CN103740753A - Bi-1基因在促进长春花细胞生长中的应用及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了BI-1基因在促进长春花细胞生长中的应用，并提供一种促进长春花细胞生长、提高培养细胞产量（总生物量）的方法。实验表明，通过在长春花细胞中过表达BI-1基因，可以促进长春花细胞的生长速度，提高培养周期内细胞的总生物量，在30天培养期内长春花细胞的总产量比非转基因长春花细胞和转基因对照细胞提高1.1倍。按照本发明方法，可提供可以快速生长的转AtBI-1基因的长春花细胞系，这对于长春花细胞培养技术中提高长春花细胞总生物量具有重要的应用意义。

Description

BI-1基因在促进长春花细胞生长中的应用及方法

（一）技术领域

本发明涉及BI-1基因在促进长春花细胞生长中的应用，以及利用拟南芥AtBI-1基因促进长春花细胞生长的方法。

（二）背景技术

长春花生物碱是一类具有抗癌活性的天然产物。由于长春花生物碱结构特殊，难以用化学方法进行人工合成，因此从天然长春花植物中提取长春花生物碱是目前主要的生产方法。然而，由于长春花自然资源有限，研究探索不依赖和消耗自然资源的长春花生物碱新型生产技术是国内外的重要发展趋势之一。

长春花细胞离体培养法是近年来发展起来的一种生产天然抗癌物质的新型生物技术。细胞离体培养法具有不消耗自然资源、不占用耕地、不受自然环境条件的影响等特点，因此受到国内外的广泛重视。在细胞培养实践中，细胞生长速度是决定培养细胞产量（生物量、细胞收获量）的基础，而培养过程中所获得的细胞生物量是决定培养细胞中长春花生物碱产量的基础。由于植物细胞在离体培养过程中受培养环境和条件的限制，细胞生长速度慢，因此长春花细胞培养中生物量低是长期以来限制细胞培养法工业化生产长春花生物碱技术大规模应用的主要原因之一。

细胞凋亡（apoptosis）是由基因控制的一种细胞主动死亡过程，又称为程序性细胞死亡（programmed cell death），是真核细胞的一种特殊的死亡形式。凋亡具有特定的形态特征和生化标记。在动物体内，细胞增殖和细胞死亡的平衡维持对机体的发育与生命的维持至关重要。Baxinhibitor-1（BI-1）是新发现的细胞凋亡抑制基因，其编码产物是Bax调控的细胞死亡通路上的一个调控因子。BI-1最初以动物睾丸增强基因转录本而被克隆得到，是一个单拷贝，进化高度保守的基因。BI-1基因过表达与一些肿瘤发生有关系。细胞的增殖、分化和凋亡之间的平衡是细胞培养过程中一个重要特征，也是生物体组织稳定性的先决条件。研究报道表明，BI-1过表达是打破动物体组织稳定性，导致多种肿瘤发生的基础。在离体培养的植物细胞中，由于不存在与动物肿瘤发生相类似的机制，因此从理论上讲，BI-1过表达不可能将正常的植物细胞转化为瘤细胞。

近年来研究发现，植物体内也具有和动物BI-1序列相似的基因。研究报道表明，植物BI-1基因在植物抗干旱、耐盐以及病原体侵染的耐受性等抵抗生物逆境和非生物逆境胁迫过程中起到重要作用。目前还未有利用植物BI-1基因促进长春花等植物细胞生长的研究报道。

（三）发明内容

本发明目的是提供BI-1基因在促进长春花细胞生长中的应用，并提供一种促进长春花细胞生长、提高培养细胞产量（总生物量）的方法。

本发明采用的技术方案是：

BI-1基因在促进长春花细胞生长中的应用。实验表明，通过在长春花细胞中过表达BI-1基因，可以促进长春花细胞的生长速度，提高培养周期内细胞的总生物量，在30天培养期内长春花细胞的总产量比非转基因长春花细胞和转基因对照细胞提高1.1倍。

优选的，所述BI-1基因为拟南芥AtBI-1基因。具体的，所述拟南芥AtBI-1基因序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还涉及一种促进长春花细胞生长的方法，所述方法包括：将拟南芥AtBI-1基因连接到具有35S启动子的表达载体质粒（如pCD782、pCAMBIA1301等），构建AtBI-1基因重组质粒，将AtBI-1基因重组质粒导入长春花细胞中，筛选稳定表达的阳性克隆并进行传代培养，获得可快速生长的转基因长春花细胞。

所述传代培养条件为：转基因长春花细胞接种量0.04～0.06mg/mL，28℃±2℃、130～150rpm黑暗培养；传代培养所用的培养基为MS液体培养基+2.0mg/L NAA+2mg/L IAA+0.1mg/L CK，pH5.8±0.2。转基因长春花细胞在上述培养条件下传代培养5～6次（每15天按1:15体积比转接一次），可获得形态稳定的转基因长春花悬浮细胞系。所得转基因长春花悬浮细胞系培养条件同上述传代培养条件。

所述MS液体培养基组成如下：硝酸铵1.65g/L、硝酸钾1.9g/L、氯化钙0.44g/L、硫酸镁0.37g/L、磷酸二氢钾0.17g/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸5.2mg/L、硫酸镁22.3mg/L、硫酸锌3.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、硫酸铁27.8mg/L、蔗糖30g/L，溶剂为水。

本发明的主要效果表现在：按照本发明方法，可提供可以快速生长的转AtBI-1基因的长春花细胞系，这对于长春花细胞培养技术中提高长春花细胞总生物量具有重要的应用意义。

（四）附图说明

图1为转基因长春花细胞中AtBI-1表达的RT-PCR检测结果；

图2为转AtBI-1基因长春花细胞与非转基因长春花野生型细胞和转基因对照细胞的生长比较。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：转AtBI-1基因长春花悬浮细胞系构建

（1）AtBi-1基因扩增:以含有AtBI-1cDNA序列的pYX112-AtBI-GFP质粒（该质粒由东京大学Hirofumi Uchimiya博士（uchimiyaiam.u-tokyo.ac.jp）提供。也可以使用其它含有AtBI-1cDNA序列的质粒，这些质粒可从已公开发表相关论文的作者处获得，例如：Sanchez P，de Torres Zabala M，Grant M.AtBI-1，a plant homologue of Baxinhibitor-1，suppresses Bax-induced cell death in yeast and is rapidlyupregulated during wounding and pathogen challenge.Plant Journal.2000，21（4）:393-399.）DNA为模板，扩增回收AtBi-1。扩增引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：

P1:5'-CTGACTCGAGATGGACGGGTCCGGGGAGCAGCTT-3'

P2:5'-CTGAACTAGTTCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGTG-3'。

PCR产物电泳后回收扩增的AtBi-1基因（SEQ ID NO.1）备用；

（2）35S启动子回收

在20μl反应体系中加入含有35S启动子的pCD782质粒（或其它含有35S启动子的质粒，如pCAMBIA1301等）DNA5μg，2μl10×相应酶切缓冲液（1×NE Buffer，上海生工生物工程技术服务有限公司），1μl限制性内切酶（XhoI/SpeI，7U），用无菌水补至20μl，在最适温度（37℃±1℃）下反应3h，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示切出了含有35S启动子的大片段和GFP小片段，将含有35S启动子的pCD782片段回收备用；

（3）AtBi-1酶切（XhoI/SpeI）为粘性末端

为了保证连接的高效、稳定，将AtBi-1酶切为粘性末端，酶切体系和条件（2），酶切产物回收备用；

（4）将步骤（2）、（3）获得的含有35S启动子的pCD782片段和AtBI-1DNA连接。反应条件：16℃、过夜，连接后的产物将其命名为pER8-AtBi-1。

反应体系如下：

表1：pCD782、AtBI-1连接反应体系

（5）pER8－AtBi-1转化农杆菌EHA105

用连接过夜的pER8－AtBi-1按照下述方法转化农杆菌EHA105：挑取EHA105单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃下300rpm振荡培养30～36h，得到菌液。将该菌液以1：100的比例接种于LB液体培养基中，37℃下300rpm振荡培养2～3h，至OD₂₆₀=0.5。取上述菌液1.5ml于Eppendorf管中，冰上放置10min后，3000rpm、4℃离心，去掉上清。用1ml经冰预冷的CaCl₂溶液（0.05M）重悬上述沉淀，冰上放30min后，3000rpm、4℃离心10min。弃去上清，并加入60μl灭菌甘油，340μl0.05M的CaCl₂于上述沉淀中，轻轻振荡使细胞重悬浮，并于冰上放置30min后获得感受态细胞。取感受态细胞200μl，加入10μl连接后的pER8－AtBi-1DNA溶液，摇匀后冰浴中放置30min，42℃水浴热激90秒，然后迅速放冰上5min，加入800μl液体LB培养基，于37℃下振荡1h，使细胞恢复正常生长状态。取100μl菌液均匀涂布于含壮观霉素及潮霉素（浓度均为50mg/L）的LB固体培养基上，37℃培养16～24h；挑取长出的抗性单菌落划线，扩增，进行菌落PCR鉴定。获得的阳性菌落用于长春花细胞的遗传转化。

（6）长春花细胞遗传转化

取阳性农杆菌40μl接种至10ml LB三角瓶中培养（250rpm，28℃）至菌液的OD₂₆₀值在0.8～1.0之间（菌液颜色较浑浊，呈桔黄色），移取1ml菌液至50ml新鲜的LB液体培养基中培养24h（250rpm，28℃）得到菌液。吸取上述菌液500μl于50ml MS液体培养基中。取2～5mg长春花细胞置于5ml农杆菌悬浮液中1～2min，轻轻振荡2～3次，以无菌滤纸过滤并以10ml含200mg/L头胞霉素的MS液体培养基清洗3-4次后，将侵染的长春花细胞接种到含潮霉素（40mg/L）的MS液体培养基中，28℃、140rpm黑暗培养10天，获得具有潮霉素抗性的转基因长春花细胞。

（7）长春花细胞遗传转化——PCR鉴定

以上述（1）DNA序列为引物，对经过抗生素筛选的阳性细胞进行PCR扩增，扩增产物电泳结果呈阳性的为转基因细胞，否则为阴性细胞。

（8）长春花细胞遗传转化——AtBI-1基因表达水平检测

以上述（1）序列为引物，采用RT-PCR技术对转基因长春花细胞、长春花野生型细胞和转基因对照细胞中AtBI-1基因的表达水平进行检测，结果表明转基因细胞中AtBI-1基因可以高水平稳定表达，而长春花野生型细胞和转基因对照细胞中未检测到AtBI-1基因表达，结果参见图1。

（9）转AtBI-1基因长春花细胞系建立

将上述转基因长春花细胞按0.05mg/ml比例接种到传代培养基（MS液体培养基＋2.0mg/L NAA，2mg/L IAA，0.1mg/L CK，pH5.8）中，28℃下黑暗振荡培养（140rpm），每15天按1:15体积转接一次，经过5～6代培养后可获得形态稳定的转AtBI-1基因的长春花悬浮细胞系。

实施例2：AtBI-1基因对长春花细胞生长的促进作用

（1）以实施例1获得的转AtBI-1基因长春花悬浮细胞系为材料，转基因长春花细胞按0.05mg/ml比例接种到传代培养基（MS液体培养基＋2.0mg/L NAA，2mg/L IAA，0.1mg/L CK，pH5.8）中，28℃下黑暗振荡培养（140rpm）；

（2）以未经遗传转化的长春花细胞为材料，按照实施例1步骤（9）方法进行悬浮继代培养，获得长春花野生型悬浮细胞系，并按照与（1）完全相同的培养条件进行培养；

（3）以不含AtBI-1cDNA的空载体按照实施例1转基因操作方法获得长春花转基因对照细胞系，并将此细胞系按照与（1）完全相同的培养条件进行培养；

（4）在细胞生长的不同时期分别取样测定细胞的鲜重，考查转AtBI-1基因长春花细胞、长春花野生细胞、转基因对照细胞的生长曲线。结果表明，转AtBI-1基因长春花细胞的生长速度明显高于长春花野生细胞和转基因对照细胞。培养30天后转AtBI-1基因长春花细胞比长春花野生细胞和转基因对照细胞的生物量高1.1倍（图2）；

（5）实验结果表明，在长春花细胞中转入拟南芥AtBI-1基因可以显著促进长春花细胞生长。

Claims (5)

1.BI-1基因在促进长春花细胞生长中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述BI-1基因为拟南芥AtBI-1基因。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述拟南芥AtBI-1基因序列如SEQ ID No.1所示。

4.一种促进长春花细胞生长的方法，所述方法包括：将拟南芥AtBI-1基因连接到具有35S启动子的表达载体质粒，构建AtBI-1基因重组质粒，以农杆菌侵染法将AtBI-1基因重组质粒导入长春花细胞中，筛选稳定表达的阳性克隆并进行传代培养，获得可快速生长的转基因长春花细胞系。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述传代培养条件为：转基因长春花细胞接种量0.04～0.06mg/mL，28℃±2℃、130～150rpm黑暗培养；培养基组成如下：2.0mg/L NAA，2mg/L IAA，0.1mg/L CK，溶剂为MS液体培养基，pH5.8±0.2。

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