DE112009002224T5 - Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung verschiedener wirtschaftlich wichtiger ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT (Aspartat-Aminosäuretransferase)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte ASPAT-codierende Nukleinsäuren und diese enthaltende Konstrukte bereit, die in der Durchführung der Verfahren der Erfindung von Nutzen sind. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein „MYB91-like transcription factor-”(MYB91)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein MZB91-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt zusätzlich Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Pflanzen, die diese Nukleinsäuresequenzen enthaften, bereit. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin auch allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstumscharakteristika durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für eine GASA („Gibberellic Acid Stimulated Arabidopsis) codiert, in einer Pflanze.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung verschiedener wirtschaftlich wichtiger ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT (Aspartat-Aminosäuretransferase)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte ASPAT-codierende Nukleinsäuren und diese enthaltende Konstrukte bereit, die in der Durchführung der Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein „MYB91-like transcription factor”(MYB91)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein MYB91-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt zusätzlich Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Pflanzen, die diese Nukleinsäuresequenzen enthalten, bereit.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin auch allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Verbesserung verschiedener Pflanzenwachstumscharakteristika durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für eine GASA („gibberellic acid stimulated Arabidopsis) codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein GASA codiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumscharakteristika im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin außerdem allgemein das Gebiet der Molekularbiologie und betrifft ein Verfahren zur Steigerung verschiedener wirtschaftlich wichtiger ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen. Die vorliegende Erfindung betrifft spezifischer ein Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen durch Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein AUX/IAA(Auxin/Indolessigsäure)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein IAA-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Merkmale im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch für AUX/IAA codierende Nukleinsäuren enthaltende Konstrukte bereit, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen.
  • Die stetig anwachsende Weltbevölkerung und die schwindende Reserve an anbaufähigem Land, das für die Landwirtschaft zur Verfügung steht, treibt die Forschung hin zur Erhöhung der Effizienz der Landwirtschaft. Herkömmliche Methoden für Verbesserungen bei Nutzpflanzen und Gartenpflanzen wenden selektive Züchtungstechniken zum Identifizieren von Pflanzen mit wünschenwerten Merkmalen an. Allerdings weisen derartige selektive Züchtungstechniken mehrere Nachteile dahingehend auf, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, welche häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, welche nicht immer dazu führen können, dass die erwünschte Eigenschaft von Elternpflanzen weitergegeben wird. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben es der Menschheit erlaubt, das Keimplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die gentechnische Manipulation von Pflanzen beinhaltet die Isolierung und Manipulierung von genetischem Material (typischerweise in der Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einbringung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Diese Technologie weist das Vermögen auf, Nutzpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, landwirtschaftlichen oder gärtnerischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.
  • Eine Eigenschaft von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist ein erhöhter Ertrag. Der Ertrag ist normalerweise als der messbare Gewinn von ökonomischem Wert aus einer Nutzpflanze definiert. Dies kann in Bezug auf die Quantität und/oder Qualität definiert sein. Der Ertrag ist direkt von mehreren Faktoren, wie zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (zum Beispiel der Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blatt-Seneszenz und sonstigem, abhängig. Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Jungpflanzenvitalität können ebenfalls bedeutende Faktoren bei der Bestimmung des Ertrags sein. Das Optimieren der oben erwähnten Faktoren kann daher zu einer Erhöhung des Nutzpflanzenertrags beitragen.
  • Der Samenertrag ist ein besonders wichtiges Merkmal, da die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Nutzpflanzen, wie Mais, Reis, Weizen, Canola und Sojabohne machen über die Hälfte der gesamten menschlichen Kalorienaufnahme aus, ob durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch Verzehr von Fleischprodukten, welche auf Grundlage verarbeiteter Samen erzeugt wurden. Sie stellen ebenfalls eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Metaboliten, die in industriellen Verfahren verwendet werden, dar. Samen enthaften einen Embryo (die Quelle von neuen Sprossen und Wurzeln) sowie ein Endosperm (die Quelle von Nährstoffen für das Embryowachstum während der Keimung und während des frühen Wachstums der Keimlinge). Die Entwicklung eines Samens beteiligt zahlreiche Gene und erfordert den Transfer von Metaboliten aus den Wurzeln, Blättern und Stängeln in den wachsenden Samen. Das Endosperm assimiliert im Besonderen die Stoffwechselvorläufer von Kohlehydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert sie zu Speichermakromolekülen, um das Korn auszufüllen.
  • Die Pflanzenbiomasse ist der Ertrag für Futterpflanzen, wie Alfalfa, Silomais und Heu. Bei Getreidepflanzen hat man zahlreiche Stellvertreter für den Ertrag verwendet. Am bedeutendsten unter diesen sind Schätzungen der Pflanzengröße. Die Pflanzengröße kann auf viele Arten gemessen werden, abhängig von der Spezies und der Entwicklungsstufe, beinhaltet jedoch das Gesamtpflanzen-Trockengewicht, das oberirdische Trockengewicht, das oberirdische Frischgewicht, die Blattfläche, das Stängelvolumen, die Pflanzenhöhe, den Rosettendurchmesser, die Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, die Triebzahl und die Blattzahl. Viele Spezies halten ein konservatives Verhältnis zwischen der Größe der verschiedenen Teile der Pflanze bei einer gegebenen Entwicklungsstufe ein. Diese allometrischen Beziehungen werden verwendet, um aus einem dieser Größenmaße auf ein anderes zu schließen (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Die Pflanzengröße bei einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann in der Regel mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze und wird deshalb wahrscheinlich während derselben Zeitdauer ein größeres Gewicht gewinnen (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50: 39). Dies kommt zusätzlich zu der potentiellen Fortdauer des mikroumgebungsbezogenen oder genetischen Vorteils hinzu, den die Pflanze hatte, um anfänglich die höhere Größe zu erreichen. Es existiert eine starke genetische Komponente hinsichtlich Pflanzengröße und Wachstumsrate (z. B. ter Steege et al., 2005, Plant Physiology 139: 1078), und daher besteht für eine Auswahl an diversen Genotypen wahrscheinlich eine Korrelation der Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung mit der Große unter einer anderen (Hittalmani et al., 2003, Theoretical Applied Genetics 107: 679). Auf diese Weise wird eine Standardumgebung als Stellvertreter für die vielfältigen und dynamischen Umgebungen benutzt, welche von Nutzpflanzen auf dem Feld an unterschiedlichen Örtlichkeiten und Zeitpunkten angetroffen werden.
  • Eine andere bedeutende Eigenschaft für viele Nutzpflanzen ist die Jungpflanzenvitalität. Die Verbesserung der Jungpflanzenvitalität ist ein wichtiges Ziel bei modernen Reis-Züchtungsprogrammen sowohl in gemäßigten als auch tropischen Reis-Kuttivaren. Lange Wurzeln sind wichtig für eine korrekte Bodenverankerung bei in Wasser ausgesätem Reis. Falls Reis direkt in überflutete Ackerfelder ausgesät wird und falls die Pflanzen rasch durch das Wasser auflaufen müssen, stehen längere Sprosse bzw. Triebe mit der Wuchskraft in Zusammenhang. Wo eine Aussaat mit Drillvorrichtung praktiziert wird, sind längere Mesokotyle und Koleoptile für ein günstiges Auflaufen der Keimpflanzen/Jungpflanzenvitalität bedeutsam. Die Fähigkeit, künstlich in Pflanzen einzubringen, wäre für die Landwirtschaft von großer Bedeutung. Zum Beispiel war eine geringe Jungpflanzenvitalität eine Einschränkung bei der Einführung von Mais-(Zea mays L.)-Hybriden auf Basis von ”Corn Belt”-Keimplasma im europäischen Atlantikraum.
  • Der Harvest Index, das Verhältnis von Samenertrag zu oberirdischem Trockengewicht, ist unter vielen Umweltbedingungen verhältnismäßig stabil, und somit kann häufig eine beständige Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag erhalten werden (z. B. Rebetzke et al., 2002, Crop Science 42: 739). Diese Prozesse sind intrinsisch verknüpft, weil die Mehrheit der Kornbiomasse von der aktuellen oder gespeicherten photosynthetischen Produktivität seitens der Blätter und des Stängels der Pflanze abhängig ist (Gardener et al., 1985, Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68–73). Deshalb ist das Selektieren hinsichtlich der Pflanzengröße sogar bei frühen Entwicklungsstadien als ein Indikator für den zukünftigen potentiellen Ertrag verwendet worden (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Beim Testen hinsichtlich der Auswirkung von genetischen Unterschieden auf die Stresstoleranz ist die Fähigkeit zur Standardisierung von Bodeneigenschaften, Temperatur, Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit sowie Lichtintensität ein spezifischer Vorteil von Gewächshaus- oder Pflanzenwachstumskammer-Umgebungen im Vergleich zu Feldbedingungen. Allerdings können künstliche Einschränkungen auf den Ertrag wegen geringer Bestäubung aufgrund des Fehlens von Wind oder Insekten oder wegen ungenügendem Raum für die reife Wurzel oder das Laubkronenwachstum (canopy growth) die Anwendung dieser regulierten Umgebungen zum Testen von Ertragsunterschieden begrenzen. Deshalb sind Messungen der Pflanzengröße in der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus Standardpraktiken, um Hinweise auf potentielle genetische Ertragsvorteile bereitzustellen.
  • Ein weiteres wichtiges Merkmal ist das einer verbesserten Toleranz gegenüber abiotischem Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweiten Ernteverlust, wobei die Durchschnittserträge für die meisten wichtigen Nutzpflanzen um mehr als 50% reduziert werden (Wang et al. (2003) Planta 218: 1–14). Abiotische Stressfaktoren können durch Dürre, Salzgehalt, Temperaturextreme, chemische Toxizität und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit zur Verbesserung der Pflanzentoleranz gegenüber abiotischem Stress wäre weltweit für Landwirte von großem wirtschaftlichen Vorteil und würde den Anbau von Nutzpflanzen während ungünstigen Bedingungen sowie in Territorien, auf welchen eine Kultivierung von Nutzpflanzen ansonsten nicht möglich sein kann, gestatten.
  • Der Nutzpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben erwähnten Faktoren erhöht werden.
  • Abhängig von der Endanwendung kann die Modifikation bestimmter Ertragseigenschaften gegenüber anderen bevorzugt sein. Beispielsweise kann für Anwendungen wie Futtermittel- oder Holzproduktion oder Biotreibstoff-Ressourcen ein Zuwachs bei den vegetativen Teilen einer Pflanze wünschenswert sein, und für Anwendungen wie Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann ein Zuwachs hinsichtlich der Samenparameter besonders erwünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können, abhängig vom Verwendungszweck, manche gegenüber anderen bevorzugt sein. Verschiedene Mechanismen können zur Erhöhung des Samenertrags beitragen, ungeachtet dessen, ob diese in Form einer erhöhten Samengröße oder einer erhöhten Samenzahl vorliegt.
  • Ein möglicher Ansatz zur Erhöhung des Ertrags (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann durch Modifikation der inhärenten Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie etwa dem Zellzyklus oder verschiedenen Signalleitungswegen, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind.
  • Was ASPAT-Polypeptide betrifft, so ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen verbessert werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäure, die für eine ASPAT (Aspartat-Amonosäuretransferase) codiert, in einer Pflanze moduliert.
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, wurde jetzt gefunden, dass sich verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöhen lassen, indem man in einer Pflanze die Expression einer für ein „MYB91-like transciption factor” (MYB91)-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz erhöht. Die erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhter Pflanzenhöhe, erhöhtem Harvest Index und erhöhtem Tausendkorngewicht.
  • Was GASA-Polypeptide betrifft, wurde jetzt gefunden, dass sich verschiedene Wachstumscharakteristika verbessern lassen, indem man in einer Pflanze die Expression einer für ein GASA („gibberellic acid stimulated Arabidopsis) codierenden Nukleinsäure moduliert.
  • Was AUX/IAA-Polypeptide betrifft, wurde jetzt gefunden, dass sich verschiedene Wachstumscharakteristika in Pflanzen verbessern lassen, indem man in einer Pflanze die Expression einer für ein AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert.
  • Hintergrund
  • 1. Aspartat-Aminotransferase (ASPAT)
  • Die Fähigkeit einer Pflanze im Bezug auf Wachstum, Entwicklung und Ertragsproduktion wird von der Regulierung des Kohlenstoff- und des Stickstoffmetabolismus sowie des N/C-Verhältnisses in einer Pflanze beeinflusst; Lawlor 2002 Journal of Experimental Botany, Band 53, Nr. 370, S. 773–787.
  • Das Enzym Aspartat-Aminotransferase (ASPAT) katalysiert katalysiert die reversible Transaminierung zwischen Aspartat und 2-Oxoglutarat unter Bildung von Glutamat und Oxaloacetat unter Einsatz von Pyridoxyl-5¢-phosphat (PLP) als essentiellen Cofaktor in einer Reaktion, die folgendermaßen ausgedrückt werden kann: L-Aspartat + 2-Oxoglutarat Oxaloacetat + L-Glutamat.
  • Das Enzym spielt bei allen Organismen eine Schlüsselrolle bei der metabolischen Regulation des Kohlenstoff- und des Stickstoffmetabolismus. Strukturell und funktionell ist die ASPAT bei allen Organismen konserviert. Bei den Eukaryonten spielt das Enzym beim Austausch der Kohlenstoff- und Stickstoff-Pools zwischen den subzellulären Kompartimenten eine Schlüsselrolle.
  • Die Aspartat-Aminotransferasen werden der Gruppe I der Aminotransferase-Überfamilie zugeordnet (Jensen und Gu. 1996). Außerdem wurden die Aspertat-Aminotransferasen in vier Untergruppen eingeteilt. Die Untergruppe Ia beinhaltet die ASPAT-Enzyme aus Eubakterien und Eukaryonten, während die Untergruppe Ib die Enzyme von gewissen Eubakterien einschließlich Cyanobakterien und Archaebakterien umfasst Eine neue Gruppe von ASPAT-Enzymen wurde von Be La Torre et la. 2006, Plant J. 2006, 46(3): 414–25 beschrieben.
  • Bei den Pflanzen wurden Gene identifiziert, die für ASPAT-Polypeptide codieren und bei denen ein Targeting an unterschiedliche subzelluläre Kompartimente erfolgt und die in den Mitochondrien, im Zytosol, im Peroxisomen und im Chloroplasten zu funktionellen ASPAT-Isoenzymen assembliert werden.
  • 2. ”MYB91-like transcription factor” (MYB91)
  • Bei den DNA-Bindungsproteinen handelt es sich um Proteine, die beliebige von vielen DNA-Bindungsdomänen umfassen und die so eine spezifische oder allgemeine Affinität für DNA aufweisen. Zu den DNA-Bindungsproteinen zählen zum Beispiel Transkriptionsfaktoren, die den Transkriptionsvorgang modulieren, Nukleasen, die DNA-Moleküle spalten, sowie Histone, die an der Verpackung der DNA im Zellkern beteiligt sind.
  • Die Transkriptionsfaktoren werden üblicherweise als Proteine mit einer sequenzspezifischen DNA-Bindungsaffinität, die fähig sind, die Transkription zu aktivieren und/oder zu reprimieren, definiert. Das Genom von Arabidopsis thaliana codiert für mindestens 1533 Transkriptionsregulatoren, die ~5,9% seiner geschätzten Gesamtgenzahl ausmachen (Riechmann et al. (2000) Science 290: 2105–2109). Die Database of Rice Transcription Factors (DRTF) ist eine Sammlung von bekannten und prognostizierten Transkriptionsfaktoren von Oryza sativa L. ssp. indica und Oryza sativa L. ssp. japonica und enthält derzeit 2.025 Genmodelle von mutmaßlichen Transkriptionsfaktoren (TF) bei indica und 2.384 bei japonica, die in 63 Familien eingeteilt wenden (Gao et al. (2006) Bioinformatics 2006, 22(10): 1286–7).
  • Bei einer dieser Familien handelt es sich um die MYB-Domänen-Transkriptionsfaktorfamilie, die durch eine hochkonservierte DNA-Bindungsdomäne, nämlich die MYB-Domäne, gekennzeichnet ist. Die MYB-Domäne wurde ursprünglich im Oncogen (v-myb) eines Avian Myeloblastosis Virus (Klempnauer et al. (1982) Cell 33, 453–63) beschrieben. Viele Wirbeltiere enthalten drei Gene, die mit v-Myb, c-Myb, A-Myb und B-Myb verwandt sind und andere ähnliche Gene sind bei Insekten, Pflanzen, Pilzen und Schleimpilzen identifiziert worden. Die codierten Proteine sind bei einer Vielzahl von Zelltypen wesentlich für die Kontrolle der Proliferation und Differenzierung. Die MYB-Proteine enthalten eine bis vier imperfekte direkte Wiederholungen einer konservierten Sequenz von 50-53 Aminosäuren, die für eine ”helix-turn-helix”-Struktur, die an der DNA-Bindung beteiligt ist, codiert (Rosinski und Atchley (1998) J. Mol. Evol. 46, 74–83). Für eine MYB-Sequenzwiederholung sind drei regelmäßig beabstandete Tryptophanreste, die in der dreidimensionalen ”helix-turn-helix”-Struktur ein Tryptophan-Cluster bilden, charakteristisch. Die drei Sequenzwiederholungen im c-Myb werden als R1, R2 und R3 bezeichnet, und Sequenzwiederholungen von anderen MYB-Proteinen werden entsprechend ihrer Ähnlichkeit zu R1, R2 bzw. R3 eingeteilt. Da außerhalb der MYB-Domäne nur eine beschränkte Sequenzkonservierung erfolgt, ist bei den MYB-Proteinen eine Cluster-Bildung zu Untergruppen aufgrund von außerhalb der MYB-Codierregion identifizierten konservierten Motiven erfolgt (Jiang et al. (2004) Genome Biology 5, R46).
  • AtMYB91 gehört zu der R2R3-MYB-Genfamilie (Li und Parish, Plant J. 8, 963–972, 1995), bei der es sich um eine große Genfamilie handelt (und bei der 126 Gene in Arabidopsis thaliana beschrieben wurden (Zimmermann et al., Plant J. 40, 22–34, 2004)). Mitglieder dieser Gruppe sind an verschiedenen Vorgängen beteiligt, darunter dem Sekundärmetabolismus, der Zellmorphogenese, der Regulation der Meristembildung, der Blüten- und Samenentwicklung, dem Zellzyklus, Abwehr- und Stressreaktionen, Licht- und Hormonsignalleitung (Chen et al., Cell Res. 16, 797–798, 2006). AtMYB91 wird auch ”AS1 asymmetric leaves 1” genannt und ist nahe mit den Polypeptiden PHAN Phantastica aus Antirrhinum und ROUGH SHEATH2 (RS2) aus dem Mais verwandt (Sun et al. (2002) Planta 214(5): 694–702), die alle eine evolutionär konservierte Rolle bei der Spezifizierung der Blattzellidentität, insbesondere der Dorsal-Ventral-Identität spielen. Bei Arabidopsis wird AS1 in Blattgründerzellen exprimiert, wo es als Heterodimer mit den strukturmäßig nicht verwandten AS2-Proteinen agiert, um die Aktivität von Genen der ”KNOTTED 1-like homeobox” (KNOX)-Genen zu reprimieren.
  • 3. Gibberellinsäurestimulierter Arabidopsis (GASA)
  • GASA(Gibberellic Acid-Stimulated Arabidopsis)-Proteine sind pflanzenspezifisch und werden während verschiedenen physiologischen Vorgängen exprimiert. Verschiedene GASA-artige Gene reagieren auf Hormone; die Expression des Tomatengens GAST1 des ersten Mitglieds der Familie, das charakterisiert wurde, wurde bei Behandlung von exogenem Gibberellin in einem gibberelindeffizienten Hintergrund induziert (Shi et al. Plant J. 2, 153–159, 1992). Ein verwandtes Tomatengen, nämlich RSI-1, weist eine hohe Sequenzidentität zu GAST1 auf und wird während der Seitenwurzelbildung aktiviert (Taylor und Scheuring, Mol. Gen. Genet 243, 148–157, 1994). GASA1 bis GASA4 aus Arabidopsis wurden erstmals aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu dem Tomaten GAST1 identifiziert (Herzog et al. Plant Mol. Biol. 27, 743–752, 1995). Die Expressionsdaten zeigten, dass GASA1 in Blütenknospen und unreifen Schoten akkumuliert wird, GASA2 und GASA3 in Schoten und trockenen Samen, und GASA4 in wachsenden Wurzeln und Blütenknospen. Von GASA4 wird berichtet, dass es in allen meristematischen Regionen exprimiert wird (Hubert et al., Plant Mol. Biol. 36, 871–883, 1998).
  • Funktionell sind die GASA-Proteine nicht gut charakterisiert. Es wird berichtet, dass die GASA-Proteine an Reaktionen auf Pathogene und bei der Pflanzenentwicklung beteiligt sind. Pflanzen, die GEG, ein GASA-Homolog aus Gerbera hybrida ektopisch exprimierten, wiesen verglichen mit dem Wildtyp kürzere Kronen mit einer verringerten Zelllänge auf, was anzeigt, dass GEG eine Rolle als Hemmer der Zellstreckung spielt. Die Überexpression von Arabidopsis-GASA4 führte zu Pflanzen mit erhöhtem Samengewicht (Roxrud et al., Plant Cell Physiol. 48, 471–483, 2007). Diese Pflanzen wiesen jedoch gelegentlich Veränderungen bezüglich der Meristemidentität auf, wobei eine Rückumwandlung von der Blütenmeristementwicklung zu der Entwicklung von normalen indeterminierten Influoreszenzen auftrat Weiterhin führte die modulierte GASA4-Expression zu einer deutlich verstärkten Verzweigung. Die Überexpression von Arabidopsis-GASA4 erhöhte auch die Toleranz gegenüber Hitzestress (Ko et al., Plant Physiol. Biochem. 45, 722–728, 2007).
  • 4. Auxin/Indolessigsäuregene (AUX/IAA)
  • Die AUX/IAA (Auxin/Indolessigsäure)-Gene codieren für eine Familie von Proteinen, deren Expression streng durch Auxin reguliert wird. Das Pflanzenhormon Auxin ist an verschiedenen Vorgängen wie Zellteilung, Zellstreckung und –differenzierung, Musterbildung bei Embryonen, dem Gefäßsystem und anderen Geweben, Regulation des Wachstums von primären und lateralen Wurzel- oder Sprossmeristemen beteiligt. Die AUX/IAA-Proteine werden weiterhin üblicherweise gewebespezifisch exprimiert.
  • Die AUX/IAA-Proteine weisen typischerweise vier konservierte Aminosäuresequenzmotive auf (Domäne I, II, III und IV) und verfügen über Zellkernlokalisierungs-Signalsequenzen. Von den Domänen I und II wird behauptet, dass sie das Protein destabilisieren und dass sie am Proteinumsatz beteiligt sein könnten. Von den Domänen III und IV wird behauptet, dass sie an Protein-Protein-Interaktionen beteiligt sind: Die AUX/IAA-Proteirie können Homodimere bilden und assoziieren bekanntermaßen mit ARF-Proteinen. Die AUX/IAA-ARF-Komplexe sind wahrscheinlich an der auxinvermittelten Genexpression beteiligt. Die AUX/IAA-Proteine sind negative Regulatoren der Auxinreaktionsfaktoren (ARF), die die Expression der auf Auxin reagierenden Gene regulieren. Die AUX/IAA-Proteine binden an die DNA-gebundenen ARF-Partnerproteine und reprimieren die ARF-Aktivität. Im auxinaktivierten Zustand werden die AUX/IAA-Proteine über Interaktionen mit dem auxinmodfizierten SCFTIR1-Komplex ubiquitiniert und anschließend durch Einwirkung des 26S-Proteasoms abgebaut. Eine Übersicht der Rollen und Aktivitäten der AUX/IAA-Proteine findet sich bei Reed (Trends in Plant Science 6, 420–425, 2001). Eine Struktur- und Expressionsanalyse der ”early auxinresponsive” AUX/IAA-Genfamilie beim Reis (Oryza sativa) wurde in jüngster Zeit von Jain et al. 2006 Funct. Integr. Genomics. 2006 Jan; 6(1): 47–59 beschrieben.
  • Bei IAA14 handelt es sich um ein AUX/IAA-Protein, das als Transkriptionsrepressor bei der Seitenwurzelbildung dient. Eine Funktionszuwachsmutation bei IAA14 blockiert die frühen Pericyclusteilungen, die die Seitenwurzelbildung initiieren (Fukaki et al., Plant J. 29, 153–168, 2002).
  • Kurze Darstellung der Erfindung
  • 1. Aspartat-Aminosäuretransferase (ASPAT)
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein ASPAT-Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit verbesserten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein ASPAT-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert.
  • 2. „MYB91-like transcription factor” (MYB91)
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Erhöhen der Expression einer für ein wie hier definiertes „MYB91-like transcription factor” (MYB91)-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in einer Pflanze Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für einen „MYB91-like transcription factor” (MYB91) wie hier definiert codierenden Nukleinsäuresequenz in einer Pflanze erhöht. Die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhter Pflanzenhöhe, erhöhtem Harvest Index (HI) und erhöhtem Tausendkorngewicht (TKW).
  • 3. „Gibberellic acid stimulated Arabidopsis” (GASA)
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein GASA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, erhält.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Steigern der ertragsbezogenen Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein GASA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert.
  • 4. Auxin/Indolessigsäuregene (AUX/IAA)
  • Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure Pflanzen mit verbesserten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere einem erhöhten Ertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, bei dem man die Expression einer für ein AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze moduliert, wobei die ertragsbezogenen Eigenschaften kein erhöhtes Wurzelwachstum umfassen.
  • Definitionen
  • Polypeptid(e)/Protein(e)
  • Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet und betreffen Aminosäuren in einer polymeren Form von beliebiger Länge, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
  • Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)(Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
  • Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül” werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden, in einer polymeren unverzweigten Form von beliebiger Länge.
  • Kontrollpflanze(n)
  • Die Auswahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein routinemäßiger Teil eines experimentellen Ansatzes und kann entsprechende Wildtyp-Pflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das Gen von Interesse einschließen. Die Kontrollpflanze stammt typischerweise aus der gleichen Pflanzenart oder sogar aus der gleichen Varietät wie die zu untersuchende Pflanze. Die Kontrollpflanze kann auch eine Nullizygote der zu untersuchenden Pflanze sein. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, einschließlich Samen und Samenteilen.
  • Homolog(e)
  • ”Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme, welche Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen im Vergleich
  • zum betreffenden unmodifizierten Protein aufweisen und eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind, besitzen.
  • Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
  • Eine Insertion bezieht sich darauf, dass ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorherbestimmte Stelle in einem Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Intra-Sequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren umfassen. Im Allgemeinen werden Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Resten, sein. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.
  • Eine Substitution bezieht sich auf die Ersetzung von Aminosäuren des Proteins mit anderen Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie etwa einer ähnlichen Hydrophobizität, Hydrophilizität, Antigenizität, Neigung zur Bildung oder Aufbrechung von α-Helixstrukturen oder β-Faltblattstrukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise an Einzelresten vorhanden, aber können abhängig von den funktionellen Erfordernissen, welche dem Polypeptid auferlegt sind, gehäuft vorliegen; Insertionen werden üblicherweise eine Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten aufweisen. Die Aminosäuresubstititionen sind vorzugsweise konservative Aminosäuresubstitutionen. Tabellen über konservative Substitution sind im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) sowie die nachstehende Tabelle 1). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen
    Rest Konservative Substitutionen Rest Konservative Substitutionen
    Ala Ser Leu Ile; Val
    Arg Lys Lys Arg; Gln
    Asn Gln; His Met Leu; Ile
    Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr
    Gln Asn Ser Thr; Gly
    Cys Ser Thr Ser; Val
    Glu Asp Trp Tyr
    Gly Pro Tyr Trp; Phe
    His Asn; Gln Val Ile; Leu
    Ile Leu, Val
  • Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen können mit Hilfe von auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Peptidsynthesetechniken, wie etwa der Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, leicht ausgeführt werden. Verfahren für die Manipulierung von DNA-Sequenzen zur Erzeugung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt Zum Beispiel sind Techniken zur Herstellung von Substitutiorismutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), QuickChange-ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige ortsgerichtete Mutagenese-Protokolle ein.
  • Derivate
  • ”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche im Vergleich zur Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie dem Protein von Interesse, Substitutionen von Aminosäuren mit nicht-natürlichen vorkommenden Aminosäureresten, oder Additionen von nicht-natürlich vorkommenden Aminosäureresten, umfassen können. ”Derivate” eines Proteins beinhalten außerdem Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche natürlich vorkommende, veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristoylierte, sulfatierte etc.) oder nicht-natürlich veränderte Aminosäurereste im Vergleich zu der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann außerdem eine oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder -Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, aus der es abgeleitet ist, wie zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Liganden, der kovalent oder nicht-kovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie etwa ein Reportermolekül, das gebunden ist, um ihren Nachweis zu erleichtern, sowie nicht-natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zur Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins, umfassen. Ferner zählen zu ”Derivaten” ebenfalls Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Übersichtsartikel über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
  • Ortholog(e)/Paralog(e)
  • Orthologe und Paraloge umfassen evolutionäre Konzepte, die zur Beschreibung der ancestralen Beziehungen von Genen zur Anwendung kommen. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Spezies, welche aus der Duplikation eines ancestralen Gens hervorgegangen sind; Orthologe sind Gene aus unterschiedlichen Organismen, welche durch Speziation hervorgegangen sind, und sind ebenfalls von einem gemeinsamen ancestralen Gen abgeleitet.
  • Domäne
  • Der Begriff ”Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen evolutionär verwandter Proteine konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen variieren können, deuten Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen hochkonserviert sind, auf Aminosäuren hin, die wahrscheinlich in der Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins wesentlich sind. Identifiziert durch das hohe Ausmaß ihrer Konservierung in alignierten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen können sie als Identifikatoren verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein beliebiges fragliches Potypeptid einer bereits identifizierten Polypeptidfamilie angehört.
  • Motiv/Consensus-Sequenz/Signatur
  • Der Begriff ”Motiv” oder ”Consensus-Sequenz” oder ”Signatur” bezieht sich auf eine kurze konservierte Region in der Sequenz von evolutionär verwandten Proteinen. Motive sind häufig hochkonservierte Teile von Domänen, aber können ebenfalls lediglich einen Teil der Domäne einschließen oder außerhalb einer konservierten Domäne liegen (wenn alle der Aminosäuren des Motives außerhalb einer definierten Domäne liegen).
  • Hybridisierung
  • Der Begriff ”Hybridisierung”, wie hierin definiert, ist ein Verfahren, in dem im Wesentlichen homologe komplementäre Nukleotidsequenzen miteinander annealen bzw. sich aneinander anlagern. Das Hybridisierungsverfahren kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Das Hybridisierungsverfahren kann ebenfalls stattfinden, wenn eine der komplementären Nukleinsäuren an eine Matrix, wie magnetische Beads, Sepharose-Beads oder ein beliebiges anderes Harz, immobilisiert ist. Das Hybridisierungsverfahren kann ferner stattfinden, wobei eine der komplementären Nukleinsäuren an einem festen Träger immobilisiert ist, wie etwa einer Nitrozellulose- oder Nylonmembran, oder z. B. durch Photolithographie beispielsweise an einem silikatischen Glasträger immobilisiert ist (wobei man letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder Mikroarrays oder als Nukleinsäure-Chips kennt). Um zu ermöglichen, dass eine Hybridisierung stattfindet, werden die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufzuschmelzen und/oder Haarnadeln oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen.
  • Der Begriff ”Stringenz” bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Stringenz einer Hybridisierung wird von Bedingungen, wie der Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und der Hybridisierungspuffer-Zusammensetzung, beeinflusst. Im Allgemeinen werden Niederstringenzbedingungen so gewählt, dass sie um etwa 30°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert sind. Mittlere Stringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 20°C unterhalb von Tm liegt, und Hochstringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 10°C unterhalb von Tm liegt. Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen werden in der Regel zum Isolieren von hybridisierenden Sequenzen angewandt, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweisen. Allerdings können Nukleinsäuren hinsichtlich der Sequenz abweichen und aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes immer noch ein im Wesentlichen identisches Polypeptid codieren. Deshalb können manchmal mittelstringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich sein, um derartige Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren.
  • Der Tm ist die Temperatur bei definierter Ionenstärke und pH, bei welcher 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Der Tm ist von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung sowie der Länge der Sonde abhängig. Zum Beispiel hybridisieren längere Sequenzen spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Rate der Hybridisierung wird bei etwa 16°C bis 32°C unter dem Tm erhalten. Das Vorhandensein von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung verringert die elektrostatische Abstoßung zwischen den zwei Nukleinsäure-Strängen, wodurch die Hybridbildung gefördert wird; dieser Effekt ist für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M sichtbar (für höhere Konzentrationen kann dieser Effekt vernachlässigt werden). Formamid senkt die Schmelztemperatur von DNA-DNA- und DNA-RNA-Doppelsträngen um 0,6 bis 0,7°C für jedes Prozent an Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid gestattet, dass die Hybridisierung bei 30 bis 45°C durchgeführt werden kann, obwohl die Rate bzw. Geschwindigkeit der Hybridisierung vermindert wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die thermische Stabilität der Duplices. Im Durchschnitt, und für große Sonden, sinkt der Tm um etwa 1°C je Prozent an Basenfehlpaarurig. Der Tm kann mit Hilfe der folgenden Gleichungen, abhängig von den Typen der Hybride, berechnet werden:
    • 1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): Tm = 81,5°C + 16,6xlog10[Na+]a + 0,41x%[G/Cb] – 500x[Lc]–1 – 0,61x% Formamid
    • 2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: Tm = 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58(%G/Cb) + 11,8 (%G/Cb)2 – 820/Lc
    • 3) Oligo-DNA- oder Oligo-RNAd-Hybride: Für < 20 Nukleotide: Tm = 2 (In) Für 20-35 Nukleotide: Tm = 22 + 1,46 (In)

    aoder für ein sonstiges einwertiges Kation, aber nur exakt im Bereich von 0,01–0,4 M.
    bnur exakt für %GC im Bereich von 30% bis 75%.
    cL = Länge des Duplex in Basenpaaren.
    dOligo, Oligonukleotid; In = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. v. G/C) + (Anz. v. A/T).
  • Nicht-spezifische Bindung kann unter Anwendung einer von vielen bekannten Techniken reguliert werden, wie zum Beispiel Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusetzungen von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nicht-homologe Sonden kann eine Serie von Hybridisierungen durchgeführt werden mittels Variieren von einem von (i) progressivem Senken der Annealing-Temperatur (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) progressivem Senken der Formamidkonzentration (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während einer Hybridisierung verändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung in der Regel auch von der Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten ab. Um den aus nicht-spezifischer Hybridisierung resultierenden Hintergrund zu entfernen, werden Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu den kritischen Faktoren bei derartigen Waschschritten zählen die Ionenstärke und Temperatur der letztendlichen Waschlösung: je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur, umso höher ist die Stringenz des Waschschritts. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unter der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, welches mindestens das Zweifache von demjenigen des Hintergrundes ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays oder Genamplifikations-Nachweisverfahren wie oben angegeben beschaffen. Auch können mehr oder weniger stringente Bedingungen gewählt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während des Waschens abgeändert wenden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Zum Beispiel umfassen typische Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1x SSC oder bei 42°C in 1x SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 65°C in 0,3x SSC. Beispiele von Mittelstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4x SSC oder bei 40°C in 6x SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 50°C in 2x SSC. Die Länge des Hybrids ist die vorhergesehene Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Wenn Nukleinsäuren von bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge bestimmt werden durch Alignieren der Sequenzen und Identifizieren der hierin beschriebenen konservierten Regionen. 1x SSC steht für 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und Waschlesungen kennen zusätzlich 5x Denhardt-Reagens, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,5% Natriumpyrophosphat, enthalten.
  • Für die Zwecke des Definierens der Höhe der Stringenz kann auf Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder auf Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 und jährliche Aktualisierungen) Bezug genommen werden.
  • Spleiß-Variante
  • Der Begriff ”Spleiß-Variante”, wie hierin verwendet, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in welchen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verschoben oder hinzugefügt worden sind, oder in welchen Introns verkürzt oder verlängert worden sind. Derartige Varianten werden solche sein, in denen die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleibt; dies kann durch selektives Beibehalten von funktionellen Segmenten des Proteins bewirkt werden. Derartige Spleiß-Varianten können in der Natur vorgefunden oder vom Menschen erzeugt sein. Verfahren zum Vorhersagen und Isolieren derartiger Spleiß-Varianten sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
  • Allelvariante
  • Allele oder Allelvarianten sind alternative Formen eines gegebenen Gens, welche an der gleichen chromosomalen Position lokalisiert sind. Allelvarianten umfassen Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), sowie ”kleine Insertions/Deletions-Polymorphismen” (INDELs). Die Große von INDELs beträgt in der Regel weniger als 100 bp. SNPs und INDELs bilden die größte Gruppe von Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
  • Gen-Shuffling/gerichtete Evolution
  • Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution besteht aus Iterationen des DNA-Shuffling, gefolgt von einem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Abschnitten davon zu erzeugen, welche Proteine mit einer modifizierten biologischen Aktivität codieren (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151–4; U.S.-Patente 5 811 238 und 6 395 547 ).
  • Regulatorisches Element/Steuerungssequenz/Promotor
  • Die Begriffe ”regulatorisches Element”, ”Steuerungssequenz” und ”Promotor” werden hierin alle austauschbar verwendet und beziehen sich, wobei sie in einem weiten Kontext zu verstehen sind, auf regulatorische Nukleinsäuresequenzen, die zum Bewirken der Expression der Sequenzen in der Lage sind, an welche sie ligiert sind. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäure-Steuerungssequenz, welche sich stromaufwärts vom transkriptionellen Start eines Gens befindet und welche an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verbundenen Nukleinsäure gesteuert wird. Bei den zuvor erwähnten Begriffen sind transkriptionelle regulatorische Sequenzen eingeschlossen, die aus einem klassischen eukaryontischen genomischen Gen abgeleitet sind (einschließend die TATA-Box, welche für eine exakte Transkriptionsinitiation erforderlich ist, mit oder ohne einer CCAAT-Box-Sequenz), sowie weitere regulatorische Elemente (d. h. ”Upstream-aktivierende Sequenzen”, ”Enhancer” und ”Silencer”), welche die Genexpression in Antwort auf entwicklungsmäßige und/oder externe Stimuli oder in einer gewebespezifischen Weise verändern. Ebenfalls innerhalb des Begriffs eingeschlossen ist eine transkriptionelle regulatorische Sequenz eines klassischen prokaryotischen Gens, wobei er in diesem Fall eine -35-Box-Sequenz und/oder transkriptionsregulierende -10-Box-Sequenzen einschließen kann. Der Begriff ”regulatorisches Element” beinhaltet außerdem ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, welches die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ herbeiführt, aktiviert oder steigert.
  • Ein ”Pflanzenpromotor” umfasst regulatorische Elemente, welche die Expression eines codierenden Sequenzsegments in Pflanzenzellen vermitteln. Folglich muss ein Pflanzenpromotor nicht von pflanzlichem Ursprung sein, sonder kann aus Viren oder Mikroorganismen stammen, beispielsweise aus Viren, welche Pflanzenzellen angreifen. Der ”Pflanzenpromotor” kann auch aus einer Pflanzenzelle stammen, z. B. aus der Pflanze, welche mit der Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden soll und hierin beschrieben ist. Dies gilt auch für andere regulatorische ”Pflanzen”-Signale, wie etwa ”pflanzliche” Termintoren. Die Promotoren stromaufwärts der Nukleotidsequenzen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -Insertion(en) und/oder -Deletion(en) modifiziert sein, ohne die Funktionalität oder Aktivität von entweder den Promotoren, dem offenen Leserahmen (ORF) oder der 3'-regulatorischen Region, wie Terminatoren oder sonstigen 3'-regulatorischen Regionen, welche sich entfernt vom ORF befinden, zu stören. Es ist ferner möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht wird, oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar Promotoren aus heterologen Organismen, ersetzt werden. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder diesen umfassen, welcher das Gen zum richtigen Zeitpunkt und beim erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
  • Für die Identifizierung von funktionell äquivalenten Promotoren können die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, zum Beispiel durch funktionsfähiges Verknüpfen des Promotors an ein Reportergen und Testen des Expressionsspiegels und -musters des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze. Zu geeigneten, allgemein bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase. Die Promotoraktivität wird durch Messen der enzymatischen Aktivität der Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase getestet. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit denjenigen eines Referenzpromotors verglichen werden (wie etwa jenem, der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren von mRNA-Spiegeln oder durch Vergleich von mRNA-Spiegeln der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Haushaltsgenen, wie etwa 18S-rRNA, geassayt werden, wobei im Fachgebiet bekannte Verfahren, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Held et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994) zur Anwendung kommen. Mit ”schwacher Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor bezeichnet, der die Expression einer codierenden Sequenz auf einem geringen Spiegel antreibt. Mit ”geringer Spiegel” werden Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis etwa 1/100000 Transkripte, bis etwa 1/5000000 Transkripten pro Zelle gemeint. Demgegenüber treibt ein ”starker Promotor” die Expression einer codierenden Sequenz bei einem hohen Niveau oder bei etwa 1/10 Transkripte bis etwa 1/100 Transkripte bis etwa 1/1000 Transkripte pro Zelle an. Mit ”mittelstarker Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor gemeint, der die Expression einer codierenden Sequenz bei einem niedrigeren Spiegel als ein starker Promotor antreibt, insbesondere bei einem Spiegel, welcher in allen Fällen unterhalb von demjenigen liegt, der unter der Steuerung eines 35S-CaMV-Promotors erhalten wird.
  • Funktionsfähig verbunden
  • Der Begriff ”funktionsfähig verbunden”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine funktionale Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem Gen von Interesse, so dass die Promotorsequenz in der Lage ist, die Transkription des Gens von Interesse zu initiieren.
  • Konstitutiver Promotor
  • Ein ”konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der während den meisten, aber nicht notwendigerweise allen, Phasen des Wachstums und der Entwicklung, sowie unter den meisten Umweltbedingungen, in mindestens einer/einem Zelle, Gewebe oder Organ transkriptionell aktiv ist. Die nachstehende Tabelle 2a gibt Beispiele von konstitutiven Promotoren an. Tabelle 2a: Beispiele von konstitutiven Promotoren
    Genquelle Literaturstelle
    Actin McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990
    HMGP WO 2004/070039
    CAMV 35S Odell et al., Nature, 313: 810–812, 1985
    CaMV 19S Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
    GOS2 de Pater et al., Plant J. Nov.; 2(6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
    Ubiquitin Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
    Reis-Cyclophilin Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25(5): 837–43, 1994
    Mais H3-Histon Lepetit et at., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
    Alfalfa H3-Histon Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
    Actin 2 An et al., Plant J. 10(1); 107–121, 1996
    34S FMV Sanger et al., Plant Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
    kleine Rubisco-Untereinheit US 4 962 028
    OCS Leisner (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
    SAD1 Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
    SAD2 Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
    nos Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831–7846
    V-ATPase WO 01/14572
    Super-Promotor WO 95/14098
    G-Box-Proteine WO 94/12015
  • Ubiquitärer Promotor
  • Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
  • Entwicklungsmäßig regulierter Promotor
  • Ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor ist während bestimmter Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, die entwicklungsbedingten Änderungen unterliegen, aktiv.
  • Induzierbarer Promotor
  • Ein induzierbarer Promotor zeigt induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation in Antwort auf eine Chemikalie (zur Übersicht siehe Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen umweltmäßigen oder physikalischen Stimulus, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt wird, oder ”pathogeninduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze der Exposition an verschiedene Pathogene ausgesetzt wird.
  • Organspezfischer/gewebespezifischer Promotor
  • Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein solcher, der fähig ist, die Transkription in bestimmten Organen oder Geweben präferentiell zu initiieren, wie etwa Blättern, Wurzeln, Samengewebe etc. Zum Beispiel ist ein ”wurzelspezifischer Promotor” ein Promotor, der vorwiegend in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Promotoren, die zum Initiieren der Transkription nur in bestimmten Zellen fähig sind, werden hierin als ”zellspezifisch” bezeichnet.
  • Beispiele wurzelspezifischer Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2b aufgeführt Tabelle 2b: Beispiele von wurzelspezifischen Promotoren
    Genquelle Literatur-Bezugsstelle
    RCc3 Plant Mol. Biol., Jan. 1995; 27(2): 237–48
    Arabidopsis PHT1 Kovama et al., 2005; Mudge et al. (2002, Plant J. 31: 341)
    Medicago-Phosphat-Transporter Xiao et al., 2006
    Arabidopsis Pyk10 Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346
    wurzelexprimierbare Gene Tingey et al., EMBO J. 6: 1, 1987.
    Tabakauxin-induzierbares Gen Van der Zaal et al., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.
    β-Tubulin Oppenheimer et al., Gene 63: 87, 1988.
    tabakwurzelspezifische Gene Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.
    B. napus G1-3b-Gen US-Patent Nr. 5 401 836
    SbPRP1 Suzuki et al., Plant Mol. Biol. 21: 109–119, 1993.
    LRX1 Baumberger et al. 2001, Genes & Dev. 15: 1128
    BTG-26 Brassica napus US 20050044585
    LeAMT1 (Tomate) Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
    LeNRT1-1 (Tomate) Lauter et al. (1996, PNAS 3: 8139)
    Klasse I Patatin-Gen (Kartoffel) Liu et al., Plant Mol. Biol. 153: 386–395, 1991.
    KDC1 (Daucus carota) Downey et al. (2000, J. Biol. Chem. 275: 39420)
    TobRB7-Gen W. Song (1997) Doktorarbeit, North Carolina State University, Raleigh, NC USA
    OsRAB5a (Reis) Wang et al. 2002, Plant Sci. 163: 273
    ALF5 (Arabidopsis) Diener et al. (2001, Plant Cell 13: 1625)
    NRT2;1Np (N. plumbaginifolia) Quesada et al. (1997, Plant Mol. Biol. 34: 265)
  • Ein samenspezifischer Promotor ist hauptsächlich in Samengewebe transkriptionell aktiv, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in Samengewebe (in Fällen von Leckexpression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Der samenspezifische Promotor kann Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch sein. Beispiele samenspezifischer Promotoren (Endosperm/Aleuron/Embryo-spezifisch) sind in Tabelle 2c bis Tabelle 2f nachstehend gezeigt. Weitere Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004) angegeben, wobei diese Offenbarung, als ob sie vollständig dargelegt ist, hierin durch den Bezug darauf einbezogen wird. Tabelle 2c: Beispiele von samenspezifischen Promotoren
    Genquelle Literaturstelle
    samenspezifische Gene Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
    Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;
    Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
    Paranuss-Albumin Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992.
    Legumin Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988.
    Glutelin (Reis) Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
    Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987.
    Zein Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32 1990
    napA Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996.
    Weizen-LMW- und HMW-Glutenin-1 Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
    Weizen-SPA Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
    Weizen, α-, β-, γ-Gliadine EMBO J. 3: 1409–15, 1984
    Gerste Itr1-Promotor Diaz et al., (1995) Mol. Gen. Genet 248(5): 592–8
    Gerste B1, C, D-Hordein Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet 250: 750–60, 1996
    Gerste DOF Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
    blz2 EP99106056.7
    synthetischer Promotor Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998.
    Reis Prolamin NRP33 Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
    Reis α-Globulin Glb-1 Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
    Reis OSH1 Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
    Reis α-Globulin REB/OHP-1 Nakase et al., Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
    Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase Trans. Res. 6: 157–68, 1997
    Mais ESR-Genfamilie Plant J. 12: 235–46, 1997
    Sorghum α-Kafirin DeRose et al., Plant Mol. Biol 32: 1029–35, 1996
    KNOX Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
    Reis-Oleosin Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998
    Sonnenblumen-Oleosin Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
    PRO0117, putatives Reis 40S ribosomales Protein WO 2004/070039
    PRO0136, Reis Alanin-Aminotransferase unveröffentlicht
    PRO0147, Trypsininhibitor ITR1 (Gerste) unveröffentlicht
    PRO0151, Reis WSI18 WO 2004/070039
    PRO0175, Reis RAB21 WO 2004/070039
    PRO005 WO 2004/070039
    PRO0095 WO 2004/070039
    α-Amylase (Amy32b) Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
    Cathepsin β-like Gen Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
    Gerste-Ltp2 Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
    Chi26 Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
    Mais B-Peru elinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998
    Tabelle 2d: Beispiele von endospermspezifischen Promotoren
    Genquelle Literaturstelle
    Glutelin (Reis) Takaiwa et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 208: 15–22; Takaiwa et al. (1987) FERS Letts. 221: 43–47
    Zein Matzke et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 323–32
    Weizen LMW- und HMW-Glutenin-1 Colot et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, Anderson et al. (1989) NAR 17: 461–2
    Weizen SPA Albani et al. (1997) Plant Cell 9: 171–184
    Weizen Gliadine Rafalski et al. (1984) EMBO 3: 1409–15
    Gerste Itr1-Promotor Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
    Gerste B1, C, D, Hordein Cho et al. (1999) Theor. Appl. Genet. 98: 1253–62; Muller et al. (1993) Plant J. 4: 343–55; Sorenson et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 250: 750–60
    Gerste DOF Mena et al., (1998) Plant J. 116(1): 53–62
    blz2 Onate et al. (1999) J. Biol. Chem. 274(14): 9175–82
    synthetischer Promotor Vicente-Carbajosa et al. (1998) Plant J. 13: 629–640
    Reis Prolamin NRP33 Wu et al., (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
    Reis Globulin Glb-1 Wu et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39(8) 885–889
    Reis Globulin REB/OHP-1 Nakase et al. (1997) Plant Molec. Biol. 33: 513–522
    Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase Russell et al. (1997) Trans. Res. 6: 157–68
    Mais ESR-Genfamilie Opsahl-Ferstad et al. (1997) Plant J. 12: 235–46
    Sorghum Kafirin DeRose et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 1029–35
    Tabelle 2e: Beispiele von embryospezifischen Promotoren:
    Genquelle Literaturstelle
    Reis-OSH1 Sato et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
    KNOX Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
    PRO0151 WO 2004/070039
    PRO0175 WO 2004/070039
    PRO005 WO 2004/070039
    PRO0095 WO 2004/070039
    Tabelle 2f: Beispiele von aleuronspezifischen Promotoren:
    Genquelle Literaturstelle
    o-Amylase (Amy32b) Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
    Cathepsin β-like Gen Cejudo et al., Plant Mol. 8101. 20: 849–856, 1992
    Gerste-Ltp2 Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
    Chi26 Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
    Mais B-Peru Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998
  • Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie hierin definiert, ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird.
  • Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2g gezeigt. Tabelle 2g: Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren
    Gen Expression Literaturstelle
    Mais, Orthophosphat-Dikinase blattspezifisch Fukavama et al., 2001
    Mais, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase blattspezifisch Kausch et al., 2001
    Reis, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase blattspezifisch Liu et al., 2003
    Reis, kleine Rubisco-Untereinheit blattspezifisch Nomura et al., 2000
    Reis, beta-Expansin EXBP9 sprossspezifisch WO 2004/070039
    Straucherbse, kleine Rubisco-Untereinheit blattspezifisch Panguluri et al., 2005
    Erbse RBCS3A blattspezifisch
  • Ein weiteres Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist ein meristemspezifischer Promotor, der vorwiegend in meristematischem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine gewisse Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Beispiele von für grünes Meristem spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2h gezeigt. Tabelle 2h: Beispiele von meristemspezifischen Promotoren
    Genquelle Expressionsmuster Literaturstelle
    Reis-OSH1 Spross-Apikalmeristem, vom globulären Embryostadium bis zum Keimlingsstadium Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
    Reis-Metallothionein meristemspezifisch BAD87835.1
    WAK1 & WAK 2 Spross- und Wurzel-Apikalmeristeme, und in expandierenden Blättern und Kelchblättern Wagner & Kohom (2001) Plant Cell 13(2): 303–318
  • Terminator
  • Der Begriff ”Terminator” beinhaltet eine Steuerungssequenz, welche eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit ist, welche die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines Primärtranskripts und die Termination der Transkription signalisiert Der Terminator kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel aus den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Genen oder atternativ aus einem anderen Pflanzengen oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen anderen eukaryontischen Gen abgeleitet sein.
  • Modulierung
  • Der Begriff ”Modulierung” bedeutet in Bezug auf Expression oder Genexpression ein Verfahren, in welchem der Expressionsspiegel durch die Genexpression im Vergleich zur Kontrollpflanze verändert wird, wobei der Expressionsspiegel erhöht oder verringert werden kann. Die ursprüngliche, nicht modulierte Expression kann jede Art von Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation sein. Der Begriff ”Modulieren der Aktivität” soll jedwede Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder codierten Proteine bedeuten, welche zu einem erhöhten Ertrag und/oder erhöhten Wachstum der Pflanzen führt.
  • Expression
  • Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet insbesondere die Transkription von einem Gen oder Genen oder einem genetischen Konstrukt zu struktureller RNA (rRNA, tRNA) oder zu mRNA mit oder ohne anschließende Translation der letzteren in ein Protein. Das Verfahren beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des resultierenden mRNA-Produkts.
  • Erhöhte Expression/Überexpression
  • Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie hierin verwendet, bedeutet eine beliebige Form von Expression, welche zusätzlich zum ursprünglichen Wildtyp-Expressionsspiegel erfolgt.
  • Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert und beinhalten zum Beispiel die durch geeignete Promotoren angetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancem oder von Translations-Enhancem. Isolierte Nukleinsäuren, welche als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (typischerweise stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, welche das Polypeptid von Interesse codiert, hochreguliert wird. Beispielsweise können endogene Promotoren in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution verändert werden (siehe Kmiec, US 5 565 350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der richtigen Orientierung und im richtigen Abstand zu einem Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
  • Wenn eine Polypeptidexpression gewünscht wird, ist es im Allgemeinen wünschenswert, eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer codierenden Polynukleotidregion einzuschließen. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Die 3'-End-Sequenz, welche hinzugefügt werden soll, kann zum Beispiel aus den Genen für Nopalin-Synthase oder Octopin-Synthase oder atternativ dazu aus einem anderen Pflanzengen, oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen sonstigen eukaryoritischen Gen abgeleitet sein.
  • Auch eine Intronsequenz kann an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder die codierende Sequenz der partiellen codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert Der Einschluss eines spleißbaren Introns in der Transkriptionseinheit sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Expressionskonstrukten erhöht gezeigtermaßen die Genexpression sowohl auf der mRNA- als auch der Protein-Ebene bis zu 1000-fach (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395–4405; Kallis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183–1200). Eine derartige Intron-Verstärkung der Genexpression ist typischerweise am größten bei Platzierung nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1, 2 und 6, sowie des Bronze-1-Introns sind im Fachgebiet bekannt. Für allgemeine Informationen siehe: The Maize Handbock, Kapitel 116, Hrsg.: Freeling und Walbot, Springer, N.Y. (1994).
  • Endogenes Gen
  • Die Bezugnahme hierin auf ein ”endogenes” Gen bezieht sich nicht nur auf das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form (d. h. ohne dass irgendein menschlicher Eingriff stattgefunden hat) vorgefunden wird, sondern bezieht sich außerdem auf das gleiche Gen (oder ein(e) im Wesentlichen homologe(s) Nukleinsäure/Gen) in einer isolierten Form, welches anschließend in eine Pflanze (wieder)eingeführt wird (ein Transgen). Zum Beispiel kann eine transgene Pflanze, die ein derartiges Transgen enthält, eine erhebliche Reduktion der Transgen-Expression und/oder eine erhebliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert wenden oder vom Menschen, zum Beispiel durch chemische Synthese, erzeugt werden.
  • Verringerte Expression
  • Eine Bezugnahme hierin auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” von Expression wird verwendet, um eine Verringerung der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptidspiegel und/oder der Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen zu bezeichnen. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung beträgt, mit zunehmender Präferenz, mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Verringerung im Vergleich zu derjenigen von Kontrollpflanzen. Verfahren für die Verringerung der Expression sind im Fachgebiet bekannt, und der Fachmann auf dem Gebiet wird ohne weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
  • Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze wird eine ausreichende Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz benötigt Um ein ”Gensilencing” durchzuführen, kann diese so gering wie 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide sein, wobei sie alternativ so groß sein kann, wie das gesamte Gen (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder zum Teil oder insgesamt). Die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden kann aus der Nukleinsäure, welche das Protein von Interesse codiert (Zielgen), oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist, abgeleitet sein. Vorzugsweise ist die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden in der Lage, Wasserstoffbrücken mit dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang) zu bilden, und weiter bevorzugt besitzt die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, mit zunehmender Präferenz, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zum Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, welche ein (funktionales) Polypeptid codiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen hierin erörterten Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
  • Beispiele von verschiedenen Verfahren zur Verringerung oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze, oder zur Verminderung der Spiegel und/oder Aktivität eines Proteins, sind dem Fachmann bekannt. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
  • Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann unter Anwendung von routinemäßigen Hilfsmitteln und Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder substantielle Eliminierung von endogener Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, eines genetischen Konstrukts, in welches die Nukleinsäure (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von einem beliebigen Protein von Interesse in der Lage ist) als ein invertierter Repeat (teilweise oder vollständig), getrennt durch einen Spacer bzw. Abstandhalter (nicht-codierende DNA), einkloniert ist.
  • In einem derartigen bevorzugten Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im Wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines ”Inverted Repeat” einer Nukleinsäure oder eines Teils davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur fähig ist. Der ”Inverted Repeat” wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Steuerungssequenzen umfasst Eine nicht-codierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Abstandhalter, zum Beispiel ein Matrix-Anheftungs-Region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker etc.) ist zwischen den zwei invertierten Nukleinsäuren, welche den ”Inverted Repeat” bilden, befindlich. Nach der Transkription des ”Inverted Repeat” wird eine chimäre RNA mit einer selbst-komplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als die Haarnadel-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, welche in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut wenden. Der RISC spaltet die mRNA-Transkripte weiter, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die zu Polypeptiden translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Für weitere allgemeine Einzelheiten, siehe zum Beispiel Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ).
  • Die Ausführung der Verfahren der Erfindung beruht nicht auf dem Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem genetischen Konstrukt, in welches die Nukleinsäure als ein ”Inverted Repeat” einkloniert ist, sondern es können ein oder mehrere beliebige von einigen, allgemein bekannten ”Gen-Silencing”-Verfahren zur Anwendung kommen, um die gleichen Effekte zu erzielen.
  • Ein derartiges Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing von Genexpression (Herunterregulieren). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze von einer doppelsträngigen RNA-Sequenz (dsRNA) ausgelöst, welche im Wesentlichen ähnlich zum endogenen Zielgen ist Diese dsRNA wird von der Pflanze zu etwa 20 bis etwa 26 Nukleotiden weiterprozessiert, welche als kurze interferierende RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, welcher das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
  • Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense-Orientierung” bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche homolog zu einem mRNA-Transkript davon ist. Deswegen wird man in eine Pflanze mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz einführen. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens verringern, was zur Entstehung eines Phänomens führt, welches als Co-Suppression bekannt ist Die Reduktion der Genexpression wird noch erheblicher sein, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und der Auslösung von Co-Suppression besteht.
  • Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein codiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem endogenen Gen, welches stumm gemacht bzw. gesilenct werden soll. Die Komplementarität kann in der ”codierenden Region” und/oder in der ”nicht-codierenden Region” eines Gens lokalisiert sein. Der Begriff ”codierende Region” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff ”nicht-codierende Region” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die codierende Region flankieren und welche transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (ebenfalls bezeichnet als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen).
  • Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß den Regeln der Watson-und-Crick-Basenpaarung entworfen werden. Die Antiserse-Nukleinsäuresequenz kann zur gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) komplementär sein, aber kann ebenfalls ein Oligonukleotid sein, welches den Antisense zu lediglich einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der 5'- und 3'-UTR der mRNA) darstellt Zum Beispiel kann die Antisense-Oligonukleotidsequenz komplementär zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid codiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotidsequenz ist im Fachgebiet bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kann unter Anwendung von chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedenartig modifizierte Nukleotide verwendet werden, entworfen zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildeten Duplex, wobei z. B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden kbrinen. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwendet werden kbnnen, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Zyklisierung und 'Caps' sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, wie etwa Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
  • Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in welchen eine Nukleinsäuresequenz in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h., die von der insertierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird bezüglich einer Zielnukleinsäure von Interesse eine Antisense-Orientierung aufweisen). Vorzugsweise findet die Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäurekonstrukts statt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verbundenes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
  • Die zum Silencing in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküle (ob in eine Pflanze eingeführt oder in situ erzeugt) hybridisieren oder binden an, für ein Polypeptid codierende genomische DNA und/oder mRNA-Transkripte, um dadurch die Expression des Proteins zu inhibieren, z. B. durch Inhibieren von Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex erfolgen, oder, zum Beispiel im Fall einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, welche an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer spezifischen Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ dazu können Antisense-Nukleinsäuresequenzen modifiziert sein, um ausgewählte Zellen anzuzielen, und dann systemisch verabreicht wenden. Für die systemische Verabreichung können Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, welche an Zelloberflächen-Rezeptoren oder -Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen zugeführt werden.
  • Gemäß eines weiteren Aspekts ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann außerdem ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nuci. Ac. Res. 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FERS Lett. 215, 327–330) umfassen.
  • Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung von endogener Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen durchgeführt werden. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, wie einer mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, in der Lage sind. Somit können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme; beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) verwendet werden, um ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, wodurch die Anzahl an mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden können, wesentlich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entworfen werden (siehe zum Beispiel: Cech et al., US-Patent Nr. 4 987 071 ; und Cech et al., US-Patent Nr. 5116742 ). Alternativ dazu können mRNA-Transkripte, welche einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivitat aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist auf dem Fachgebiet bekannt (z. B., Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 , und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
  • Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden.
  • Gen-Silencing kann auch auftreten, wenn eine Mutation auf einem endogenen Gen und/oder eine Mutation auf einem/einer isolierten Gen/Nukleinsäure, welche(s) anschließend in eine Pflanze eingebracht wird, vorhanden ist. Die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzung(en) können daher ein Polypeptid vorsehen, das noch zum Binden an interagierende Proteine (wie etwa Rezeptorproteine) in der Lage ist, aber seine normale Funktion nicht aufzeigen kann (wie etwa Signalleitungs-Ligand).
  • Ein weiteres Vorgehen für das Gen-Silencing besteht im Ziellenken von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens (z. B. dem Promotor und/oder Enhancern) komplementär sind, wodurch tripelhelikale Strukturen gebildet werden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27–36, 1992; und Maher, L. J., Bioassays 14, 807–15, 1992.
  • Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zum Inhibieren von dessen Funktion in planta oder zum Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Insbesondere mag es in Betracht gezogen werden, dass vom Menschen geschaffene Moleküle zum Inhibieren der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder zur Störung des Signalleitungsweges, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
  • Alternativ dazu kann ein Screening-Programm angesetzt werden, um natürliche Varianten eines Gens in einer Pflanzenpopulation zu identifizieren, wobei die Varianten Polypeptide mit verringerter Aktivität codieren. Solche natürlichen Varianten können beispielsweise auch zur Ausführung von homologer Rekombination angewandt werden.
  • Künstliche und/oder natürliche MicroRNAs (miRNAs) können verwendet wenden, um Genexpression und/oder mRNA-Translation auszuknocken. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19-24 Nukleotiden. Sie funktionieren vorwiegend zum Regulieren der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen MicroRNAs (miRNAs) weisen eine perfekte oder beinahe perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Allerdings gibt es natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Sie werden aus längeren nicht-codierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch Doppelstrang-spezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Nach der Prozessierung werden sie in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) durch Binden an dessen Hauptkomponente, ein Argonaute-Protein, eingebaut. MiRNAs dienen als die Spezifitätskomponenten des RISC, da sie mit Zielnukleinsäuren, vorwiegend mRNAs, im Cytoplasma eine Basenpaarung eingehen. Anschließende regulatorische Events beinhalten die Ziel-mRNA-Spaltung und -Zerstörung und/oder die Translationsinhibition. Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich deshalb häufig in verringerten mRNA-Spiegeln von Zielgenen.
  • Artifizielle MikroRNAs (amiRNAs), welche typischerweise eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, können in spezifischer Weise gentechnisch erzeugt werden, um die Genexpression von einzelnen oder mehreren Genen von Interesse negativ zu regulieren. Determinanten der Pflanzen-MikroRNA-Zielauswahl sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können angewandt werden, um beim Entwurf von spezifischen amiRNAs zu helfen (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005).
  • Zweckdienliche Hilfsmittel für den Entwurf und die Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorläufern sind ebenfalls öffentlich verfügbar (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
  • Für eine optimale Leistung erfordern die Gen-Silencing-Techniken, die zum Reduzieren der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze angewandt werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotyledonen Pflanzen für die Transformation monokotyledoner Pflanzen, und aus dikotyledonen Pflanzen für die Transformation dikotyledoner Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer beliebigen gegebenen Pflanzenspezies in diese selbe Spezies eingebracht. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Allerdings ist es kein absolutes Erfordernis, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz aus derselben Pflanzenspezies stammt, wie die Pflanze, in welche sie eingeführt wird. Es ist ausreichend, dass eine wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäure besteht.
  • Beispiele verschiedener Verfahren für die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze sind oben beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne weiteres in der Lage sein, die oben genannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch Verwenden eines geeigneten Promotors.
  • Selektierbares Marker(gen)/Reportergen
  • Unter ”selektierbarer Marker”, ”selektierbares Markergen” oder ”Reportergen” ist ein beliebiges Gen eingeschlossen, welches einen Phänotyp an eine Zelle vermittelt, in der es exprimiert wird, so dass die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen erleichtert wird, die mit einem Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung transfiziert oder transformiert sind. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuremqoleküle durch eine Reihe unterschiedlicher Prinzipien. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, welche Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz vermitteln, welche eine neue metabolische Eigenschaft einbringen oder welche eine visuelle Selektion zulassen. Zu Beispielen von selektierbaren Markergenen zählen Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie etwa nptll, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, welche Resistenz zum Beispiel gegen Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin vermitteln) sowie gegen Herbizide vermitteln (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta® vermittelt; aroA oder gox, welche Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, welche zum Beispiel Resistenz gegen Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sutfonylharnstoff vermitteln), oder Gene, die ein metabolisches Merkmal bereitstellen (wie etwa manA, das Pflanzen gestattet, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, oder Xylose-Isomerase für die Verwertung von Xylose, oder antinutritive Marker, wie die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Erzeugung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit seinen gefärbten Substraten, beispielsweise X-Gal), Lumineszenz (wie etwa das Luciferin/Luciferase-System) oder Fluoreszenz (Grün-fluoreszierendes Protein, GFP, und Derivate davon). Diese Liste repräsentiert nur eine kleine Anzahl von möglichen Marker. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit derartigen Marker vertraut. Es werden, abhängig von dem Organismus und dem Selektionsverfahren, unterschiedliche Marker bevorzugt.
  • Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeteten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie denjenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktional sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die für einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene kennen aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind im Fachgebiet bekannt, verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt 'Definitionen' beschrieben.
  • Da die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich oder unerwünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, wendet das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuren in vorteilhafter Weise Techniken an, welche die Entfernung oder Exzision dieser Markergene ermöglichen. Ein derartiges Verfahren ist die sogenannte Co-Transformation. Das Co-Transfomations-Verfahren verwendet zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und ein zweiter die Markergen(e) trägt. Ein großer Anteil an Transformanten empfängt oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Im Fall der Transformation mit Agrobakterien empfangen die Transformanten in der Regel nur einen Teil des Vektors, d. h. die von der T-DNA flankierte Sequenz, welche üblicherweise die Expressionskassette repräsentiert. Die Markergene können anschließend durch Ausführen von Kreuzungen aus der transformierten Pflanze entfernt werden. In einem anderen Verfahren werden in ein Transposon integrierte Markergene für die Transformation gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (bekannt als Ac/Ds-Technologie). Die Transformanen können mit einer Transposase-Quelle gekreuzt werden, oder die Transformanen werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt, welches die Expression einer Transposase vermittelt, transient oder stabil transformiert. In einigen Fällen (ungefähr 10%), springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle heraus, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen durch Ausführen von Kreuzungen elimiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, welche das Detektieren derartiger Events ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen; deren Vorteil besteht darin, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieses Typs ist das sogenannte Cre/Iox-System. Cre1 ist eine Rekombinase, welche die zwischen den IoxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Wenn das Markergen zwischen den IoxP-Sequenzen integriert ist, wird es entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und zwar durch die Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Selbstverständlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewandt werden.
  • Transgenisch/Transgen/Rekombinant
  • Für die Zwecke der Erfindung bedeuten ”transgenisch”, ”Transgen” oder ”rekombinant”, zum Beispiel in Hinsicht auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, der die Nukleinsäuresequenz umfasst, oder einen Organismus, der mit den Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren gemäß der Erfindung transformiert ist, alle diejenigen Konstruktionen, die durch rekombinante Verfahren bewerkstelligt werden, in welchen entweder
    • (a) die Nukleinsäuresequenzen, die in den Verfahren der Erfindung nützliche Proteine codieren, oder
    • (b) genetische Steuerungssequenz(en), welche funktionsfähig mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verknüpft sind, wie beispielsweise ein Promotor, oder
    • (c) a) und b),
    nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung lokalisiert sind oder durch rekombinante Verfahren modifiziert worden sind, wobei es möglich ist, dass die Modifikation zum Beispiel die Form einer Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotidresten annimmt. Es versteht sich, dass mit der natürlichen genetischen Umgebung der natürliche genomische oder chromosomale Locus bzw. Genort in der Ursprungspflanze oder das Vorhandensein in einer genomischen Bibliothek gemeint ist. Im Falle einer genomischen Bibliothek wird die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest teilweise beibehalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz mindestens auf einer Seite und besitzt eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, vorzugsweise mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der Nukleinsäuresequenzen mit der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, welche ein in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliches Polypeptid codiert, wie oben definiert – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese Expressionskassette durch nicht-natürliche, synthetische (”künstliche”) Verfahren, wie zum Beispiel mutagene Behandlung, modifiziert wird. Geeignete Verfahren sind zum Beispiel in US 5 565 350 oder WO 00/15815 beschrieben.
  • Es versteht sich daher, dass mit einer transgenen Pflanze für die Absichten der Erfindung, wie oben, gemeint ist, dass die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Genort im Genom der Pflanze vorliegen, wobei es möglich ist, dass die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Wie erwähnt, bedeutet ”transgen” jedoch ebenfalls, dass, obwohl die erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren an ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz im Vergleich zur natürlichen Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Es versteht sich, dass ”transgen” vorzugsweise die Expression der Nukleinsäuren gemäß der Erfindung an einem unnatürlichen Genort im Genom, d. h. homolog, bedeutet, oder dass vorzugsweise eine heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen sind hierin erwähnt.
  • Transformation
  • Der Begriff ”Einbringung” oder ”Transformation”, wie hierin darauf Bezug genommen wird, beinhaltet den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des für den Transfer angewandten Verfahrens. Pflanzengewebe, das zur anschließenden klonalen Vermehrung in der Lage ist, ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem genetischen Konstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert, und eine gesamte Pflanze daraus regeneriert werden. Das gewählte, jeweilige Gewebe wird abhängig von den klonalen Propagationssystemen variieren, welche für die zu transformierende jeweilige Spezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele schließen Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallusgewebe, existierendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonmeristem und Hypokotylmeristem) ein. Das Polynukleotid kann transient oder stabil in eine Wirtszelle eingebracht und kann nicht-integriert, zum Beispiel als ein Plasmid, beibehalten werden. Alternativ dazu kann es in das Wirtsgenom integriert werden. Die resultierende, transformierte Pflanzenzelle kann dann zum Regenerieren einer transformierten Pflanze auf eine Weise, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, verwendet werden.
  • Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenspezies ist heutezutage eine durchaus routinemäßige Technik. In vorteilhafter Weise kann ein beliebiges von mehreren Transformationsverfahren angewandt werden, um das Gen von Interesse in eine geeignete Vorfahrenzelle einzubringen. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren können für transiente oder für stabile Transformationen angewandt wenden. Transformationsverfahren beinhalten die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme freier DNA erhöhen, direkte Injektion der DNA in die Pflanze, Beschuss mit einer Partikelkanone, Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen sowie Mikroprojektion. Man kann Verfahren auswählen unter dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72–74; Negrutiu, I., et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 363–373); der Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al. (1985) Bio/Technol. 3, 1099–1102); der Mikroinjektion in Pflanzenmaterial hinein (Crossway, A., et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); dem Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Teilchen (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), der Infektion mit (nicht-integrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, einschließlich transgener Nutzpflanzen, werden vorzugsweise durch Agrobacterium-vermittelte Transformation hergestellt. Ein vorteilhaftes Transformationsverfahren ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck ist es zum Beispiel möglich, den Agrobakterien zu gestatten, auf Pflanzensamen einzuwirken, oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien zu inokulieren. Es hat sich gemäß der Erfindung als besonders zweckmäßig erwiesen zu gestatten, dass eine Suspension transformierter Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest auf die Blütenanlagen einwirkt Die Pflanze wird anschließend weiter wachsen gelassen, bis die Samen der behandelten Pflanze erhalten werden (Clough und Bent, Plant J. (1998) 16, 735–743). Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis schließen allgemein bekannte Verfahren für die Reistransformation ein, wie etwa diejenigen, welche in einem beliebigen von Folgendem beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Plants 199: 612–617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), wobei diese Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargelegt wären. Im Falle von Mais-Transformation ist das bevorzugte Verfahren beschaffen, wie entweder in Ishida et al. (Nat Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Die Verfahren sind beispielsweise ferner in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128–143, sowie in Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die Nukleinsäuren oder das Konstrukt, welche(s) exprimiert werden sollen, wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der zum Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie etwa Pflanzen, welche als Modell herangezogen werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung nicht als Nutzpflanze betrachtet) oder Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, beispielsweise durch Eintauchen von zerquetschten Blättern oder zerhackten Blätternm in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877, beschrieben oder ist unter anderem aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38, bekannt.
  • Zusätzlich zur Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu intakten Pflanzen regeneriert wenden müssen, ist es ebenfalls möglich, die Zellen von Pflanzenmeristemen und insbesondere diejenigen Zellen, welche sich zu Gameten entwickeln, zu transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung, wodurch es zur Entstehung transgener Pflanzen kommt So werden beispielsweise Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und Samen werden aus den sich entwickelnden Pflanzen erhalten, von denen ein gewisser Anteil transformiert und somit transgen ist [Feldman, KA, und Marks, MD (1987). Mol. Gen Genet 208: 274–289; Feldmann, K., (1992). In: C. Koncz, N-H. Chua und J. Shell (Hrsg.), Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274289]. Alternative Verfahren basieren auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Schnittstelle im Zentrum der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch in ähnlicher Weise transformierte Samen zu einem späteren Zeitpunkt erhalten wenden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen Genet., 245: 363–370). Ein besonders effektives Verfahren ist jedoch das Vakuuminfiltrationsverfahren mit seinen Modifikationen, wie dem ”floral dip”-Verfahren. Im Falle von Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N. (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], wohingegen im Fall des ”floral dip”-Verfahrens das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer tensidbehandetten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ, und Bent, AF (1998) The Plant J. 16, 735–743]. In beiden Fällen wird ein gewisser Anteil an transgenen Samen geerntet, und diese Samen können von nicht-transgenen Samen durch Kultivieren unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen unterschieden werden. Darüber hinaus besitzt die stabile Transformation von Plastiden Vorteile, weil Plastiden in den meisten Nutzpflanzen matemal vererbt werden, was das Risiko eines Transgen-Flusses durch Pollen verringert oder eliminiert. Die Transformation des Chloroplastengenoms wird im Allgemeinen durch ein Verfahren bewirkt, das in Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] schematisch geschildert worden ist. Kurz gesagt, werden die zu transformierenden Sequenzen zusammen mit einem selektierbaren Markergen zwischen flankierende Sequenzen, die homolog zum Chloroplastengenom sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen lenken die ortsspezifische Integration in das Plastom. Plastidale Transformation ist für viele verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden, und eine Übersicht erhält man in Bock (2001) "Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology". J. Mol. Biol., 21. Sep. 2001; 312 (3): 425–38, oder Maliga, P. (2003) "Progress towards commercialization of plastid transformation technology". Trends Biotechnol. 21, 20–28. In jüngster Zeit ist über einen weiteren biotechnologischen Fortschritt in Form von markerfreien Plastidentransformanten, welche mittels eines transienten, cointegrierten Markergens hergestellt werden können, berichtet worden (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
  • T-DNA-Aktivierungs-Tagging
  • T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, üblicherweise enthaltend einen Promotor (es kann sich auch um einen Translations-Enhancer oder einen Intron handeln), in die genomische Region des Gens von Interesse oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der codierenden Region eines Gens in einer derartigen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Typischerweise wird die Regulierung der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor gestört, und das Gen kommt unter die Kontrolle des neu eingebrachten Promotors. Der Promotor ist typischerweise in einer T-DNA eingebettet Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom insertiert, zum Beispiel durch Agrobacterium-Infektion, und führt zur modifizierten Expression von Genen nahe der insertierten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression von Genen nahe dem eingebrachten Promotor.
  • TILLING
  • Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die zum Erzeugen und/oder Identifizieren von Nukleinsäuren nützlich ist, welche Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität codieren. TILLING erlaubt auch die Selektion von Pflanzen, welche derartige Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufzeigen, entweder hinsichtlich Stärke oder Lokalisierung oder Zeitgebung (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufzeigen, als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. TILLING vereinigt Hochdichte-Mutagenese mit Hochdurchsatz-Screeningverfahren. Die beim TILLING typischerweise befolgten Schritte sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei, GP, und Koncz, C (1992), in: Methods in Arabidopsis Research, Koncz, C, Chua, NH, Schell, J (Hrsg.), Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) in: Meyerowitz, EM, Somerville, CR (Hrsg.), "Arabidopsis". Cold Spring Hartcar Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner, J., und Caspar, T. (1998) in: J. Martinez-Zapater, J. Salinas, (Hrsg.), Methods an Molecular Biology, Bd. 82. Humana Press, Totooma, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Vereinigen bzw. Poolen der Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer Region von Interesse; (d) Denaturieren und Annealen, um die Bildung von Heteroduplexen zu gestatten; (e) DHPLC, wobei die Gegenwart eines Heteroduplex in einem Pool als ein Extra-Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifikation des Mutanten-Individuums; und (g) Sequenzieren des Mutanten-PCR-Produkts. Verfahren für TILLING sind im Fachgebiet allgemein bekannt (McCallum et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18: 455–457; übersichtmäßig zusammengefasst von Stemple (2004) Nat. Rev. Genet 5(2): 145–50).
  • Homologe Rekombination
  • Homologe Rekombination gestattet die Einbringung einer gewählten Nukleinsäure in einem Genom an einer definierten gewählten Position. Homologe Rekombination ist eine Standardtechnologie, die in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe oder das Moos Physcomitrella, routinemäßig angewandt wird. Verfahren zur Durchführung homologer Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen beschrieben worden (Offringa et al. (1990) EMBO J. 9(10): 3077–84), sondern auch für Nutzpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al. (2002) Nat. Biotech. 20(10): 1030–4; Iida und Terada (2004) Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132–8), und es existieren Vorgehensweisen, welche, ungeachtet des Zielorganismus, allgemein anwendbar sind (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
  • Ertrag
  • Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen einen messbaren Gewinn von wirtschaftlichem Wert, typischerweise in Bezug auf eine spezifizierte Nutzpflanze, ein Gebiet und eine Zeitperiode. Individuelle Pflanzenteile tragen auf Basis ihrer Anzahl, Größe und/oder Gewicht direkt zum Ertrag bei, oder die tatsächliche Ausbeute ist der Ertrag pro Quadratmeter für eine Nutzpflanze und pro Jahr, was mittels Dividieren der Gesamtproduktion (einschließend sowohl geerntete als auch geschätzte Produktion) durch die bepflanzten Quadratmeter bestimmt wird. Der Begriff ”Ertrag” an einer Pflanze kann sich auf vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf die reproduktiven Organe und/oder auf Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze beziehen.
  • Jungpflanzenvitalität
  • ”Jungpflanzenvitalität” bezieht sich auf aktives gesundes, richtig ausgewogenes Wachstum, insbesondere während der frühen Stadien des Pflanzenwachstums, und kann aus einer erhöhten Pflanzenfitness resultieren, beispielsweise aufgrund dessen, dass die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. Optimieren der Verwendung von Energieressourcen und der Aufteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Jungpflanzenvitalität zeigen außerdem erhöhtes Keimlings-Überleben und eine bessere Hervorbringung der Nutzpflanze, was häufig zu sehr gleichmäßigen Feldern (wobei die Nutzpflanze in gleichmäßiger Weise wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen die verschiedenen Stadien der Entwicklung im Wesentlichen zur gleichen Zeit erreicht) und oftmals zu einem besserem und höheren Ertrag führt. Deshalb kann die Jungpflanzenvitalität durch Messen verschiedener Faktoren, wie etwa Tausendkorngewicht, Prozentsatz der Keimung, Prozentsatz der Emergenz, Keimlingswachstum, Keimlingshöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und vielen anderen, bestimmt werden.
  • Erhöhen/Verbessern/Steigern
  • Die Begriffe ”erhöhen”, werbessern” oder ”steigern” sind austauschbar und sollen im Sinne der Patentanmeldung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, weiter bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wie hierin definiert, bedeuten.
  • Samenertrag
  • Erhöhter Samenertrag kann sich als eines oder mehrere der Folgenden manifestieren: a) eine Erhöhung der Samenbiomasse (Gesamtsamengewicht), welche auf Einzelsamen-Basis und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter bezogen sein kann; b) erhöhte Anzahl von Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl von (gefüllten) Samen; d) erhöhte Samen-Füllrate (welche als das Verhältnis zwischen der Zahl gefüllter Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Harvest Index, der als ein Verhältnis des Ertrags an erntefähigen Teilen, wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse, ausgedrückt wird; und f) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKW), und g) erhöhte Anzahl an Hauptrispen, was aus der gezählten Zahl gefüllter Samen und deren Gesamtgewicht extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKW kann aus erhöhter Samengröße und/oder Samengewicht resultieren, und kann auch aus einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße resultieren.
  • Eine Erhöhung im Samenertrag kann sich auch als eine Erhöhung in Samengröße und/oder Samenvolumen manifestieren. Ferner kann sich eine Erhöhung des Samenertrags auch als eine Erhöhung bei Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder Samenumfang manifestieren. Erhöhter Samenertrag kann auch zu modifizierter Architektur führen oder kann aufgrund einer modifizierten Architektur auftreten.
  • Grünheits-Index
  • Der ”Grünhuts-Index”, wie hierin verwendet, wird aus Digitalbildern von Pflanzen berechnet. Für jedes Pixel, das zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehört, wird das Verhältnis des Grünwerts gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell zum Codieren von Farbe) berechnet. Der Grünheits-Index wird als der Prozentsatz an Pixeln ausgedrückt, für den das Grün-zu-Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit wird der Grünheits-Index von Pflanzen in der letzten Abbildung vor dem Aufblühen gemessen. Im Gegensatz dazu wird der Grünheits-Index von Pflanzen unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen in der ersten Abbildung nach der Düne gemessen.
  • Pflanze
  • Der Begriff ”Pflanze”, wie hierin verwendet, umfasst ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen sowie Pflanzenteile, einschließlich Samen, Sprosse, Stängel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst. Der Begriff ”Pflanze” beinhaltet außerdem Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Kallusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der zuvor Genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst.
  • Zu Pflanzen, welche in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen, einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher, die aus der Liste ausgewählt sind, die unter anderem Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölsamenraps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerokallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Omithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticale sp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp. umfasst.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein ASPAT-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein ASPAT-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert und gegebenenfalls auf Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften selektiert.
  • Weiterhin wurde nun überraschenderweise gefunden, dass man durch eine Erhöhung der Expression einer für ein wie hier definiertes MYB91-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in einer Pflanze Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein MYB91-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz erhöht.
  • Weiterhin wurde nun auch überraschenderweise gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein GASA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein GASA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert.
  • Weiterhin wurde nun außerdem überraschenderweise gefunden, dass man durch Modulieren der Expression einer für ein AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung des Samenertrags in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, bei dem man in einer Pflanze die Expression einer für ein AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure moduliert und wobei die ertragsbezogenen Eigenschaften kein erhöhtes Wurzelwachstum umfassen.
  • Was die ASPAT-Polypeptide betrifft, so besteht ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid (eine ASPAT-Nukleinsäure) codiert, darin, dass man eine Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, in eine(r) Pflanze einführt und exprimiert. Vorzugsweise findet die erhöhte Expression der ASPAT-Nukleinsäure und/oder des ASPAT-Polypeptids und/oder der ASPAT-Aktivität in einem oder mehr subzellulären Kompartimenten ausgewählt mit steigender Bevorzugung aus der Reihe Zytosol, Chloroplast, Peroxisomen, Glyoxisomen und Mitochondrien einer Pflanzenzelle statt.
  • Die im Zytosol vorhandenen Mengen der ASPAT-Nukleinsäureexpressionsniveaus und/oder des ASPAT-Polypeptids und/oder der ASPAT-Aktivität können z. B. dadurch erhöht werden, dass man eine ASPAT-Nukleinsäure, die für eine Zytosol-Isoform codiert, exprimiert. ASPAT-Nukleinsäuren, die für auf natürliche Weise in einem Organell der Pflanzenzelle exprimierte Isoformen codieren, können jedoch im Zytosol auch dadurch exprimiert werden, dass man die spezifischen Organell-Targeting-Motive entfernt. Ähnlich dazu kann eine auf natürliche Weise auftretende Zytosol-Isoform in einem bevorzugten Organell dadurch exprimiert werden, dass man spezifische Säureaminosäuremotive, die für bekannte spezifische subzelluläre Targeting-Signale für solch ein Organell codieren, fusioniert. Mittel und Techniken zum Exprimieren eines Polypeptids in einem bevorzugten Organell einer Pflanzenzelle sind in der Fachwelt gut bekannt.
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, so erfolgt ein bevorzugtes Verfahren zum Erhöhen der Expression einer für ein MYB91-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in einer Pflanze durch Einführen einer für ein MYB91-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze und durch deren Exprimieren darin.
  • Was GASA-Polypeptide betrifft, so erfolgt ein bevorzugtes Verfahren zur Modulation (vorzugsweise zum Erhöhen) der Expression einer für ein GASA-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz durch Einführen einer für ein GASA-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze und durch deren Exprimieren darin.
  • Was AUX/IAA-Polypeptide betrifft, so erfolgt ein bevorzugtes Verfahren zur Modulation (vorzugsweise zum Erhöhen) der Expression einer für ein AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz durch Einführen einer für ein AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze und durch deren Exprimieren dann.
  • Was ASPAT-Polypeptide betrifft, so soll im Folgenden jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes ASPAT-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches ASPAT-Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als ”ASPAT-Nukleinsäure” oder ”ASPAT-Gen” bezeichnet wird.
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, so soll im Folgenden jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes MYB91-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäuresequenz” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäuresequenz gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches MYB91-Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäuresequenz handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die für den im Folgenden beschriebenen Polypeptidtyp codiert und die im Folgenden auch als ”MYB91-Nukleinsäuresequenz” oder ”MYB91-Gen” bezeichnet wird.
  • Was GASA-Polypeptide betrifft, so soll im Folgenden jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes GASA-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches GASA-Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als ”GASA-Nukleinsäure” oder ”GASA-Gen” bezeichnet wird.
  • Was AUX/IAA-Polypeptide betrifft, so soll im Folgenden jeder Verweis auf ein ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes Protein (oder Polypeptid)” so verstanden werden, dass damit ein wie hier definiertes AUX/IAA-Polypeptid gemeint ist. Jeder Verweis auf eine ”für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäure” soll im Folgenden so verstanden werden, dass damit eine Nukleinsäure gemeint ist, die dazu fähig ist, für ein solches AUX/IAA-Polypeptid zu codieren. Bei der in eine Pflanze einzuführenden (und daher für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten) Nukleinsäure handelt es sich um eine beliebige Nukleinsäure, die für den im Folgenden beschriebenen Proteintyp codiert und die im Folgenden auch als ”AUX/IAA-Nukleinsäure” oder ”AUX/IAA-Gen” bezeichnet wird.
  • Ein ”ASPAT”-Polypeptid wie im vorliegenden Text definiert bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid umfassend eine Domäne einer Aminotransferase I und II (Aminotran_1_2) (Interpro-Eintragsnummer: IPR004839; pfam-Eintragsnummer: PF00155) und gegebenenfalls eine Aspartat-Transaminase Aktivität (EC. 2.6.1.1).
  • Vorzugsweise umfasst ein ASPAT-Polypeptid eine Aminotran_1_2-Domäne mit mit steigender Bevorzugung mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität mit einer beliebigen der Aminotran_1_2-Domänen gemäß Tabellen D1, Tabelle D2 und Tabelle D3.
  • Vorzugsweise umfasst das ASPAT-Polypeptid ein Motiv mit mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% zu einem oder mehr der folgenden Motive:
    Figure 00500001
    wobei eine beliebige Aminosäure durch eine konservierte Aminosäure substituiert werden kann.
  • Vorzugsweise hat das Homolog eines ASPAT-Polypeptids, mit zunehmender Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71% 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Gesamtsequenzidentität zur Aminosäure von einem der Polypeptide von Tabelle A1, vorzugsweise einem der Polypeptide in der phylogenetischen Klasse 1 von Tabelle B1, stärker bevorzugt mit SEQ ID NR: 2, noch stärker bevorzugt mit SEQ ID NR: 8, am meisten bevorzugt mit SEQ ID NR: 6. Darüberhinaus umfasst das Homolog eines ASPAT-Proteins vorzugsweise eine Aminotran_1_2-Domäne wie oben beschrieben. Die Sequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
  • Alternativ dazu hat ein für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignetes ASPAT-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, die, wenn sie zur Konstruktion eines phylogenetischen Baums wie dem in 2 gezeigten verwendet wird, in zunehmender Präferenz mit einem der in Tabelle B1 aufgeführten Polypeptide der phylogenetischen Klasse 1, Klasse 2, Klasse 3 und Klasse 4 Cluster bildet.
  • Ein ”MYB91-Polypeptid” wie im vorliegenden Text definiert bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid umfassend (i) mit steigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität mit einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 269; und (ii) mit steigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität mit einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 270; und (iii) mit steigender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer konservierten Domäne gemäß SEQ ID NR: 271.
  • Alternativ dazu oder zusätzlich bezieht sich ein wie hier definiertes ”MYB91-Polypeptid” auf eine beliebige Polypeptidsequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem wie in SEQ ID NR: 221 wiedergegebenen Polypeptid.
  • Alternativ dazu oder zusätzlich bezieht sich ein wie hier definiertes ”MYB91-Polypeptid” auf ein beliebiges Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer beliebigen der hier in Tabelle A2 angeführten Polypeptidsequenzen.
  • Alternativ dazu oder zusätzlich bezieht sich ein wie hier definiertes ”MYB91-Polypeptid” auf eine beliebige Polypeptidsequenz, die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums von MYB-Polypeptiden, wie demjenigen, der in 4 abgebildet ist, verwendet wird, eher Cluster mit der MYB91-Gruppe von Polypeptiden bildet als mit einer anderen Gruppe.
  • Ein ”GASA-Polypeptid” wie im vorliegenden Text definiert bezieht sich auf Polypeptide umfassend in ihrer nativen Form ein Sekretionssignal, die GASA-Domäne PF02704 (Interpro IPR003854) sowie die folgenden drei Motive: Motiv 4 (SEQ ID NR: 277), umfassend 4 konservierte Cys-Reste:
    Figure 00510001
    • wobei X in Position 2 eine beliebige Aminosäure sein kann, jedoch vorzugsweise eine aus der Gruppe N, K, M, G, L, I, Q; und wobei X in Position 3 eine beliebige Aminosäure sein kann, jedoch vorzugsweise eine aus der Gruppe V, T, S, M, I, L, H, Y, K; und wobei X in Position 6 eine beliebige Aminosäure sein kann, jedoch vorzugsweise eine aus der Gruppe Q, A, N, D, L, V, R, H, S, G, K, E, T; und wobei X in Position 7 eine beliebige Aminosäure sein kann, jedoch vorzugsweise eine aus der Gruppe R, T, A, D, K, E, Q, S, W, C; und wobei X in Position 9 eine beliebige Aminosäure sein kann, jedoch vorzugsweise eine aus der Gruppe N, K, R, H, S, G, A, Q, L, D.
    Motiv 5 (SEQ ID NR: 278):
    Figure 00510002
    • wobei X in Position 6 eine beliebige Aminosäure sein kann, jedoch vorzugweise eine aus der Gruppe T, P, S, Y, V, N, F, L; und wobei X in Position 7 eine beliebige Aminosäure sein kann, jedoch vorzugsweise eine aus der Gruppe G, Y, F, S, A, L, V.
  • Die Motive 4 und 5 sind einander benachbart oder sind von einander durch 1 Aminosäure getrennt. Motiv 6 (SEQ ID NR: 279):
    Figure 00520001
    • wobei X in Position 4 eine beliebige Aminosäure sein kann, jedoch vorzugweise eine aus der Gruppe Q, R, S, D, E, N, T, H.
  • Der Begriff GASA-Polypeptid, wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst jedoch nicht GASA4 aus Arabidopsis thaliana (SEQ ID NR: 295).
  • Vorzugsweise umfasst das GASA-Polypeptid, das sich für die Verfahren der vorliegenden Erfindung eignet, eines oder mehrere der folgenden Motive: Motiv 7 (SEQ ID NR 280):
    Figure 00520002
    • wobei X an Position 7 eine beliebige Aminosäure sein kann, jedoch vorzugsweise eine aus der Gruppe E, H, G, K, A, Q, S, R, T, N, D, L, V; und wobei X an Position 8 eine beliebige Aminosäure sein kann, jedoch vorzugsweise eine aus der Gruppe E, D, K, Q, S, R, A, T, C.
    Motiv 8 (SEQ ID NR 281):
    Figure 00520003
    • wobei X in Position 12 eine beliebige Aminosäure sein kann, jedoch vorzugweise eine aus der Gruppe E, H, T, A, S, L, V, K, M.
  • Vorzugsweise schließt sich an Motiv 7 unmittelbar Motiv 8 an, oder Motiv 7 ist von Motiv 8 durch 1 Aminosäure getrennt.
  • Motiv 9 (SEQ ID NR: 282):
    Figure 00520004
  • Vorzugsweise schließt sich an Motiv 8 unmittelbar Motiv 9 an, oder Motiv 8 ist von Motiv 9 durch 1 Aminosäure getrennt.
  • Motiv 10 (SEQ ID NR: 283).
    Figure 00520005
  • Motiv 11 (SEQ ID NR: 284):
    Figure 00520006
  • Motiv 12 (SEQ ID NR: 285):
    Figure 00520007
  • Alternativ dazu hat das Homolog eines GASA-Proteins mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zur durch SEQ ID NR: 276 wiedergegebenen Aminosäure, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein die wie oben umrissenen konservierten Motive umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
  • Vorzugsweise bildet die Polypeptidsequenz, die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 9 abgebildet ist, eher Cluster mit der Gruppe der GASA-Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 276 (oder SEQ ID NR: 291 oder SEQ ID NR: 292) als mit einer beliebigen anderen Gruppe. Es wird darauf hingewiesen, dass GASA4 aus Arabidopsis thaliana (SEQ ID NR: 295) aus der Gruppe der GASA-Proteine, wie sie in der vorliegenden Erfindung definiert sind, ausgeschlossen ist
  • Ein ”AUX/IAA-Polypeptid” wie hier definiert bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid umfassend eine AUX/IAA-Domäne (PFAM-Eintragsnummer PF02309, InterPro-Eintragsnummer IPR003311). Ein ”AUX/IAA-Polypeptid” wie hier definiert umfasst nicht das Motiv gemäß SEQ ID NR: 670: (K/N)(I/M/L)F(S/Y)(Q/G)L(IAA2-Motiv).
  • AUX/IAA-Polypeptide der Erfindung weisen eine äquivalente Aminosäurestruktur und Funktion auf wie die AUX/IAA-Transkriptionsfaktorfamilie und Homologe davon.
  • Die Struktur und Funktion von AUX/IAA-Domänen sind in der Fachwelt gut bekannt Typischerweise finden sie sich in AUX/IAA-Transkriptionsfaktoren von Pflanzen. Mitglieder der AUX/IAA-Transkriptionsfaktorfamilie pflanzlichen Ursprungs sind in der Fachwelt gut bekannt. Eine Zusammenstellung der AUX/IAA-Polypeptide, wie sie sich im Königreich der Viridiplantae finden, finden sich in einschlägigen Datenbanken, wie der sogenannten ”Plant Transcription Database (PInTFDB)”, die von der Universität Potsdam (Deutschland) geführt wird und bei Riano-Pacho et al. BMC Bioinformatics 2007 8: 47 beschrieben ist.
  • In der PInTFDB-Datenbank werden die Mitglieder der AUX/IAA-Familie als Polypeptide mit einer AUX/IAA-Domäne (PFAM-Eintragsnummer: PF02309) bzw. ohne Auxin_resp-Domäne (pfam-Eintragsnummer: PF06507) identifiziert; die Auxin_resp-Domänen finden sich typischerweise in ARF-Polypeptiden und fehlen typischerweise bei AUX/IAA-Polypeptiden.
  • Ein Beispiel für eine AUX/IAA-Domäne, wie sie sich zwischen den Aminosäurekoordinaten 5-171 von SEQ ID NR: 432 findet. AUX/IAA-Domänen mit Sequenzähnlichkeit zu der Domäne, wie sie in SEQ ID NR: 432 vorliegt, finden sich in den Polypeptiden von Tabelle A4.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird, um die Verfahren der Erfindung durchzuführen, ein bevorzugtes ein AUX/IAA-Polypeptid, das auch als ”IAA14-like” Polypeptid bezeichnet wird, bereitgestellt, das eine AUX/IAA-Domäne mit mindestens 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäure der AUX/IAA-Domäne gemäß den Aminosäuren 1 bis 220 in SEQ ID NR: 738 (13) umfasst.
  • Vorzugsweise umfasst das ”IAA14-like” Polypeptid mindestens eines und mit zunehmender Präferenz 2, 3, 4, 5 oder alle sechs der folgenden Motive: Motiv 13 SEQ ID NR: 739:
    Figure 00540001
    Motiv 14, SEQ ID NR 740:
    Figure 00540002
    Motiv 15, SEQ ID NR: 741:
    Figure 00540003
    Motiv 16, SEQ ID NR 742:
    Figure 00540004
    • wobei X an Position 11 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, jedoch X an Position 11 vorzugsweise für eine K, T, R, N, S, oder Q und wobei X an Position 12 für eine beliebige Aminosäure stehen kann, X an Position 12 jedoch vorzugsweise für eine von N, L, T, N, V, I oder C steht.
  • Motiv 17, SEQ ID NR 743:
    Figure 00540005
  • Motiv 18, SEQ ID NR: 744:
    Figure 00540006
  • Motiv 15 lautet vorzugsweise:
    Figure 00550001
  • Motiv 16 lautet vorzugsweise:
    Figure 00550002
  • Motiv 17 lautet vorzugsweise:
    Figure 00550003
  • Motiv 18 lautet vorzugsweise:
    Figure 00550004
  • Vorzugsweise weist das AUX/IAA-Polypeptid der Erfindung mit steigender Bevorzugung mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäure einer AUX/IAA-Domäne auf, vorzugsweise zu der AUX/IAA-Domäne von einem der Polypeptide von Tabelle A4, am stärksten bevorzugt zu der AUX/IAA-Domäne von SEQ ID NR: 432, wie dies durch die Aminosäuren, die sich zwischen den Aminosäurekoordinaten 5 bis 171 befinden, dargestellt ist.
  • Vorzugsweise bildet die ”IAA14-like” Polypeptidsequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie in 1 bei Remington et al. (Plant Physiol. 135, 1738–1752, 2004) dargestellt verwendet wird, eher mit der Gruppe A der ”IAA14-like” Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 738 umfasst, Cluster als mit einer beliebigen sonstigen Gruppe (siehe auch 15).
  • Alternativ dazu hat das Homolog eines AUX/IAA-Proteins mit zunehmender Präferenz mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51% 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zur durch ein beliebiges der Polypeptide der Tabelle A4 oder Tabelle A5, vorzugsweise durch SEQ ID NR: 432 oder SEQ ID NR: 738 wiedergegebenen Aminosäure, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein ein oder mehrere der wie oben umrissenen konservierten Motive umfasst Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern und vorzugsweise mit Sequenzen reifer Proteine (d. h. ohne Berücksichtigung von Sekretionssignalen oder Transitpeptiden), ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bildet die Polypeptidsequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie in 1 bei Remington et al. (Plant Physiol. 135, 1738–1752, 2004) verwendet wird, eher mit der Gruppe A der ”IAA14-like” Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 738 umfasst, Cluster als mit einer sonstigen anderen Gruppe (siehe auch 15).
  • Die Begriffe ”Domäne”, ”Signatur” und ”Motiv” sind im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert. Es existieren Spezialdatenbanken für die Identifizierung von Domänen, zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Bucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (in:) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Hrsg.: Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searis D., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nuci. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Eine Auswahl an Werkzeugen für die Analyse von Proteinsequenzen in silico ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Schweizer Institut für Bioinformatik; Gasteiger et al., "ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis", Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788(2003)) verfügbar. Domänen oder Motive können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden.
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, so ist ein Alignment der Polypeptide von Tabelle A2 hierin in 5 gezeigt Solche Alignments eignen sich zum Identfizieren der zwischen den wie hier definierten MYB91-Polypeptiden am meisten konservierten Domänen oder Motive. Beispiele für solche Domänen sind (i) eine MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 269 und/oder gemäß SEQ ID NR: 270 (in 5 durch die Buchstaben X gekennzeichnet); und (ii) ein MYB-DNA-Transkriptionsfaktor mit einem InterPro-Eintrag IPR015495 (in 2 ebenfalls durch die Buchstaben X gekennzeichnet). Eine weitere solche Domäne ist eine C-terminale konservierte Domäne gemäß SEQ ID NR: 271, die in 5 ebenfalls durch die Buchstaben X gekennzeichnet ist.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA zu derartigen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständigen Sequenzen überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welches die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem zum Beispiel der ClustalW-Multiple-Sequenz-Alignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen paarweisen Alignment-Parametern und einer Bewertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10. Juli 2003; 4: 29. MatGAT.: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences) verfügbar sind. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können anstatt der Verwendung von Volllängensequenzen zur Identifizierung von Homologen auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, wobei die oben erwähnten Programme unter Anwendung der Standardparameter verwendet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol. 147(1); 195–7).
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, so wird hier in Beispiel 3 in Tabelle B die prozentuale Identität zwischen dem wie durch SEQ ID NR: 221 wiedergegebenen MYB91-Polypeptid und dem in Tabelle A2 aufgeführten MYB91-Polypeptide beschrieben, die lediglich 52% Aminosäuresequenzidentität betragen kann. In manchen Fällen können die Default-Parameter verändert werden, um die Stringenz der Suche zu verändern. Bei Verwendung von BLAST zum Beispiel kann die statistische Signifikanzschwelle (”expect”-Wert genannt) für das Angeben von ”Matches” mit Datenbanksequenzen erhöht werden, um weniger stringente ”Matches” aufzuzeigen. Auf diese Weise können kurze beinahe exakte ”Matches” identifiziert werden.
  • Was die GASA-Polypeptide betrifft, so kann ein Alignment zum Beispiel mit den reifen Proteinsequenzen, also ohne Sekretionssignalpeptid, erstellt werden. Verfahren zum Identifizieren von Signalpeptiden sind in der Fachwelt gut bekannt, siehe zum Beispiel Bendtsen et al., J. Mol. Biol., 340: 783–795 (2004).
  • Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Ist bekannt, wo sich ein Protein befindet, so hilft dies bei der Klärung seiner Funktion. Experimentelle Methoden zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunolokalisierung bis zum Tagging von Proteinen mit grünem fluoreszierendem Protein (GFP) oder beta-Glucuronidase (GUS). Solche Methoden sind genau, wenn auch im Vergleich zu computergestützten Verfahren arbeitsintensiv. In jüngerer Zeit wurden große Fortschritte hinsichtlich der mittels Computer errechneten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht. Unter den dem Fachmann gut bekannten Algorithmen stehen bei ExPASy Proteomics, gehosted vom Schweizer Institut für Bioinformatik, z. B. die Werkzeuge PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, SignalP, TMHMM und andere zur Verfügung. Durch Anwenden des PSort-Algorithmus auf ein MYB91-Polypeptid gemäß SEQ ID NR: 221 erhält man eine prognostizierte subzelluläre Lokalisierung im Zellkern.
  • Weiterhin verfügen ASPAT-Polypeptide typischerweise über eine Aspartat-Transaminase, auch Aspartat-Transferase genannte Aktivität. Werkzeuge und Techniken zum Messen der Aspartat-Transaminase-Aktivität sind im Stand der Technik gut bekannt. Die Aspartat-Transaminase-Aktivität kann zum Beispiel in vivo durch Komplementierung von E. coli-Stämmen, die für die Aktivität defizient sind, wie dies bei De la Torre et al. 2006 beschrieben ist, getestet werden. Alternativ dazu kann eine biochemische Bestimmung der Aspartat-Transferase-Aktivitat wie zum Beispiel in De la Torre et al. 2006 beschrieben durchgeführt werden.
  • Darüber hinaus liefern ASPAT-Polypeptide, wenn sie wie im Beispielteil umrissen gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Samenertrag.
  • GASA-Polypeptide liefern, wenn sie wie im Beispielteil umrissen gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere einem erhöhten Gesamtsamengewicht und/oder einer erhöhten Anzahl an gefüllten Samen und/oder einem erhöhten Harvest Index.
  • Weiterhin können transgene Pflanzen, die GASA-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) exprimieren, eine gesteigerte Toleranz gegenüber Hitzestress aufweisen (Ko et al, 2007). Mittel und Techniken zum Messen der Resistenz von Pflanzen gegenüber Hitzestress sind in der Fachwelt gut bekannt, siehe zum Beispiel die bei Ko et al., 2007 beschriebenen Verfahren.
  • Weiterhin weisen die AUX/IAA-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise eine Proteinbindungsaktivität auf: die AUX/IAA-Polypeptide binden an ARF (Auxin Response Factor)-Polypeptide. Mittel und Techniken zum Messen der Proteinbindungsaktivität sind in der Fachwelt gut bekannt und beinhalten zum Beispiel die Immunpräzipitation von Proteinkomplexen und Hefe-Zwei-Hybrid. Mittel und Techniken zum Messen der Assoziation von AUX/IAA und ARF-Polypeptid sind in der Fachwelt gut bekannt und beinhalten zum Beispiel die Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse (siehe zum Beispiel Fukaki et al. (Plant J. 44, 382–395, 2005).
  • Typischerweise umfassen die AUX/IAA-Polypeptide der Erfindung eine EAR-Domäne (Ohata et al., Plant Cell. 2001, 13(8): 1959–68), bei der es sich um eine gut bekannte Proteindomäne handelt, die typischerweise den Transkriptionsfaktoren, die solch eine Domäne umfassen, eine Repressionsaktivität verleiht. Die AUX/IAA-Polypeptide der Erfindung weisen vorzugsweise eine Transkriptionsrepressionsaktivität auf.
  • Was die ”IAA14-like”-Polypeptide betrifft, so assoziieren diese (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise mit ARF7- oder ARF19-Proteinen. Mittel und Techniken zum Messen dieser Assoziation sind in der Fachwelt gut bekannt und beinhaften zum Beispiel die Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse (siehe zum Beispiel Fukaki et al. (Plant J. 44, 382–395, 2005). Weitere Einzelheiten finden sich im Beispielteil.
  • Zusätzlich führen die AUX/IAA-Polypeptide, wenn sie wie im Beispielteil umrissen in Reis gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung exprimiert werden, zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen, ausgewählt aus der Gruppe gesteigerter Harvest Index, gesteigerte Wurzelbiomasse, gesteigerte Grünbiomasse und gesteigerter Samenertrag.
  • Zusätzlich führen die AUX/IAA-Polypeptide, wenn sie wie im Beispielteil umrissen in Reis gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung exprimiert wenden, zu Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen wie gesteigerte Samenfüllrate und gesteigerter Harvest Index.
  • Darüber hinaus liefern IAA14-like-Polypeptide, wenn sie wie im Beispielteil umrissen gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, vorzugsweise einem erhöhten Samenertrag.
  • Zusätzlich können AUX/IAA-Polypeptide eine bevorzugte subzelluläre Lokalisierung aufweisen, typischerweise eines oder mehrere von im Kern, im Zytoplasma, in Chhloroplasten oder in Mitochondrien. Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Ist bekannt, wo sich ein Protein befindet, so hilft dies bei der Klärung seiner Funktion. Experimentelle Methoden zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisierung bis zum Tagging von Proteinen mit ”green fluorescent Protein” (GFP) oder beta-Glucuronidase (GUS). Solche Methoden sind präzise, wenn auch im Vergleich zu computergestützten Verfahren arbeitsintensiv. In jüngerer Zeit wurden große Fortschritte hinsichtlich der mittels Computer errechneten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht Unter den dem Fachmann gut bekannten Algorithmen stehen bei ExPASy Proteomics, gehosted vom Schweizer Institut für Bioinformatik, z. B. die Werkzeuge PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, SignalP, TMHMM und andere zur Verfügung.
  • Was ASPAT-Polypeptide betrifft, so wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 1 wiedergegebenen Nukleinsäuresequenz, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für ASPAT codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten ASPAT-Polypeptid durchführen.
  • Beispiele von für ASPAT-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren sind hier in Tabelle A1 des Beispielteils angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A1 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des durch SEQ ID NR: 2 wiedergegebenen ASPAT-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A1 vom Beispielteil aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Reis-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hocheingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten übereinstimmungstreffern zählt ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hocheingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, so wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 220 wiedergegebenen Nukleinsäuresequenz, die für die MYB91-Potypeptidsequenz von SEQ ID NR: 221 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für ein MYB91-Polypeptid codierenden Nukleinsäure durchführen.
  • Beispiele von für MYB91-Polypeptide codierenden Nukleinsäuresequenzen sind hier in Tabelle A2 von Beispiel 1 angeführt. Solche Nukleinsäuresequenzen eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A2 von Beispiel 1 angeführten Polypeptidsequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des durch SEQ ID NR: 221 wiedergegebenen MYB91-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 220 oder SEQ ID NR 221 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Populus trichocarpa-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
  • Was GASA-Polypeptide betrifft, so wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 275 wiedergegebenen Nukleinsäuresequenz, die für die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 276 codiert, und mit SEQ ID NR: 361, die SEQ ID NR: 291 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für ein GASA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten GASA-Polypeptid durchführen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Nukleinsäure, die für das GASA-Polypeptid codiert, wenn sie in einer Pflanze exprimiert wird, um eine heterologe Nukleinsäure, wobei sich die heterologe Nukleinsäure stark genug von der endogenen GASA-Nukleinsäure unterscheidet, damit ein Gen-Silencing vermieden wird.
  • Beispiele von für GASA-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren sind hier in Tabelle A3 des Beispielteils angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A3 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des durch SEQ ID NR: 276 wiedergegebenen GASA-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A3 des Beispietteils aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 275 oder SEQ ID NR: 276 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Tomaten-(Solanum lycopersicum-)Sequenzen erfolgen; falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 361 oder SEQ ID NR: 291 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Pappel-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
  • Was AUX/IAA-Polypeptide betrifft, so wird die vorliegende Erfindung durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 431 oder durch SEQ ID NR: 737 wiedergegebenen Nukleinsäuresequenz, die für die Potypeptidsequenz von SEQ ID NR: 432 oder durch SEQ ID NR: 738 codiert, veranschaulicht. Die Durchführung der Erfindung ist jedoch nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung lassen sich vorteilhaft mit einer beliebigen wie hier definierten für ein AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder einem beliebigen wie hier definierten IAA14-Polypeptid durchführen.
  • Beispiele von für AUX/IAA-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren sind hier in Tabelle A4 und in Tabelle A5 des Beispielteils angeführt. Solche Nukleinsäuren eignen sich zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Die in Tabelle A4 und in Tabelle A5 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des durch SEQ ID NR: 432 oder durch SEQ ID NR: 738 wiedergegebenen AUX/IAA-Polypeptids, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hier definiert sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. In der Regel beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A4 und in Tabelle A5 des Beispielteils aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt Man benutzt im Allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Vollfängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder der nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 431 oder SEQ ID NR: 432 ist, würde der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis-Sequenzen erfolgen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Übereinstimmungstreffer aus dem ersten Blast von derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch eingestufter Treffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Treffern zählt.
  • Hoch eingestufte Übereinstimmungstreffer sind diejenigen mit einem niedrigen E-Wert. Je niedriger der E-Wert, umso signifikanter die Wertung (oder in anderen Worten, umso niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Fachgebiet allgemein bekannt. Zusätzlich zu E-Werten werden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. Im Fall von großen Familien kann ClustalW eingesetzt werden, gefolgt von einem Nachbarkopplungs- bzw. ”Neighbour-joining”-Baum, um bei der Visualisierung der Einordnung bzw. Clusterung verwandter Gene zu helfen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Auch Nukleinsäurevarianten können bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Zu Beispielen solcher Varianten zählen Nukleinsäuren, welche für Homologe und Derivate von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hier definiert sind. Außerdem sind Nukleinsäuren in den Verfahren der Erfindung nützlich, die für Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, besitzen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodfizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind. AUX/IAA sind Nukleinsäuren, bei denen der Codon-Einsatz optimiert ist oder bei denen miRNA-Targetstellen entfernt sind.
  • Ferner zählen zu den bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlichen Nukleinsäurevarianten Abschnitte von Nukleinsäuren, die für ASPAT-Polypeptide oder MYB91-Polypeptide oder GASA-Polypeptide oder AUX/IAA-Polypeptide codieren, Nukleinsäuren, die mit Nukleinsäuren, die für ASPAT-Polypeptide oder MYB91-Polypeptide oder GASA-Polypeptide oder AUX/IAA-Polypeptide codieren, hybridisieren, Spleiß-Varianten von Nukleinsäuren, die für ASPAT-Polypeptide oder GASA-Polypeptide oder AUX/IAA-Polypeptide codieren, Allelvarianten von Nukleinsäuren, die für ASPAT-Polypeptide oder MYB91-Polypeptide oder GASA-Polypeptide oder AUX/IAA-Polypeptide codieren, sowie Varianten von Nukleinsäuren, die für ASPAT-Polypeptide oder MYB91-Polypeptide oder GASA-Polypeptide oder AUX/IAA-Polypeptide codieren, welche durch Gen-Shuffling erhalten werden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Spleiß-Variante, Allelvariante und Gen-Shuffling sind wie hierin beschrieben beschaffen.
  • Nukleinsäuren, die für ASPAT-Polypeptide oder MYB91-Polypeptide oder GASA-Polypeptide oder AUX/IAA-Polypeptide codieren, müssen nicht Volllängenukleinsäuren sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf der Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit voller Länge beruht Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einem Abschnitt von einer für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codierenden Nukleinsäure.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäure hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere codierende (oder nicht-codierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere codierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
  • Was ASPAT-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes ASPAT-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 100, 200, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispietteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Noch weiter bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 1, ganz besonders bevorzugt handelt es sich um die Nukleinsäure von SEQ ID NR: 3. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie dem in 2 abgebildeten verwendet wird, mit zunehmender Präferenz Cluster mit einem der Polypeptide in der phylogenetischen Klasse 1, Klasse 2, Klasse 3 und Klasse 4 wie in Tabelle B1 aufgeführt bildet Ganz besonders bevorzugt codiert der Abschnitt das durch SEQ ID NR: 4 wiedergegebene Aminosäurefragment.
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes MYB91-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A2 von Beispiel 1 angeführten Polypeptidsequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mit zunehmender Präferenz mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Nukleinsäureabschnitt, der für eine Polypeptidsequenz umfassend (i), mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 269; und (ii) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 270 und (iii) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer konservierten Domäne gemäß SEQ ID NR: 271 codiert. Weiter bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt einer für eine Polypeptidsequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zum durch SEQ ID NR: 221 wiedergegebenen MYB91-Polypeptid oder zu einer der hier in Tabelle A2 angeführten Polypeptidsequenzen codierenden Nukleinsäuresequenz Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Abschnitt um einen Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 220.
  • Was GASA-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes GASA-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A3 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A3 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A3 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 200, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A3 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A3 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert Ganz besonders bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 275. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie desjenigen, der in 9 abgebildet ist, verwendet wird, eher mit der Gruppe der GASA-Polypeptide, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 276 (oder SEQ ID NR: 291 oder SEQ ID NR: 292) Cluster bildet als mit einer beliebigen sonstigen Gruppe.
  • Was AUX/IAA-Polypeptide betrifft, codieren Abschnitte, die bei den Verfahren der Erfindung von Nutzen sind, für ein wie hier definiertes AUX/IAA-Polypeptid und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A4 oder in Tabelle A5 des Beispielteils angeführten Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A4 oder in Tabelle A5 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A4 oder in Tabelle A5 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 100, 200, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A4 oder in Tabelle A5 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen stammen oder aus einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A4 oder in Tabelle A5 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Ganz besonders bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 431 oder von SEQ ID NR: 737. Vorzugsweise codiert der Abschnitt für ein Fragment einer Aminosäuresequenz, umfassend eine AUX/IAA-Domäne (PFAM-Eintragsnummer PF2309, InterPro-Eintrag IPR003311).
  • Bei einem ”IAA14-like” Polypeptid codiert der Abschnitt vorzugsweise für ein Fragment einer Aminosäuresequenz das, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie in 1 bei Remington et al. (Plant Physiol. 135, 1738–1752, 2004) abgebildet, verwendet wird, eher mit Gruppe A der ”IAA14-like” Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 738 umfasst, Cluster als mit einer beliebigen anderen Gruppe (siehe auch 13).
  • Eine andere für die erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Nukleinsäurevariante ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen verringerter Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein wie hier definiertes ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codiert, oder mit einem wie hier definierten Abschnitt in der Lage ist Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer der in Tabelle A1 bis A5 des Beispielteils angeführten Nukleinsäuren fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert, oder bei dem man in eine Pflanze eine zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog einer der in Tabelle A1 bis A5 des Beispielteils angeführten Nukleinsäuresequenzen codiert, fähige Nukleinsäure einführt und dort exprimiert.
  • Was ASPAT-Polypeptide betrifft, so codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche hybridisierende Sequenzen für ein wie hier definiertes ASPAT-Polypeptid, welches im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A1 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure, welche für ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, in der Lage. Noch weiter bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure, wie sie durch SEQ ID NR: 1 wiedergegeben wird, oder an einen Abschnitt davon in der Lage. Ganz besonders bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz wie durch SEQ ID NR: 3 dargestellt.
  • Die hybridisierende Sequenz codiert vorzugsweise für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie die volle Länge aufweist und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 2 abgebildet ist, verwendet wird, mit zunehmender Präferenz Cluster mit einem der Polypeptide in der phylogenetischen Klasse 1, Klasse 2, Klasse 3 und Klasse 4 wie in Tabelle B1 aufgeführt bildet.
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, so codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche hybridisierende Sequenzen für ein wie hier definiertes MYB91-Polypeptid, welches im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder an ein Komplement davon oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure, welche für ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert, oder ein Komplement davon in der Lage ist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz fähig, mit einer Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die für eine Polypeptidsequenz umfassend (i) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidenität zu einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 269; und (ii) mit zunehmender Bevorzugung, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR 270 und (iii) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer konservierten Domäne gemäß SEQ ID NR: 271 codiert. Weiter bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz fähig zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zum durch SEQ ID NR: 221 wiedergegebenen MYB91-Polypeptid oder zu einer der hier in Tabelle A2 angeführten Polypeptidsequenzen codiert. Ganz besonders bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, wie sie durch SEQ ID NR: 220 wiedergegeben wird, oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
  • Was GASA-Polypeptide betrifft, so codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche hybridisierende Sequenzen für ein wie hier definiertes GASA-Polypeptid, welches im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A3 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an ein Komplement einer beliebigen der in Tabelle A3 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an ein Komplement einer Nukleinsäure, welche für ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, in der Lage. Ganz besonders bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure, wie sie durch SEQ ID NR: 275 wiedergegeben wird, oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
  • Die hybridisierende Sequenz codiert vorzugsweise für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie die volle Länge aufweist und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 9 abgebildet ist, verwendet wird, eher Cluster mit der Gruppe der GASA-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 276 (oder SEQ ID NR: 291 oder SEQ ID NR: 292) wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, bildet als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Was AUX/IAA-Polypeptide betrifft, so codieren in den Verfahren der Erfindung nützliche hybridisierende Sequenzen für ein wie hier definiertes AUX/IAA-Polypeptid, welches im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A4 oder in Tabelle A5 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an ein Komplement einer beliebigen der in Tabelle A4 oder in Tabelle A5 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuren oder an einen Abschnitt von beliebigen dieser Sequenzen in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an ein Komplement einer Nukleinsäure, welche für ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 oder in Tabelle A5 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, in der Lage. Ganz besonders bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an das Komplement einer Nukleinsäure, wie sie durch SEQ ID NR: 431 oder durch SEQ ID NR: 737 wiedergegeben wird, oder an einen Abschnitt davon in der Lage.
  • Vorzugsweise codiert die hybridisierende Sequenz oder ihre komplementäre Sequenz für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, umfassend eine AUX/IAA-Domäne (PFAM-Eintragsnummer PF2309, InterPro-Eintrag IPR003311).
  • Bei den ”IAA14-like”-Polypeptiden codiert die hybridisierende Sequenz vorzugsweise für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, wenn sie über die volle Länge verfügt und bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie in 1 bei Remington et al. (Plant Physiol. 135, 1738–1752, 2004) dargestellt verwendet wird, eher mit Gruppe A der ”IAA14-like”-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 738 umfasst, Cluster bildet als mit einer beliebigen sonstigen Gruppe (siehe auch 15).
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist eine Spleiß-Variante, die für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid wie hierin oben definiert codiert, wobei eine Spleiß-Variante wie hier definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Spleiß-Variante von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder einer Spleiß-Variante von einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A1 bis Tabelle A5 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
  • Was ASPAT-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei bevorzugten Spleiß-Varianten um Spleiß-Varianten einer durch SEQ ID NR: 1 wiedergegebenen Nukleinsäure oder eine Spleiß-Variante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise bildet die von der Spleiß-Variante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 2 abgebildet ist, mit zunehmender Präferenz Cluster mit einem der Polypeptide in der phylogenetischen Klasse 1, Klasse 2, Klasse 3 und Klasse 4 wie in Tabelle B1 aufgeführt.
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei bevorzugten Spieiß-Varianten um Spleiß-Varianten einer durch SEQ ID NR: 220 wiedergegebenen Nukleinsäuresequenz, oder eine Spleiß-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 221 codiert. Vorzugweise handelt es sich bei der Spleißvariante um eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz umfassend (i), mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 269; und (ii), mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 270; und (iii) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer konservierten Domäne gemäß SEQ ID NR: 271 codiert. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Spleiß-Variante um eine Spleiß-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zum durch SEQ ID NR: 221 wiedergegebenen MY691-Polypeptid oder zu einer der hier in Tabelle A2 angeführten Polypeptidsequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei der Spleißvariante um eine Spleißvariante einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 220 oder einer Nukleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 221 codiert.
  • Was die GASA-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei bevorzugten Spleißvarianten um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 275 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 276 codiert. Vorzugsweise bildet die Aminosäuresequenz, die von der Spleißvariante codiert wird, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 93 abgebildet ist, eher mit der Gruppe der GASA-Polypeptide umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 276 (oder SEQ ID NR: 291 oder SEQ ID NR: 292) Cluster als mit einer beliebigen sonstigen Gruppe.
  • Was die AUX/IAA-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei bevorzugten Spleißvarianten um Spleißvarianten einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 431 oder von SEQ ID NR: 737 oder eine Spleißvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 432 oder von SEQ ID NR: 738 codiert.
  • Vorzugsweise umfasst die Aminosäuresequenz, die von der Spleißvariante codiert wird, eine AUX/IAA-Domäne (PFAM-Eintragsnummer PF2309, InterPro-Eintrag IPR003311).
  • Bei ”IAA14-like” Polypeptiden bildet die Aminosäuresequenz, die von der Spleißvariante codiert wird, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie er in 1 bei Remington et al. (Plant Physiol. 135, 1738–1752, 2004) abgebildet ist, vorzugsweise mit der Gruppe A der ”IAA14-like” Polypetide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 738 umfasst, Cluster als mit einer beliebigen sonstigen Gruppe (siehe auch 15).
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung von Nutzen ist, ist eine Allelvariante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein wie oben definiertes ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codiert, wobei eine Allelvariante wie hier definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Allelvariante einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispietteils angegebenen Nukleinsäuren oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
  • Was ASPAT-Polypeptide betrifft, so weisen die von in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Allelvarianten codierten Polypeptide im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das ASPAT-Polypeptid von SEQ ID NR: 2 und beliebige der in Tabelle A1 des Beispielteils dargestellten Aminosäuren auf. Allelvarianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 1 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise bildet die von der Allelvariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 2 abgebildet ist, mit zunehmender Präferenz Cluster mit einem der Polypeptide in der phylogenetischen Klasse 1, Klasse 2, Klasse 3 und Klasse 4 wie in Tabelle B1 aufgeführt.
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, so weisen die Allelvarianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das MYB91-Polypeptid von SEQ ID NR: 221 und eine beliebige der in Tabelle A2 von Beispiel 1 dargestellten Polypeptidsequenzen auf. Allelvarianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise handelt es sich bei der Allelvariante um eine Allelvariante einer Polypeptidsequenz umfassend (i), mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 269; und (ii), mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 270; und (iii) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer konservierten Domäne gemäß SEQ ID NR: 271. Weiter bevorzugt handelt es sich bei der Allelvariante, um, mit zunehmender Präferenz, eine Allelvariante, die eine Polypeptidsequenz mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zum durch SEQ ID NR: 221 wiedergegebenen MYB91-Polypeptid oder zu einer der hier in Tabelle A2 angeführten Polypeptidsequenzen codiert. Ganz besonders bevorzugt ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 220 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 221 codiert.
  • Was GASA-Polypeptide betrifft, so weisen die Polypeptide, die von Allelvarianten codiert sind, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das GASA-Polypeptid von SEQ ID NR: 276 und eine beliebige der in Tabelle A3 des Beispielteils dargestellten Aminosäuren auf. Allelvarianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 275 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 276 codiert. Vorzugsweise bildet die durch die Allelvariante codierte Aminosäuresequenz wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 9 abgebildet ist, verwendet wird, eher Cluster mit der Gruppe der GASA-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 276 (oder SEQ ID NR: 291 oder SEQ ID NR: 292) wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Was AUX/IAA-Polypeptide betrifft, so weisen die Polypeptide, die von Allelvarianten codiert sind, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das AUX/IAA-Polypeptid von SEQ ID NR: 432 oder von SEQ ID NR: 738 und eine beliebige der in Tabelle A4 oder in Tabelle A5 des Beispielteils dargestellten Aminosäuren auf. Allelvarianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die Allelvariante eine Allelvariante von SEQ ID NR: 431 oder von SEQ ID NR: 737 oder eine Allelvariante einer Nukleinsäure, die für ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 432 oder von SEQ ID NR: 738 codiert. Vorzugsweise umfasst die durch die Allelvariante codierte Aminosäuresequenz eine AUX/IAA-Domäne (PFAM-Eintragsnummer PF2309, InterPro-Eintrag IPR003311). Bei ”IAA14-like” bildet die Aminosäuresequenz, die von der Allelvariante codiert wird, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie in bei Remington et al. (Plant Physiol, 135, 1738–1752, 2004) abgebildet verwendet wird, vorzugsweise eher mit Gruppe A der ”IAA14-like”-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 738 umfasst, Cluster als mit einer beliebigen sonstigen Gruppe (siehe auch 15).
  • Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls zur Anwendung kommen, um Varianten von Nukleinsäuren zu erzeugen, welche für wie oben definierte ASPAT-Polypeptide oder MYB91-Polypeptide, GASA-Polypeptide, AUX/IAA-Polypeptide codieren, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” wie hier definiert ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispielteils angegebenen Nukleinsäuresequenzen oder umfassend das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze von einer Variante einer Nukleinsäuresequenz, die für ein Ortholog, Paralog oder Homolog von beliebigen der in Tabelle A1 bis A5 des Beispielteils angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, wobei die Nukleinsäurevariante durch Gen-Shuffling erhalten wird.
  • Was ASPAT-Polypeptide betrifft, so bildet die von der durch Genshuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz vorzugsweise, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 2 abgebildet ist, mit zunehmender Präferenz Cluster mit einem der Polypeptide in der phylogenetischen Klasse 1, Klasse 2, Klasse 3 und Klasse 4 wie in Tabelle B1 aufgeführt.
  • Was die MYB91-Polypeptide betrifft, so codiert die durch Gen-Shuffling erhaltene Nukleinsäuresequenzvariante vorzugsweise für eine Polypeptidsequenz umfassend (i), mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 269; und (ii), mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 270; und (iii) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer konservierten Domäne gemäß SEQ ID NR: 271. Weiter bevorzugt codiert die durch Genshuffling erhaltene Nukleinsäuresequenzvariante für eine Polypeptidsequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zum durch SEQ ID NR: 221 wiedergegebenen MYB91-Polypeptid oder zu einer der hier in Tabelle A1 angeführten Polypeptidsequenzen. Ganz besonders bevorzugt codiert die durch Gen-Shuffling erhaltene Nukleinsäuresequenz eine Polypeptidsequenz wie durch SEQ ID NR: 221 dargestellt.
  • Was GASA-Polypeptide betrifft, so bildet die von der durch Genshuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 9 abgebildet ist, verwendet wird, eher Cluster mit der Gruppe der GASA-Polypeptide, die die durch SEQ ID NR: 276 (oder SEQ ID NR: 291 oder SEQ ID NR: 292) wiedergegebene Aminosäuresequenz umfassen, als mit irgendeiner anderen Gruppe.
  • Bei den ”IAA14-like”-Polypeptiden bildet die von der durch Gen-Shuffling erhaltenen Nukleinsäurevariante codierte Aminosäuresequenz, wenn sie bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums wie in 1 bei Remington et al. (Plant Physiol. 135, 1738–1752, 2004) dargestellt verwendet wird, eher mit Gruppe A der in ”IAA14-like”-Polypeptide, die die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NR: 738, umfasst, Cluster als mit einer beliebigen sonstigen Gruppe (siehe auch 15).
  • Weiterhin lassen sich Nukleinsäurevarianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten. Zum Erzielen einer ortsgerichteten Mutagenese sind mehrere Verfahren verfügbar, wobei die üblichsten PCR-basierende Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley, Hrsg.).
  • Für ASPAT-Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das ASPAT-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer monokotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Poaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa.
  • Vorteilhafterweise stellt die Erfindung auch bis jetzt unbekannte für ASPAT codierende Nukleinsäuren und ASPAT-Polypeptide bereit.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül aus der folgenden Reihe bereitgestellt:
    • (i) eine Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 81, 147, 153, 183 und 185;
    • (ii) das Komplement einer Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 81, 147, 153, 183 und 185;
    • (iii) eine Nukleinsäure, die für das Polypeptid gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 184 und 186 codiert, vorzugsweise aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, wobei die isolierte Nukleinsäure von einer Polypeptidsequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 184 und 186 abgeleitet werden kann und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt;
    • (iv) eine Nukleinsäure mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen aus Tabelle A1, die weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt;
    • (v) ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt
    • (vi) eine Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 184 und 186 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A1, die vorzugsweise verstärkte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird auch ein isoliertes Polypeptid aus der folgenden Reihe bereitgestellt:
    • (i) eine Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 184 und 186;
    • (ii) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 184 und 186 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A1, die vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt;
    • (iii) Derivate von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (i) oder (ii) oben.
  • Für MYB91-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das MYB91-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Salicaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Populus trichocarpa.
  • Für GASA-Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das GASA-Polypeptid codierende Nuklearsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, besonders bevorzugt aus der Familie Solanaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Solanum lycopersicum. Alternativ stammt die für das GASA-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus der Familie Salicaceae, vorzugsweise aus Populus sp.
  • Für AUX/IAA-Polypeptide codierende Nukleinsäuren lassen sich aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle gewinnen. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die für das IAA-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer monokotyledonen oder einer dikotyledonen Pflanze, mehr bevorzugt aus der Familie Poaceae oder Brassicaceae, ganz besonders bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa oder aus Arabidopsis thaliana.
  • Durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung erhält man Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften. insbesondere erhält man durch die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einem erhöhtem Ertrag, insbesondere einem erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hier ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
  • Ein Verweis auf gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften soll hier eine Erhöhung der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeuten, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile im Erdboden einschließen kann. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntefähigen Teilen um Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen. Was die GASA-Polypeptide betrifft, so ist anzumerken, dass die Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die für ein GASA-Polypeptid gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung codiert, keine signifikanten Veränderungen bezüglich der Verzweigungseigenschaften im Vergleich zu den Kontrollpflanzen aufwies.
  • Wenn man Mais als ein Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung, unter anderem, als eines oder mehrere der Folgenden manifestieren: Erhöhung der Anzahl an Pflanzen, welche pro Quadratmeter hervorgebracht werden, eine Erhöhung der Anzahl von Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Ackerreihen, der Anzahl der Kerne pro Reihe, des Kerngewichts, des Tausendkorngewichts, der/des Ährenlänge/Durchmessers, Erhöhung der Samen-Füllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist). Wenn man Reis als Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem als eine Erhöhung bei einem oder mehreren der Folgenden manifestieren: Anzahl an Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl an Rispen pro Pflanze, Anzahl an Ährchen pro Rispe, Anzahl an Blüten (Blütchen) pro Rispe (welche ausgedrückt wird als ein Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen gegenüber der Anzahl an Hauptrispen), Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist), Erhöhung des Tausendkorngewichts.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bereit, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein ASPAT-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein MYB91-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Da die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung einen erhöhten Ertrag und/oder erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen eine erhöhte Wachstumsrate (wenigstens während eines Teils ihres Lebenszyklus) im Vergleich zur Wachstumsrate von Kontrollpflanzen bei einem entsprechenden Stadium in ihrem Lebenszyklus aufzeigen.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen überall in der gesamten Pflanze herrschen. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Der Lebenszyklus einer Pflanze kann sich so verstehen, dass die Zeit gemeint ist, welche benötigt wird, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, an welchem die Pflanze trockene reife Samen erzeugt hat, die ähnlich zum Ausgangsmaterial sind. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Jungpflanzenvitalität, Wachstumsrate, Grünheits-Index, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann an einer oder mehreren Stufen im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Pflanzenlebenszyklus stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der frühen Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann eine erhöhte (frühe) Wuchskraft reflektieren. Die Erhöhung in der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, was gestattet, dass Pflanzen später ausgesät und/oder froher geerntet werden, als es sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt kann mit einer früheren Blütezeit erreicht wenden; eine verzögerte Blüte ist normalerweise keine erwünschte Eigenschaft bei Kulturpflanzen. Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie das weitere Aussäen von Samen derselben Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel Säen und Ernten von Reispflanzen, gefolgt von Säen und Ernten weiterer Reispflanzen, sämtlich innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht wird, kann sie, in ähnlicher Weise, das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel das Säen und Ernten von Maispflanzen, gefolgt zum Beispiel von Aussaat und gegebenenfalls Ernte von Sojabohne, Kartoffel oder einer beliebigen anderen geeigneten Pflanze). Im Falle mancher Nutzpflanzen kann auch das mehrmalige Abernten vom gleichen Wurzelstock möglich sein. Das Ändern des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Acre führen (aufgrund einer Erhöhung der Mehrmaligkeit (z. B. in einem Jahr), bei der eine beliebige jeweilige Pflanze angebaut und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch die Kultivierung transgener Pflanzen in einem weiteren geographischen Gebiet als bei ihren Wildtyp-Gegenstücken zulassen, da die territorialen Eingrenzungen für den Anbau einer Nutzpflanze häufig von nachteiligen Umweltbedingungen entweder zur Zeit des Pflanzens (frühe Jahreszeit) oder zur Zeit des Erntens (späte Jahreszeit) bestimmt werden. Derartige nachteilige Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt wird. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven ermittelt werden, wobei es sich bei derartigen Parameter, unter anderem, um T-Mid (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 50% ihrer maximalen Größe zu erreichen) und T-90 (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 90% ihrer maximalen Größe zu erreichen) handeln kann.
  • Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulation der Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Eine Erhöhung der ertragsbezogenen Eigenschaften tritt ungeachtet dessen, ob sich die Pflanze unter Nichtstressbedingungen befindet oder ob die Pflanze verschiedenen Stressfaktoren ausgesetzt ist, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen wachsen gelassen werden, auf. Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Milder bzw. mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums einstellt Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, weiter bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nichtstressbedingungen. Auf Grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs- und/oder Pestizidbehandlungen) werden starke Stressfaktoren bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig angetroffen. Als eine Konsequenz ist das von mäßigem Stress induzierte beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressfaktoren sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressfaktoren, denen eine Pflanze ausgesetzt ist Abiotische Stressfaktoren können zurückzuführen sein auf Dürre oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (insbesondere wegen Dürre), Satzstress, oxidativen Stress oder einem ionischen Stress verursacht wird. Biotische Stressfaktoren sind typischerweise diejenigen Stressarten, welchen von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, steht für diejenigen Umweltbedingungen, die ein optimales Wachstum von Pflanzen erlauben. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Stressbedingungen kultivierte Pflanzen, die im Vergleich zu unter vergleichbaren Stressbedingungen kultivierten Kontrollpflanzen erhöhte ertragsbezogenen Eigenschaften aufweisen. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Stressbedingungen kultiviert werden, bereitgesteltt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein MYB91-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Im Besonderen können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Nichtstressbedingungen oder unter Bedingungen mit milder Düne durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Wie in Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Düne, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen Proteinen und Strukturproteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen Umwelt-Stressfaktoren häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stressproteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Pflanzen mit optimalen Wachstumsbedingungen (die unter Nichtstressbedingungen kultiviert wurden) ergeben typischerweise, mit zunehmender Präferenz, mindestens 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% oder 75% der durchschnittlichen Produktion einer solchen Pflanze in einer beliebigen gegebenen Umgebung. Die durchschnittliche Produktion kann auf der Grundlage von Ernte und/oder Saison berechnet werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Durchschnittsertrags-Produktionen einer Nutzpflanze.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Stressbedingungen kultivierte Pflanzen, die im Vergleich zu unter vergleichbaren Stressbedingungen kultivierten Kontrollpflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, welche unter Nichtstressbedingungen oder unter milden Stressbedingungen kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, welche für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Es versteht sich, dass der Begriff ”abiotischer Stress”, wie hierin definiert, ein oder mehrere beliebige von Folgenden bedeutet: Wasserstress (wegen Düne oder überschüssigem Wasser), anaerober Stress, Salzstress, Temperaturstress (durch heiße, kalte oder Frost-Temperaturen), Stress durch chemische Toxizität und oxidativer Stress. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus Wasserstress, Satzstress, oxidativem Stress und ionischem Stress. Vorzugsweise ist der Wasserstress ein Dürrestress. Der Begriff Salzstress ist nicht auf gewöhnliches Salz (NaCl) eingeschränkt, sondern es kann sich um einen beliebigen Stress handeln, der unter anderem von einem oder mehreren von: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2 verursacht wird.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Salzstressbedingungen kultivierte Pflanzen, die im Vergleich zu unter vergleichbaren Stressbedingungen kultivierten Kontrollpflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, welche unter Salztressbedingungen kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, welche für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Begriff Salzstress ist nicht auf Kochsalz (NaCl) eingeschränkt, sondern es kann sich um einen beliebigen Stress handeln, der unter anderem von einem oder mehreren aus der Reihe: NaCl, KCl, LiCl, MgCl2, CaCl2 verursacht wird.
  • Ein weiteres Beispiel für abiotischen Umweltstress ist die verringerte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen, welche von den Pflanzen für das Wachstum und die Entwicklung assimiliert werden müssen. Wegen des starken Einflusses der Nährstoffverwertungseffizienz auf den Pflanzenertrag und die Produktqualität wird eine gewaltige Menge an Düngemitteln über Feldern verteilt, um Pflanzenwachstum und -qualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird gewöhnlicherweise von drei Hauptnährstoffen limitiert, nämlich Phosphor, Kalium und Stickstoff, der, unter diesen dreien, gewöhnlich das geschwindigkeitslimitierende Element beim Pflanzenwachstum ist. Deshalb ist das für Pflanzenwachstum erforderliche hauptsächliche Nährstoff-Element der Stickstoff (N). Er ist ein Bestandteil von zahlreichen wichtigen Verbindungen, welche in lebenden Zellen angetroffen werden, einschließlich Aminosäuren, Proteinen (Enzymen), Nukleinsäuren und Chlorophyll. Stickstoff macht 1,5% bis 2% der Pflanzen-Trockensubstanz und ungefähr 16% des gesamten Pflanzenproteins aus. Somit ist die Stickstoffverfügbarkeit ein hauptsächlicher limitierender Faktor für Nutzpflanzenwachstum und -produktion (Frink et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(4): 1175–1180) und besitzt außerdem einen sehr großen Einfluss auf die Proteinakkumulation und Aminosäure-Zusammensetzung. Daher sind Nutzpflanzen mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften bei Kultivierung unter stickstofflimitierenden Bedingungen von großem Interesse.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert unter Nährstoffmangelbedingungen, insbesondere unter Stickstoffmangelbedingungen kultivierte Pflanzen, die im Vergleich zu unter vergleichbaren Stressbedingungen kultivierten Kontrollpflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, welche unter Nährstoffmangelbedingungen kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, welche für ein ASPAT-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Nährstoffmangel kann aus einem Mangel an Nährstoffen wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert Pflanzen, die bei Kultivierung unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, insbesondere unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit, erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise verringerter Stickstoffverfügbarkeit, kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein MYB91-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Die verringerte Nährstoffverfügbarkeit kann aus einem Mangel oder Überschuss an Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren. Vorzugsweise handelt es sich bei der verringerten Nährstoffverfügbarkeit um eine verringerte Stickstoffverfügbarkeit.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung liefert Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen im Vergleich zu unter vergleichbaren Stressbedingungen kultivierten Kontrollpflanzen erhöhte ertragsbezogenen Eigenschaften aufweisen. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter abiotischen Stressbedingungen kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein MYB91-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst Gemäß einem Aspekt der Erfindung handelt es sich bei dem abiotischen Stress um einen osmotischen Stress ausgewählt aus einem oder mehreren aus der Reihe: Wasserstress, Salzstress, oxidativer Stress und ionischer Stress.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen) oder Zellen, die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäure-Transgen, das für ein wie oben definiertes ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codiert, welches funktionell mit einem in Pflanzen wirkenden Promotor verbunden ist.
  • Die Erfindung stellt außerdem genetische Konstrukte und Vektoren zum Erleichtern des Einbringens und/oder der Expression von für ASPAT-Polypeptide oder MYB91-Polypeptide oder GASA-Polypeptide oder AUX/IAA-Polypeptide codierenden Nukleinsäuren in Pflanzen bereit. Die Genkonstrukte können in Vektoren insertiert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren in Pflanzen hinein geeignet sind und für die Expression des Gens von Interesse in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines wie hier definierten Genkonstrukts in den Verfahren der Erfindung vor.
  • Im Genaueren sieht die vorliegende Erfindung ein Konstrukt vor, umfassend:
    • (a) eine für ein wie oben definiertes ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codierende Nukleinsäure;
    • (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die codierende Nukleinsäure ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid wie oben definiert. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert.
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, so handelt es sich bei einer der Steuerungssequenzen eines Konstrukts vorzugsweise um einen aus einem Pflanzengenom isolierten konstitutiven Promotor. Ein Beispiel für einen konstitutiven Promotor ist ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis, ganz besonders bevorzugt eine durch SEQ ID NR: 272 wiedergegebene GOS2-Sequenz.
  • Pflanzen wenden mit einem Vektor transformiert, der jedwede der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, welche auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, erfolgreich zu transformieren zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig an eine oder mehrere Steuerungssequenzen (mindestens an einen Promotor) verknüpft.
  • Vorteilhaft kann zur Steuerung der Expression der Nukleinsäuresequenz ein beliebiger Promotortyp verwendet werden, gleich ob natürlich oder synthetisch; vorzugsweise ist der Promotor jedoch pflanzlichen Ursprungs. Ein konstitutiver Promotor eignet sich besonders für die Verfahren. Vorzugsweise handelt es sich bei dem konstitutiven Promotor außerdem um einen ubiquitären Promotor mittlerer Stärke. Definitionen der verschiedenen Promotortypen finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”. Was ASPAT-Polypeptide betrifft, so ist für die erfindungsgemäßen Verfahren ein für grünes Gewebe ein spezifischer Promotor ebenfalls geeignet.
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, so kann zum Erhöhen der Expression der Nukleinsäuresequenz vorteilhaft ein beliebiger Promotortyp verwendet werden, gleich ob natürlich oder synthetisch. Ein konstitutiver Promotor eignet sich besonders für die Verfahren, vorzugsweise ein aus einem Pflanzengenom isolierter konstitutiver Promotor. Der konstitutive Pflanzenpromotor steuert die Expression auf einem Niveau, das in allen Fällen unter dem liegt, welches man unter der Kontrolle eines viralen 35S-CaMV-Promotors erhält. Ein Beispiel für einen solchen Promotor ist ein durch SEQ ID NR: 272 wiedergegebener GOS2-Promotor.
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, so eigen sich organspezifische Promotoren, zum Beispiel für die bevorzugte Expression in Blättern, Stängeln, Knollen, Meristemen, Samen, zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Entwicklungsgesteuerte und induzierbare Promotoren eignen sich ebenfalls zum Durchführen der Verfahren der Erfindung. Definitionen der verschiedenen Promotortypen finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Was ASPAT-Polypeptide betrifft, so sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die durch SEQ ID NR: 1 wiedergegebene, für das ASPAT-Polypeptid codierende Nukleinsäure beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für das ASPAT-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder unter der Kontrolle eines für grünes Gewebe spezifischen Promotors beschränkt.
  • Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich bevorzugt um einen Promotor mittlerer Stärke, mehr bevorzugt ausgewählt aus einem aus Pflanzen stammenden Promotor, wie einen GOS2-Promotor, mehr bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um einen GOS2-Promotor aus Reis. Weiterhin bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 218 ähnelt; ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 218 wiedergegeben. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gemäß einem anderen bevorzugten Merkmal der Erfindung ist die für ein ASPAT-Polypeptid codierende Nukleinsäure funktionsfähig mit einem für grünes Gewebe spezifischen Promotor verbunden. Bei dem für grünes Gewebe spezifischen Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor eines Protochlorophyllidreduktase-Gens (PR-Gens), mehr bevorzugt stammt der PR-Promotor aus Reis, weiterhin bevorzugt wird der PR-Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 219 ähnelt; ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 219 wiedergegeben. Beispiele weiterer für grünes Gewebe spezifischer Promotoren, die sich ebenfalls zur Durchführung der Verfahren der Erfindung einsetzen lassen, sind oben in Tabelle 3 im Abschitt ”Definitions” gezeigt.
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, so sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die durch SEQ ID NR: 220 wiedergegebene, für das MYB91-Polypeptid codierende Nukleinsäure beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für das MYB91-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors beschränkt.
  • Was GASA-Polypeptide betrifft, so sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die durch SEQ ID NR: 275 oder SEQ ID NR: 361 wiedergegebene, für das GASA-Polypeptid codierende Nukleinsäure beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für das GASA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors beschränkt.
  • Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke, mehr bevorzugt ausgewählt aus einem aus Pflazen stammenden Promotor, wie einen GOS2-Promotor; mehr bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um den GOS2-Promotor aus Reis. Wetter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch ein Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 290 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 290 wiedergegeben. Weitere Beispiele konstitutiver Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eingesetzt werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die einen GOS2-Promotor und die für das GASA-Polypeptid codierende Nukleinsäure enthält.
  • Was AUX/IAA-Polypeptide betriff, so sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die durch SEQ ID NR: 431 oder durch SEQ ID NR: 737 wiedergegebene, für das AUX/IAA-Polypeptid codierende Nukleinsäure beschränkt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer für das AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors beschränkt.
  • Bei dem konstitutiven Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor mittlerer Stärke, mehr bevorzugt ausgewählt aus einem aus Pflanzen stammenden Promotor, wie einen GOS2-Promotor; besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um den GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch ein Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 669 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 669 wiedergegeben.
  • Alternativ handelt es sich bei dem konstitutiven Promotor vorzugsweise um einen schwachen konstitutiven Promotor, mehr bevorzugt ausgewählt aus einem aus Pflanzen stammenden Promotor, wie einen „High Mobility Group Protein” (HMGP)-Promotor; mehr bevorzugt handelt es sich bei dem Promotor um den HMGP-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz wiedergegeben, die im Wesentlichen SEQ ID NR: 747 ähnelt, ganz besonders bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch SEQ ID NR: 747 wiedergegeben. Weitere Beispiele für aus Pflanzen stammende und konstitutive Promotoren finden sich hier im Abschnitt ”Definitionen”.
  • Gegebenenfalls können in dem in eine Pflanze eingeführten Konstrukt eine oder mehrere Terminatorsequenzen eingesetzt werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die einen GOS2- oder einen HMGP-Promotor, welcher im Wesentlichen SEQ ID NR: 669 bzw. SEQ ID NR: 747 ähnelt, und die für das AUX/IAA-Polypeptid codierende Nukleinsäure enthält.
  • Zusätzliche Steuerungselemente können Transkriptions- sowie Translationsverstärker einschließen. Dem Fachmann werden für eine Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignete Terminator- und Verstärkersequenzen bekannt sein. Zur Erhöhung der Menge an reifer Nachricht, die sich im Zytosol anreichert, kann man in der 5'-untranslatierten Region (UTR) oder in der Codierungssequenz außerdem eine Intronsequenz einfügen, wie im Definitionsabschnitt beschrieben. Bei anderen Kontrollsequenzen (neben Promotor, Verstärker, Silencer, Intronsequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) kann es sich um Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente handeln. Solche Sequenzen sollten dem Fachmann bekannt sein oder sollten sich von diesem leicht in Erfahrung bringen lassen.
  • Die genetischen Konstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprung-Sequenz enthaften, welche für die Beibehaltung und/oder Replikation in einem spezifischen Zelltyp erfordert wird. Ein Beispiel besteht in dem Fall, dass ein genetisches Konstrukt in einer Bakterienzelle als ein episomales genetisches Element (z. B. Plasmid- oder Cosmid-Molekül) gehalten werden muss. Bevorzugte Replikationsursprünge schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den f1-ori und colE1 ein.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
  • Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie denjenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktionsfähig sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenzmoleküle, die für einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäuresequenz transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind im Fachgebiet bekannt, verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt 'Definitionen' beschrieben.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Einbringen und die Expression einer beliebigen für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure, wie hierin oben definiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt genauer gesagt ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit Besteigenden ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere einem erhöhten Samenertrag bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle, von einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codiert; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen sein, die zum Codieren eines ASPAT-Polypeptids oder eines MYB91-Polypeptids oder eines GASA-Polypeptids oder eines AUX/IAA-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist ausführsicher im Abschnitt ”Definitionen” hierin beschrieben.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß einem bevorzugten Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” hierin beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann vertraut ist. Geeignete Verfahren können in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer gefunden werden.
  • Nach einer Transformation werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen im Allgemeinen hinsichtlich Gegenwart von einem oder mehreren Markern selektiert, welche von pflanzlich exprimierbaren Genen codiert werden, die mit dem Gen von Interesse co-transferiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial in der Regel selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nicht-transformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und nach einer anfänglichen Wachstumsperiode einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterworfen werden. Eine weitere Möglichkert besteht im Wachsenlassen der Samen, zutreffendenfalls nach Sterilisation, auf Agarplatten unter Anwendung eines geeigneten Selektionsmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ werden die transformierten Pflanzen hinsichtlich der Gegenwart eines selektierbaren Markers, wie denjenigen, die oben beschrieben sind, gescreent.
  • Im Anschluss an DNA-Transfer und Regeneration können vermeintlich transformierte Pflanzen auch, zum Beispiel unter Anwendung von Southern-Analyse, hinsichtlich der Gegenwart des Gens von Interesse, der Kopienzahl und/oder der genomischen Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich können Expressionsspiegel der neu eingeführten DNA unter Anwendung von Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei beide Techniken dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
  • Die erzeugten, transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) geselbstet und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten, transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen; klonale Transformanten (z. B. wobei alle Zellen transformiert sind, um die Expressionskassette zu enthalten); Propfungen von transformierten und nicht-transformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock an einen nicht-transformierten Spross gepropft wird) sein.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich in deutlicher Weise auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime bzw. Verbreitungseinheiten davon. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primären transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, welche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung darin besteht, dass die Nachkommen dieselben genotypischen und/oder phänotypischen Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform in den Verfahren gemäß der Erfindung hervorgebracht werden.
  • Die Erfindung schließt auch Wirtszellen ein, die eine isolierte Nukleinsäure enthalten, welche für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuresequenzen oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind im Prinzip in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
  • Die Verfahren der Erfindung sind in vorteilhafter Weise auf eine beliebige Pflanze anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäumen oder Sträuchern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Nutzpflanze. Zu Beispielen von Nutzpflanzen zählen Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Luzerne, Raps, Leinsamen, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt ist die Pflanze eine monokotyledone Pflanze. Zu Beispielen von monokotyledonen Pflanzen zählt Zuckerrohr. Weiter bevorzugt ist die Pflanze ein Getreide. Zu Beispielen von Getreiden zählen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze wie, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stängel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, wobei diese erntefähigen Teile eine rekombinante Nukleinsäure enthalten, die für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid kodiert. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß eines bevorzugten Merkmals der Erfindung ist die modulierte Expression eine erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
  • Wie oben erwähnt, wird ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codiert, durchgeführt, indem man eine für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-like-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz in eine Pflanze einbringt und dort exprimiert; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften, auch unter Verwendung anderer gut bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, die für ASPAT-Polypeptide oder GASA-Polypeptide oder AUX/IAA-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser ASPAT-Polypeptide oder GASA-Polypeptide oder AUX/IAA-Polypeptide bei der Steigerung beliebiger der oben erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die für MYB91-Polypeptide, wie hierin beschrieben, codieren, und die Verwendung dieser MYB91-Polypeptide bei der Erhöhung beliebiger der zuvor erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen unter normalen Wachstumsbedingungen, unter abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen (vorzugsweise osmotischen Stress-Wachstumsbedingungen) und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit.
  • Die hierin beschriebenen Nukleinsäuren, die für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codieren, oder die ASPAT-Polypeptide oder MYB91-Polypeptide oder GASA-Polypeptide oder AUX/IAA-Polypeptide selbst können Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein für ein für ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene oder die ASPAT-Polypeptide selbst können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
  • Allelvarianten einer/eines für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure/Gens können ebenfalls Anwendung in markerunterstützten Züchtungsprogrammen finden. Solche Züchtungsprogramme erfordern machmal das Einbringen von allelischer Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von Allelvarianten mit unabsichtlich verursachtem sogenanntem ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung Allelvarianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen Allelvarianten der betreffenden Sequenz, welche erhöhten Ertrag und/oder ertragsbezogene Eigenschaften ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene Allelvarianten der betreffenden Sequenz enthalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige Allelvariante identifiziert worden ist, mit einer anderen Pflanze. Dies konnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
  • Nukleinsäuren, die für ASPAT-Polypeptide oder MYB91-Polypeptide oder GASA-Polypeptide AUX/IAA-Polypeptide codieren, können ebenfalls als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, sowie als Marker für mit diesen Genen gekoppelte Merkmale verwendet werden. Derartige Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwickeln. Eine derartige Verwendung von für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäuren erfordert lediglich eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die codierenden Nukleinsäuren können als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J., Fritsch, EF., und Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsverdauter pflanzlicher genomischer DNA können mit den codierenden Nukleinsäuren, die für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codieren, sondiert werden. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181) unterzogen wenden, um eine genetische Karte zu erstellen. Darüber hinaus können die Nukleinsäuren verwendet werden, um Southern-Blots zu sondieren, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs aus einer Auswahl von Individuen enthalten, welche Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und verwendet, um die Position der für ein ASPAT-Polypeptid oder ein MYB91-Polypeptid oder ein GASA-Polypeptid oder ein AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in der genetischen Karte zu berechnen, welche zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Anwendung von pflanzengenabgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung ist in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41, beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwenden der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Intercross-Populationen, Rückkreuzungs-Populationen, wahllos gekreuzte Populationen, beinahe-isogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al., in: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346, und darin zitierte Literaturstellen).
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden bei der direkten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH)-Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl derzeitige Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (mehrere kb bis einige hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), können Verbesserungen der Empfindlichkeit eine Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
  • Eine Vielzahl von auf Nukleinsäure-Amplifikation basierenden Verfahren zur genetischen und physikalischen Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotid-Verlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping bzw. Bestrahlungs-Hybridkartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure verwendet, um Primerpaare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen zu entwerfen und herzustellen. Das Entwerfen derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt in Verfahren unter Anwendung von PCR-basierter genetischer Kartierung kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
  • Was ASPAT-Polypeptide, was GASA-Polypeptide oder ein AUX/IAA-Polypeptid betrifft, so führen die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften kombiniert werden, wie etwa weiteren ertragssteigernden Eigenschaften, Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen Stressfaktoren, Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • Was MYB91-Polypeptide betrifft, so führen die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften kombiniert werden, wie etwa weiteren ertragssteigernden Eigenschaften, Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen Stressfaktoren, Toleranz gegen Herbizide, Insektizide, Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • Punkte
  • 1. Aspartat-Aminosäuretransferase (ASPAT)
    • 1. Verfahren zum Steigern von Ertragsmerkmalen in Pflanzen in Bezug auf Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT(Aspartat-Aminotransferase)-Polypeptid umfassend eine Domäne der Aminotransferase-Klasse I und II (Aminotran_1_2) (Interpro-Eintragsnummer: IPR004839; pfam-Eintragsnummer: PF00155) codiert, in einer Pflanze und gegebenenfalls Selektieren von Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen.
    • 2. Verfahren nach Punkt 1, wobei das ASPAT-Polypeptid umfassend eines oder mehr der folgenden Motive mit mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% zu einem oder mehr der folgenden Motive: (i) Motiv 1: NPTG (SEQ ID NR: 207), (ii) Motiv 2: IVLLHACAHNPTGVDPT (SEQ ID NR. 208), (iii) Motiv 3: SRLLILCSPSNPTGSVY (SEQ ID NR: 209), wobei jeder beliebige Aminosäurerest durch eine konservierte Aminosäure substituiert sein kann.
    • 3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
    • 4. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, für ein beliebiges der in Tabelle A aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
    • 5. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A1 angegebenen Proteine codiert.
    • 6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 7. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nichrtstressbedingungen erhalten werden.
    • 8. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Dürrestress-, Salzstress- oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
    • 9. Verfahren gemäß einem der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
    • 10. Verfahren gemäß einem der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem für grünes Gewebe spezifischen Promotor, vorzugsweise mit einem PR-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem PR-Promotor aus Reis, verbunden ist.
    • 11. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 10, wobei die Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, mehr bevorzugt aus der Gattung Oryza, ganz besonders bevorzugt aus Oryza sativa.
    • 12. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die bzw. der durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 11 erhältlich ist, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, umfasst.
    • 13. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, wie in den Punkten 1 oder 2 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
    • 14. Konstrukt gemäß Punkt 13, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist.
    • 15. Konstrukt gemäß Punkt 13, wobei eine der Steuerungssequenzen ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, vorzugsweise ein PR-Promotor, ganz besonders bevorzugt ein PR-Promotor aus Reis, ist
    • 16. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 13 bis 15 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 17. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 13 bis 15 transformiert ist.
    • 18. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (a) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die fix ein ASPAT-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (b) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
    • 19. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
    • 20. Transgene Pflanze gemäß Punkt 11, 17 oder 18 oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer, ist
    • 21. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 20, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
    • 22. Produkte, gewonnen aus einer Pflanze gemäß Punkt 20 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 18.
    • 23. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung von Samenertrag und/oder Spross biomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 24. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Reihe: (a) eine Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 81, 147, 153, 183 und 185; (b) das Komplement einer Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 81, 147, 153, 183 und 185; (c) eine Nukleinsäure, die für das Polypeptid gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 184 und 186 codiert, vorzugsweise aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, wobei die isolierte Nukleinsäure von einer Polypeptidsequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 184 und 186 abgeleitet werden kann und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (d) eine Nukleinsäure mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen aus Tabelle A1, die weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vemittelt; (e) ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (f) eine Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 184 und 186 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A1, die vorzugsweise verstärkte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt.
    • 25. Isoliertes Polypeptid ausgewählt aus der folgenden Reihe: (i) eine Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 184 und 186; (ii) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71% 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 184 und 186 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A, die vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (iii) Derivate von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (i) oder (ii) oben.
  • 2. ”MYB91-like” Transkriptionsfaktor (MYB91)
    • 1. Verfahren zum Steigern von Ertragsmerkmalen in Pflanzen in Bezug auf Kontrollpflanzen, umfassend das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein ”MYB91-like Transcription Factor” (MYB91)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das MYB91-Polypeptid Folgendes umfasst: (i) (i), mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 269; und (ii), mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 270; und (iii) mit zunehmender Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer konservierten Domäne gemäß SEQ ID NR: 271, und gegebenenfalls Selektieren auf Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen.
    • 2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das MYB91-Polypeptid mit zunehmender Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 98% 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einem wie in SEQ ID NR: 221 wiedergegebenen Polypeptid umfasst.
    • 3. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das MYB91-Polypeptid mit zunehmender Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer der Polypeptidsequenzen, die in der Tabelle A2 hierin angegeben sind, umfasst.
    • 4. Verfahren gemäß einem der Punkte 1, wobei das MYB91-Polypeptid, wenn es bei der Erstellung eines phylogenetischen Baums von MYB-DNA-Bindungsdomänen-Polypeptiden, wie demjenigen, der in 4 abgebildet ist, verwendet wird, eher Cluster mit der MYB91-Gruppe von Polypeptiden bildet als mit einer der anderen Gruppen.
    • 5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein MYB91-Polypeptid codiert, durch eine der in Tabelle A2 angegebenen Nukleinsäuresequenz-SEQ ID-NRn oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die zum Hybridisieren mit einer der in Tabelle A2 angegebenen Nukleinsäuresequenzen-SEQ ID-NRn in der Lage ist, oder ein Komplement repräsentiert wird.
    • 6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einer der in Tabelle A2 angegebenen Polypeptidsequenz-SEQ ID-NRn codiert
    • 7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die erhöhte Expression durch ein oder mehrere aus: T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING oder homologe Rekombination, bewirkt wird.
    • 8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die erhöhte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die für ein MYB91-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
    • 9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die erhöhte ertragsbezogene Eigenschaft eines oder mehrere ist von: erhöhter Pflanzenhöhe, erhöhtem Harvest Index (HI) und/oder erhöhtem Tausenkorngewicht (TKW).
    • 10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor verbunden ist.
    • 11. Verfahren gemäß Punkt 10, wobei es sich bei dem konstitutiven Promotor um einen GOS2-Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor aus Reis, ganz besonders bevorzugt einen durch SEQ ID NR: 272 wiedergegebenen GOS2-Promotor handelt
    • 12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein MYB91-Polypeptid codiert, aus einer Pflanze, bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Salicaceae stammt und die Nukleinsäuresequenz ganz besonders bevorzugt aus Populus trichocarpa stammt.
    • 13. Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen) oder Pflanzenzellen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die Pflanze bzw. der Teil oder die Zelle davon ein isoliertes Nukleinsäuretransgen umfasst, das für ein MYB91-Polypeptid codiert.
    • 14. Konstrukt, umfassend: (a) eine Nukleinsäuresequenz, die für ein MYB91-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 1 bis 6 definiert; (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationsequenz.
    • 15. Konstrukt gemäß Punkt 14, wobei die Steuerungssequenz ein konstitutiver Promotor ist.
    • 16. Konstrukt gemäß Punkt 15, wobei es sich bei dem konstitutiven Promotor um einen GOS2-Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor aus Reis, ganz besonders bevorzugt eine durch SEQ ID NR: 272 wiedergegebene GOS2-Sequenz handelt.
    • 17. Verwendung eines Konstrukts gemäß einem der Punkte 14 bis 16 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften eine oder mehrere sind von: erhöhter Pflanzenhöhe, erhöhtem Harvest Index (HI) und erhöhtem Tausendkorngewicht (TKW).
    • 18. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß einem der Punkte 14 bis 16 transformiert ist.
    • 19. Verfahren für die Produktion von transgenen Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die für ein MYB91-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 1 bis 7 definiert, in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils bzw. der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
    • 20. Transgene Pflanze mit erhöhten samenertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche aus der erhöhten Expression einer isolierten Nukleinsäuresequenz resultieren, die für ein MYB91-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 1 bis 6 definiert, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, welche(r) aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist
    • 21. Transgene Pflanze gemäß Punkt 13, 18 oder 20, wobei die Pflanze eine Kulturpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
    • 22. Erntefähige Teile, umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein MYB91-Polypeptid codiert, von einer Pflanze gemäß Punkt 21, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
    • 23. Produkte, gewonnen aus einer Pflanze gemäß Punkt 21 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 22.
    • 24. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die für ein MYB91-Polypeptid codiert, wie in einem der Punkte 1 bis 6 definiert, bei der Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften, welche eines oder mehrere von: erhöhter Pflanzenhöhe, erhöhtem Harvest Index (HI) und erhöhtem Tausendkorngewicht (TKW) umfassen.
  • 3. ”Gibberellic Acid Stimulated Arabidopsis” (GASA)
    • 1. Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein GASA-Polypeptid codiert, wobei die Sequenz des GASA-Polypeptids eine Pfam-PF02704-Domäne umfasst, mit der Maßgabe, dass es sich bei dem GASA-Protein nicht um GASA4 gemäß SEQ ID NR: 295 handelt
    • 2. Verfahren nach Punkt 1, wobei das GASA-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (b) Motiv 4 (SEQ ID NR: 277), (c) Motiv 5 (SEQ ID NR: 278), (d) Motiv 6 (SEQ ID NR: 279)
    • 3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein GASA-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
    • 4. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 3, wobei die für ein GASA-Polypeptid codierende Nukleinsäure für eines der in Tabelle A3 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure oder eine zum Hybridisieren mit einer solchen Nukleinsäure fähige Nukleinsäure ist.
    • 5. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem der in Tabelle A3 angegebenen Proteine codiert.
    • 6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
    • 7. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
    • 8. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Dürrestress-, Salzstress- oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
    • 9. Verfahren gemäß einem der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
    • 10. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 9, wobei die für ein GASA-Polypeptid codierende Nukleinsäure pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze.
    • 11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 10, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein GASA-Polypeptid codiert, umfasst.
    • 12. Konstrukt, umfassend: (a) Nukleinsäure, die für ein GASA-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert; (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationsequenz.
    • 13. Konstrukt gemäß Punkt 12, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein G052-Promotor, ganz besonders bevorzugt ein G052-Promotor aus Reis, ist.
    • 14. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 12 oder 13 transformiert ist.
    • 16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein GASA-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzeile unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
    • 17. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche auf die modulierte Expression einer Nukleinsäure, die für ein GASA-Polypeptid codiert, wie in Punkt 1 oder 2 definiert, zurückzuführen sind, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
    • 18. Transgene Pflanze gemäß Punkt 11, 15 oder 17, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
    • 19. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 18, wobei die erntefähigen Teile Samen sind.
    • 20. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19 abgeleitet sind.
    • 21. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein GASA-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere der Erhöhung des Samenertrags in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • 4. Auxin/Indolessigsäure-Gene (AUX/IAA)
    • 1. Verfahren zur Steigerung ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die für ein AUX/IAA-Polypeptid umfassend eine AUX/IAA-Domäne codiert, in einer Pflanze.
    • 2. Verfahren nach Punkt 1, wobei die AUX/IAA-Domäne, mit zunehmender Bevorzugung, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47% 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68% 69% 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäure einer AUX/IAA-Domäne, vorzugsweise zu der AUX/IAA-Domäne von einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A4, am stärksten bevorzugt zu der AUX/IAA-Domäne gemäß SEQ ID NR: 432, entsprechend den Aminosäuren, die sich zwischen den Aminosäurekoordinaten 5 bis 171 befinden, aufweist.
    • 3. Verfahren nach Punkt 1, wobei es sich bei dem AUX/IAA-Polypeptid um ein ”IAA14-like”-Polypeptid handelt, eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst: (i) Motiv 13: SEQ ID NR: 739, (ii) Motiv 14: SEQ ID NR: 740, (iii) Motiv 15: SEQ ID NR 741, (iv) Motiv 16: SEQ ID NR 742, (v) Motiv 17: SEQ ID NR: 743, (vi) Motiv 18: SEQ ID NR: 744.
    • 4. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 3, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein AUX/IAA-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
    • 5. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 4, wobei die Nukleinsäure, die für ein AUX/IAA-Polypeptid codiert, für ein beliebiges der in Tabelle A4 oder in Tabelle A5 aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
    • 6. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 5, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A4 oder in Tabelle A5 angegebenen Proteine codiert.
    • 7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Punkte, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfasst.
    • 8. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 7, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nichrtstressbedingungen erhalten werden.
    • 9. Verfahren gemäß einem der Punkte 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am meisten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
    • 10. Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 9, wobei die Nukleinsäure, die für ein AUX/IAA-Polypeptid codiert, pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer monokotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, mehr bevorzugt aus der Gattung Oryza, am meisten bevorzugt aus Oryza sativa.
    • 11. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die bzw. der durch ein Verfahren gemäß einem der Punkte 1 bis 10 erhältlich ist, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein AUX/IAA-Polypeptid codiert, umfasst.
    • 12. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, codierend für ein AUX/IAA-Polypeptid, wie in einem der Punkte 1 oder 2 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
    • 13. Konstrukt gemäß Punkt 12, wobei es sich bei einer der Steuerungssequenzen um einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt einen GOS2-Promotor aus Reis handelt.
    • 14. Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 12 oder 13 in einem Verfahren zur Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
    • 15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 12 oder 13 transformiert ist.
    • 16. Verfahren für die Produktion von transgenen Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer für ein wie unter Punkt 1 oder 2 definiertes AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
    • 17. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen als Resultat der modulierten Expression einer für ein wie unter Punkt 1 oder 2 definiertes AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure oder aus dieser transgenen Pflanze gewonnene transgene Pflanzenzelle.
    • 18. Transgene Pflanze gemäß Punkt 11, 15 oder 17 oder daraus gewonnene transgene Pflanzenzelle, wobei es sich bei der Pflanze um eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff bzw. Zwerghirse, Milo und Hafer handelt
    • 19. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
    • 20. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19 abgeleitet sind.
    • 21. Verwendung einer für ein AUX/IAA-Polypeptid codierenden Nukleinsäure zum Erhöhen des Ertrags, insbesondere zum Erhöhen des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Beschreibung der Figuren
  • Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben, in denen:
  • 1 ein multiples Alignment von ASPAT-Polypeptiden zeigt.
  • 2 einen phylogenetischen Baum von ASPAT-Polypeptiden zeigt.
  • 3 den binären Vektor, der für die verstärkte Expression einer für ASPAT codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promoters (pGOS2) oder eines Reis-PR-Promotors in Oryza sativa, zeigt.
  • 4 die phylogenetische Verwandtschaft zwischen den MYB-DNA-Bindungsdomänen-Polypeptiden aus Arabidopsis thaliana und aus anderen Pflanzen auf Grundlage der Aminosäuresequenz (gemäß Stracke et al. (2004) Current Opinion in Plant Biology 2001, 4: 447–456) zeigt Mit den MYB-Polypeptiden wurden unter Verwendung von PHYLIP Cluster gebildet, und Motive wurden unter Verwendung von MEME nachgewiesen. Die Polypeptide, die sich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignen, bilden mit MYB91 Cluster, umkringelt und durch einen schwarzen Pfeil gekennzeichnet.
  • 5 ein mit ClustalW 1.81 erstelltes multiples Sequenz-Alignment der MYB91-Polypeptide aus Tabelle A2 zeigt. Zwei MYB-DNA-Bindungsdomänen mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778, ein MYB-Transkriptionsfaktor mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR015495 und eine C-terminale konservierte Domäne sind unterhalb der Konsensussequenz mit den Buchstaben X gekennzeichnet.
  • 6 den binären Vektor für die verstärkte Expression einer Nukleinsäuresequenz zeigt, die für ein MYB91-Polypeptid codiert, unter der Kontrolle eines in Pflanzen funktionellen Promoters in Oryza-sativa-Pflanzen.
  • 7 die Domänenstruktur von SEQ ID NR: 276 zeigt, wobei die GASA-Domäne PF02704 fett eingezeichnet ist. Das mutmaßliche Sekretionssignalpeptid (Aminosäure 1-24) ist unterstrichen.
  • 8 ein multiples Alignment von verschiedenen GASA-Proteinen zeigt Die Motive 4 bis 12 oder andere Motive können hiervon abgeleitet werden.
  • 9 einen phylogenentischen Baum von Arabidopsis-GASA-Proteinen (Roxrud et al. 2007) zeigt. Ausgehend von einem multiplen Alignment mit ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22, 4673–4680, 1994) erhielt man einen ”Neighbour-Joining” phylogenetischen Baum unter Verwendung der Software PAUP v. 4.0 (http://www.paup.csit.fsu.edu), und das statistische Vertrauen wurde durch Bootstrap-Analyse mit 1.000 Probenahmenwiederholungen berechnet.
  • 10 den binären Vektor für erhöhte Expression einer für GASA-like codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (GOS2) in Oryza sativa zeigt.
  • 11 ein multiples Alignment von AUX/IAA-Polypeptiden zeigt.
  • 12 den binären Vektor für erhöhte Expression einer für AUX/IAA codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-GOS2-Promotors (pGOS2) in Oryza sativa zeigt.
  • 13 die Domänenstruktur von SEQ ID NR: 738 zeigt, wobei die AUX/IAA-Domäne fett gedruckt ist und die konservierten Motive unterstrichen sind.
  • 14 ein multiples Alignment von ”IAA14-like”-Proteinsequenzen zeigt.
  • 15 einen ”Neighbour-Joining Baum der Arabidopsis IAA-Proteine (Remington et al., 2004) zeigt. Die SEQ ID NR: 738 ist von IAA14 in Gruppe A dargestellt, und ”IAA14-like”-Proteine bilden bevorzugt in dieser Gruppe A Cluster.
  • 16 den binären Vektor zeigt, der für die verstärkte Expression einer für ”IAA14-like” codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Reis-HMGP-Promoters (pHMGP) in Oryza sativa verwendet wurde.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche alleinig der Veranschaulichung dienen. Mit den folgenden Beispielen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung vollständig zu definieren oder anderweitig zu begrenzen.
  • DNA-Manipulation: Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual. 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R.D.D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) und Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
  • Beispiel 1: Identifizieren von Sequenzen, die mit der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind
  • Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) gehustet werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) identifiziert. Das Programm wurde eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. So wurde zum Beispiel das durch die in der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleinsäure codierte Polypeptid für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg. In einigen Fallen lassen sich die Vorgabeparameter anpassen, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann man den E-Wert erhöhen, so dass weniger stringente Übereinstimmungen angezeigt werden. Auf diese Weise lassen sich kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifizieren.
  • 1.1. Aspartat-Aminosäuretransferase (ASPAT)
  • In Tabelle A1 findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen.
  • Tabelle A1: Beispiele für ASPAT-Polypeptide:
    Figure 01130001
  • Figure 01140001
  • Figure 01150001
  • In manchen Fällen sind entsprechende Sequenzen durch Forschungsinstitutionen wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA) provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryontic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken aus bestimmten Organismen, wie etwa die vom ”Joint Genome Institute” unterhaltenen, wie die Pappel-Genomsequenzen, gescreent worden.
  • Weiterhin hat der Zugang zu nicht öffentlichen Datenbanken die Identifizierung von anderen Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen mittels des BLAST-Algorithmus wie oben beschrieben ermöglicht.
  • 1.2. „MYB91 like transcription factor” (MYB91)
  • In Tabelle A2 findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen.
  • Tabelle A2: Beispiele für MYB91-Polypeptidsequenzen und codierende Nukleinsäuresequenzen:
    Figure 01160001
  • Figure 01170001
  • In manchen Fällen sind entsprechende Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR; beginnend mit TA), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryontic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für bestimmte Organismen erzeugt worden, wie etwa vom ”Joint Genome Institute”. Weiterhin hat der Zugang zu nicht öffentlichen Datenbanken die Identifizierung von neuen Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen ermöglicht.
  • 1.3. „Gibberellic acid stimulated Arabidopsis” (GASA)
  • In Tabelle A3 findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen.
  • Tabelle A3: Beispiele für GASA-Polypeptide:
    Figure 01170002
  • Figure 01180001
  • Figure 01190001
  • In manchen Fällen sind entsprechende Sequenzen durch Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryontic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren.
  • 1.4. Auxin/Indolessigsäure-Gene (AUX/IAA)
    Figure 01190002
  • Figure 01200001
  • Figure 01210001
  • Figure 01220001
  • Figure 01230001
  • 1.5. IAA14-Polypeptide
  • In Tabelle A5 findet sich eine Liste der mit der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandten Nukleinsäuresequenzen.
  • Tabelle A5: Beispiele für IAA14-like-Polypeptide:
    Figure 01230002
  • Figure 01240001
  • In manchen Fällen sind entsprechende Sequenzen durch Forschungsinstitutionen wie The Institute for Genomic Research (TIGR) provisorisch zusammengetragen und öffentlich zugänglich gemacht worden. Mit der Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) lassen sich derartige Sequenzen entweder durch Stichwort-Suche oder durch Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenz von Interesse identifizieren.
  • Beispiel 2: Alignment der mit der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptidsequenz verwandten Sequenzen
  • 2.1. Aspartat-Aminosäuretransferase (ASPAT)
  • Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des ClustalW 2.0-Algorithmus für progressives Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) mit Standardeinstellungen (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Gonnet (oder Blosum 62 (wenn ein Alignment mit Polypeptiden erstellt wird)), Lückenöffnungsstrafwert 10, Lückenerweiterungsstrafwert: 0,2) durchgeführt. Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt. Das Alignment der ASPAT-Polypeptide erfolgt in 1.
  • Ein phylogenetischer Baum der ASPAT-Polypeptide (2) wurde mit Hilfe eines Neighbourjoining-Clusterungsalgorithmus erstellt, wie er im Programm AlignX aus dem Vector NTI (Invitrogen) zur Verfügung gestellt wird. Die Polypeptide bildeten in fünf phylogenetischen Hauptklassen, nämlich Klasse 1, Klasse 2, Klasse 3, Klasse 4 und Klasse 5, Cluster. Tabelle B1 zeigt die Polypeptide, die innerhalb der fünf Klassen auftreten. Die Polypeptide von Klasse 5 wurden als ”Outgroup” in der phylogenetischen Analyse verwendet und stellen keine ASPAT-Polypeptide dar. Die Polypeptide der Klasse 5 sind daher nicht Bestandteil der hierin beschriebenen Erfindung. Die Polypeptide innerhalb von Klasse 1 und 2 wenden typischerweise im Zytosol oder im Chloroplasten exprimiert. Die Klasse 5 entspricht der neuen Klasse der von De La Torre et al. 2006 definierten ASAPT-Polypeptide. Die Polypeptide innerhalb von Klasse 4 werden typischerweise in den Mitochondrien exprimiert. Tabelle B1: phylogenetische Klassen der ASPAT-Polypeptide
    Figure 01250001
  • Figure 01260001
  • Figure 01270001
  • Figure 01280001
  • Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des ClustalW 2.0-Algorithmus für progressives Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500) mit Standardeinstellungen (langsames Alignment, Ähnlichkeitsmatrix: Gonnet, Lückenöffnungsstrafwert 10, Lückenerweiterungsstrafwert: 0,2) durchgeführt. Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt.
  • 2.2. „MYB91 like transcription factor” (MYB91)
  • Ein Mehrfach-Sequenzalignment von allen der MYB91-Polypeptidsequenzen in Tabelle A2 wurde mit Hilfe des Algorithmus ClustalW 1.81 durchgeführt. Ergebnisse der Alignments sind in 5 der vorliegenden Anmeldung gezeigt. Zwei MYB-DNA-Bindungsdomänen mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778, ein MYB-Transkriptionsfaktor mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR015495, und eine C-terminale konservierte Domäne sind unter der Konsensus-Sequenz mit dem Buchstaben X bezeichnet.
  • 2.3. „Gibberellic acid stimulated Arabidopsis” (GASA)
  • Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des Programms AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weitverbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Die Vorgabewerte betragen für den Lückenöffnungsstrafwert 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert 0,1, und die gewählte Gewichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt. Die Sequenzkonservierung zwischen GASA -Polypeptiden liegt im Wesentlichen im C-terminalen Teil der Polypeptide, wobei Sequenzlänge und -zusammensetzung vom N-terminalen Teil gewöhnlich variabler sind. Das Alignment der GASA-Polypeptide erfolgt in 8.
  • 2.4. Auxin/Indolessigsäure-Gene (AUX/IAA)
  • Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des Programms AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weitverbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Das aligment wurde mit Standardeinstellungen durchgeführt: Lückenöffnungsstrafwert 10, der Lückenerweiterungsstrafwert 0,2. Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt. Es besteht ein Alignment der AUX/IAA-Polypeptide (11).
  • In der Konsensussequenz sind die hochkonservierten Aminosäurereste gekennzeichnet.
  • 2.5. IAA14-Polypeptide
  • Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde mit Hilfe des Programms AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weitverbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Die Vorgabewerte betragen für den Lückenöffnungsstrafwert 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert 0,1, und die gewählte Gewichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Zur weiteren Optimierung des Alignments wurde eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt. Die Sequenzkonservierung zwischen IAA14-Polypeptiden liegt im Wesentlichen in der C-terminalen Hälfte der Polypeptide. Das Alignment der IAA14-Polypeptide erfolgt in 14.
  • Beispiel 3: Berechnung von globaler prozentualer Identität zwischen zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Polypeptidsequenzen
  • 3.1. Aspartat-Aminosäuretransferase (ASPAT)
  • Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, werden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahrens bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Globat-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lockenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
  • Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:
    Wertungsmatrix: Blosum62
    Erstlücke: 12
    Lückenerweiterung: 2
  • Es können auch eine MATGAT-Tabelle für das lokale Alignment einer spezifischen Domäne oder Daten bezüglich der Identitats/Ähnlichkeits-% zwischen spezifischen Domänen erzeugt werden.
  • 3.2. „MYB91 like transcription factor” (MYB91)
  • Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahrens bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
  • Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:
    Wertungsmatrix: Blosum62
    Erstlücke: 12
    Lückenerweiterung: 2
  • Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle C1 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt (mit Ausnahme der Polypeptid-Teilsequenzen).
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten Volllängenpolypeptidsequenzen kann, verglichen mit der SEQ ID NR: 221, lediglich 52% Aminosäureidentität betragen.
  • Figure 01320001
  • Die prozentuale Aminosäureidentität lässt sich signifikant erhöhen, wenn man die am meisten konservierte Region der Polypeptide vergleicht Vergleicht man zum Beispiel die Aminosäuresequenz eines MYB-DNA-Trankriptionsfaktors mit einem InterPro-Eintrag IPR015495 gemäß SEQ ID NR: 268 oder einer MYB-DNA-Bindungsdomäne mit einer InterPro-Eintragsnummer IPR014778 gemäß SEQ ID NR: 269 und/oder 270 oder einer C-terminal konservierten Domäne gemäß SEQ ID NR 271 mit den entsprechenden korrespondierenden Domänen der Polypeptide von Tabelle A1, so erhöht sich die prozentuale Aminosäureidentität signifikant (mit zunehmender Bevorzugung mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität).
  • 3.3. „Gibberellic acid stimulated Arabidopsis” (GASA)
  • Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgesteltt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
  • Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:
    Wertungsmatrix: Blosum62
    Erstlücke: 12
    Lückenerweiterung: 2
  • Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle C2 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale angegeben und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben.
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten GASA-Polypeptidsequenzen kann, verglichen mit SEQ ID NR: 276, lediglich 22,2% Aminosäureidentität betragen.
  • Tabelle C2: MatGAT-Ergebnisse für globale Ähnlichkeit und Identität über die DNA-Bindungsdomäne der Polypeptidsequenzen.
    Figure 01340001
  • Figure 01350001
  • Figure 01360001
  • Figure 01370001
  • Figure 01380001
  • Figure 01390001
  • Figure 01400001
  • Figure 01410001
  • Figure 01420001
  • Figure 01430001
  • Figure 01440001
  • Figure 01450001
  • 3.4. Auxin/Indolessigsäure-Gene (AUX/IAA)
  • Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren, nämlich der MatGAT(Matrtx Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka) bestimmt. Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix.
  • Die Parameter, die im Vergleich verwendet werden können, sind:
    Wertungsmatrix: Blosum62
    Erstlücke: 12
    Lückenerweiterung: 2
  • 3.5. IAA14-Polypeptide
  • Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12 und einem Lückenerweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
  • Die im Vergleich verwendeten Parameter waren:
    Wertungsmatrix: Blosum62
    Erstlücke: 12
    Lückenerweiterung: 2
  • Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle C3 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben.
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten IAA14-1ike-Polypeptidsequenzen kann, verglichen mit der SEQ ID NR: 738 (A.thaliana_AT4G14550.1), lediglich 26,3% Aminosäureidentität betragen, liegt aber üblicherweise über 35%.
  • Tabelle C3: MatGAT-Ergebnisse für globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen.
    Figure 01470001
  • Figure 01480001
  • Figure 01490001
  • Figure 01500001
  • Beispiel 4: Identifizierung von Domänen, die in Polypeptidsequenzen enthalten sind, die sich für die Durchführung der Verfahren der Erfindung eignen
  • 4.1. Aspartat-Aminosäuretransferase (ASPAT)
  • Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, bei denen verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwendet werden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sauger Institute in Großbritannien gehostet. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien gehostet.
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz gemäß SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 2 und SEQ ID NR: 6 sind in der Tabelle D1, Tabelle D2 bzw. Tabelle D3 dargestellt.
  • Tabellen D1, D2, D3: Ergebnisse des InterPro-Scans (Haupteintragsnummern) der durch SEQ ID NR: 76 wiedergegebenen Polypeptidsequenz.
  • Tabelle D1
    Figure 01500002
  • Figure 01510001
  • Tabelle D2
    Figure 01510002
  • Figure 01520001
  • Tabelle D3
    Figure 01520002
  • 4.2. „MYB91 like transcription factor” (MYB91)
  • Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien gehostet.
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 221 repräsentiert, sind in der Tabelle D4 dargestellt.
  • Tabelle D4: Ergebnisse des InterPro-Scans der durch SEQ ID NR: 221 wiedergegebenen Polypeptidsequenz.
    Figure 01530001
  • 4.3. „Gibberellic acid stimulated Arabidopsis” (GASA)
  • Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modelle, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien gehostet bzw. gehostet Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien gehostet.
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 2 repräsentiert, sind in der Tabelle D5 dargestellt. Tabelle D5: Ergebnisse des InterPro-Scans (Hauptzugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie sie durch die SEQ ID NR: 276 repräsentiert wird.
    Datenbank Eintragsnummer Eintragsbezeichnung Aminosäurekoordinaten in SEQ ID NR 2
    InterPro IPR003854 Gibberellin regulated protein
    HMMPfam PF02704 GASA 5-114
  • 4.4. Auxin/Indolessigsäure-Gene (AUX/IAA)
  • Das Vorhandensein konservierter Proteindomänen in SEQ ID NR: 432 wurde durch Durchsuchen der Pfam-Datenbank bestimmt. Bei Pfam handelt es sich um eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien gehostet.
  • Die Ergebnisse der Pfam mit der Suchsequenz, wie durch SEQ ID NR: 432 repräsentiert, sind in der Tabelle D6 dargestellt. Tabelle D6: Ergebnisse der Pfam-Suche (Haupteintragsnummern) der durch SEQ ID NR: 432 wiedergegebenen Polypeptidsequenz.
    Pfam-A Beschreibung Art des Eintrags Aminosäurekoordinate der Domäne PF02309 in SEQ ID NR: 2 HMM Bits-Score E-Wert Alignmentmodus
    Start End From To
    AUX_IAA AUX/IAA family Family PF02309 5 171 1 269 70,3 6,9e-18 Is
  • Der verwendete Alignment-Modus ist der so genannte ”Is”-Modus. Die in dem Modell eingesetzten Parameter sind in Tabelle D7 angegeben. Tabelle D7: HMM-Modell Is-Modell: hmmbuild -F HMM_Is SEED hmmcalibrate -cpu 1 -seed 0 HMM_Is
    Parameter Is
    Sequenz Domäne
    Gathering cut-off -83 -83
    Trusted cut-off -82 -82
    Noise cut-off -83.5 -83.5
  • 4.5. IAA14-Polypeptide
  • Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine verwenden, um Proteinsignaturen abzuleiten. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Bei Pfam handelt es sich um erne große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, die viele herkömmliche Proteindomänen und -familien umfasst. Pfam wird am Server des Sauger Institute in Großbritannien bereitgehalten bzw. gehostet. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien bereitgehalten.
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 738 wiedergegeben, sind in der Tabelle D8 dargestellt. Tabelle D8: Ergebnisse des InterPro-Scans (Haupteintragsnummern) der durch SEQ ID NR: 738 wiedergegebenen Polypeptidsequenz.
    Datenbank Eintragsnummer Eintragsbezeichnung Aminosturekoordinaten in SEQ ID NR 738
    InterPro IPR003311 AUX/IAA protein
    HMMPfam PF02309 AUX_IAA 1-220
    InterPro IPR011525 Aux/IAA-ARF-dimensation
    ProfileScan PS50962 IAA_ARF 111-211
    InterPro NULL NULL
    superfamily SSF54277 CAD & PB1 domains 106-209
  • Beispiel 5: Topologie-Vorhersage der für die Durchführung der Erfindung geeigneten Polypeptidsequenzen
  • 5.1. Aspartat-Aminosäuretransferase (ASPAT)
  • TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryontischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung bzw. Ortszuweisung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Züverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) gehostet.
  • Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltstelle vorhergesagt werden.
  • Eine Anzahl von Parameter wurde ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussbedingungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltstellen (Ja oder Nein).
  • Die durch das GRP repräsentierten Proteinsequenzen werden für die Suche in TargetP 1.1 verwendet. Die Organismengruppe ”Pflanze” wird gewählt, es werden keine Ausschlussbedingungen bzw. Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wird angefordert.
  • Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
    • • ChloroP 1.1, gehostet auf dem Server der Technical University of Denmark;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, gehostet auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, gehostet auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada;
    • • TMHMM, gehostet auf dem Server der Technical University of Denmark.
  • 5.2. „Gibberellic acid stimulated Arabidopsis” (GASA)
  • TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryotischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung bzw. Ortszuweisung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminaien Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) gehostet.
  • Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
  • Es wurde eine Anzahl von Parameter ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussbedingungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
  • Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der durch SEQ ID NR: 221 wiedergegebenen Polypeptidsequenz sind in der Tabelle E1 aufgeführt. Die Organismengruppe ”Pflanze” wurde gewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen bzw. Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert. Es wird vorhergesagt, dass die durch SEQ ID NR: 221 wiedergegebene Polypeptidsequenz sezerniert wird, und zwar mit einer Sekretionssignalsequenz von 24 Aminosäuren. Tabelle E1: TargetP 1.1-Analyse der durch SEQ ID NR: 221 wiedergegebenen Polypeptidsequenz
    Länge (AA) 114
    chloroplastisches Transitpeptid 0,022
    mitochondriales Transitpeptid 0,022
    Signalpeptid des sekretorischen Pfades 0,960
    andere subzelluläre Ziele 0,023
    vorhergesagter Ort 5
    Verlässlichkeitsklasse 1
    vorhergesagte Länge des Transitpeptids 24
  • Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
    • • ChloroP 1.1, gehostet auf dem Server der Technical University of Denmark;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, gehostet auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, gehostet auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberta, Kanada;
    • • TMHMM, gehostet auf dem Server der Technical University of Denmark;
    • • PSORT (URL: psort.org);
    • • PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).
  • 5.3. Auxin/Indolessigsäure-Gene (AUX/IAA)
  • TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryotischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung bzw. Ortszuweisung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
  • Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
  • Eine Anzahl von Parametern wurde ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussbedingungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
  • Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
    • • ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada;
    • • TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
    • • PSORT (URL: psort.org);
    • • PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).
  • 5.4. IAA14-Polypeptide
  • TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryotischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung bzw. Ortszuweisung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Präsequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
  • Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
  • Eine Anzahl von Parameter wurde ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschlussbedingungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (Ja oder Nein).
  • Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der durch SEQ ID NR: 738 wiedergegebenen Polypeptidsequenz sind in der Tabelle E2 aufgeführt. Die Organismengruppe ”Pflanze” wurde gewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen bzw. Cutoffs definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert. Bei der subzellulären Lokalisierung der durch SEQ ID NR: 738 wiedergegebenen Polypeptidsequenz kann es sich um das Zytoplasma oder den Zellkern handeln, wobei kein Transitpeptid vorhergesagt wird. Tabelle E2: TargetP 1.1-Analyse der durch SEQ ID NR: 738 wiedergegebenen Polypeptidsequenz. Abkürzungen: Len, Länge; cTP, chloroplastisches Transitpeptid; mTP, mitochondriales Transitpeptid, SP, Signalpeptid des sekretorischen Pfades, other, andere subzelluläre Ziele, Loc, vorhergesagter Ort; RC, Verlässlichkeitsklasse; TPlen, vorhergesagte Länge des Transitpeptids
    Name Len cTP mTP SP other Loc RC TPlen
    AtIAA14 228 0,116 0,087 0,047 0,879 - 2 -
    cutoff 0,000 0,000 0,000 0,000
  • Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
    • • ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Kanada;
    • • TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
    • • PSORT (URL: psort.org);
    • • PLOC (Park and Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656–1663, 2003).
  • PSort-Analyse sagt eine nukleare Lokalisierung vorher, was sich mit den Daten aus der Literatur deckt (Fukaki et al., 2002).
  • Beispiel 6: Vorhersage der subzellulären Lokalisierung der Polypeptidsequenzen, die sich für die Durchführung der Verfahren der Erfindung eignen
  • 6.1. „MYB91-like”-Transkriptionsfaktor (MYB91)
  • Die Versuchsmethoden für die Lokalisierung des Proteins reichen von der Immunlokalisierung bis zum Tagging von Proteinen mit dem ”Green Fluorescent Protein” (GFP) oder der beta-Glucuronidase (GUS). Solche Verfahren zum Identifizieren der subzellulären Kompartimentierung von GRF-Polypeptiden sind in der Fachwelt gut bekannt.
  • Ein vorhergesagtes Kernlokalisierungssignal (NLS) kann in den Polypeptidsequenzen von Tabelle A2 durch multiples Sequenz-Alignment und anschließendes visuelles Beobachten entdeckt werden. Ein NLS ist eine oder mehr kurze Sequenzen von positiv geladenen Lysin- oder Argininresten.
  • Es wurde eine Vorhersage der Proteinlokalisierung aufgrund der Sequenzdaten mit einem Computer durchgeführt. Zu den Algorithmen, mit denen der Fachmann gut vertraut ist, und die bei den vom Swiss Institute for Bioinformatics gehosteten ExPASy Proteomics Werkzeugen verfügbar sind, zählen zum Beispiel PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, SignalP, TMHMM, TMpred und andere.
  • Der PSort-Algorithmus sagt für ein MYB91-Polypeptid gemäß SEQ ID NR: 221 als höchste Wahrscheinlichkeit (0,088) eine subzelluläre Lokalisierung im Zellkern voraus. Weiterhin werden zwei mutmaßliche NLS vorausgesagt
    Figure 01610001
  • Beispiel 7: Assay im Zusammenhang mit den für die Durchführung der Verfahren der Erfindung geeigneten Polypeptidsequenzen
  • 7.1. „MYB91-like”-Transkriptionsfaktor (MYB91)
  • MYB91-Polypeptide, die bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung (zumindest in ihrer nativen Form) nützlich sind, weisen typischerweise, jedoch nicht zwangsweise, eine transkriptionsregulierende Aktivität sowie eine Fähigkeit, mit anderen Proteinen zu interagieren, auf. Die DNA-Bindungsaktivität und die Protein-Protein-Interaktionen können leicht in vitro oder in vivo bestimmt werden, und zwar unter Verwendung von fachbekannten Techniken (zum Beispiel in Current Protocols in Molecular Biology, Band 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols). Die MYB91-Polypeptide enthalten zwei Myb-DNA-Bindungsdomäne (InterPro-Eintrag IPR014778).
  • 7.2. „Gibberellic Acid-Stimulated” Arabidopsis (GASA)
  • Transgene Pflanzen, die GASA-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) exprimieren, können eine verbesserte Toleranz gegenüber Hitzestress aufweisen. Ein Hitzetoleranz-Assay wird bei Ko et al. (2007) beschrieben: um die Hitzestress-Testreaktion bei der Samenkeimung zu überprüfen, werden Samen auf mit Wasser gesättigtem Filterpapier ausgesät Sie werden 18 h lang bei Raumtemperatur quellen gelassen, in 50°C umgestellt und 3 h einer Hitzebehandlung ausgesetzt. Danach werden sie in 22°C umgestellt. Das Erscheinen des Keimblatts wird nach 5 Tagen bestimmt Die Versuche werden für jede Linie (jeweils 30 Samen) in dreifacher Wiederholung durchgeführt. Um den Hitzetoleranz-Assay zu beurteilen, werden Samen auf normalem MS-Medium (Murashige & Skoog-Salzmischung) keimen gelassen. Sieben Tage alte Keimlinge werden 2,5 h lang 50°C ausgesetzt, und die überlebenden Pflanzen werden 10 Tage nachdem sie in normale Wachstumbedingungen zurückgestellt wurden, beurteilt Die Versuche wurden für jede Linie (jeweils 40 Samen) in dreifacher Wiederholung durchgeführt. Als Kontrollen werden Wildtyppflanzen verwendet.
  • 7.3. IAA14-Polypeptide
  • IAA14 soll in einem Hefe-zwei-Hybrid-System mit ARF7 und ARF19 interagieren (Fukaki et al., 2005): Die cDNA-Fragmente, die für das C-terminale Ende von Arabidopsis ARF5 (Aminosäuren 778-902), ARF7 (Aminosäuren 1031-1164) und ARF19 (Aminosäuren 952-1086) codieren, werden aus einer Blüten-cDNA-Bibliothek amplifiziert, und zwar unter Verwendung der folgenden Primer-Sätze: 5'-agaattcAATAGTAAAGGCTCATC ATGGCAG-3' und 5'-agtcgacGTTACATTTATGAAACAGAAGTCTTAAGATCG-3' für ARF5, 5'-agtcgacaAGCTCAGACTCAGCGAATGCG-3' und 5'-cagtcgacTCACCGGTTAAACGAAGTGGC-3' für ARF7, and 5'-gagaattcAATCAGACTCAACGAATGCG-3' und 5'-agtcgacCTATCTGTTGAAAGAAGCTGCAGC-3' für ARF19.
  • Das offene Leseraster von IAA14 in voller Länger wird mit zwei Primern, nämlich, 5'-cgaattcATGAACCTTAAGGAGACGGAGC-3' und 5'-tgtcgacTCATGATCTGTTCTTGAACTTCTCC-3', amplifiziert. Die PCR-Produkte werden in pCR-Blunt II TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) subkloniert und vor ihrer leserastergerechten Insertion in pAD-GAL4-2.1 oder pBD-GAL4 Cam (Stratagene, CA, USA) unter Verwendung der EcoRI/SalI-Stellen (IAA14, ARF5 und ARF19) bzw. SalI-Stellen (ARF7) sequenziert. Anschließend werden die Konstrukte in Saccharomyces-cerevisiae-Y190-Zellen eingeführt, und mit den Transformanten werden Assays auf beta-Galactosidaseaktivität wie zuvor beschrieben (Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laborstory Course Manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994) durchgeführt.
  • Beispiel 8: Klonieren der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz
  • 8.1. Root Hairless 1 (RHL1)
  • Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek entweder aus Arabidopsis thaliana-Keimlingen oder aus Oryza sativa (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt Die verwendete cDNA-Bibliothek und die verwendeten Primer sind in Tabelle F1 angegeben.
  • Tabelle F1
    Figure 01630001
  • Die Primer schließen die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination ein. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift. die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pASPAT, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der die SEQ ID NR: 1 umfassende ”entry clone” wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker, eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 218) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::ASPAT (3) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Auf ähnliche Weise wurden Expressionsvektoren umfassend die folgenden Merkmale erzeugt (Tabelle F2): Tabelle F2
    Vektor Promotor ASPT-Nukleinsäure (längstes ORF in SEQ ID NR:)
    ExprVect1 pPR (SEQ ID NR: 219) SEQ ID NR: 3
    ExprVect2 pGOS2 (SEQ ID NR: 218) SEQ ID NR 5
    ExprVect3 pPR (SEQ ID NR: 219) SEQ ID NR: 5
    ExprVect4 pGOS2 (SEQ ID NR: 218) SEQ ID NR: 7
    ExprVect5 pGOS2 (SEQ ID NR: 218) SEQ ID NR 9
  • 8.2. „MYB91-like” Transkriptionsfaktor (MYB91)
  • Falls nicht anders erwähnt, werden die DNA-Rekombinationstechniken gemäß den in Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York bzw. in Band 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols beschriebenen Standardprotokollen durchgeführt. Die Standardmaterialien und -methoden für pflanzenmolekulare Arbeiten sind von R.D.D. Croy in Plant Molecular Biology Labfax (1993), herausgegeben von BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK) beschrieben.
  • Die für eine durch SEQ ID NR: 221 wiedergegebene MYB91-Polypeptidsequenz codierende Populus trichocarpa-Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine mit RNA aus Tomatenpflanzen verschiedener Entwicklungsstadien erstellte cDNA-Bank verwendet wurde. Für die PCR-Amplifikation wurden die folgenden Primer, die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen, verwendet: 1) prm11884 (SEQ ID NR: 271, sense):
    Figure 01640001
    2) pnn11885 (SEQ ID NR: 272, reverse, komplementär):
    Figure 01640002
  • Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment der erwarteten Länge (einschließlich attB-Stellen) wurde amplifiziert und aufgereinigt, ebenfalls nach Standardmethoden. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone” erhält. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der die SEQ ID NR: 220 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry Bone” kloniert wurde, vorgesehen ist Ein Reis-G052-Promotor (SEQ ID NR: 53) für die konstitutive Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pG052::MYB91 (6) für die konstitutive Expression nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • 8.3. „Gibberellic acid stimulated Arabidopsis” (GASA)
  • a) Klonieren von Tomaten-GASA
  • Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Tomaten-Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek mit Solanum lycopersicum thaliana-Keimlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um prm10623 (SEQ ID NR: 86; sense, Startcodon fett): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctaaacaatggagaagacacttagctta-3' und prm10624 (SEQ ID NR: 287; reverse, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatatatgattaagggcatttt-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ”entry clone”, pGASA, erhielt Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway)-Technologie erworben.
  • Der die SEQ ID NR: 275 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry Bone” kloniert wurde, vorgesehen ist Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 290) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::GASA (3) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • a) Klonieren von Pappel-GASA
  • Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Pappel-Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Schablone eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek aus Pappel-Keimpflanzen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Schablone in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um prm10625 (SEQ ID NR: 288; sense, Startcodon fett): 5'-gggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaacaatgaagaagctcttctttgct-3' und prm10626 (SEQ ID NR: 289; reverse, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtacatgcacatcttgactgtct-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt, und das weitere Klonierungsverfahren wurde wie oben beschrieben durchgeführt, einschließlich der Verwendung des Reis-GOSs-Promotors.
  • 8.4. Auxin/Indolessigsäure-Gene (AUX/IIAA)
  • Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek aus Oryza sativa-Keimpflanzen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Matrize in 50 μl PCR-Mix durchgeführt, mit einem Primer-Satz, der zu den ersten und letzten 20 Nukleotiden der SEQ ID NR: 431 komplementär war. Die Sequenz des in der PCR verwendeten forward-Primers kann durch die SEQ ID NR: 667 wiedergegeben werden und der reverse-Primer durch die SEQ ID NR: 668. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ””entry clone””, pAUX/IAA, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der die SEQ ID NR: 431 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 699) für die konstitutive spezifische Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pGOS2::AUX/IAA (12) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • 8.5. IAA14-Potypeptide
  • Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde durch PCR amplifiziert, wobei als Schablone eine speziell erstellte cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana-Keimpflanzen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, UK) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hifi Taq DNA-Polymerase unter Standardbedingungen mit 200 ng Schablone in 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Bei den verwendeten Primern handelte es sich um prm07273 (SEQ ID NR: 745; sense, Startcodon fett): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgaaccttaaggagacggag-3' und prm07274 (SEQ ID NR: 746; reverse, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcaatgcatattgtcctctttt-3', die die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls nach Standardmethoden aufgereinigt. Dann wurde der erste Schritt der Gateway-Vorschrift, die BP-Reaktion, durchgeführt, während der das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch man gemäß der Gateway-Terminologie einen ””entry clone””, pIAA14-like, erhielt. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen als Teil der Gateway®-Technologie erworben.
  • Der die SEQ ID NR: 737 umfassende ”entry clone” wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem Zielvektor für die Transformation von Oryza sativa eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionale Elemente innerhalb der T-DNA-Borders Folgendes: einen pflanzlichen Selektionsmarker; eine screenbare Markerexpressionskassette; sowie eine Gateway-Kassette, die für die LR-in-vivo-Rekombination mit der interessierenden Nukleinsäuresequenz, die bereits in den ”entry clone” kloniert wurde, vorgesehen ist. Ein Reis-HMGP-Promotor (SEQ ID NR: 747) für schwache konstitutive Expression befand sich stromaufwärts von dieser Gateway-Kassette.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der erhaltene Expressionsvektor pHMGP::IAA14-like (16) nach im Stand der Technik gut bekannten Methoden in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 9: Pflanzentransformation
  • Transformation von Reis
  • Das Agrobaderium, welches den Expressionsvektor enthielt, wurde zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-Japonica-Kultivars Nipponbare wurden entspelzt. Die Sterilisierung wurde durch Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl2, gefolgt von sechsmaligem 15-minütigem Waschen mit sterilem destilliertem Wasser, durchgeführt Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Kallus-Induktionsmedium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Kalli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Kalli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Kallus-Stücke wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
  • Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor enthielt, wurde für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den geeigneten Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann geerntet und in flüssigem Cokultivierungs-Medium zu einer Dichte (OD600) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt, und die Kalli wurden 15 Minuten lang in der Suspension eingetaucht. Die Kallusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Kalli wurden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Kallus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht wurde das embryogene Potential freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Kalli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem auxinhaltigen Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Die abgehärteten Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
  • Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
  • Transformation von Mais
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Abwandlung des Verfahrens durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wird. Die Transformation in Mais ist genotypabhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden aus der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) abgeerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agmbacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryos werden auf Kallus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, im Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C während 2 bis 3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Weizen
  • Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexiko) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agmbacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Kallus-Induktionsmedium, und dann Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C während 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und während 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Sojabohne
  • Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens transformiert, welches in U.S.-Patent 5 164 310 von Texas A&M beschrieben ist. Mehrere kommerzielle Sojabohnenvarietäten sind einer Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Aussäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten Jungsämlingen herausgeschnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden herausgeschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, welches den Expressionsvektor enthält. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und auf Selektionsmedien überführt. Regenerierte Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Raps/Canola
  • Kotyledonäre Petiolen bzw. Keimblattstiele sowie Hypokotyle von einem 5–6 Tage alten Jungsämling werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Aussäen oberflächensterilisiert. Die Keimblattstiel-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden von den In-vitro-Sämlingen abgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des Schnittendes des Keimblattstiel-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enhaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Keimblattstiel-Explantate in bzw. auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) während 7 Tagen überführt und danach auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mgA BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf Bewurzelungsmedium (MS0) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Alfalfa
  • Ein sich regenerierender Klon von Alfalfa (Medicago sativa) wird unter Anwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Alfalfa-Varietät ausgewählt werden, wie es durch Brown, DCW, und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Petiolen-Explantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunklen auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mgA Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/ K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate wenden in Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum zum Inhibieren des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert Nach einigen Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryonen werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Keimlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthaften.
  • Transformation von Baumwolle
  • Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens gemäß des Verfahrens transformiert, das in US 5 159 135 beschrieben ist. Baumwollsamen wenden in 3% Natriumhypochlorit-Lösung während 20 Minuten oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann für die Keimung auf bzw. in SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl überführt. Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alter Keimlingen werden entfernt, in Stücke von 0,5 cm geschnitten und auf 0,8%igen Agar platziert. Eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, transformiert mit dem Gen von Interesse und geeigneten Selektionsmarkern) wird für die Inokulation der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung überführt man die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashige-und-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl2, sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien. Individuelle Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten (mit Unterkulturen alle vier bis sechs Wochen) isoliert und werden auf selektivem Medium zur Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16 h Lichtperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend auf nicht-selektivem Medium während 2 bis 3 Monaten weiter kultiviert, was zur Entstehung von somatischen Embryonen führt. Gesund aussehende Embryonen von mindestens 4 mm Länge werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, das mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure ergänzt ist, überführt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen im 2- bis 3-Blattstadium werden in Blumentöpfe mit Vermiculit und Nährstoffen überführt Die Pflanzen werden abgehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus verbracht.
  • Beispiel 10: Vorgehen bei der phänotypischen Auswertung
  • 10.1 Auswertungsansatz
  • Es wurden ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Events, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Events wurden ungefähr 10 T1-Keimlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Keimlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen bestanden in kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunklen sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%. Pflanzen, welche unter Nichtstressbedingungen wachsen gelassen wurden, wurden in regelmäßigen Intervallen bewässert, um sicherzustellen, dass Wasser und Nährstoffe nicht limitierend waren und die Bedürfnisse der Pflanze zum Abschließen von Wachstum und Entwicklung erfüllt wurden.
  • T1-Events wurden unter Befolgen desselben Auswertungsvorgehens wie für die T1-Generation, aber mit mehr Individuen pro Event in der T2-Generation weiter ausgewertet. Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Imaging-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
  • Dürre-Screen
  • Pflanzen aus T2-Samen wenden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Rispenschiebens nähern. Sie werden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wird. Zur Überwachung des Bodenwassergehalts (SWC) wenden Feuchtigkeitssonden in zufällig ausgewählte Blumentöpfe gesteckt. Fällt der SWC unter bestimmte Schwellenwerte, so werden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wird. Die Pflanzen werden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
  • Screen der Stickstoffverwendungseffizienz
  • Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe werden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff(N)-Gehalt enthält, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen wenden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
  • Salzstress-Screen
  • Pflanzen werden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfaser und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wird während der ersten zwei Wochen nach dem Umpflanzen der Pflänzchen in das Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen werden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet werden. Dann werden samenbezogene Parameter gemessen.
  • 10.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parameter von allen Pflanzen aller Events, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsevents hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert für Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgesetzt. Ein signfikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt hin, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Gens ist, welche die Unterschiede beim Phänotyp verursacht.
  • Weil zwei Experimente mit überlappenden Events durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse ausgeführt. Dies ist nützlich, um die Konsistenz der Effekte über die zwei Experimente hinweg zu überprüfen, und, sofern dies der Fall ist, Beweise aus beiden Experimenten zu sammeln, damit die Konfidenz bei der Schlussfolgerung erhöht wird. Das angewandte Verfahren war ein Misch-Modell-Vorgehen, welches die Mehrfachebenen-Struktur der Daten (d. h. Experiment-Event-Segreganten) berücksichtigt. P-Werte wurden durch Vergleichen des Wahrscheinlichkeitsverhältnis-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhalten.
  • 10.3 Gemessene Parameter
  • Messung von biomassebezogenen Parametern
  • Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Imaging-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
  • Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrück wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche an dem Zeitpunkt gemessen wird, an dem die Pflanze ihre maximale Blatt-Biomasse erreicht hatte. Die Jungpflanzenvitalität ist die oberirdische Pflanzen(Keimpflanzen)-Fläche drei Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als eine Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als das Maximum der Biomasse von Wurzeln, das während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird); oder als eine Erhöhung im Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
  • Die Jungpflanzenvitalität wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterschieden, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
  • Messungen von samenbezogenen Parametern
  • Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezahlt, eingetütet, mit einem Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl an gefüllten Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen bestimmt, welche nach dem Trennungsschritt verblieb. Der Gesamtsamenertrag wurde durch Wiegen aller von einer Pflanze abgeernteten gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde durch Zählen der Anzahl der von einer Pflanze geernteten Hülsen gemessen. Das Tausendkorngewicht (TKW) wird aus der gezählten Anzahl gefüllter Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Harvest Index (HI) ist in der vorliegenden Erfindung definiert als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106. Die Gesamtzahl an Blüten pro Rispe, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl an Samen und der Anzahl an reifen Hauptrispen. Die Samen-Füllrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist der Anteil (ausgedrückt als ein%-Wert) der Anzahl gefüllter Samen gegenüber der Gesamtzahl an Samen (oder Blütchen).
  • Beispiel 11: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
  • 11.1. Aspartat-Aminotransferase (ASPAT)
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T2-Generation, die eine Nukleinsäure umfassend das längste offene Leseraster in SEQ ID NR: 3 unter der Kontrolle des Reis-GOS2-Promoters unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind im Folgenden dargestellt (Tabelle G1). Bezüglich der Einzelheiten zu der Erzeugung der transgenen Pflanzen, siehe die obigen Beispiele. Für die oberirdische Biomasse (AreaMax), das Auflaufen, den Samenertrag (totalwgseeds), die Anzahl gefüllter Samen (nrfilledseed), die Füllrate (fillrate) und die Pflanzenhöhe (HeightMax) wurde ein Anstieg von mindestens 5% beobachtet (Tabelle G1). Tabelle G1 Phänotyp von mit pGOS2::ASAPT transformierten transgenen Pflanzen.
    Parameter % Anstieg bei den transgenen Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollpflanzen
    AreaMax 7,4
    totalwgseeds 11,8
    nrfilledseed 9,3
    fillrate 5,0
    HeightMax 5,0
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T1-Generation, die eine Nukleinsäure umfassend das längste offene Leseraster in SEQ ID NR: 5 unter der Kontrolle des Reis-GOS2-Promoters unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind im Folgenden dargestellt (Tabelle G2). Bezüglich der Einzelheiten zu der Erzeugung der transgenen Pflanzen, siehe die obigen Beispiele. Für die Pflanzenhöhe (HeightMax) wurde eine Erhöhung von mindestens 5% beobachtet. Tabelle G2 Phänotyp von mit ExprVect2 transformierten transgenen Pflanzen.
    Parameter % Anstieg bei den transgenen
    Pflanzen im Vergleich zu den
    Kontrollpflanzen
    Pflanzenhöhe 5,2
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T1-Generation, die eine Nukleinsäure umfassend das längste offene Leseraster in SEQ ID NR: 5 unter der Kontrolle des Reis-PR-Promoters unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind im Folgenden dargestellt (Tabelle G3). Bezüglich der Einzelheiten zu der Erzeugung der transgenen Pflanzen, siehe die obigen Beispiele. Für die oberirdische Biomasse (AreaMax), die Auflaufkraft (EmerVigor), den Samenertrag (totalwgseeds), die Anzahl gefüllter Samen (nrfilledseed), die Anzahl Blüten pro Rispe (flowerperpan), die Anzahl der ersten Rispen (firstpan), die Samengesamtzahl (nrtotalseed) und die Pflanzenhöhe (HeightMax) wurde ein Anstieg von mindestens 5% beobachtet. Tabelle G3 Phänotyp von mit dem Expressionsvektor ExprVect3 transformierten transgenen Pflanzen.
    Parameter % Anstieg bei den transgenen Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollpflanzen
    AreaMax 29,3
    EmerVigor 49,8
    totalwgseeds 31,2
    nrfilledseed 32,0
    flowerperpan 9,5
    firstpan 15,8
    nrtotalseed 26,8
    HeightMax 11,6
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T2-Generation, die eine Nukleinsäure umfassend das längste offene Leseraster in SEQ ID NR: 5 unter der Kontrolle des Reis-PR-Promoters unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind im Folgenden dargestellt (Tabelle G4). Bezüglich der Einzelheiten zu der Erzeugung der transgenen Pflanzen, siehe die obigen Beispiele. Für die oberirdische Biomasse (AreaMax), die Auflaufkraft (EmerVigor), den Gesamtsamenertrag (totalwgseeds), die Anzahl gefüllter Samen (nrfilledseed), die Anzahl Blüten pro Rispe (flowerperpan), die Anzahl der ersten Rispen (firstpan), die Samengesamtzahl (nrtotalseed) und die Pflanzenhöhe (HeightMax) wurde ein Anstieg von mindestens 5% beobachtet. Tabelle G4 Phänotyp von mit dem Expressionsvektor ExprVect3 transformierten transgenen Pflanzen.
    Parameter % Anstieg bei den transgenen Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollpflanzen
    AreaMax 9,7
    EmerVigor 17,8
    totalwgseeds 24,4
    nrfilledseed 23,3
    fillrate 8,4
    harvestindex 14,7
    firstpan 10,8
    nrtotalseed 14,9
    HeightMAax 5,3
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T1-Generation, die eine Nukleinsäure umfassend das längste offene Leseraster in SEQ ID NR: 3 unter der Kontrolle des Reis-PR-Promoters unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind im Folgenden dargestellt (Tabelle G5). Bezüglich der Einzelheiten zu der Erzeugung der transgenen Pflanzen, siehe die obigen Beispiele. Für den Samenertrag (totalwgseeds), die Anzahl gefüllter Samen (nrfilledseed), den Harvest Index (harvestindex) und die Samenfüllrate (fillrate) wurde ein Anstieg von mindestens 5% beobachtet. Tabelle G5 Phänotyp der mit dem Expressionsvektor ExprVect1 transformierten transgenen Pflanzen.
    Parameter % Anstieg bei den transgenen Pflanzen im Vergleich zu den Kontrollpflanzen
    totalwgseeds 23,0
    nrfilledsccd 20,1
    fillrate 9,9
    harvestindex 13,8
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T1-Generation, die eine Nukleinsäure umfassend das längste offene Leseraster in SEQ ID NR: 9 unter der Kontrolle des Reis-GOS2-Promoters unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind im Folgenden dargestellt (Tabelle G6). Bezüglich der Einzelheiten zu der Erzeugung der transgenen Pflanzen, siehe die obigen Beispiele. Für die gefüllten Samen (nrfilledseed) und den Harvest Index (harvestindex) wurde ein Anstieg von mindestens 5% beobachtet. Tabelle G6 Phänotyp von mit dem Expressionsvektor ExprVect5 transformierten transgenen Pflanzen.
    Parameter % Anstieg bei den transgenen
    Pflanzen im Vergleich zu den
    Kontrollpflanzen
    fillrate 6,6
    harvestindex 6,0
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen unter Nichtstressbedingungen sind unten angegeben. Für die Füllrate und den Harvest Index wurde ein Anstieg von mindestens 5% beobachtet.
  • 11.2. „MYB91-like”-Transkriptionsfaktor (MYB91)
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen der T1-Generation, die die Nukleinsäuresequenz, die für ein MYB91-Polypeptid gemäß SEQ ID NR: 221 codiert, unter der Kontrolle eines konstitutiven Promoters exprimieren und die unter normalen Wachstumsbedingungen herangezogen werden, sind unten angegeben.
  • Es bestand ein signifikanter Anstieg bei der Pflanzenhöhe, dem Harvest Index (HI) und dem Tausendkorngewicht (TKG). Tabelle G7: Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen der T1-Generation, die die Nukleinsäuresequenz, die für ein MYB91-Polypeptid gemäß SEQ ID NR: 221 codiert, unter der Kontrolle eines Promoters für konstitutive Expression exprimieren.
    Merkmal Durchschnittlicher Gesamtanstieg in % bei 4 Events in der T2-Generation
    Pflanzenhöhe 3%
    Harvest Index 8%
    Tausendkorngewicht 6%
  • 11.3. „Gibberellic Acid-Stimulated Arabidopsis” (GASA)
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, die die Tomaten-GASA-Nukleinsäure unter der Kontrolle eines mittelstarken konstitutiven Promoters unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind unten in Tabelle G8 angegeben. Tabelle G8: Gesamtanstieg (%) für die Ertragsparameter
    Parameter 1. Auswertung 2. Auswertung
    Zeit bis zur Blüte 2,1 3,5
    Füllrate 10,4 8,3
    Blüten pro Rispe 4,8 14,7
  • Die Blütezeit war im Vergleich zu den Kontrollpflanzen reduziert, und es wurde ein Anstieg von mehr als 5% in Bezug auf die Füllrate und die Anzahl Blüten pro Rispe beobachtet Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, die die Pappel-GASA-Nukleinsäure unter der Kontrolle eines mittelstarken konstitutiven Promoters unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind unten in Tabelle G9 angegeben. Tabelle G9: Gesamtanstieg (%) für die Ertragsparameter
    Parameter 1. Auswertung 2. Auswertung
    Samengesamtgewicht 13,3 13,7
    Harvest Index 18,8 22,2
    Tausendkorngewicht 4,2 2,9
  • 11.4. Auxin/Indolessigsäuregene (AUX/IAA)
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen in der T2-Generation, die eine Nukleinsäure umfassend das längste offene Leseraster in SEQ ID NR: 431 unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind unten angegeben. Für die Einzelheiten bezüglich der Herstellung der transgenen Pflanzen, siehe die vorigen Beispiele.
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen unter Nichtstressbedingungen sind unten dargestellt (Tabelle G10). Für die Anzahl gefüllter Samen pro Pflanze (nrfilledseed), den Harvest Index (harvestindex) und den Samenertrag (totalwgseeds) wurde ein Anstieg von mindestens 5% beobachtet. Tabelle G10
    Ertragsmerkmal Prozentsatz des Anstiegs bei transgenen Pflanzen verglichen mit Kontrollpflanzen
    totalwgseeds 12,0
    harvestindex 8,3
    nrfilledseed 11,2
  • 11.5. IAA14-Polypeptide
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen T2-Reispflanzen, die die „IAA14-like”-Nukleinsäure gemäß SEQ ID NR: 738 unter Nichtstressbedingungen exprimieren, sind unten angegeben (Tabelle G11). Tabelle G11: Gesamtertragsanstieg (in %) bei transgenen Pflanzen, die SEQ ID NR: 738 exprimieren
    Parameter Gesamtanstieg
    totalwgseeds 19,2
    nrfilledseed 18,6
    fillrate 18,8
    harvestindex 21,1
    HeightMax 5,5
    GravityYMax 6,6
  • Ein Anstieg wurde für das Samengesamtgewicht, die Anzahl gefüllter Samen, die Samenfüllrate (Anzahl gefüllter Samen geteilt durch die Samengesamtzahl und multipliziert mit 100), den Harvest Index, die Pflanzenhöhe und den Schwerpunkt (ein Indikator für die Verzweigung der Pflanzen) gefunden. Für jeden der in Tabelle G11 angeführten Parameter betrug der p-Wert p < 0,05.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (25)

  1. Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT (Aspartat-Aminotransferase)-Polypeptid, umfassend eine Domäne der Aminotransferasen-Klasse I und II (Aminotran_1_2) (Interpro-Eintragsnummer: IPR004839; pfam-Eintragsnummer: PF00155), codiert, und gegebenenfalls Selektieren von Pflanzen mit gesteigerten Ertragsmerkmalen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ASPAT-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive mit mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% zu einem oder mehr der folgenden Motive umfasst:
    Figure 01820001
    wobei jeder beliebige Aminosäurerest durch eine konservierte Aminosäure substituiert sein kann.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, für ein beliebiges der in Tabelle A aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Ortholog oder Paralog eines der in Tabelle A aufgeführten Proteine codiert.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nichtstressbedingungen erhalten werden.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Dürrestress-, Salzstress- oder Stickstoffmangelbedingungen erhalten werden.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem für grünes Gewebe spezifischen Promotor, vorzugsweise mit einem PR-Promotor, ganz besonders bevorzugt mit einem PR-Promotor aus Reis, verbunden ist
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, pflanzlichen Ursprungs ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, mehr bevorzugt aus der Gattung Oryza, ganz besonders bevorzugt aus Oryza sativa.
  12. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die bzw. der durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 erhältlich ist, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, umfasst.
  13. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, wie in den Ansprüchen 1 oder 2 definiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationsequenz.
  14. Konstrukt nach Anspruch 13, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, ganz besonders bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis, ist
  15. Konstrukt nach Anspruch 13, wobei eine der Steuerungssequenzen ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, vorzugsweise ein PR-Promotor, ganz besonders bevorzugt ein PR-Promotor aus Reis, ist.
  16. Verwendung eines Konstrukts nach Anspruch 13 bis 15 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  17. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die bzw. der mit einem Konstrukt nach Anspruch 13 bis 15 transformiert ist.
  18. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, in einer Pflanze; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  19. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welcher aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, die für ein Root-Hairless-Polypeptid codiert, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, resultiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
  20. Transgene Pflanze nach Anspruch 11, 17 oder 18 oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer ist.
  21. Erntefähige Teile einer Pflanze nach Anspruch 20, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
  22. Produkte, gewonnen aus einer Pflanze nach Anspruch 20 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze nach Anspruch 21.
  23. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung von Samenertrag und/oder Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  24. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der folgenden Reihe: (i) eine Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 81, 147, 153, 183 und 185; (ii) das Komplement einer Nukleinsäure gemäß einer von SEQ ID NR: 81, 147, 153, 183 und 185; (iii) eine Nukleinsäure, die für das Polypeptid gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 184 und 186 codiert, vorzugsweise aufgrund der Degeneration des genetischen Codes, wobei die isolierte Nukleinsäure von einer Polypeptidsequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 184 und 186 abgeleitet werden kann und weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (iv) eine Nukleinsäure mit, mit zunehmender Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Nukleinsäuresequenzen aus Tabelle A, die weiterhin vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (v) ein Nukleinsäuremolekül, das mit einem Nukleinsäuremolekül von (i) bis (iv) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (vi) eine Nukleinsäure, die für ein ASPAT-Polypeptid codiert, mit, mit zunehmender Bevorzugung, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61% 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71% 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 1184 und 186 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A, die vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt.
  25. Isoliertes Polypeptid, ausgewählt aus der folgenden Reihe: (i) eine Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 184 und 186; (ii) eine Aminosäuresequenz mit, mit zunehmender Bevorzugung, mindestens 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß einer von SEQ ID NR: 82, 148, 154, 184 und 186 und einer beliebigen der anderen Aminosäuresequenzen in Tabelle A, die vorzugsweise gesteigerte Ertragsmerkmale in Bezug auf Kontrollpflanzen vermittelt; (iii) Derivate von beliebigen der Aminosäuresequenzen gemäß (i) oder (ii) oben.
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