Nukleinsäuren sind hier in Tabelle H des Beispielteils angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle H des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des SEC22-Polypeptids gemäß SEQ ID NR: 156, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche, wie sie im Definitionsabschnitt beschrieben ist, identifiziert werden; handelt es sich bei der Abfragesequenz um SEQ ID NR: 155 oder SEQ ID NR: 156, erfolgt der zweite BLAST (back-BLAST) gegen S.-lycopersicum-Sequenzen.
  • Die Erfindung stellt außerdem bislang unbekannte, für SEC22 codierende Nukleinsäuren und SEC22-Polypeptide, die sich dazu eignen, Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen gesteigerte Ertragsmerkmale zu verleihen, bereit.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül aus der folgenden Reihe bereitgestellt:
    • (i) eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 155, 157, 159, 161, 163 bis 219;
    • (ii) das Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 155, 157, 159, 161, 163 bis 219;
    • (iii) eine Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 156, 158, 160, 162, 164 bis 220 codiert, die zusätzlich oder alternativ dazu ein oder mehrere Motive mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu einer beliebigen oder mehreren der in SEQ ID NR: 221 bis SEQ ID NR: 222 angeführten Domänen umfasst, und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • (iv) ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iii) unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein isoliertes Polypeptid aus der folgenden Reihe bereitgestellt:
    • (i) eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 156, 158, 160, 162, 164 bis 220;
    • (ii) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 156, 158, 160, 162, 164 bis 220, die zusätzlich oder alternativ dazu ein oder mehrere Motive mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu einer beliebigen oder mehreren der in SEQ ID NR: 221 bis SEQ ID NR: 222 angeführten Motive umfasst, und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen verleiht;
    • (iii) Derivate von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (i) oder (ii) oben.
  • Auch Nukleinsäurevarianten können bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Zu Beispielen solcher Varianten zählen Nukleinsäuren, welche für Homologe und Derivate von einer beliebigen der in Tabelle A des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Außerdem sind Nukleinsäuren in den Verfahren der Erfindung nützlich, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, besitzen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind. Weitere für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeignete Varianten sind Varianten, bei denen der Codon-Einsatz optimiert ist oder bei denen miRNA-Targetstellen entfernt sind.
  • Ferner zählen zu den bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlichen Nukleinsäurevarianten Abschnitte von Nukleinsäuren, die für SEC22-Polypeptide codieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die für SEC22-Polypeptide codieren, hybridisieren, Spleißvarianten von Nukleinsäuren, die für SEC22-Polypeptide codieren, Allelvarianten von Nukleinsäuren, die für SEC22-Polypeptide codieren, sowie Varianten von Nukleinsäuren, die für SEC22-Polypeptide codieren, welche durch Gen-Shuffling erhalten werden. Die Begriffe Hybridisierungssequenz, Spleißvariante, Allelvariante und Gen-Shuffling sind wie hierin beschrieben beschaffen.
  • Nukleinsäuren, die für SEC22-Polypeptide codieren, müssen nicht Volllängennukleinsäuren sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf der Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit voller Länge beruht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einem Abschnitt von einer für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codierenden Nukleinsäure.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäure hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere codierende (oder nicht-codierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere codierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
  • Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, codieren für ein wie hier definiertes SEC22-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle H des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 100, 200, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 155. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines phylogenetischen Baums wie dem in 155 von Uemura et al. 2004 beschriebenen verwendet wird, Cluster mit der Gruppe der AtSEC22- und/oder AtYKP61- und/oder AtYKP62-Polypeptide bildet.
  • Eine andere für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäurevariante ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen verringerter Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein wie hier definiertes SEC22-Polypeptid codiert, oder mit einem wie hier definierten Abschnitt in der Lage ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angeführten Nukleinsäuren fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert, oder bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angeführten Nukleinsäuresequenzen codiert, fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert.
  • Hybridisierungssequenzen, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind und für ein wie hier definiertes SEC22-Polypeptid codieren, haben im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle H des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren mit dem Komplement einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils aufgeführten Nukleinsäuren oder mit einem Abschnitt einer beliebigen dieser Sequenzen, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, in der Lage, oder die Hybridisierungssequenz ist zum Hybridisieren mit dem Komplement einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen codiert, fähig. Ganz besonders bevorzugt ist die Hybridisierungssequenz zum Hybridisieren mit dem Komplement einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 155 oder mit einem Abschnitt davon in der Lage.
  • Vorzugsweise codiert die Hybridisierungssequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie vollständig ist und zur Konstruktion eines phylogenetischen Baums wie dem in 155 oder Uemura et al. 2004 gezeigten verwendet wird, Cluster mit der Gruppe der AtSEC22- und/oder AtYKT61- und/oder AtYKT62-Polypeptide bildet.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist eine Spleißvariante, die für ein wie hier definiertes SEC22-Polypeptid codiert, wobei eine Spleißvariante wie hier definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Spleiß-Variante von einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einer Spleißvariante von einer für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codierenden Nukleinsäure.
  • Bevorzugte Spleißvarianten sind Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 155 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 156 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die Spleißvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie zur Konstruktion eines phylogenetischen Baums wie dem in 12 oder Uemura et al. 2004 verwendet wird, Cluster mit der Gruppe der AtSEC22- und/oder AtYKT61- und/oder AtYKT62-Polypeptide.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes SEC22-Polypeptid codiert, wobei eine Allelvariante wie hier definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Erhöhen von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Allelvariante einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
  • Die von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Allelvarianten codierten Polypeptide weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das SEC22-Polypeptid von SEQ ID NR: 156 und beliebige der in Tabelle H des Beispielteils gezeigten Aminosäuren auf. Allelvarianten kommen in der Natur vor, und zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung gehört auch die Verwendung dieser natürlichen Allele. Vorzugsweise ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 155 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 156 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die Allelvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie zur Konstruktion eines phylogenetischen Baums wie dem in 12 oder Uemura et al. 2004 gezeigten verwendet wird, Cluster mit der Gruppe der AtSEC22- und/oder AtYKT61- und/oder AtYKT62-Polypeptide.
  • Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls zur Anwendung kommen, um Varianten von Nukleinsäuren zu erzeugen, welche für wie oben definierte SEC22-Polypeptide codieren, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” wie hier definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle H des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, wobei die Nukleinsäurevariante durch Gen-Shuffling erhalten wird.
  • Vorzugsweise bildet die durch die durch Gen-Shuffling erhaltene Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie zur Konstruktion eines phylogenetischen Baums wie dem in 12 oder Uemura et al. 2004 gezeigten verwendet wird, Cluster mit der Gruppe der AtSEC22- und/oder AtYKT61- und/oder AtYKT62-Polypeptide.
  • Weiterhin lassen sich Nukleinsäurevarianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten. Zum Erzielen einer ortsgerichteten Mutagenese sind mehrere Verfahren verfügbar, wobei die üblichsten PCR-basierte Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, Hrsg.).
  • Für SEC22-Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das SEC22-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotylen oder monokotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Solanaceae oder Poaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Solanum lycopersicum oder Oryza sativa.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen. Insbesondere erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, insbesondere einem erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
  • Ein Verweis auf gesteigerte Ertragsmerkmale soll hier eine Erhöhung der Jungqpflanzenvitalität und/oder der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile im Erdboden einschließen kann. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntefähigen Teilen um Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung von Ertragsmerkmalen, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Da die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung erhöhte Ertragsmerkmale aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen eine erhöhte Wachstumsrate (wenigstens während eines Teils ihres Lebenszyklus) im Vergleich zur Wachstumsrate von Kontrollpflanzen bei einem entsprechenden Stadium in ihrem Lebenszyklus aufzeigen.
  • Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen liefert herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Dürrebedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein SEC22-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen, herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Nährstoffmangelbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein SEC22-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Salzstressbedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Salzstressbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein SEC22-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Dürrestressbedingungen herangezogene Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu unter vergleichbaren Bedingungen herangezogenen Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags bei unter Dürrestressbedingungen herangezogenen Pflanzen bereitgestellt, welches die Modulation der Expression einer für ein SEC22-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze umfasst.
  • Die Erfindung stellt außerdem genetische Konstrukte und Vektoren zum Erleichtern des Einbringens und/oder der Expression von für SEC22-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren in Pflanzen bereit. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren in Pflanzen hinein geeignet sind und für die Expression des Gens von Interesse in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines wie hier definierten Genkonstrukts in den Verfahren der Erfindung vor.
  • Genauer sieht die vorliegende Erfindung ein Konstrukt vor, umfassend:
    • (a) eine Nukleinsäure, die für ein wie oben definiertes SEC22-Polypeptid codiert;
    • (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Die für ein SEC22-Polypeptid codierende Nukleinsäure ist vorzugsweise wie oben definiert. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert.
  • Noch mehr bevorzugt handelt es sich bei der Nukleinsäure von (a) um SEQ ID NR: 155 oder SEQ ID NR: 157 und bei der Steuerungssequenz von (b) um einen konstitutiven GOS2-Promotor aus Reis.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der jedwede der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, welche auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, erfolgreich zu transformieren, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig mit einer oder mehreren Steuerungssequenzen (mindestens mit einem Promotor) verbunden.
  • Vorteilhafterweise kann zur Steuerung der Expression der Nukleinsäuresequenz ein beliebiger Promotortyp verwendet werden, gleich ob natürlich oder synthetisch, vorzugsweise ist der Promotor jedoch pflanzlichen Ursprungs. Ein konstitutiver Promotor eignet sich besonders für die Verfahren. Vorzugsweise handelt es sich bei dem konstitutiven Promotor um einen ubiquitären konstitutiven Promotor mittlerer Stärke. Definitionen der verschiedenen Promotortypen finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die für das SEC22-Polypeptid codierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 155 oder SEQ ID NR: 157 beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für ein SEC22-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors beschränkt.
  • Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke, besonders bevorzugt ausgewählt aus einem aus einer Pflanze stammenden Promotor, wie einem GOS2-Promotor, besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um den GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 224 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 224 wiedergegeben. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Wie oben erwähnt, wird ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, durchgeführt, indem man eine für ein SEC22-Polypeptid codierende Nukleinsäure in eine Pflanze einbringt und dort exprimiert; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von Ertragsmerkmalen, auch unter Verwendung anderer gut bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologer Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
  • Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren die Einführung und Expression einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt genauer gesagt ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, insbesondere erhöhtem Samenertrag, bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder einer Pflanzenzelle, von einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines SEC22-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” hierin beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich in deutlicher Weise auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime davon. Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, das für ein wie oben definiertes SEC22-Polypeptid codiert. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primär transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, welche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung darin besteht, dass die Nachkommen dasselbe/dieselben genotypische(n) und/oder phänotypische(n) Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform in den Verfahren gemäß der Erfindung hervorgebracht werden.
  • Die Erfindung schließt auch Wirtszellen ein, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, welche für ein SEC22-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder der Vektor sind im Prinzip in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
  • Die Verfahren der Erfindung sind in vorteilhafter Weise auf eine beliebige Pflanze anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyle und dikotyle Pflanzen einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Nutzpflanze. Zu Beispielen von Nutzpflanzen zählen Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Luzerne, Raps, Leinsamen, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt ist die Pflanze eine monokotyle Pflanze. Zu Beispielen von monokotylen Pflanzen zählt Zuckerrohr. Weiter bevorzugt ist die Pflanze ein Getreide. Beispiele für Getreide schließen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ein.
  • Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, wobei diese erntefähigen Teile eine rekombinante Nukleinsäure enthalten, die für ein SEC22-Polypeptid codiert. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die für SEC22-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser SEC22-Polypeptide bei der Steigerung beliebiger der oben erwähnten Ertragsmerkmale in Pflanzen. Zum Beispiel können die hierin beschriebenen Nukleinsäuren, die für ein SEC22-Polypeptid codieren, oder die SEC22-Polypeptide selbst Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein für ein SEC22-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die SEC22-Polypeptide selbst können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren. Weiterhin können Allelvarianten einer für ein SEC22-Polypeptid codierenden Nukleinsäure/eines für ein SEC22-Polypeptid codierenden Gens in markergestützten Zuchtprogrammen Anwendung finden. Nukleinsäuren, die für SEC22-Polypeptide codieren, können auch als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, sowie als Marker für mit diesen Genen gekoppelte Merkmale verwendet werden. Derartige Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln.
  • Punkte
  • Die Erfindung stellt vorzugsweise die folgenden Punkte bereit.
    • 1. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert, umfassend SEQ ID NR: 23 (Motiv1).
    • 2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei es sich bei dem Motiv um R(R/L/F/V)SPGGP(D/N)P(Q/R)HH (SEQ ID NR: 24) handelt.
    • 3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
    • 4. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 3, wobei die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
    • 5. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A angegebenen Proteine codiert.
    • 6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 7. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
    • 8. Verfahren gemäß einem der Punkte 3 bis 7, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
    • 9. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 8, wobei die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
    • 10. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 9, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, umfasst.
    • 11. Konstrukt, umfassend: (i). Nukleinsäure, die für ein wie in Punkt 1 oder 2 definiertes CLE-Typ-2-Polypeptid codiert; (ii). eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii). eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • 12. Konstrukt gemäß Punkt 11, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis, handelt.
    • 13. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 11 oder 12 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 14. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 11 oder 12 transformiert ist.
    • 15. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i). Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (ii). Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
    • 16. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein wie in Punkt 1 oder 2 definiertes CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
    • 17. Transgene Pflanze gemäß Punkt 10, 14 oder 16, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze wie Rübe oder Zuckerrübe, oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
    • 18. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 17, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse, Wurzelbiomasse und/oder Samen sind.
    • 19. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 17 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19 abgeleitet sind.
    • 20. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags, der Sprossbiomasse und/oder der Wurzelbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 21. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das Bax-Inhibitor-1-Polypeptid eine mit dem Bax-Inhibitor in Zusammenhang stehende Domäne (PF01027) umfasst.
    • 22. Verfahren gemäß Punkt 21, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für das Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
    • 23. Verfahren gemäß Punkt 21 oder 22, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen und vorzugsweise einen erhöhten Samenertrag und/oder eine erhöhte Biomasse im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 24. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 23, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
    • 25. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 23, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Bedingungen von osmotischem Stress und/oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
    • 26. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 25, wobei das Bax-Inhibitor-1-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: i) Motiv 3a: [DN]TQxxxE[KR][AC]xxGxxDY[VIL]xx[STA] (SEQ ID NR: 131), ii) Motiv 4a: xxxxxISPx[VS]xx[HYR][LI][QRK]x[VFN][YN]xx[LT] (SEQ ID NR: 133), iii) Motiv 5a: FxxFxxAxxxxxRRxx[LMF][YF][LH]x (SEQ ID NR: 135),
    • 27. Verfahren gemäß Punkt 26, wobei das Bax-Inhibitor-1-Polypeptid zusätzlich eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: i) Motiv 6a: DTQxI[VI]E[KR]AHxGDxDYVKHx (SEQ ID NR: 137); ii) Motiv 7a: x[QE]ISPxVQxHLK[QK]VY[FL]xLC[FC] (SEQ ID NR: 139); iii) Motiv 8a: F[AG]CF[SP][AG]AA[ML][VL][AG]RRREYLYL[AG]G (SEQ ID NR: 141); iv) Motiv 9: [IF]E[VL]Y[FL]GLL[VL]F[VM]GY[VIM][IV][VYF] (SEQ ID NR: 143); v) Motiv 10: [MFL][LV]SSG[VLI]SxLxW[LV][HQ][FL]ASxIFGG (SEQ ID NR: 144); vi) Motiv 11: H[ILV][LIM][FLW][NH][VI]GG[FTL]LT[AVT]x[GA]xx[GA]xxxW[LM][LM] (SEQ ID NR: 145); vii) Motiv 12: Rx[AST][LI]L[ML][GAV]xx[LVF][FL][EKQ]GA[STY]IGPL[IV] (SEQ ID NR: 146).
    • 28. Verfahren gemäß Punkt 26, wobei das Bax-Inhibitor-1-Polypeptid zusätzlich eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: i) Motiv 13a: DTQx[IVM][IV]E[KR][AC]xxGxxDxx[KRQ]Hx (SEQ ID NR: 147); ii) Motiv 14: E[LVT]Y[GLF]GLx[VLI][VF]xGY[MVI][LVI]x (SEQ ID NR: 149); iii) Motiv 15: KN[FL]RQISPAVQ[SN]HLK[RL]VYLT (SEQ ID NR: 150); iv) Motiv 16a: Fx[CS]F[ST]xA[AS]xx[AS]xRR[ESH][YFW]x[FY][LH][GS][GA]xL (SEQ ID NR: 151).
    • 29. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 28, wobei die für ein Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist.
    • 30. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 29, wobei die für ein Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle C aufgelisteten Polypeptide codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
    • 31. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 30, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle C angegebenen Polypeptide codiert.
    • 32. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 31, wobei die für ein Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codierende Nukleinsäure SEQ ID NR: 30 entspricht.
    • 33. Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 32, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem konstitutiven Promotor mittlerer Stärke, vorzugsweise mit einem Promotor aus einer Pflanze, besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
    • 34. Pflanze, Pflanzenteil davon, einschließlich Samen, oder Pflanzenzelle, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 21 bis 33, wobei diese Pflanze, dieser Pflanzenteil bzw. diese Pflanzenzelle eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die für ein wie in einem der Punkte 21 und 26 bis 32 definiertes Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codiert.
    • 35. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die für ein Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 21 und 26 bis 32 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (i) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • 36. Konstrukt gemäß Punkt 35, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen konstitutiven Promotor mittlerer Stärke, vorzugsweise einen Promotor aus einer Pflanze, besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis, handelt.
    • 37. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 35 oder 36 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag und/oder einer erhöhten Biomasse im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 38. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 35 oder 36 transformiert ist.
    • 39. Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag und/oder einer erhöhten Biomasse im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches Folgendes umfasst: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 21 und 26 bis 32 definiert, in einer Pflanzenzelle oder Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
    • 40. Transgene Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag und/oder einer erhöhten Biomasse, herrührend von einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 21 und 26 bis 32 definiert, oder eine von dieser transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
    • 41. Transgene Pflanze gemäß Punkt 34, 38 oder 40, oder eine davon abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze wie Rübe, Zuckerrübe oder Luzerne oder eine Monokotyle wie Zuckerrohr oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
    • 42. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 41, wobei die erntefähigen Teile Samen sind.
    • 43. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 41 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 42 abgeleitet sind.
    • 44. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 21 und 26 bis 32 definiert, zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise zum Erhöhen des Ertrags, und besonders bevorzugt zum Erhöhen des Samenertrags und/oder zum Erhöhen der Biomasse in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 45. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das SEC22-Polypeptid eine Longin-ähnliche Domäne umfasst.
    • 46. Verfahren gemäß Punkt 45, wobei die Longin-ähnliche Domäne mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 100% Sequenzidentität zu: (i) einer Longin-ähnlichen Domäne in SEQ ID NR: 156 gemäß der Sequenz, die sich zwischen den Aminosäuren 1 und 131 von SEQ ID NR: 156 (SEQ ID NR: 221) befindet; (ii) einer Longin-ähnlichen Domäne in SEQ ID NR: 158 gemäß der Sequenz, die sich zwischen den Aminosäuren 1 und 131 in SEQ ID NR: 158 (SEQ ID NR: 222) befindet, aufweist.
    • 47. Verfahren gemäß Punkt 45 oder 46, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
    • 48. Verfahren gemäß einem der Punkte 45 bis 47, wobei die für ein SEC22-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle H aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
    • 49. Verfahren gemäß einem der Punkte 45 bis 48, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle H angegebenen Proteine codiert.
    • 50. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Samenertrag, vorzugsweise eine erhöhte Anzahl gefüllter Samen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 51. Verfahren gemäß einem der Punkte 45 bis 50, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Dürrestress erhalten werden.
    • 52. Verfahren gemäß einem der Punkte 45 bis 50, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen oder unter Stressbedingungen wie Salzstress oder Stickstoffmangel erhalten werden.
    • 53. Verfahren gemäß einem der Punkte 47 bis 52, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
    • 54. Verfahren gemäß einem der Punkte 45 bis 53, wobei die für ein SEC22-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Solanaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Solanum, ganz besonders bevorzugt aus Solanum lycopersicum.
    • 55. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 45 bis 54, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, umfasst.
    • 56. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, wie in Punkt 45 oder 46 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
    • 57. Konstrukt gemäß Punkt 56, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis, handelt.
    • 58. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 56 oder 57 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 59. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 56 oder 57 transformiert ist.
    • 60. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, wie in Punkt 45 oder 46 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
    • 61. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, wie in Punkt 45 oder 46 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
    • 62. Transgene Pflanze gemäß Punkt 55, 59 oder 61, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
    • 63. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 62, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
    • 64. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 62 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 63 abgeleitet sind.
    • 65. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Beschreibung der Figuren
  • Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben, in denen:
  • 1 ein multiples Alignment von SEQ ID NR: 2. und anderen CLE-Typ-2-Polypeptiden wiedergibt. Motiv 1 ist fett gezeigt, SEQ ID NR: 2 ist als AT4G18510 wiedergegeben.
  • 2 eine Weblogo-Darstellung des Konservationsmusters von Resten in den einzelnen Gruppen und für die gesamte Proteinfamilie, aus Oelker et al. (2008), zeigt. Das CLE-Hauptmotiv mit einer Länge von 12 Aminosäuren ist mit einem schwarzen Rahmen markiert. Gruppenspezifische Reste sind in den verschiedenen Gruppen schwarz markiert. Invariante Reste sind im untersten Logo schwarz markiert. Konservierte Reste sind grau markiert. Die Größe des Buchstabens symbolisiert die Häufigkeit des Vorkommens des betreffenden Restes in der Gruppe und dessen Position. In den Gruppen 1, 2, 8 und 13 wurde etwa 50 Aminosäuren stromaufwärts des primären CLE-Motivs ein zweites Motiv identifiziert. Erweiterungen des Motivs sind sowohl am C-Terminus als auch am N-Terminus erkennbar. Die in Klammern gesetzten Zahlen geben die Anzahl an Sequenzen an, die der entsprechenden Gruppe zugeordnet werden.
  • 3 den für eine erhöhte Expression einer für CLE-Typ-2 codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2) in Oryza sativa verwendeten binären Vektor wiedergibt.
  • 4 eine MATGAT-Tabelle für CLE-Typ-2-Polypeptide aus Arabidopsis und Reis darstellt.
  • 5 die Domänenstruktur von SEQ ID NR: 30 mit Angabe der Position der mit dem Bax-Inhibitor in Zusammenhang stehenden Domäne (identifiziert durch Pfam (PF 01027), fett unterstrichen) und Angabe der Position der Motive 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9, 10, 11a und 12 wiedergibt.
  • 6 & 7 ein multiples Alignment verschiedener zur RA/BI-1-Gruppe (Tafel a) und zur EC/BI-1-Gruppe (Tafel b) zählender BI-1-Polypeptide wiedergeben. Die Sternchen markieren identische Aminosäuren unter den verschiedenen Proteinsequenzen, die Doppelpunkte stellen hochkonservierte Aminosäuresubstitutionen dar, und die Punkte stellen weniger konservierte Aminosäuresubstitutionen dar; in den anderen Positionen gibt es keine Sequenzkonservierung. Diese Alignments lassen sich dazu nutzen, weitere Motive zu definieren, wenn man konservierte Aminosäuren verwendet.
  • 8 einen phylogenetischen Baum von BI-1-Polypeptiden zeigt. Die Proteine wurden mit MUSCLE aligniert (Edgar (2004), Nucleic Acids Research 32(5): 1792–97). Ein Neighbourjoining-Baum wurde mit QuickTreel.1 berechnet (Howe et al. (2002). Bioinformatics 18(11): 1546–7). Ein kreisförmiges schräges Kladogramm wurde mit Dendroscope2.0.1 gezeichnet (Hudson et al. (2007). Bioinformatics 8(1): 460). Bei e = 1e–40 wurden alle drei mit Arabidopsis BI-1 verwandten Gene wiedergefunden. Der Baum wurde mit repräsentativen Mitgliedern der einzelnen Kluster erstellt.
  • 9 die MATGAT-Tabelle (Beispiel 12) zeigt
  • 10 den für eine erhöhte Expression einer für BI-1 codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2) in Oryza sativa verwendeten binären Vektor zeigt.
  • 11 den binären Vektor (pUBI) darstellt, der zum Klonieren einer für BI-1 codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Ubiquitinpromotors verwendet wurde, umfassend die folgenden Elemente im Vektorgerüst: einen Replikationsursprung in E. coli, einen Replikationsursprung in Agrobacterium, ein Replikationsprotein für die DNA-Replikation; eine Stabilitätsregion des Replikationsursprungs in Agrobacterium und einen selektionierbaren Marker, der Kanamycinresistenz in Bakterien verleiht.
  • 12 ein multiples Alignment verschiedener SEC22-Polypeptide wiedergibt. Konservierte Aminosäuren sind in mehreren SEC22-Polypeptiden in äquivalenten Positionen vorhanden. Diese Alignments lassen sich dazu nutzen, weitere Motive zu definieren, wenn man konservierte Aminosäuren bestimmt.
  • 13 den phylogenetischen Baum von SEC22-Polypeptiden auf der Basis von 12 von Uemura et al. 2004 zeigt.
  • 14 den für eine erhöhte Expression einer für ein SEC22 codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2) in Oryza sativa verwendeten binären Vektor wiedergibt.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche allein der Veranschaulichung dienen. Mit den folgenden Beispielen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung vollständig zu definieren oder anderweitig zu begrenzen.
  • DNA-Manipulation: Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) und Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
  • Beispiel 1: Identifikation der mit SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2 verwandten Sequenzen
  • Sequenzen (vollständige cDNA, ESTs oder genomisch), die mit SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2 verwandt sind, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410 und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) identifiziert. Das Programm wird eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. So wurde zum Beispiel das von der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1 codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer).
  • Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen lassen sich die Vorgabeparameter anpassen, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.
  • Tabelle A stellt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen bereit, die mit SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2 verwandt sind. Tabelle A: Beispiele für CLE-Typ-2-Nukleinsäuren und -Polypeptide:
    Ursprungspflanze Name Nukleinsäure-SEQ ID NR: Protein-SEQ ID NR:
    A.thaliana AT4G18510 1 12
    A.thaliana AT1G73165 2 13
    A.thaliana AT1G06225 3 14
    A.thaliana AT2G31081 4 15
    A.thaliana AT2G31083 5 16
    A.thaliana AT2G31085 6 17
    A.thaliana AT2G31082 7 18
    O.sativa Os01g48230.1 8 19
    O.sativa Os02g15200.1 9 20
    O.sativa Os05g48730.1 10 21
    O.sativa Os06g34330.1 11 22
  • Sequenzen sind durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige verwandte Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren. Spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken wurden für bestimmte Organismen erzeugt, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”. Weiterhin hat der Zugang zu nicht öffentlichen Datenbanken die Identifizierung neuer Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen ermöglicht.
  • Beispiel 2: Alignment von CLE-Typ-2-Polypeptidsequenzen
  • Das Alignment der Polypeptidsequenzen erfolgte unter Anwendung des ClustalW 2.0-Algorithmus für fortschreitendes Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) mit Standardeinstellungen (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Gonnet, gap opening penalty 10, gap extension penalty: 0,2). Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt. Die CLE-Typ-2-Polypeptide sind in der 1 aligniert.
  • Beispiel 3: Berechnung der globalen prozentualen Identität zwischen Polypeptidsequenzen
  • Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem gap opening penalty von 12 und einem gap extension penalty von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix.
  • Ergebnisse der Analyse für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen sind in 4 gezeigt. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt. Die im Vergleich verwendeten Parameter waren: Wertungsmatrix: Blosum62; First Gap: 12; Extending Gap: 2. Die Sequenzidentität (in %) zwischen den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten CLE-Typ-2-Polypeptidsequenzen können, verglichen mit der SEQ ID NR: 2, bei lediglich 23,6% liegen.
  • Beispiel 4: Funktionsassay für das CLE-Typ-2-Polypeptid
  • Ein Funktionsassay für das CLE-Typ-2-Polypeptid findet sich in Whitford et al. (2008) – Plant CLE peptides from two distinct functional classes synergistically induce division of vascular cells. PNAS, Band 105, Nr. 47, S. 18625–18630 (25. November 2008). Es wurde gezeigt, dass ein synthetisches Peptid, das sich vom CLE-Typ-2-Polypeptid gemäß SEQ ID NR: 2 ableitet, das Wachstum der Wurzeln stoppt.
  • Beispiel 5: Klonieren der für das CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz
  • Die Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Arabidopsis thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um prm14832 (SEQ ID NR: 27; sense, Startcodon fett): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggctaagttaagcttcact-3' und prm14833 (SEQ ID NR: 28; revers, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtta aacatgtcgaagaaattga-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pCLE-type 2, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der die SEQ ID NR: 1 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als Funktionselemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 26) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::CLE-type 2 (3) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 6: Pflanzentransformation
  • Transformation von Reis
  • Das Agrobacterium, welches den Expressionsvektor enthielt, wurde zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare wurden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wurde durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl2, gefolgt von sechsmaligem 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Callus-Induktionsmedium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Calli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
  • Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor enthielt, wurde für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann gesammelt und in einem flüssigen Cokultivierungsmedium in einer Dichte (OD600) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt und die Calli wurden 15 Minuten lang in die Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli wurden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wurde das embryogene Potenzial freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem auxinhaltigen Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
  • Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
  • Beispiel 7: Transformation anderer Kulturpflanzen
  • Transformation von Mais
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Abwandlung des Verfahrens durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden aus der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) abgeerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryos werden auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C 2–3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Weizen
  • Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexiko) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryos in vitro auf Callus-Induktionsmedium, und dann Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C 2–3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und 2–3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Sojabohne
  • Sojabohne wird gemäß einer Modifikation der in der US-Patentschrift 5,164,310 von Texas A&M beschriebenen Methode transformiert. Mehrere kommerzielle Sojabohnensorten sind einer Transformation nach diesem Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Aussäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten Jungsämlingen herausgeschnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden herausgeschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, welches den Expressionsvektor enthält. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien überführt. Regenerierte Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht. Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Raps/Canola
  • Kotyledonäre Keimblattstiele sowie Hypokotyle von einem 5–6 Tage alten Jungsämling werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Aussäen oberflächensterilisiert. Die Kotyledon-Keimblattstiel-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden von den In-vitro-Sämlingen abgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des Schnittendes des Keimblattstiel-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Keimblattstiel-Explantate auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) während 7 Tagen überführt und danach auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf das Bewurzelungsmedium (MS0) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Luzerne
  • Ein sich regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird unter Anwendung des Verfahrens von McKersie et al. (1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Luzerne-Varietät ausgewählt werden, wie es durch Brown DCW und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Keimblattstiel-Explantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum zum Inhibieren des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach einigen Wochen werden somatische Embryos auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryos werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Baumwolle
  • Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens gemäß dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren transformiert. Die Baumwollsamen werden 20 Minuten lang in 3%iger Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert und mit destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann für die Keimung in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl überführt. Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alten Setzlingen werden entfernt, in Stücke von 0,5 cm geschnitten und auf 0,8%igen Agar platziert. Eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, transformiert mit dem Gen von Interesse und geeigneten Selektionsmarkern) wird für die Inokulation der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung überführt man die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-und-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl2, sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien. Individuelle Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten (mit Unterkulturen alle vier bis sechs Wochen) isoliert und werden auf selektivem Medium zur Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16 h Lichtperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend auf nicht-selektivem Medium 2 bis 3 Monate lang weiter kultiviert, was zur Entstehung von somatischen Embryos führt. Gesund aussehende Embryos von mindestens 4 mm Länge werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, das mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure ergänzt ist, überführt. Die Embryos werden bei 30°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Blumentöpfe mit Vermiculit und Nährstoffen überführt. Die Pflanzen werden gehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus verbracht.
  • Transformation von Zuckerrübe
  • Samen der Zuckerrübe (Beta vulgaris L.) werden eine Minute lang in 70%igem Ethanol sterilisiert und anschließend durch 20 min in 20%iger Hypochloritbleiche, z. B. normaler Clorox®-Bleiche (im Handel erhältlich von Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, USA), geschüttelt. Die Samen werden mit sterilem Wasser gespült und an der Luft getrocknet und anschließend auf Keimungsmedium (auf Murashige und Skoog (MS) basierendes Medium (siehe Murashige, T. und Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, Band 15, 473–497) mit B5-Vitaminen (Gamborg et al.; Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., Band 50, 151–8.) ergänzt mit 10 g/l Saccharose und 0,8% Agar) ausplattiert. Hypokotylgewebe wird im Wesentlichen für die Initiierung von Sprosskulturen gemäß Hussey und Hepher (Hussey, G. und Hepher, A., 1978. Clonal propagation of sugarbeet plants and the formation of polylpoids by tissue culture. Annals of Botany, 42, 477–9) verwendet, wobei auf einem mit 30 g/l Saccharose plus 0,25 mg/l Benzylaminopurin und 0,75% Agar angereicherten Medium auf MS-Basis, pH 5,8, bei 23–25°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert wird.
  • Für die Transformationsexperimente wird ein Agrobacterium-tumefaciens-Stamm verwendet, der ein binäres Plasmid trägt, welches ein selektierbares Markergen enthält, zum Beispiel nptII. Einen Tag vor der Transformation wird eine flüssige LB-Kultur mit Antibiotika auf einem Schüttler kultiviert (28°C, 150 U/min), bis eine optische Dichte (O. D.) bei 600 nm von ~1 erreicht ist. Bakterienkulturen, die über Nacht kultiviert worden waren, werden zentrifugiert und in Inokulationsmedium (O. D. ~1) mit Acetosyringon, pH 5,5, resuspendiert.
  • Sprossbasisgewebe wird in Scheiben (ungefähr 1,0 cm × 1,0 cm × 2,0 mm) geschnitten. Das Gewebe wird 30 s in flüssigem Bakterieninokulationsmedium eingetaucht. Überschüssige Flüssigkeit wird durch Abtupfen mit Filterpapier entfernt. Es kam zu einer 24–72-ständigen Cokultivierung auf dem Medium auf MS-Basis mit 30 g/l Saccharose und einer anschließenden nichtselektiven Periode mit Medium auf MS-Basis, 30 g/l Saccharose mit 1 mg/l BAP zum Induzieren der Sprossentwicklung und Cefotaxim zum Eliminieren des Agrobacteriums. Nach 3–10 Tagen werden die Explantate auf ein ähnliches selektives Medium transferiert, welches zum Beispiel Kanamycin oder G418 enthält (50–100 mg/l je nach Genotyp).
  • Die Gewebe werden alle 2 bis 3 Wochen auf frisches Medium übertragen, um den Selektionsdruck aufrechtzuerhalten. Die sehr schnelle Initiierung von Sprossen (nach 3 bis 4 Tagen) deutet auf eine Regeneration existierender Meristeme und nicht auf eine Organogenese neu entwickelter transgener Meristeme hin. Nach mehreren Subkultivierungsdurchgängen werden kleine Sprossen zur Wurzelinduktion auf Medium mit 5 mg/l NAA und Kanamycin oder G418 übertragen. Weitere Schritte werden unternommen, um die Möglichkeit einer Erzeugung von chimären (teilweise transgenen) tranformierten Pflanzen zu reduzieren. Gewebeproben aus regenerierten Sprossen werden für die DNA-Analyse verwendet.
  • Andere Methoden zur Transformation von Zuckerrüben sind im Stand der Technik bekannt, zum Beispiel die von Linsey & Gallois (Linsey, K. und Gallois, P., 1990. Transformation of sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Experimental Botany; Band 41, Nr. 226: 529–36) oder die in der als WO9623891A veröffentlichen internationalen Anmeldung veröffentlichten Methoden.
  • Zuckerrohrtransformation
  • Aus 6 Monate alten Zuckerrohrpflanzen werden Spindeln isoliert (siehe Arencibia A., et al., 1998. An efficient protocol for sugarcane (Saccharum spp. L.) transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Research, Band 7, 213–22; Enriquez-Obregon G., et al., 1998. Herbicide-resistant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by Agrabacterium-mediated transformation. Planta, Band 206, 20–27). Material wird durch 20-minütiges Eintauchen in eine 20%ige Hypochlorit-Bleiche, z. B. normaler Clorox®-Bleiche (im Handel erhältlich von Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, USA) sterilisiert. Querschnitte mit einer Größe von etwa 0,5 cm werden in Top-Oben-Richtung in das Medium gegeben. Das Pflanzenmaterial wird 4 Wochen lang auf Medium auf MS-Basis (Murashige, T., und Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, Band 15, 473–497) einschl. B5-Vitaminen (Gamborg, O., et al., 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., Band 50, 151–8) ergänzt mit 20 g/l Saccharose, 500 mg/l Caseinhydrolysat, 0,8% Agar und 5 mg/l 2,4-D kultiviert, bei 23°C im Dunkeln. Die Kulturen werden nach 4 Wochen auf identisches frisches Medium übertragen.
  • Für die Transformationsexperimente wird ein Agrobacterium-tumefaciens-Stamm verwendet, der ein binäres Plasmid trägt, welches ein selektierbares Markergen enthält, zum Beispiel hpt. Einen Tag vor der Transformation wird eine flüssige LB-Kultur mit Antibiotika auf einem Schüttler kultiviert (28°C, 150 U/min), bis eine optische Dichte (O. D.) bei 600 nm von ~0,6 erreicht ist. Bakterienkulturen, die über Nacht kultiviert worden waren, werden zentrifugiert und in Inokulationsmedium auf MS-Basis (O. D. ~0,4) mit Acetosyringon, pH 5,5, resuspendiert.
  • Stücke von embryogenen Zuckerrohr-Kalli (2–4 mm) werden auf Basis morphologischer Charakteristika wie kompakter Struktur und gelber Farbe isoliert, 20 min im Abzug getrocknet und anschließend 10–20 Minuten lang in ein flüssiges Bakterieninokulationsmedium eingetaucht. Überschüssige Flüssigkeit wird durch Abtupfen mit Filterpapier entfernt. Es kam zu einer 3–5-tägigen Cokultivierung im Dunkeln auf Filterpapier, welches oben auf das Medium auf MS-Basis einschl. B5-Vitaminen mit 1 mg/l 2,4-D gegeben wurde. Nach der Cokultivierung werden die Kalli mit sterilem Wasser gewaschen, gefolgt von einer nicht selektiven Periode auf ähnlichem Medium mit 500 mg/l Cefotaxim zum Eliminieren des Agrobacteriums. Nach 3–10 Tagen werden die Explantate auf ein selektives Medium auf MS-Basis einschl. B5-Vitaminen mit 1 mg/l 2,4-D transferiert, für weitere 3 Wochen mit 25 mg/l Hygromycin (je nach Genotyp). Alle Behandlungen erfolgen bei 23°C im Dunkeln.
  • Resistente Kalli werden weiter auf Medium ohne 2,4-D mit 1 mg/l BA und 25 mg/l Hygromycin bei einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, was zur Entwicklung von Sprosskulturen führt. Die Sprosse werden isoliert und auf selektivem Wurzelmedium (auf MS-Basis einschließlich 20 g/l Saccharose, 20 mg/l Hygromycin und 500 mg/l Cefotaxim) kultiviert. Gewebeproben aus regenerierten Sprossen werden für die DNA-Analyse verwendet.
  • Andere Transformationsmethoden für Zuckerrohr sind im Stand der Technik bekannt, zum Beispiel aus der internationalen Anmeldung, die als WO2010/151634A veröffentlicht wurde, und dem erteilten europäischen Patent EP1831378 .
  • Beispiel 8: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 8.1 Auswertungsansatz
  • Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Sechs Ereignisse, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen bestanden aus kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunkeln sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%.
  • Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
  • Dürre-Screen
  • Pflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens näherten. Sie werden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wird. Zur Überwachung des Bodenwassergehalts (SWC) werden Feuchtigkeitssonden in zufällig ausgewählte Blumentöpfe gesteckt. Fällt der SWC unter bestimmte Schwellenwerte, so werden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wird. Die Pflanzen werden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogen werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
  • Screen der Stickstoffausnutzungseffizienz
  • Reispflanzen aus T1-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe wurden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff(N)-Gehalt enthielt, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
  • Salzstress-Screen
  • Pflanzen wurden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wurde während der ersten zwei Wochen nach dem Umpflanzen der Pflänzchen in das Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wurden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet wurden. Dann wurden samenbezogene Parameter gemessen.
  • 8.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parametern von allen Pflanzen aller Ereignisse, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsereignisse hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert für Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgesetzt. Ein signifikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt hin, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Gens ist, welche die Unterschiede beim Phänotyp verursacht.
  • 8.3 Gemessene Parameter
  • Messung von biomassebezogenen Parametern
  • Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche an dem Zeitpunkt gemessen wird, an dem die Pflanze ihre maximale Blatt-Biomasse erreicht hatte. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Pflanzen(Setzlings)-Fläche drei Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als eine Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als das Maximum der Biomasse von Wurzeln, das während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird); oder als eine Erhöhung im Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
  • Die Jungpflanzenvitalität wird durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wird für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wird durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird.
  • Messungen von samenbezogenen Parametern
  • Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl an gefüllten Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen bestimmt, welche nach dem Trennungsschritt verblieb. Der Gesamtsamenertrag wurde durch Wiegen aller von einer Pflanze abgeernteten gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde durch Zählen der Anzahl der von einer Pflanze geernteten Hülsen gemessen. Das Tausendkerngewicht (TKW) wird aus der gezählten Anzahl gefüllter Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Ernteindex (Harvest Index, HI) ist in der vorliegenden Erfindung definiert als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor von 106. Die Gesamtzahl an Blüten pro Rispe, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl an Samen und der Anzahl an reifen Hauptrispen. Die Samenfüllrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist der Anteil (ausgedrückt als ein %-Wert) der Anzahl gefüllter Samen gegenüber der Gesamtzahl an Samen (oder Blütchen).
  • Beispiel 9: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
  • Die Ergebnisse der Untersuchung von transgenen Reispflanzen, die eine für das Polypeptid von SEQ ID NR: 2 codiert, unter Stickstoffmangelbedingungen exprimieren, sind unten gezeigt (Tabelle B). Bezüglich der Einzelheiten zu den Generationen der transgenen Pflanzen, siehe die obigen Beispiele.
  • Eine Zunahme von mindestens 5% wurde bei der oberirdischen Biomasse (AreaMax), der Gesamtwurzelbiomasse (RootMax), der Anzahl an Blütchen einer Pflanze (nrtotalseed), dem Grünheitsgrad einer Pflanze vor dem Blühen (GNbfFlow), der Anzahl an Rispen bei der ersten Ernte (firstpan), der Anzahl an Blüten pro Rispe (flowerperpan), der Höhe der Pflanze (GravityYMax) und der Menge an dünnen Wurzeln (ThinMax) beobachtet. Tabelle B: Zusammenfassung der Daten für transgene Reispflanzen; gezeigt ist die prozentuale Gesamtzunahme, und bei allen Parametern ist der p-Wert < 0,05 und über der 5%-Schwelle.
    Parameter Gesamtzunahme
    AreaMax 15,1
    RootMax 13,4
    nrtotalseed 30,8
    GNbfFlow 5,0
    firstpan 15,4
    flowerperpan 11,8
    GravityYMax 3,8
    RootThinMax 5,3
  • Beispiel 10: Identifikation der mit SEQ ID NR: 29 und SEQ ID NR: 30 verwandten Sequenzen
  • Sequenzen (vollständige cDNA, ESTs oder genomisch), die mit SEQ ID NR: 29 und SEQ ID NR: 30 verwandt sind, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410 und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) identifiziert. Das Programm wird eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. So wurde zum Beispiel das von der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 29 codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen lassen sich die Vorgabeparameter anpassen, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.
  • In Tabelle C wird eine Liste von Bax-Inhibitor-1-Nukleinsäuren und -Polypeptiden bereitgestellt. Tabelle C: Beispiele für Bax-Inhibitor-1-Nukleinsäuren und Polypeptide:
    Name Nukleinsäure-SEQ ID NR: Polypeptid-SEQ ID NR:
    P.trichocarpa_Bax_inhibitor-1#1 29 30
    O.sativa_LOC_Os02g03280.2#1 31 32
    A.hypogaea_TA2565_3818#1 33 34
    B.gymnorrhiza_TA2344_39984#1 35 36
    C.aurantium_TA1184_43166#1 37 38
    G.max_Glyma01g41380.1#1 39 40
    L.japonicus_TC38887#1 41 42
    L.usitatissimum_LU04MC01169_61583833@1167#1 43 44
    M.esculenta_TA5927_3983#1 45 46
    M.truncatula_CR931735_20.4#1 47 48
    P.trichocarpa_676443#1 49 50
    P.trifoliata_TA5600_37690#1 51 52
    P.vulgaris_TC11390#1 53 54
    A.majus_AJ787008#1 55 56
    C.annuum_TC17367#1 57 58
    C.solstitialis_TA1004_347529#1 59 60
    C.tinctorius_TA1518_4222#1 61 62
    H.tuberosus_TA2997_4233#1 63 64
    I.nil_TC5648#1 65 66
    L.sativa_TC17084#1 67 68
    N.tabacum_TC42752#1 69 70
    N.tabacum_TC53378#1 71 72
    O.basilicum_TA1757_39350#1 73 74
    S.lycopersicum_TC193237#1 75 76
    T.officinale_TA194_50225#1 77 78
    Triphysaria_sp_TC15689#1 79 80
    A.lyrata_946464#1 81 82
    A.thaliana_AT4G17580.1#1 83 84
    A.thaliana_AT5G47120.1#1 85 86
    B.distachyon_TA569_15368#1 87 88
    B.napus_BN06MC22639_48694500@22558#1 89 90
    C.reinhardtii_139760#1 91 92
    C.vulgaris_39100#1 93 94
    Chlorella_56207#1 95 96
    F.vesca_TA8754_57918#1 97 98
    H.vulgare_TC186735#1 99 100
    M.polymorpha_TA1222_3197#1 101 102
    P.americana_TA1856_3435#1 103 104
    P.patens_185792#1 105 106
    P.pinaster_TA3143_71647#1 107 108
    P.sitchensis_TA16029_3332#1 109 110
    P.virgatum_TC4094#1 111 112
    S.bicolor_Sb04g002150.1#1 113 114
    S.bicolor_Sb10g000210.1#1 115 116
    S.moellendorffii_93021#1 117 118
    S.officinarum_TC88739#1 119 120
    T.aestivum_TC322254#1 121 122
    Z.mays_TC515994#1 123 124
  • Sequenzen sind durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige verwandte Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren. Spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken wurden für bestimmte Organismen erzeugt, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”. Weiterhin hat der Zugang zu nicht öffentlichen Datenbanken die Identifizierung neuer Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen ermöglicht.
  • Beispiel 11: Alignment von BI-1-Polypeptidsequenzen
  • Das Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit dem MUSCLE 3.7-Programm (Edgar, Nucleic Acids Research 32, 1792–1797, 2004) durchgeführt. Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert (gap open penalty) ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert (gap extension penalty) ein Wert von 0,1, und die gewählte Gewichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert sind). Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt. Die BI-1-Polypeptide sind in den 6 & 7 aligniert. 6 stellt ein multiples Alignment verschiedener zur RA/BI-1-Gruppe zählender BI-1-Polypeptide dar, 7 stellt ein multiples Alignment verschiedener zur EC/BI-1-Gruppe zählender BI-1-Polypeptide dar.
  • Ein phylogenetischer Baum von BI-1-Polypeptiden (8) wurde erstellt. Die Proteine wurden mit MUSCLE (Edgar (2004), Nucleic Acids Research 32(5): 1792–97) aligniert. Ein Neighbour-joining-Baum wurde mit QuickTree1.1 berechnet (Howe et al. (2002). Bioinformatics 18(11): 1546–7). Ein kreisförmiges schräges Kladogramm wurde mit Dendroscope2.0.1 gezeichnet (Hudson et al. (2007). Bioinformatics 8(1): 460). Bei e = 1e–40 wurden alle drei mit Arabidopsis BI-1 verwandten Gene wiedergefunden. Der Baum wurde mit repräsentativen Mitgliedern der einzelnen Kluster erstellt.
  • Beispiel 12: Berechnung der globalen prozentualen Identität zwischen Polypeptidsequenzen
  • Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem gap opening penalty von 12 und einem gap extension penalty von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix.
  • Ergebnisse der Software-Analyse sind in 9 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt. Die im Vergleich verwendeten Parameter waren: Wertungsmatrix: Blosum62; First Gap: 12; Extending Gap: 2. Die Sequenzidentität (in %) zwischen den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten BI-1-Polypeptidsequenzen liegt, verglichen mit SEQ ID NR: 30, im Allgemeinen über 36% und kann bis zu 85% betragen. Unter Bezugnahme auf Figur 9 entsprechen die angegebenen ID-Nummern den folgenden Sequenzen:
    29 P.trichocarpa_Bax_inhibitor-1 (SEQ ID NR: 2) 53 Triphysaria_sp_TC15689
    30 A.hypogaea_TA2565_3818 54 A.lyrata_946464
    31 B.gymnorrhiza_TA2344_39984 55 A.thaliana_AT4G17580.1
    32 C.aurantium_TA1184_43166 56 A.thaliana_AT5G47120.1
    33 G.max_Glyma01g41380. 57 B.distachyon_TA569_15368
    34 L.japonicus_TC38887 58 B.napus_BN06MC22639_48694500
    35 L.usitatissimum LU04MC01169_61583833 59 C.reinhardtii 139760
    36 M.esculenta_TA5927_3983 60 C.vulgaris_39100
    37 M.truncatula_CR931735_20.4 61 Chlorella_56207
    38 P.trichocarpa_676443 62 F.vesca_TA8754_57918
    39 P.trifoliata_TA5600_37690 63 H.vulgare_TC186735
    40 P.vulgaris_TC11390 64 M.polymorpha_TAl222_3197
    41 A.majus_AJ787008 65 O.sativa_LOC_Os02g03280.2 (SEQ ID NR: 4)
    42 C.annuum_TC17367 66 P.americana_TA1856_3435
    43 C.solstitialis_TA1004_347529 67 P.patens_185792
    44 C.tinctorius_TA1518_4222 68 P.pinaster_TA3143_71647
    45 H.tuberosus_TA2997_4233 69 P.sitchensis_TA16029_3332
    46 I.nil_TC5648 70 P.virgatum_TC4094
    47 L.sativa_TC17084 71 S.bicolor_Sb04g002150.1
    48 N.tabacum_TC42752 72 S.bicolor_Sb10g000210.1
    49 N.tabacum_TC53378 73 S.moellendorffii_93021
    50 O.basilicum_TA1757_39350 74 S.officinarum_TC88739
    51 S.lycopersicum_TC193237 75 T.aestivum_TC322254
    52 T.officinale_TA194_50225 76 Z.mays_TC515994
  • Beispiel 13: Identifizierung von Domänen, die in Polypeptidsequenzen enthalten sind, die sich für die Durchführung der Verfahren der Erfindung eignen
  • Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischen Informationen über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien gehostet. Interpro wird am European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet.
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 30 sind in der Tabelle D aufgeführt. Tabelle D: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 30.
    Interpro-ID Domänen-ID Domänenname Kurzbezeichnung Ort
    IPR006214 PF01027 PFAM Bax inhibitor-1-related UPF0005 [36-232]
    PTHR23291 PANTHER Bax inhibitor-1-related BAX INHIBITOR-RELATED [36-232]
    nicht integriert PTHR23291:SF4 PANTHER nicht integriert BAX INHIBITOR 1 [9-246]
    TMHMM nicht integriert Transmembrane_region [37-55] [61-81] [91-109] [119-141] [146-166] [172-194]
  • Beispiel 14: Funktionsassay für die BI-1-Polypeptide
  • Es wurde von Nagano et al. (2009 Plant J., 58(1): 122–134) gezeigt, dass BI-1-Polypeptide mit AtCb5 wechselwirken. Nagano et al. identifizierten das Arabidopsis-Cytochrome b(5) (AtCb5) als mit Arabidopsis-BI-1 (AtBI-1) wechselwirkend, indem sie die Arabidopsis-cDNA-Bibliothek mit dem Split-Ubiquitin-Hefe-zwei-Hybrid-(split-ubiquitin yeast two-hybrid, suY2H)-System screenten. Cb5 ist ein Elektronentransferprotein, das sich hauptsächlich in der ER-Membran befindet. Darüber hinaus bestätigten ein Bimolecular-Fluorescence-Complementation-(BiFC)-Assay und eine Fluoreszenzresonanzenergietransfer-(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FREI)-Analyse, dass AtBI-1 in Pflanzen mit AtCb5 wechselwirkt. Nagano et al. zeigten außerdem, dass für die durch AtBI-1 vermittelte Unterdrückung des Zelltods in Hefe die Fettsäurehydroxylase 1 aus Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae fatty acid hydroxylase, ScFAH1), die eine Cb5-ähnliche Domäne am N-Terminus aufweist und mit AtBI-1 wechselwirkt, benötigt wird. ScFAH1 ist eine in der ER-Membran befindliche Sphingolipid-Fettsäure-2-Hydroxylase. Im Gegensatz dazu hatten AtFAH1 und AtFAH2, die funktionelle ScFAH1-Homologe in Arabidopsis sind, keine Cb5-ähnliche Domäne und wechselwirkten stattdessen mit AtCb5 in Pflanzen. Nagano et al. offenbarten weiterhin, dass AtBI-1 in Pflanzenzellen über AtCb5 mit AtFAHs wechselwirkt.
  • Beispiel 15: Klonieren der für das BI-1-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz
  • 15.1 Beispiel 1
  • In diesem Beispiel wurde eine Nukleinsäuresequenz durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Populus trichocarpa-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um prm12053 (SEQ ID NR: 125; sense): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggaatcgttcgcttcc-3' und prm12054 (SEQ ID NR: 126; revers, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcgagcacatagtcagtcttcc-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pBI-1, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der die SEQ ID NR: 29 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als Funktionselemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 153) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::BI-1 (10) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • 15.2 Beispiel 2
  • In diesem Beispiel wurde eine Nukleinsäuresequenz durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Oryza sativa-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um prm14082 (SEQ ID NR: 127; sense): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggacgccttctactcgac-3' und prm14083 (SEQ ID NR: 128; revers, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcgggaagagaag ctctcaag-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pBI-10, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der die SEQ ID NR: 31 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als Funktionselemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die IR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 153) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::BI-10 nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert. Der Vektor war ähnlich dem in 5 gezeigten Vektor, mit Ausnahme der für das BI-1-Polypeptid codierenden Nukleinsäure.
  • Beispiel 16: Pflanzentransformation
  • Transformation von Reis
  • Das die Expressionsvektoren enthaltende Agrobacterium (siehe Beispiele 15.1 und 15.2) wurde zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare wurden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wurde durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl2, gefolgt von sechsmaligem 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Callus-Induktionsmedium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Calli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
  • Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor enthielt, wurde für die Cokultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann gesammelt und in einem flüssigen Cokultivierungsmedium in einer Dichte (OD600) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt und die Calli wurden 15 Minuten lang in die Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli wurden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wurde das embryogene Potenzial freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem auxinhaltigen Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
  • Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
  • Beispiel 17: Transformation anderer Kulturpflanzen Transformation von Mais
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Abwandlung des Verfahrens durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden aus der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) abgeerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryos werden auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C 2–3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C 2 bis 3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Weizen
  • Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexiko) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryos in vitro auf Callus-Induktionsmedium, und dann Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C 2–3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und 2–3 Wochen lang, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Sojabohne
  • Sojabohne wird gemäß einer Modifikation der in der US-Patentschrift 5,164,310 von Texas A&M beschriebenen Methode transformiert. Mehrere kommerzielle Sojabohnensorten sind einer Transformation nach diesem Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Aussäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten Jungsämlingen herausgeschnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden herausgeschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, welches den Expressionsvektor enthält. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien überführt. Regenerierte Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht. Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Raps/Canola
  • Kotyledonäre Keimblattstiele sowie Hypokotyle von einem 5–6 Tage alten Jungsämling werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Aussäen oberflächensterilisiert. Die Kotyledon-Keimblattstiel-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden von den In-vitro-Sämlingen abgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des Schnittendes des Keimblattstiel-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Keimblattstiel-Explantate auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) während 7 Tagen überführt und danach auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf Bewurzelungsmedium (MS0) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Luzerne
  • Ein sich regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird unter Anwendung des Verfahrens von McKersie et al. (1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Luzerne-Varietät ausgewählt werden, wie es durch Brown DCW und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Keimblattstiel-Explantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum zum Inhibieren des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach einigen Wochen werden somatische Embryos auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryos werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Baumwolle
  • Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens gemäß dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren transformiert. Die Baumwollsamen werden 20 Minuten lang in 3%iger Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert und mit destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann für die Keimung in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl überführt. Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alten Setzlingen werden entfernt, in Stücke von 0,5 cm geschnitten und auf 0,8%igen Agar platziert. Eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, transformiert mit dem Gen von Interesse und geeigneten Selektionsmarkern) wird für die Inokulation der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung überführt man die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-und-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl2, sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien. Individuelle Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten (mit Unterkulturen alle vier bis sechs Wochen) isoliert und werden auf selektivem Medium zur Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16 h Lichtperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend auf nicht-selektivem Medium 2 bis 3 Monate lang weiter kultiviert, was zur Entstehung von somatischen Embryos führt. Gesund aussehende Embryos von mindestens 4 mm Länge werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, das mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure ergänzt ist, überführt. Die Embryos werden bei 30°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Blumentöpfe mit Vermiculit und Nährstoffen überführt. Die Pflanzen werden gehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus verbracht.
  • Beispiel 18: Phänotypische Bewertungsvorschrift für Reispflanzen
  • H18.1 Auswertungsansatz
  • Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Sechs Ereignisse, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen bestanden aus kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunkeln sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%. Pflanzen, welche unter Nichtstressbedingungen wachsen gelassen wurden, wurden in regelmäßigen Intervallen bewässert, um sicherzustellen, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend sind, und um die Bedürfnisse der Pflanze zu erfüllen.
  • Dürre-Screen
  • Pflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens näherten. Sie werden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wird. Zur Überwachung des Bodenwassergehalts (SWC) werden Feuchtigkeitssonden in zufällig ausgewählte Blumentöpfe gesteckt. Fällt der SWC unter bestimmte Schwellenwerte, so werden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wird. Die Pflanzen werden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stressbedingungen herangezogen werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
  • Screen der Stickstoffausnutzungseffizienz
  • Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe werden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff(N)-Gehalt enthält, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
  • Salzstress-Screen
  • Pflanzen wurden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfasern und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wurde während der ersten zwei Wochen nach dem Umpflanzen der Pflänzchen in das Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wurden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet wurden. Dann wurden samenbezogene Parameter gemessen.
  • 18.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parametern von allen Pflanzen aller Ereignisse, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsereignisse hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert für Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgesetzt. Ein signifikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt hin, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Gens ist, welche die Unterschiede beim Phänotyp verursacht.
  • 18.3 Gemessene Parameter
  • Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
  • Messung von biomassebezogenen Parametern
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche an dem Zeitpunkt gemessen wird, an dem die Pflanze ihre maximale Blatt-Biomasse erreicht hatte. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als eine Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als das Maximum der Biomasse von Wurzeln, das während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird); oder als eine Erhöhung im Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
  • Mit der Entwicklungszeit in Zusammenhang stehende Parameter
  • Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Pflanzen(Setzlings)-Fläche drei Wochen nach der Keimung. Die Jungpflanzenvitalität wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird.
  • Die ”Blütezeit” der Pflanze lässt sich unter Anwendung des in WO 2007/093444 beschriebenen Verfahrens bestimmen.
  • Messungen von samenbezogenen Parametern
  • Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl an gefüllten Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen bestimmt, welche nach dem Trennungsschritt verblieb. Der Gesamtsamenertrag wurde durch Wiegen aller von einer Pflanze abgeernteten gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde durch Zählen der Anzahl der von einer Pflanze geernteten Hülsen gemessen. Das Tausendkerngewicht (TKW) wird aus der gezählten Anzahl gefüllter Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Ernteindex (Harvest Index, HI) ist in der vorliegenden Erfindung definiert als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor von 106. Die Gesamtzahl an Blüten pro Rispe, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl an Samen und der Anzahl an reifen Hauptrispen. Die Samenfüllrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist der Anteil (ausgedrückt als ein %-Wert) der Anzahl gefüllter Samen gegenüber der Gesamtzahl an Samen (oder Blütchen).
  • Beispiel 19: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Reispflanzen
  • 19.1 Beispiel 1
  • Die Ergebnisse einer Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T2-Generation, die eine Nukleinsäure, die für das BI-1-Polypeptid von SEQ ID NR: 30 (siehe Beispiel 15.1) unter Nichtstressbedingungen codiert, exprimiert sind unten in Tabelle E wiedergegeben.
  • Wenn die Pflanzen unter Nichtstressbedingungen kultiviert wurden, wurde für die Wurzelbiomasse (RootThickMax) und beim Samenertrag eine Zunahme von mindestens 5% beobachtet, wie sich am Gesamtgewicht der Samen, der Anzahl an gefüllten Samen der Füllrate und dem Ernteindex zeigt. Tabelle E: Zusammenfassung der Daten für transgene Reispflanzen; bei allen Parametern ist die prozentuale Gesamtzunahme für die Bestätigung (T2-Generation) gezeigt, bei allen Parametern ist der-Wert < 0,05.
    Parameter Gesamtzunahme
    Gesamtsamengewicht 18,9
    Anzahl an gefüllten Samen 14,0
    Füllrate 27,4
    Ernteindex 19,7
    RootThickMax 7,9
  • Zusätzlich zeigten die BI-1-Nukleinsäure exprimierenden Pflanzen Jungpflanzenvitalität und ein erhöhtes Tausendkerngewicht.
  • 19.2 Beispiel 2
  • Die Ergebnisse einer anderen Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T2-Generation, die eine Nukleinsäure, die für das BI-1-Polypeptid von SEQ ID NR: 32 (siehe Beispiel 15.2) unter Nichtstressbedingungen codiert, exprimiert sind unten in Tabelle F wiedergegeben. Wenn die Pflanzen unter Nichtstressbedingungen kultiviert wurden, wurde beim Samenertrag eine Zunahme von mindestens 5% beobachtet, wie sich am Gesamtgewicht der Samen, der Füllrate und dem Ernteindex zeigt. Tabelle F: Zusammenfassung der Daten für transgene Reispflanzen; bei allen Parametern ist die prozentuale Gesamtzunahme für die Bestätigung (T2-Generation) gezeigt, bei allen Parametern ist der p-Wert < 0,05.
    Parameter Gesamtzunahme
    Gesamtsamengewicht 10,7
    Füllrate 5,4
    Ernteindex 10,0
  • Zusätzlich zeigten die BI-1-Nukleinsäure exprimierenden Pflanzen Jungpflanzenvitalität und ein erhöhtes Tausendkerngewicht und eine erhöhte Anzahl an gefüllten Samen.
  • Beispiel 20: Transgene Arabidopsis-Pflanzen, die eine für BI-1 codierende Nukleinsäuresequenz exprimieren
  • Beispiel 20.1 Herstellung des Konstrukts
  • SEQ ID NR: 30 aus Populus trichocarpa wurde durch PCR amplifiziert, wie im Protokoll für PfuUltra DNA-Polymerase (Stratagene) beschrieben. Die Zusammensetzung für das Protokoll der PfuUltra-DNA-Polymerase war wie folgt: 1 × PCR-Puffer, jeweils 0,2 mM der einzelnen dNTP, 5 ng Plasmid pBI-1 (siehe Beispiel 15.1) mit SEQ ID NR: 30, 50 pmol Forward-Primer, 50 pmol Reverse-Primer, mit oder ohne 1 M Betain, 2,5 u PfuUltra-DNA-Polymerase.
  • Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: 1 Zyklus von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 61°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 2 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 3 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 59°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 4 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 58°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 25 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 57°C, 15 Minuten bei 72°C, dann 1 Zyklus von 10 Minuten bei 72°C, dann schließlich 4–16°C.
  • Zum Amplifizieren und Klonieren der SEQ ID NR: 30 wurden die folgenden Primer verwendet: Primer 1 (Vorwärts-Primer): 5'-TTGCTCTTCCATGGAATCGTTCGCTTCCTTC-3' (SEQ ID NR: 129), der aus einer Adaptorsequenz (unterstrichen) und einer ORF-spezifischen Sequenz besteht; und Primer 2 (Reverse-Primer): 5'-TTGCTCTTCGTCAATCTCTTCTTTTCTTCTTC-3' (SEQ ID NR: 130), der aus einer Adaptorsequenz (unterstrichen) und einer ORF-spezifischen Sequenz besteht. Die Adaptorsequenzen ermöglichen das Klonieren des ORF in die verschiedenen die Colic-Adaptoren enthaltende Vektoren.
  • Dann wurde ein binärer Vektor für die nicht zielgerichtete Expression des Proteins konstruiert. „Nicht zielgerichtete” Expression bedeutet in diesem Zusammenhang, dass an den zu exprimierenden ORF keine zusätzliche Erkennungssequenz angefügt wurde. Der für die nicht zielgerichtete Expression verwendete binäre Vektor wurde pUBI, wie er in 11 wiedergegeben ist. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Border einen pflanzenselektierbaren Marker. Der Vektor enthielt weiterhin einen Ubiquitin-Promotor aus Petersilie (Petroselinum crispum) zur konstitutiven Expression, vorzugsweise in grünen Geweben.
  • Zum Klonieren von SEQ ID NR: 30 wurde Vektor-DNA nach dem Standardprotokoll (MBI Fermentas) mit den Restriktionsenzymen PacI und NcoI behandelt. In allen Fällen wurde die Reaktion durch 20-minütige Desaktivierung bei 70°C gestoppt und gemäß dem Standardprotokoll (Qiagen bzw. Macherey-Nagel) über QIAquick- oder NucleoSpin Extract II-Säulen gereinigt.
  • Dann wurde das PCR-Produkt, das den amplifizierten ORF mit den betreffenden Adaptorsequenzen und der Vektor-DNA darstellt, gemäß dem Standardprotokoll (MBI Fermentas) mit T4 DNA-Polymerase behandelt, so dass Einzelstrangüberhänge erhalten wurden, und zwar mit den Parametern 1 Einheit T4 DNA-Polymerase bei 37°C für 2–10 Minuten für den Vektor und 1–2 Einheiten T4 DNA-Polymerase bei 15–17°C für 10–60 Minuten für das PCR-Produkt mit der SEQ ID NO: 30. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Hochsalzpuffer gestoppt und über QIAquick- oder NucleoSpin Extract II-Säulen gemäß dem Standardprotokoll (Qiagen bzw. Macherey-Nagel) aufgereinigt. Etwa 30–60 ng präparierter Vektor und eine definierte Menge des präparierten Amplifikats wurden gemischt und bei 65°C für 15 Minuten lang hybridisiert, gefolgt von 37°C 0,1°C/1 Sekunde, gefolgt von 37°C 10 Minuten, gefolgt von 0,1°C/1 Sekunde, dann 4–10°C.
  • Die ligierten Konstrukte wurden in dem gleichen Reaktionsgefäß durch Zugabe kompetenter E. coli-Zellen (Stamm DHSalpha) und Inkubation für 20 Minuten bei 1°C und einem anschließenden Hitzeschock für 90 Sekunden bei 42°C sowie Abkühlen auf 1–4°C transformiert. Dann wurde Vollmedium (SOC) zugegeben und das Gemisch wurde für 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Das gesamte Gemisch wurde anschließend auf eine Agarplatte mit 0,05 mg/ml Kanamycin plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
  • Das Ergebnis des Klonierungsschritts wurde durch Amplifikation mit Hilfe der Primer verifiziert, die stromaufwärts und stromabwärts der Integrationsstelle binden, so dass die Amplifikation der Insertion ermöglicht wurde. Die Amplifikationen erfolgten wie in dem Protokoll der Taq DNA-Polymerase (Gibco-BRL) beschrieben. Die Amplifikationszyklen waren wie folgt: 1 Zyklus von 1–5 Minuten bei 94°C, gefolgt von 35 Zyklen von jeweils 15–60 Sekunden bei 94°C, 15–60 Sekunden bei 50–66°C und 5–15 Minuten bei 72°C, gefolgt von 1 Zyklus von 10 Minuten bei 72°C, dann 4–16°C.
  • Ein Teil einer positiven Kolonie wurde in ein Reaktionsgefäß überführt, das mit Vollmedium (LB), das mit Kanamycin angereichert war, gefüllt war, und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Plasmidzubereitung erfolgte wie im Qiaprep- bzw. NucleoSpin Multi-96 Plus-Standardprotokoll (Qiagen bzw. Macherey-Nagel) angegeben.
  • Die Sequenz der den Ubiquitin-Promotor (mit einem Intron) kondensiert an das BI-1-Gen enthaltenden Genkassette ist in SEQ ID NR: 154 wiedergegeben.
  • Beispiel 20.2 Arabidospis-Transformation
  • In diesem Beispiel wird die Herstellung transgener Pflanzen, die SEQ ID NR: 30 exprimieren, erläutert.
  • 1–5 ng isolierte Plasmid-DNA wurde durch Elektroporation oder Transformation in kompetente Zellen von Agrobacterium tumefaciens, Stamm GV 3101 pMP90 (Koncz und Schell, Mol. Gen. Gent. 204, 383 (1986)) transformiert. Danach wurde Vollmedium (YEP) zugegeben und das Gemisch wurde 3 Stunden lang bei 28°C in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. Anschließend wurde das gesamte Reaktionsgemisch auf YEP-Agarplatten plattiert, die mit den entsprechenden Antibiotika, beispielsweise Rifampicin (0,1 mg/ml), Gentamycin (0,025 mg/ml) und Kanamycin (0,05 mg/ml), angereichert waren, und 48 Stunden lang bei 28°C inkubiert.
  • Die Agrobakterien, die das Plasmidkonstrukt enthalten, wurden dann zur Transformation von Pflanzen verwendet. Mit Hilfe einer Pipettenspitze wurde eine Kolonie von der Agarplatte gepickt und in 3 ml flüssigem TB-Medium aufgenommen, das auch geeignete Antibiotika, wie oben beschrieben, enthielt. Die Vorkultur wurde 48 Std. bei 28°C und 120 U/min gezüchtet.
  • 400 ml LB-Medium, das die gleichen Antibiotika wie oben enthielt, wurde für die Hauptkultur verwendet. Die Vorkultur wurde in die Hauptkultur überführt. Sie wurde 18 Std. bei 28°C und 120 U/min gezüchtet. Nach Zentrifugation bei 4000 U/min wurde das Pellet in Infiltrationsmedium (MS-Medium, 10% Saccharose) resuspendiert.
  • Zum Heranziehen der Pflanzen für die Transformation wurden Schalen (Piki Saat 80, grün, mit Siebboden versehen, 30 × 20 × 4,5 cm, von Wiesauplast, Kunststofftechnik, Deutschland) bis zur Hälfte mit einem GS 90-Substrat (Standardboden, Werkverband E. V., Deutschland) gefüllt. Die Schalen wurden über Nacht mit 0,05% Proplant-Lösung (Chimac-Apriphar, Belgien) gegossen. Samen von A. thaliana C24 (Nottingham Arabidopsis Stock Centre, UK; NASC Stock N906) wurden über die Schale verteilt, und zwar etwa 1000 Samen pro Schale. Die Schalen wurden mit einer Haube abgedeckt und in der Stratifikationseinheit (8 h, 110 μmol/m2s1, 22°C; 16 h, Dunkelheit, 6°C) untergebracht. Nach 5 Tagen wurden die Schalen in einer Kammer mit kurztaggesteuerter Umgebung (8 h, 130 μmol/m2s1, 22°C; 16 Std., Dunkelheit 20°C) untergebracht, wo sie etwa 10 Tage verblieben, bis sich die ersten echten Blätter gebildet hatten.
  • Die Keimlinge wurden in Töpfe überführt, die das gleiche Substrat enthielten (Teku Töpfe, 7 cm, LC Serie, hergestellt von Pöppelmann GmbH & Co, Deutschland). Für jeden Topf wurden fünf Pflanzen ausgestochen. Die Töpfe wurden dann in die Kammer mit kurztaggesteuerter Umgebung zurückgestellt, damit die Pflanze weiter wachsen konnte.
  • Nach 10 Tagen wurden die Pflanzen in das Gewächshaus (ergänzende Beleuchtung 16 Std., 340 μE/m2 s, 22°C; 8 h, Dunkelheit, 20°C) überführt, wo sie weitere 17 Tage wachsen konnten.
  • Für die Transformation wurden 6 Wochen alte Arabidopsis-Pflanzen, die gerade zu blühen begonnen hatten, 10 Sekunden lang in die vorstehend beschriebene Agrobakteriensuspension getaucht, die vorher mit 10 μl Silwett L77 (Crompton S. A., Osi Specialties, Schweiz) behandelt worden war. Das entsprechende Verfahren ist in Clough J. C. und Bent A. F. (Plant J. 16, 735 (1998)) beschrieben.
  • Die Pflanzen wurden anschließend 18 Stunden lang in einer Feuchtkammer untergebracht. Danach wurden die Töpfe zurück in das Gewächshaus gestellt, damit die Pflanzen weiter wachsen konnten. Die Pflanzen verblieben weitere 10 Wochen im Gewächshaus, bis die Samen erntereif waren. Je nach dem Toleranzmarker, der zur Selektion der transformierten Pflanzen verwendet wurde, wurden die geernteten Samen im Gewächshaus ausgepflanzt und einer Sprühselektion unterzogen oder ansonsten zuerst sterilisiert und dann auf Agarplatten gezüchtet, die mit dem entsprechenden Selektionsmittel angereichert waren. Da der Vektor das Bar-Gen als Toleranzmarker enthielt, wurden die Jungpflanzen viermal in einem Abstand von 2 bis 3 Tagen mit 0,02% BASTA® besprüht, und man ließ die transformierten Pflanzen Samen bilden. Die Samen transgener A. thaliana-Pflanzen wurden in einem Gefrierschrank (bei –20°C) aufbewahrt.
  • Beispiel 20.3 Screening von Pflanzen auf Wachstum mit eingeschränkter Stickstoffversorgung
  • Pro transgenem Konstrukt wurden 4–7 unabhängige transgene Linien (= Ereignisse) getestet (21–28 Pflanzen pro Konstrukt). Arabidopsis thaliana-Samen wurden in Töpfe ausgesät, die eine 1:0,45:0,45(v:v:v)-Mischung von nährstoffarmem Boden (”Einheitserde Typ 0”, 30% Lehm, Tantau, Wansdorf, Deutschland), Sand and Vermiculit enthalten. Je nach Nährstoffgehalt der einzelnen Chargen an nährstoffarmem Boden wurden der Bodenmischung Makronährstoffe mit Ausnahme von Stickstoff zugesetzt, so dass man im vorgedüngten Boden einen Nährstoffgehalt erhielt, der mit dem von vollständig gedüngtem Boden vergleichbar war. Stickstoff wurde bis zu einem Gehalt von etwa 15% im Vergleich zu vollständig gedüngtem Boden zugesetzt. Die mediane Konzentration an Makronährstoffen in vollständig gedüngtem Boden und stickstoffarmem Boden ist in Tabelle G angegeben. Tabelle G:
    Makronährstoff Mediane Konzentration von Makronährstoffen in stickstoffabgereichertem Boden [mg/l] Mediane Konzentration von Makronährstoffen in vollständig gedüngtem Boden [mg/l]
    N (löslich) 27,9 186,0
    P 142,0 142,0
    K 246,0 246,0
    Mg 115,0 115,0
  • Die Keimung wurde durch eine 4-tägige Dunkelperiode bei 4°C induziert. Anschließend wurden die Pflanzen unter Standardwachstumsbedingungen (Photoperiode mit 16 h Licht und 8 h Dunkelheit, 20°C, 60% relative Feuchtigkeit, und eine Photonenflussdichte von 200 μE) herangezogen. Die Pflanzen wurden herangezogen und kultiviert, unter anderem wurden sie jeden zweiten Tag mit vollentsalztem Wasser gegossen. Nach 9 bis 10 Tagen wurden die Pflanzen vereinzelt. Nach einer Gesamtzeit von 28 bis 31 Tagen wurden die Pflanzen geerntet und anhand des Frischgewichts der oberirdischen Teile der Pflanzen eingestuft. Die Zunahme an Biomasse wird als Verhältnis des Frischgewichts der oberirdischen Teile der betreffenden transgenen Pflanze und der nicht transgenen Pflanze vom Wildtyp gemessen.
  • Die Biomasseproduktion von transgenem, unter eingeschränkter Stickstoffversorgung herangezogenem Arabidopsis thaliana wurde durch Wiegen der Pflanzenrosetten gemessen. Die Zunahme an Biomasse wurde als Verhältnis des Durchschnittsgewichts transgener Pflanzen im Vergleich zum Durchschnittsgewicht von Kontrollpflanzen des Wildtyps aus dem gleichen Experiment berechnet. Die mittlere Zunahme an Biomasse bei den transgenen Konstrukten betrug 1,57 (Signifikanzwert < 0,3 und Biomassezunahme > 5% (Verhältnis > 1,05)), was eine 57%ige Zunahme bei der Biomasse im Vergleich zu Kontrollpflanzen anzeigt.
  • Beispiel 21: Identifikation der mit SEQ ID NR: 155 und SEQ ID NR: 156 verwandten Sequenzen
  • Sequenzen (vollständige cDNA, ESTs oder genomisch), die mit SEQ ID NR: 155 und SEQ ID NR: 156 verwandt sind, wurden unter anderen und in den meisten Fällen denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410 und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) identifiziert. Das Programm wird eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. So wurde zum Beispiel das von der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 155 codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fällen lassen sich die Vorgabeparameter anpassen, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.
  • Tabelle H stellt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen bereit, die mit SEQ ID NR: 155 und SEQ ID NR: 156 verwandt sind. Tabelle H: Beispiele für SEC22-Nukleinsäuren und -Polypeptide:
    Name SEQ ID NR: SEQ ID NR:
    S.Lycopersicum_XXXXXXXXXXXXXXXXX_153 155 156
    O.Sativa_XXXXXXXXXXXXXXXXX_75_ 157 158
    A.cepa_CF444242#1 159 160
    A.thaliana_AT5G52270.1#1 161 162
    A.thaliana_AT1G11890.1#1 163 164
    B.napus_BN06MC16544_45261269@16491#1 165 166
    G.max_GM06MC28862_sc89d12@28201#1 167 168
    H.annuus_HA1004M566783105.f_m19_1@9354#1 169 170
    H.vulgare_c62589399hv270303@1653#1 171 172
    H.vulgare_c62675110hv270303@8423#1 173 174
    L.usitatissimum_LU04MC05860_61762877@5856#1 175 176
    M.truncatula_AC152057_19.5#1 177 178
    O.sativa_LOC_Os06g09850.3#1 179 180
    O.sativa_LOC_Os06g09850.2#1 181 182
    O.sativa_LOC_Os03g57760.2#1 183 184
    O.sativa_LOC_Os01g13350.2#1 185 186
    O.sativa_LOC_Os06g09850.1#1 187 188
    O.sativa_LOC_Os01g13350.1#1 189 190
    O.sativa_LOC_Os03g57760.1#1 191 192
    O.sativa_LOC_Os08g21570.1#1 193 194
    P.trichocarpa_scaff_III.433#1 195 196
    P.trichocarpa_scaff_XII.1111#1 197 198
    P.trichocarpa_scaff_158.30#1 199 200
    S.Iycopersicum_TC211580#1 201 202
    T.aestivum_TC293655#1 203 204
    T.aestivum_TC282879#1 205 206
    T.aestivum_TC299964#1 207 208
    T.aestivum_TA06MC09640_55429772@9617#1 209 210
    T. aestivum_TA06MC17784_60074594@17740#1 211 212
    Z.mays_ZM07MC07595_BFb0200109@7579#1 213 214
    Z.mays_ZM07MStraceDB_BFb0022G01.f_1121367770@58185#1 215 216
    Z.mays_ZM07MC06814_62196129@6798#1 217 218
    Z.mays_ZM07MC07594_65357733@7578#1 219 220
  • Sequenzen sind durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige verwandte Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren. Spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken wurden für bestimmte Organismen erzeugt, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”. Weiterhin hat der Zugang zu nicht öffentlichen Datenbanken die Identifizierung neuer Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen ermöglicht.
  • Beispiel 22: Alignment von SEC22-Polypeptidsequenzen
  • Das Alignment der Polypeptidsequenzen erfolgte unter Anwendung des ClustalW 2.0-Algorithmus für fortschreitendes Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) mit Standardeinstellungen (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Blosum 62 (alternativ dazu kann Gonnet angewendet werden) Lückenöffnungsstrafwert 10, Lückenerweiterungsstrafwert: 0,2). Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt. Die SEC22-Polypeptide sind in der 12 aligniert.
  • Ein phylogenetischer Baum von SEC22-Polypeptide ist reproduziert, mit geringfügigen Änderungen aus Uemura et al 2004. Alternativ dazu kann man einen nachbarverbindenden Clustering-Algorithm verwenden, wie er in dem AlignX-Programm von dem Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt wird.
  • Beispiel 23: Berechnung der globalen prozentualen Identität zwischen Polypeptidsequenzen
  • Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, werden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeits-/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix.
  • Die im Vergleich verwendeten Parameter sind: Wertungsmatrix: Blosum62, First Gap: 12, Extending Gap: 2.
  • Beispiel 24: Identifizierung von Domänen, die in Polypeptidsequenzen enthalten sind, die sich für die Durchführung der Verfahren der Erfindung eignen
  • Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischen Informationen über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien gehostet. InterPro wird am European Bioinformatics Institute in Großbritannien gehostet. Es wird eine Suche in Pfam durchgeführt, wobei die Polypeptidsequenz des SEC22-Abfragepeptids verwendet wird. Die InterPro-Datenbank wird mit Hilfe des InterProScan-Tools konsultiert. In SEC22-Polypeptiden werden Longin- und/oder Synaptobrevin-Domänen gefunden.
  • Beispiel 25: Topologievorhersage für die SEC22-Polypeptidsequenzen
  • TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
  • Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
  • Alternativ dazu können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
    • • ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, Australien;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der University of Alberta, Edmonton, Alberta, Kanada;
    • • TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
    • • PSORT (URL: psort.org)
    • • PLOC (Park und Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).
  • Beispiel 26: Klonieren der für das SEC22-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz
  • Die Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Solanum lycopersicum-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren gemäß SEQ ID NR: 225 (sense) und SEQ ID NR: 226 (revers, komplementär), was die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließt. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment sich in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pSEC22, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway®-Technologie erworben. In einem zweiten Experiment wurde unter Verwendung einer für SEQ ID NR: 157 codierenden Nukleinsäure die Nukleinsäuresequenz mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Oryza-sativa-Keimlingen verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase wie oben beschrieben durchgeführt. Zum Klonen einer für SEQ ID NR: 157 codierenden Nukleinsäure wurden Primer gemäß SEQ ID NR: 227 und 228 verwendet.
  • Der die SEQ ID NR: 155 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als Funktionselemente innerhalb der T-DNA-Grenzen: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 224) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::SEC22 (157) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert. Bei der Konstruktion des SEQ ID NR: 157 enthaltenden Expressionsvektors wurde eine ähnliche LR-Reaktion durchgeführt, mit der PGOS2::SEQIDNO:157 erzeugt wurde.
  • Beispiel 27: Pflanzentransformation
  • Transformation von Reis
  • Das Agrobacterium, welches den Expressionsvektor enthielt, wurde zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare wurden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wurde durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl2, gefolgt von sechsmaligem 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt. Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Callus-Induktionsmedium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunkeln wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Calli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
  • Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor enthielt, wurde für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann gesammelt und in einem flüssigen Cokultivierungsmedium in einer Dichte (OD600) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt und die Calli wurden 15 Minuten lang in die Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungsmedium überführt und 3 Tage lang im Dunkeln bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli wurden auf 2,4-D enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunkeln bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wurde das embryogene Potenzial freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem auxinhaltigen Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
  • Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
  • Beispiel 28: Transformation anderer Kulturpflanzen
  • Transformation von Mais
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Abwandlung des Verfahrens durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden aus der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) abgeerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryos werden auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C 2 bis 3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Weizen
  • Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexiko) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryos in vitro auf Callus-Induktionsmedium, und dann Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Sojabohne
  • Sojabohne wird gemäß einer Modifikation der in der US-Patentschrift 5,164,310 von Texas A&M beschriebenen Methode transformiert. Mehrere kommerzielle Sojabohnensorten sind einer Transformation nach diesem Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Aussäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten Jungsämlingen herausgeschnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden herausgeschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, welches den Expressionsvektor enthält. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien überführt. Regenerierte Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht. Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Raps/Canola
  • Kotyledonäre Keimblattstiele sowie Hypokotyle von einem 5–6 Tage alten Jungsämling werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Aussäen oberflächensterilisiert. Die Keimblattstiel-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden aus den In-vitro-Sämlingen herausgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des Schnittendes des Keimblattstiel-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Keimblattstiel-Explantate auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) während 7 Tagen überführt und danach auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf das Bewurzelungsmedium (MS0) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Luzerne
  • Ein sich regenerierender Klon von Luzerne (Medicago sativa) wird unter Anwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Luzerne ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von sich regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Luzerne-Varietät ausgewählt werden, wie es durch Brown, DCW, und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Keimblattstiel-Explantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunkeln auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum zum Inhibieren des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach einigen Wochen werden somatische Embryos auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryos werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Baumwolle
  • Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens gemäß dem in US 5,159,135 beschriebenen Verfahren transformiert. Die Baumwollsamen werden 20 Minuten lang in 3%iger Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann für die Keimung in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl überführt. Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alten Setzlingen werden entfernt, in Stücke von 0,5 cm geschnitten und auf 0,8%igen Agar platziert. Eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, transformiert mit dem Gen von Interesse und geeigneten Selektionsmarkern) wird für die Inokulation der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung überführt man die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-und-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl2 sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien. Individuelle Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten (mit Unterkulturen alle vier bis sechs Wochen) isoliert und werden auf selektivem Medium zur Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16 h Lichtperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend auf nicht-selektivem Medium 2 bis 3 Monate weiter kultiviert, was zur Entstehung von somatischen Embryos führt. Gesund aussehende Embryos von mindestens 4 mm Länge werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, das mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure ergänzt ist, überführt. Die Embryos werden bei 30°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Blumentöpfe mit Vermiculit und Nährstoffen überführt. Die Pflanzen werden gehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus verbracht.
  • Beispiel 29: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 29.1 Auswertungsansatz
  • Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Ereignisse, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen bestanden aus kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunkeln sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%. Pflanzen, welche unter Nichtstressbedingungen wachsen gelassen werden, werden in regelmäßigen Intervallen bewässert, um sicherzustellen, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend sind, und um die Bedürfnisse der Pflanze zum Abschließen von Wachstum und Entwicklung zu erfüllen.
  • T1-Ereignisse wurden unter Befolgen desselben Auswertungsvorgehens wie für die T1-Generation, aber mit mehr Individuen pro Ereignis, in der T2-Generation weiter ausgewertet. Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
  • Dürre-Screen
  • Pflanzen aus T1-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens näherten. Sie wurden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wurde. Zur Überwachung des Bodenwassergehalts (SWC) wurden Feuchtigkeitssonden in zufällig ausgewählte Blumentöpfe gesteckt. Fiel der SWC unter bestimmte Schwellenwerte, so wurden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wurde. Die Pflanzen wurden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
  • Screen der Stickstoffausnutzungseffizienz
  • Reispflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe wurden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff(N)-Gehalt enthielt, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
  • Salzstress-Screen
  • Pflanzen wurden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfaser und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wurde während der ersten zwei Wochen nach dem Umpflanzen der Pflänzchen in dem Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen wurden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet wurden. Dann wurden samenbezogene Parameter gemessen.
  • 29.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parametern von allen Pflanzen aller Ereignisse, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsereignisse hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert für Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgesetzt. Ein signifikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt hin, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Gens ist, welche die Unterschiede beim Phänotyp verursacht.
  • Weil für den Screen der Stickstoffausnutzungseffizienz zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse ausgeführt. Dies ist nützlich, um die Konsistenz der Effekte über die zwei Experimente hinweg zu überprüfen, und, sofern dies der Fall ist, Beweise aus beiden Experimenten zu sammeln, damit die Konfidenz bei der Schlussfolgerung erhöht wird. Das angewandte Verfahren war ein Misch-Modell-Vorgehen, welches die Mehrfachebenen-Struktur der Daten (d. h. Experiment – Ereignis – Segreganten) berücksichtigt. P-Werte wurden durch Vergleichen des Wahrscheinlichkeitsverhältnis-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhalten.
  • 29.3 Gemessene Parameter
  • Messung von biomassebezogenen Parametern
  • Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche an dem Zeitpunkt gemessen wird, an dem die Pflanze ihre maximale Blatt-Biomasse erreicht hatte. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Pflanzen(Setzlings)-Fläche drei Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als eine Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als das Maximum der Biomasse von Wurzeln, das während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird); oder als eine Erhöhung im Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
  • Die Jungpflanzenvitalität wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterschieden, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
  • Messungen von samenbezogenen Parametern
  • Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit einem Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl an gefüllten Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen bestimmt, welche nach dem Trennungsschritt verblieb. Der Gesamtsamenertrag wurde durch Wiegen aller von einer Pflanze abgeernteten gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde durch Zählen der Anzahl der von einer Pflanze geernteten Hülsen gemessen. Das Tausendkerngewicht (TKW) wird aus der gezählten Anzahl gefüllter Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Ernteindex (Harvest Index, HI) ist in der vorliegenden Erfindung definiert als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor von 106. Die Gesamtzahl an Blüten pro Rispe, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl an Samen und der Anzahl an reifen Hauptrispen. Die Samenfüllrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist der Anteil (ausgedrückt als ein %-Wert) der Anzahl gefüllter Samen gegenüber der Gesamtzahl an Samen (oder Blütchen).
  • Beispiel 30: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T1-Generation, die eine Nukleinsäure, umfassend das längste offene Leseraster in SEQ ID NR: 155, unter den Dürrestressbedingungen der vorherigen Beispiele exprimieren, sind unten aufgeführt. Bezüglich der Einzelheiten zu der Erzeugung der transgenen Pflanzen, siehe die obigen Beispiele.
  • Die Ergebnisse der Untersuchung von transgenen Reispflanzen unter Dürrestressbedingungen sind unten gezeigt. Eine Zunahme von mindestens 5% wurde bei dem Gesamtsamenertrag (totalwgseeds), der Anzahl gefüllter Samen (nrfilledseed), der Füllrate (fillrate) und dem Ernteindex (harvestindex) beobachtet.
    Ertragsmerkmal Prozentuale Zunahme bei transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen
    totalwgseeds 21,0
    fillrate 28,1
    harvestindex 21,4
    nrfilledseed 18,3
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T1 und T2-Generation, die eine Nukleinsäure, umfassend das längste offene Leseraster in SEQ ID NR: 157, unter den Bedingungen mit vermindertem Stickstoff der vorherigen Beispiele exprimieren, sind unten aufgeführt. Bezüglich der Einzelheiten zu der Erzeugung der transgenen Pflanzen, siehe die obigen Beispiele.
  • Die Ergebnisse der Untersuchung von transgenen Reispflanzen in der T1-Generation unter Bedingungen mit vermindertem Stickstoff sind unten gezeigt. Eine Zunahme von mindestens 5% wurde bei der während der Lebensspanne einer Pflanze durch blättrige Biomasse maximal abgedeckten Fläche (AreaMax), dem Gesamtsamenertrag (totalwgseeds), der Anzahl an gefüllten Samen (nrfilledseed), der Füllrate (fillrate), dem Grünheitgrad vor dem Blühen (Greenness Before Flowering, GNBfFlow) und der Höhe des Schwerpunkts der blättrigen Biomasse der Pflanzen (GravityYMax) beobachtet.
    Ertragsmerkmal Prozentuale Zunahme bei transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen
    AreaMax 6,0
    totalwgseeds 11,8
    fillrate 6,2
    GNbfFlow 6,6
    nrfilledseed 11,1
    GravityYMax 6,1
  • Die Ergebnisse der Untersuchung von transgenen Reispflanzen in der T2-Generation unter Bedingungen mit vermindertem Stickstoff sind unten gezeigt. Eine Zunahme von mindestens 5% wurde bei dem Gesamtsamenertrag (totalwgseeds), der Anzahl an Blütchen pro Rispe (flowerperpan), der Füllrate (fillrate) und der Anzahl gefüllter Samen (nrfilledseed) beobachtet.
    Ertragsmerkmal Prozentuale Zunahme bei transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen
    totalwgseeds 9,2
    flowerperpan 10,7
    fillrate 6,7
    nrfilledseed 8,2
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (65)

  1. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert, umfassend SEQ ID NR: 23 (Motiv1).
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Motiv um R(R/L/F/V)SPGGP(D/N)P(Q/R)HH (SEQ ID NR: 24) handelt.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
  5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A angegebenen Proteine codiert.
  6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
  8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
  9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, ganz besonders bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
  10. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, umfasst.
  11. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein wie in Anspruch 1 oder 2 definiertes CLE-Typ-2-Polypeptid codiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  12. Konstrukt gemäß Anspruch 11, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis, handelt.
  13. Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 11 oder 12 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  14. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 11 oder 12 transformiert ist.
  15. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  16. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein wie in Anspruch 1 oder 2 definiertes CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
  17. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 10, 14 oder 16, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze wie Rübe oder Zuckerrübe, oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
  18. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 17, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse, Wurzelbiomasse und/oder Samen sind.
  19. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 17 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 19 abgeleitet sind.
  20. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein CLE-Typ-2-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags, der Sprossbiomasse und/oder der Wurzelbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  21. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein Bax-Inhibitor-1(BI-1)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das Bax-Inhibitor-1-Polypeptid eine mit dem Bax-Inhibitor in Zusammenhang stehende Domäne (PF01027) umfasst.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für das Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
  23. Verfahren gemäß Anspruch 21 oder 22, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen und vorzugsweise einen erhöhten Samenertrag und/oder eine erhöhte Biomasse im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
  25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Bedingungen von osmotischem Stress und/oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
  26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei das Bax-Inhibitor-1-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Motiv 3a: [DN]TQxxxE[KR][AC]xxGxxDY[VIL]xx[STA] (SEQ ID NR: 131), (ii) Motiv 4a: xxxxxlSPx[VS]xx[HYR][LI][QRK]x[VFN][YN]xx[LT] (SEQ ID NR: 133), (iii) Motiv 5a: FxxFxxAxxxxxRRxx[LMF][YF][LH]x (SEQ ID NR: 135),
  27. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei das Bax-Inhibitor-1-Polypeptid zusätzlich eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: i) Motiv 6a: DTQxI[VI]E[KR]AHxGDxDYVKHx (SEQ ID NR: 137); ii) Motiv 7a: x[QE]ISPxVQxHLK[QK]VY[FL]xLC[FC] (SEQ ID NR: 139); iii) Motiv 8a: F[AG]CF[SP][AG]AA[ML][VL][AG]RRREYLYL[AG]G (SEQ ID NR: 141); iv) Motiv 9: [IF]E[VL]Y[FL]GLL[VL]F[VM]GY[VIM][IV][VYF] (SEQ ID NR: 143); v) Motiv 10: [MFL][LV]SSG[VLI]SxLxW[LV][HQ][FL]ASxIFGG (SEQ ID NR: 144); vi) Motiv 11: H[ILV][LIM][FLW][NH][VI]GG[FTL]LT[AVT]x[GA]xx[GA]xxxW[LM][LM] (SEQ ID NR: 145); vii) Motiv 12: Rx[AST][LI]L[ML][GAV]xx[LVF][FL][EKQ]GA[STY]IGPL[IV] (SEQ ID NR: 146).
  28. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei das Bax-Inhibitor-1-Polypeptid zusätzlich eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: i) Motiv 13a: DTQx[IVM][IV]E[KR][AC]xxGxxDxx[KRQ]Hx (SEQ ID NR: 147); ii) Motiv 14: E[LVT]Y[GLF]GLx[VLI][VF]xGY[MVI][LVI]x (SEQ ID NR: 149); iii) Motiv 15: KN[FL]RQISPAVQ[SN]HLK[RL]VYLT (SEQ ID NR: 150); iv) Motiv 16a: Fx[CS]F[ST]xA[AS]xx[AS]xRR[ESH][YFW]x[FY][LH][GS][GA]xL (SEQ ID NR: 151).
  29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 28, wobei die für ein Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist.
  30. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 29, wobei die für ein Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle C aufgelisteten Polypeptide codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
  31. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 30, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle C angegebenen Polypeptide codiert.
  32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 31, wobei die für ein Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codierende Nukleinsäure SEQ ID NR: 30 entspricht.
  33. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 32, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem konstitutiven Promotor mittlerer Stärke, vorzugsweise mit einem Promotor aus einer Pflanze, besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
  34. Pflanze, Pflanzenteil davon, einschließlich Samen, oder Pflanzenzelle, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 33, wobei diese Pflanze, dieser Pflanzenteil bzw. diese Pflanzenzelle eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die für ein wie in einem der Ansprüche 21 und 26 bis 32 definiertes Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codiert.
  35. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die für ein Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codiert, wie in einem der Ansprüche 21 und 26 bis 32 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (i) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  36. Konstrukt gemäß Anspruch 35, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen konstitutiven Promotor mittlerer Stärke, vorzugsweise einen Promotor aus einer Pflanze, besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis, handelt.
  37. Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 35 oder 36 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag und/oder einer erhöhten Biomasse im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  38. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 35 oder 36 transformiert ist.
  39. Verfahren zum Herstellen einer transgenen Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag und/oder einer erhöhten Biomasse im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches Folgendes umfasst: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codiert, wie in einem der Ansprüche 21 und 26 bis 32 definiert, in einer Pflanzenzelle oder Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  40. Transgene Pflanze mit gesteigerten Ertragsmerkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen und besonders bevorzugt einem erhöhten Samenertrag und/oder einer erhöhten Biomasse, herrührend von einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codiert, wie in einem der Ansprüche 21 und 26 bis 32 definiert, oder eine von dieser transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
  41. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 34, 38 oder 40, oder eine davon abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze wie Rübe, Zuckerrübe oder Luzerne oder eine Monokotyle wie Zuckerrohr oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
  42. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 41, wobei die erntefähigen Teile Samen sind.
  43. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 41 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 42 abgeleitet sind.
  44. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein Bax-Inhibitor-1-Polypeptid codiert, wie in einem der Ansprüche 21 und 26 bis 32 definiert, zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vorzugsweise zum Erhöhen des Ertrags, und besonders bevorzugt zum Erhöhen des Samenertrags und/oder zum Erhöhen der Biomasse in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  45. Verfahren zur Steigerung von Ertragsmerkmalen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das SEC22-Polypeptid eine Longin-ähnliche Domäne umfasst.
  46. Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei die Longin-ähnliche Domäne mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 100% Sequenzidentität zu: (i) einer Longin-ähnlichen Domäne in SEQ ID NR: 156 gemäß der Sequenz, die sich zwischen den Aminosäuren 1 und 131 von SEQ ID NR: 156, SEQ ID NR: 221) befindet; (ii) einer Longin-ähnlichen Domäne in SEQ ID NR: 158 gemäß der Sequenz, die sich zwischen den Aminosäuren 1 und 131 in SEQ ID NR: 158 (SEQ ID NR: 222) befindet, aufweist.
  47. Verfahren gemäß Anspruch 45 oder 46, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
  48. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 45 bis 47, wobei die für ein SEC22-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle H aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
  49. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 45 bis 48, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle H angegebenen Proteine codiert.
  50. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale einen erhöhten Samenertrag, vorzugsweise eine erhöhte Anzahl gefüllter Samen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  51. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 45 bis 50, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Dürrestress erhalten werden.
  52. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 45 bis 50, wobei die gesteigerten Ertragsmerkmale unter Nichtstressbedingungen oder unter Stressbedingungen wie Salzstress oder Stickstoffmangel erhalten werden.
  53. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 47 bis 52, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
  54. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 45 bis 53, wobei die für ein SEC22-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotylen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Solanaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Solanum, ganz besonders bevorzugt aus Solanum lycopersicum.
  55. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 45 bis 54, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, umfasst.
  56. Konstrukt, umfassend: (i) eine Nukleinsäure, die für ein wie in Anspruch 45 oder 46 definiertes SEC22-Polypeptid codiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  57. Konstrukt gemäß Anspruch 56, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis, handelt.
  58. Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 56 oder 57 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  59. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 56 oder 57 transformiert ist.
  60. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 45 oder 46 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  61. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 45 oder 46 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
  62. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 55, 59 oder 61, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
  63. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 62, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
  64. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 62 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 63 abgeleitet sind.
  65. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein SEC22-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
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