JP7463284B2 - 植物におけるアミノ酸含有量の調節 - Google Patents

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Description

本発明は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）に由来するアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＡＴ）、ならびにその変異体、相同体、および断片をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列を開示する。また、それによりコードされるポリペプチド配列、ならびにその変異体、相同体、および断片も開示される。植物またはその部分において、１つ以上の遊離アミノ酸（例えば、アスパラギン酸）およびそれに由来する代謝産物または副産物（例えば、アンモニア）のレベルを調節するための、１つ以上のＮｔＡＡＴ遺伝子の発現、またはそれによってコードされるＮｔＡＡＴポリペプチド（複数可）の機能もしくは活性の調節もまた開示される。
アクリルアミドは、式Ｃ3Ｈ5ＮＯの化学化合物（ＩＵＰＡＣ名はプロプ－２－エナミド）であり、その潜在的な毒性に関する懸念が増大している。タバコを含む喫煙物品のエアロゾル中のアクリルアミドの発生源は、少なくとも部分的には、喫煙物品の製造のために使用されるタバコ材料中に存在するアミノ酸からであり得る。栽培タバコ種は、乾燥処理中、特に空気乾燥処理されたタバコ種および日光乾燥処理されたタバコ種において、全遊離アミノ酸の増加を示す。乾燥処理されたタバコ材料におけるアミノ酸含有量の変動は、熱風送管乾燥処理（これは急速な乾燥プロセスである）と比較して、周囲温度での乾燥処理（空気乾燥処理）の時間に関連しており、酵素反応が収穫後１０～１５日間依然として活性であることを可能にする。さらに、空気乾燥処理されたタバコ材料は、その他の乾燥処理されたタバコよりも高い含水量を示し、周囲温度での乾燥プロセスが減速されるため、一部の酵素反応が乾燥処理段階の後期においても依然として活性であることを可能にする第２の要因であると考えられている。植物において、特に乾燥処理された植物材料ならびにそれに由来する煙およびエアロゾルにおいて、アミノ酸ならびにそれに由来する代謝産物および副産物のレベルを低下させることが望ましい。アンモニアは乾燥処理中に生成されるアミノ酸の副産物である可能性が高いため、乾燥処理された葉、煙、およびエアロゾルにおけるアンモニアのレベルも低下させ得る。タバコが加熱または燃焼された時に、エアロゾルまたは煙における不快な臭気の形成を減少させることも望ましい。
本発明は、当該技術分野におけるこのニーズに対処することを探究する。
早期乾燥処理中のアミノ酸生合成に関与する、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍに由来するＡＡＴをコードする多数のポリヌクレオチド配列が本明細書に説明される。乾燥処理中に過剰発現されないＮｔＡＴＴ遺伝子における変化は、アミノ酸およびそれに由来する代謝産物のレベルの調節に寄与しない。しかしながら、これらの遺伝子は他の代謝経路に関与している可能性が高く、その発現における変化は、農学的に有害な表現型（例えば、遅い成長）をもたらし得る。どのＮｔＡＡＴ遺伝子が乾燥処理中に過剰発現されるのかを知ることにより、有利に、関連する遺伝子のみにおける変化を有する植物の選択が可能になり、他の代謝プロセスに対する潜在的な悪影響を減少させる。
ＡＡＴは、アスパラギン酸とグルタミン酸との間のα－アミノ基の可逆性移動を触媒し、したがって、グルタミン酸およびアスパラギン酸から窒素をチャネリングすることによるアミノ酸代謝における主要酵素である。アスパラギン酸の合成は、アスパラギン、スレオニン、イソロイシン、システイン、およびメチオニンなどの他のアミノ酸の合成に不可欠である。乾燥処理プロセス中、アスパラギン酸は、アスパラギンシンテターゼを介してアスパラギンに変換される。アスパラギンおよびグルタミンは、老齢の葉におけるＮ－転流のための主要な化合物であり、アスパラギンはバーレー種の乾燥処理された葉で産生される主要アミノ酸である。アスパラギンは、タバコ葉の加熱の際にアクリルアミドをもたらすことが知られている。アスパラギン酸は、他のアミノ酸（例えば、スレオニン、メチオニン、およびシステイン）の生合成においても重要であり、その一部は加熱の際に硫黄臭を生じる。開示されたＡＡＴの発現および／または活性を調節することにより、ここで植物の部分（例えば、葉）およびそれに由来する煙またはエアロゾルの化学的性質を変更させることが可能となる。興味深いことに、一部のＡＡＴタバコ遺伝子は、本明細書に説明されるように、空気乾燥処理プロセスの開始から少なくとも８日間、依然として発現し得る。例えば、乾燥処理中および乾燥処理後の１つ以上のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸）およびそれに由来する代謝産物（例えば、アンモニア）の量は調節することができ、したがって、タバコの加熱中に形成されるアクリルアミドの形成を調節することができ、好適には、低減することができる。さらなる例としては、タバコの加熱の際に硫黄臭を生じ得る他のアミノ酸の形成も調節することができ、好適には、低減することができる。ＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号５）、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号７）、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号１）、ＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号３）、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ（配列番号９）、ＮｔＡＡＴ３－Ｔ（配列番号１１）、ＮｔＡＡＴ４－Ｓ（配列番号１３）、およびＮｔＡＡＴ４－Ｔ（配列番号１５）を含む、Ｎｉｃｏｔｉａｎｉａ ｔａｂａｃｕｍに由来するいくつかのＡＡＴゲノムポリヌクレオチド配列が本明細書に説明される。ＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号６）、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号８）、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号２）、ＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号４）、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ（配列番号１０）、ＮｔＡＡＴ３－Ｔ（配列番号１２）、ＮｔＡＡＴ４－Ｓ（配列番号１４）、およびＮｔＡＡＴ４－Ｔ（配列番号１６）の対応する推定ポリペプチド配列も開示される。ＮｔＡＡＴ２－ＳおよびＮｔＡＡＴ２－Ｔ、ならびにより少ない程度のＮｔＡＡＴ１－Ｓ、ＮｔＡＡＴ１－Ｔは、乾燥処理中のアスパラギン酸生合成において特定の役割を果たすことが示されている。対照的に、ＮｔＡＡＴ４－ＳおよびＮｔＡＡＴ４－Ｔ転写物は、ＮｔＡＡＴ４－Ｔが空気乾燥処理の８日後に発現したままであるため、乾燥処理におけるＮｔＡＡＴ４－Ｔタンパク質の関与は除外できないが、主に葉の乾燥処理の最初の２日間の間に下方制御される。葉の乾燥処理中、ＮｔＡＡＴ３－Ｓの発現は低いままであり、黄変段階中は調節されない。ＮｔＡＡＴ３－Ｔは乾燥処理中にわずかに誘導されるが、発現レベルは比較的低いままである。
発明の効果
有利なことに、ＮｔＡＡＴポリヌクレオチド配列は、乾燥処理中に、特に乾燥処理の開始から高度に発現することができる。１つ以上のＮｔＡＡＴポリヌクレオチド配列の発現を調節することにより、アスパラギン酸のレベルを乾燥処理プロセス全体を通して調節することができるため、エアロゾルにおけるアクリルアミドのレベルの調節をもたらすことができる。特に、１つ以上のＮｔＡＡＴポリヌクレオチド配列の発現を減少させることにより、エアロゾルにおけるアクリルアミドのレベルの減少をもたらすことができる。
アスパラギン酸は、他のアミノ酸（例えば、スレオニン、メチオニン、およびシステイン）の生合成において重要であり、その一部は加熱の際に硫黄臭を生じるため、ＮｔＡＡＴポリヌクレオチド配列の発現を調節することにより、この不快な臭気を調節することができる。さらに、アンモニアが乾燥処理中に生成されたアミノ酸の副産物である可能性が高いことを知り、ＮｔＡＡＴポリヌクレオチド配列の発現および／またはそれによってコードされるタンパク質の活性を減少させることは、乾燥処理された植物材料ならびにそれに由来する煙およびエアロゾルにおけるアンモニアのレベルを減少させ得る。空気乾燥処理および日光乾燥処理方法は、熱風送管乾燥処理されたタバコ材料と比較して、乾燥処理されたタバコ材料において高いアミノ酸含有量をもたらすため、アミノ酸の増加は特に空気乾燥処理されたタバコおよび日光乾燥処理されたタバコにおいて生じる。したがって、本開示は、空気乾燥処理および熱風送管乾燥処理されたタバコ材料に特に適用される。
有利なことに、本明細書に説明される改変された植物におけるニコチンのレベルに対する影響は限定的であり、これは、改変された植物がタバコ植物および消費されるタバコ製品の生産のために使用されることが意図される場合に望ましい。
有利なことに、消費者により受け入れられ得る、遺伝子組み換えされていない植物を作り出すことができる。
有利なことに、本開示は、ＥＭＳ突然変異体植物の使用に制限されない。ＥＭＳ突然変異体植物は、育種後の作物に改善された特性をもたらす可能性が低い場合がある。一度育種を開始すると、ＥＭＳ突然変異体植物の望ましい特性（複数可）は種々の理由で失われ得る。例えば、いくつかの突然変異が必要とされる場合があり、突然変異は優性または劣性であり得、遺伝子標的における点突然変異の特定は達成することが困難であり得る。対照的に、本開示は、特異的に操作して所望の表現型を有する植物を生成することができるＮｔＡＡＴポリヌクレオチドを活用する。本開示は、様々な植物の品種または作物に適用され得る。
一態様では、（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号６もしくは配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性、配列番号２、もしくは配列番号４、もしくは配列番号１０、もしくは配列番号１２に対して少なくとも９３％の配列同一性、または配列番号１４もしくは配列番号１６に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリペプチド、あるいは（ｉｖ）（ｉ）に記載した単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクターを含む植物細胞であって、該植物細胞が、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現もしくは活性が改変されていない対照植物細胞と比較して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現もしくは活性を調節する少なくとも１つの改変を含む、植物細胞が説明される。
別の態様では、（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチド、（ｉｉ）（ｉ）に記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、（ｉｉｉ）配列番号６もしくは配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性、配列番号２、もしくは配列番号１０、もしくは配列番号１２に対して少なくとも９３％の配列同一性、または配列番号４、もしくは配列番号１４、もしくは配列番号１６に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリペプチド、あるいは（ｉｖ）（ｉ）に記載した単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクターを含む植物細胞であって、該植物細胞が、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現もしくは活性が改変されていない対照植物細胞と比較して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現もしくは活性を調節する少なくとも１つの改変を含む、植物細胞が開示される。好適には、該植物細胞は、配列番号５、配列番号７、配列番号１、もしくは配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含み、好適には、植物細胞は、配列番号１もしくは配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含む。
好適には、該植物細胞は、配列番号６もしくは配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性、または配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも９３％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリペプチドを含み、好適には、植物細胞は、配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも９３％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリペプチドを含む。
好適には、該植物細胞が、配列番号６もしくは配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性、または配列番号２に対して少なくとも９３％の配列同一性、または配列番号４に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリペプチドを含み、好適には、植物細胞が、配列番号２に対して少なくとも９３％の配列同一性、または配列番号４に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリペプチドを含む。好適には、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号５または配列番号６）、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号７または配列番号８）、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号１または配列番号２）、およびＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号３または配列番号４）のうちの１つ以上の発現および／または活性が調節されるが、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ（配列番号９または配列番号１０）、ＮｔＡＡＴ３－Ｔ（配列番号１１または配列番号１２）、ＮｔＡＡＴ４－Ｓ（配列番号１３または配列番号１４）、およびＮｔＡＡＴ４－Ｔ（配列番号１５または配列番号１６）のうちの１つ以上の発現および／または活性は調節されない。
好適には、少なくとも１つの改変は、植物細胞のゲノムの改変、または構築物、ベクター、もしくは発現ベクターの改変、またはトランスジェニック改変である。
好適には、植物細胞のゲノムの改変、または構築物、ベクター、もしくは発現ベクターの改変は、突然変異または編集である。
好適には、改変は、対照植物細胞と比較して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現もしくは活性を減少させる。
好適には、植物細胞は、請求項１（ｉ）のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡの少なくとも１９ヌクレオチドに対して少なくとも８０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを含む。
好適には、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの調節された発現もしくは活性は、対照植物に由来する乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるアミノ酸のレベルと比較して、植物細胞に由来する乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるアミノ酸のレベルを調節し、好適には、アミノ酸はアスパラギン酸またはそれに由来する代謝産物である。
好適には、植物細胞に由来する乾燥処理されたもしくは乾燥された葉におけるニコチンのレベルは、対照植物細胞の乾燥処理されたもしくは乾燥された葉におけるニコチンのレベルと実質的に同じであり、および／または植物細胞に由来する乾燥処理されたもしくは乾燥された葉におけるアクリルアミドのレベルは、対照植物に由来する乾燥処理されたもしくは乾燥された葉におけるアクリルアミドのレベルと比較して減少しており、および／または植物細胞に由来する乾燥処理されたもしくは乾燥された葉におけるアンモニアのレベルは、対照植物に由来する乾燥処理されたもしくは乾燥された葉におけるアミノ酸のレベルと比較して減少している。
さらなる態様では、本明細書に説明される植物細胞を含む、植物またはその部分が説明される。さらなる態様では、本明細書に説明される植物またはその部分が説明され、アスパラギン酸またはそれに由来する代謝産物の量は、対照植物またはその部分と比較して、植物の少なくとも一部分において改変されている。
さらなる態様では、本明細書に説明される植物もしくはその部分に由来する植物材料、乾燥処理された植物材料、または均質化された植物材料が説明され、好適には、乾燥処理された植物材料は、空気乾燥処理または日光乾燥処理または熱風送管乾燥処理された植物材料である。
さらなる態様では、本明細書に説明される植物もしくはその部分に由来するバイオマス、種子、茎、花、または葉を含む、本明細書に説明される植物材料が説明される。
さらなる態様では、本明細書に説明される植物細胞、本明細書に説明される植物の部分、または本明細書に説明される植物材料を含む、タバコ製品が説明される。
さらなる態様では、本明細書に説明される植物を生成するための方法が説明され、方法は、（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含む植物細胞を提供する工程、（ｂ）対照植物細胞と比較して、該ポリヌクレオチドの発現を調節するために植物細胞を改変する工程、および（ｃ）植物細胞を植物中に伝播させる工程を含む。
好適には、工程（ｃ）は、植物細胞を含む挿し木または苗木から植物を栽培することを含む。
好適には、植物細胞を改変する工程は、ゲノム編集またはゲノム工学によって細胞のゲノムを改変することを含む。
好適には、ゲノム編集またはゲノム工学は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発、化学的突然変異誘発または放射線突然変異誘発、相同組み換え、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、およびメガヌクレアーゼ媒介突然変異誘発から選択される。
好適には、植物細胞を改変する工程は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含み、構成的プロモーターに動作可能に連結されている構造物で細胞をトランスフェクトすることを含む。
好適には、植物細胞を改変する工程は、請求項１（ｉ）のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡに対して少なくとも８０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを細胞へ導入することを含む。
好適には、植物細胞は、請求項１（ｉ）のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡの少なくとも１９ヌクレオチドに対して少なくとも８０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを発現する構築物でトランスフェクトされる。
さらなる態様では、対照植物材料と比較して、変更された量のアスパラギン酸またはそれに由来する代謝産物を含む、乾燥処理された植物材料を生成するための方法が説明され、方法は、（ａ）本明細書に説明される植物もしくはその部分または植物材料を提供する工程、（ｂ）任意に、植物材料をそこから収穫する工程、および（ｃ）植物材料を乾燥処理する工程を含む。
好適には、植物材料は、乾燥処理された葉、乾燥処理された茎、もしくは乾燥処理された花、またはそれらの混合物を含む。
好適には、乾燥処理方法は、空気乾燥処理、火力乾燥処理、燻煙乾燥処理、および熱風送管乾燥処理からなる群から選択される。
バージニア種、バーレー種、およびオリエント種栽培タバコにおける、収穫（成熟）後、２日間の乾燥処理（４８時間）後、および乾燥処理の終了時の、全遊離アミノ酸含有量を示すグラフである。 圃場で栽培されたスイスバーレー種タバコの葉試料におけるアスパラギン酸（ａｓｐ）およびアスパラギン（ａｓｎ）の収穫後量を示すグラフである（３バルク葉反復）。遊離アミノ酸は、空気乾燥処理室内での５０日間の乾燥処理のタイムコース様式において収集された葉試料（中間茎位置）において測定された。 ＮｔＡＡＴ２－Ｓ／Ｔ ＲＮＡｉ Ｔ０植物（Ｅ３２４）およびそれぞれの対照植物（ＣＴＥ３２４）の中間葉におけるニコチン含有量を示すグラフである。 ＮｔＡＡＴ２－Ｓ／Ｔ ＲＮＡｉ Ｔ０植物（Ｅ３２４）およびそれぞれの対照植物（ＣＴＥ３２４）の中間葉におけるアスパラギン酸含有量を示すグラフである。
本開示で使用される段落の見出しは系統立てるためであり、限定することを意図していない。
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合は、定義を含めて本文書が適用される。好ましい方法および材料を以下に説明するが、本明細書に説明されるものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができる。本明細書に開示される材料、方法、および例は単なる例示であり、制限することを意図していない。
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有している」、「有する」、「できる」、「含有する」、およびそれらの変形は、付加的な作用または構成の可能性を除外しないオープンエンド移行句、用語、または言葉であることが意図されている。
単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別段明白に指示しない限り、複数形の言及を含む。
「および／または」という用語は、（ａ）もしくは（ｂ）、または（ａ）および（ｂ）の両方を意味する。
本開示は、明確に記載されているかいないかにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素を「含む」、「それからなる」、および「それから本質的になる」他の実施形態を企図する。
本明細書の数値範囲の列挙に関しては、それらの間に介在する各数値が同程度の精度で明確に企図されている。例えば、６～９の範囲では、６および９に加えて数値７および８が企図されており、６．０～７．０の範囲では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明確に企図されている。
明細書および特許請求の範囲全体で使用される場合、以下の用語は次の意味を有する。
「コード配列」または「ポリヌクレオチドをコードする」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、ポリヌクレオチドが投与される個体または哺乳動物の細胞において発現を導くことが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、制御要素に動作可能に連結された開始および終結シグナルをさらに含むことができる。コード配列はコドン最適化であり得る。
「相補体」または「相補的」は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン－クリック（例えば、Ａ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を意味することができる。「相補性」は、例えば、相互に逆平行に整列している場合に、各位置のヌクレオチド塩基が相補的であるような、２つのポリヌクレオチド間で共有される特性を指す。
「構築物」は、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、二本鎖の組み換えポリヌクレオチド断片を指す。構築物は、相補的「センス鎖またはコード鎖」と塩基対合した「鋳型鎖」塩基を含む。所定の構築物は、可能性のある２つの配向性、すなわち、ベクター（例えば、発現ベクター）内に配置されているプロモーターの配向に対して同一の（またはセンス）配向性または反対の（またはアンチセンス）配向性のいずれかで、ベクターに挿入することができる。
対照植物または対照植物細胞の文脈における「対照」という用語は、１つ以上の遺伝子またはポリペプチドの発現、機能、もしくは活性が改変（例えば、増加または低下）されておらず、それゆえに１つ以上の遺伝子またはポリペプチドの発現、機能、もしくは活性が改変されている植物との比較を提供することができる、植物または植物細胞を意味する。本明細書で使用される場合、「対照植物」は、試験パラメータを除いたすべてのパラメータにおいて試験植物または改変植物と実質的に同等である植物である。例えば、ポリヌクレオチドが導入された植物に言及する場合、対照植物はそのようなポリヌクレオチドが導入されていない同等の植物である。対照植物は、対照ポリヌクレオチドが導入された同等の植物であり得る。そのような事例では、対照ポリヌクレオチドは、植物にほとんどまたは全く表現型効果をもたらさないことが予期されているものである。対照植物は、空のベクターを含み得る。対照植物は、野生型植物に相当し得る。対照植物は、Ｔ１分離体が導入遺伝子をもはや保持していない、ヌル分離体であり得る。
「ドナーＤＮＡ」または「ドナー鋳型」は、対象の遺伝子の少なくとも一部分を含む、二本鎖ＤＮＡ断片または分子を指す。ドナーＤＮＡは、完全機能性ポリペプチドまたは部分機能性ポリペプチドをコードし得る。
「内在性遺伝子またはポリペプチド」は、生物のゲノムに起源し、遺伝子材料の欠失、獲得、または交換等の変化を受けていない遺伝子またはポリペプチドを指す。内在性遺伝子は、正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。内在性ポリペプチドは、正常な発現を受ける。
「エンハンサー配列」は、遺伝子発現を増加させることができる配列を指す。これらの配列は、転写領域の上流、イントロン内、または下流に位置することができる。転写領域は、プロモーターから転写終結領域までのエクソンおよび介在イントロンからなる。遺伝子発現の増加は、転写効率の増加、成熟ｍＲＮＡの安定化、および翻訳の強化を含む様々な機構によってできる。
「発現」は、機能性産物の生成を指す。例えば、ポリヌクレオチド断片の発現は、ポリヌクレオチド断片の転写（例えば、ｍＲＮＡもしくは機能性ＲＮＡが生じる転写）、および／またはｍＲＮＡの前駆体または成熟ポリペプチドへの翻訳を指し得る。「過剰発現」は、同じ実験のヌル分離（または非トランスジェニック）生物における産生レベルを超えるトランスジェニック生物における遺伝子産物の産生を意味する。
「機能性」および「完全機能性」は、生物学的機能または活性を有するポリペプチドを説明する。「機能性遺伝子」は、機能性または活性ポリペプチドに翻訳される、ｍＲＮＡに転写される遺伝子を指す。
「遺伝子構築物」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、発現を導くことが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御要素に動作可能に連結される開始および終結シグナルを含むことができる。
「ゲノム編集」は、アミノ酸置換を有する切断型内在性ポリペプチドまたは内在性ポリペプチドのポリペプチド発現が得られるような、内在性ポリペプチドをコードする内在性遺伝子の変化を指す。ゲノム編集は、ＨＤＲなどの修復機構による切断またはアミノ酸置換を有する遺伝子のコピーを用いて、標的化される内在性遺伝子の領域を置き換えるか、または内在性遺伝子全体を置き換えることを含むことができる。ゲノム編集は、ＮＨＥＪを使用して次いで修復される内在性遺伝子における二本鎖切断を発生させることによる、内在性遺伝子におけるアミノ酸置換の発生も含み得る。ＮＨＥＪは、アミノ酸置換が発生し得る修復中に、少なくとも１つの塩基対を追加または削除できる。ゲノム編集は、２つのヌクレアーゼ標的部位間の切断およびＮＨＥＪによるＤＮＡ切断の修復を作り出すために、同じＤＮＡ鎖上の２つのヌクレアーゼの同時作用によって遺伝子セグメントを削除することも含み得る。
配列に対して「異種」とは、外来種を起源とする配列、または同種に由来する場合は意図的な人間の介入によって組成および／もしくはゲノム遺伝子座がその天然の形態から大幅に改変された配列を意味する。
「相同組み換え修復」または「ＨＤＲ」は、一片の相同ＤＮＡが、主に細胞周期のＧ２およびＳ期に核中に存在する場合、二本鎖ＤＮＡ損傷を修復する細胞の機構を指す。ＨＤＲはドナーＤＮＡまたはドナー鋳型を使用して修復を導き、かつ遺伝子全体の標的化付加を含めたゲノムへの特異的配列変化を作り出すために使用され得る。ドナー鋳型が部位特異的ヌクレアーゼと共に提供される場合、次いで細胞機構が相同組み換えによって切断を修復し、これはＤＮＡ切断の存在下で桁違いに増大される。相同ＤＮＡ片が存在しない場合、代わりにＮＨＥＪが行われ得る。
「相同性」または「類似性」という用語は、配列整列によって比較される２つのポリペプチド分子間または２つのポリヌクレオチド分子間の配列類似性の度合いを指す。比較される２つの不連続ポリヌクレオチド間の相同性の度合いは、比較可能な位置での同一または一致するヌクレオチドの数の関数である。
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの文脈における「同一」または「同一性」は、配列が特定の領域にわたって同じである残基の特定の比率を有することを意味する。比率は、２つの配列を最適に整列し、２つの配列を特定の領域にわたって比較し、両方の配列において同一の残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を特定の領域における位置の総数で除し、その結果に１００を乗じることによって算出され、配列同一性の比率を得ることができる。２つの配列が異なる長さを有する場合、または整列によって１つ以上の互い違いの末端が生じ、比較対象の特定の領域が単一配列しか含まない場合には、単一配列の残基は計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較するとき、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等と見なされ得る。同一性は、手動で、またはＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、もしくはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎなどのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって決定され得る。一般的な多重整列プログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９４）２２，４６７３－４６８０、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９７），２４，４８７６－４８８２）は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの多重整列を作成するのに好適な方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの好適なパラメータは、以下の通りであり得る。ポリヌクレオチド整列について：ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティ＝６．６６、およびマトリックス＝Ｉｄｅｎｔｉｔｙ。ポリペプチド整列について：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、およびマトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびタンパク質の整列について：ＥＮＤＧＡＰ＝－１、およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列整列のためにこれらのパラメータおよび他のパラメータを変動させる必要があり得ることに気が付くであろう。次いで、好適には、同一性の比率の計算は、そのような整列から（Ｎ／Ｔ）として算出され、Ｎは、配列が同一の残基を共有している位置の数であり、Ｔは、ギャップを含むがオーバーハングを含まない、比較される位置の総数である。
「増加」または「増加した」という用語は、これらに限定されないが、ポリペプチド機能もしくは活性、転写機能もしくは活性、および／またはポリペプチド発現などの、量または機能もしくは活性の約１０％～約９９％の増加、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、もしくは少なくとも２００％以上の増加を指す。「増加した」という用語または「増加した量」という語句は、改変されていない植物または同じ様式で加工された同じ品種の植物由来の製品において発見され得るものよりも多い、改変された植物または改変された植物から製造された製品における量または機能もしくは活性を指すことができる。したがって、一部の文脈では、同じ様式で加工されている同じ品種の野生型植物が、量の増加が得られるかどうかを測定するための対照として使用される。
本明細書で使用される場合、「減少」または「減少した」という用語は、ポリペプチド機能、転写機能、またはポリペプチド発現などの量または機能の約１０％～約９９％の減少、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％以上の減少を指す。「増加した」という用語または「増加した量」という語句は、改変されていない植物または同じ様式で加工された同じ品種の植物由来の製品において発見され得るものよりも少ない、改変された植物または改変された植物から製造された製品における量または機能を指すことができる。したがって、一部の文脈では、同じ様式で加工されている同じ品種の野生型植物が、量の減少が得られるかどうかを測定するための対照として使用される。
「抑制する」または「抑制された」という用語は、これらに限定されないが、ポリペプチド機能もしくは活性、転写機能もしくは活性、および／またはポリペプチド発現などの、量または機能もしくは活性の約９８％～約１００％の減少、または少なくとも９８％、少なくとも９９％であるが、特に１００％の減少を意味する。
「導入される」という用語は、ポリヌクレオチド（例えば、構築物）またはポリペプチドを細胞に提供することを意味する。「導入される」は、ポリヌクレオチドが細胞のゲノムに組み込まれ得る、真核細胞へのポリヌクレオチドの取り込みへの言及を含み、細胞へのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの過渡的な供給への言及を含む。「導入される」は、安定的または過渡的な形質転換方法ならびに有性交雑への言及を含む。したがって、ポリヌクレオチド（例えば、組み換え構築物／発現構築物）を細胞に挿入する文脈における「導入される」は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、ポリヌクレオチドが細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ、自律レプリコンに変換されるか、または過渡的に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）、真核細胞へのポリヌクレオチドの取り込みへの言及を含む。
「単離された」または「精製された」という用語は、その天然の状態で発見された場合通常それに付随する構成要素を実質的または本質的に含まない材料を指す。純度および均一性は、典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー等の分析化学技法を使用して決定される。調製物中に存在する優勢種であるポリペプチドは、十分に精製される。特に、単離ポリヌクレオチドは、所望の遺伝子に隣接し、所望のポリペプチド以外のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームから分離される。本明細書で使用される場合、「精製される」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを引き起こすことを意味する。具体的には、これは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることを意味する。単離ポリヌクレオチドは、天然に存在する宿主細胞から精製され得る。当業者に既知の従来的なポリヌクレオチド精製方法を使用して、単離ポリヌクレオチドを得ることができる。また、この用語は組み換えポリヌクレオチドおよび化学的に合成されたポリヌクレオチドも包含する。
「調節する」または「調節」とは、対象のプロセス、経路、機能、もしくは活性における定性的または定量的な変化、変更、もしくは改変を引き起こすか、または促進することを指す。限定されないが、そのような変化、変更、または改変は、対象の相対的なプロセス、経路、機能、または活性の増加または減少であり得る。例えば、遺伝子発現もしくはポリペプチド発現、またはポリペプチド機能もしくは活性は、調節することができる。典型的には、相対的な変化、変更、または改変は、対照と比較することによって決定されるであろう。
本明細書で使用される場合、「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路」は、相同鋳型を必要とせずに切断末端を直接連結することによってＤＮＡにおける二重鎖切断を修復する経路を指す。ＮＨＥＪによるＤＮＡ末端の鋳型非依存性再連結は、ＤＮＡ切断点に無作為な微小挿入および微小欠失（挿入欠失）を導入する、確率論的な、エラーが発生しやすい修復プロセスである。この方法を使用して、標的遺伝子配列のリーディングフレームを意図的に破壊、削除、または変更し得る。ＮＨＥＪは、典型的には、マイクロホモロジーと呼ばれる短い相同ＤＮＡ配列を使用して修復を導く。これらのマイクロホモロジーは、しばしば二重鎖切断の末端上の一本鎖オーバーハングに存在する。オーバーハングが完全に適合性である場合、通常はＮＨＥＪが正確に切断を修復し、ヌクレオチドの損失に至る不正確な修復も起こり得るが、オーバーハングが適合性でない場合はさらにより一般的である。
「非天然型」という用語は、天然では形成されないか、または天然には存在しないポリヌクレオチド、遺伝子突然変異、ポリペプチド、植物、植物細胞、および植物材料などの実体を説明する。このような非天然型実体または人工的実体は、本明細書に説明されるか、または当該技術分野において既知である方法によって、作成、合成、開始、改変、介入、または操作され得る。このような非天然型実体または人工的実体は、人間によって作成、合成、開始、改変、介入、または操作され得る。したがって、一例として、非天然型植物、非天然型植物細胞、または非天然型植物材料は、伝統的な植物育種技法（例えば、戻し交雑）を使用して、または遺伝子操作技術（例えば、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、メガヌクレアーゼ等）によって作成され得る。さらなる例として、非天然型植物、非天然型植物細胞、または非天然型植物材料は、得られる植物、植物細胞、もしくは植物材料、またはそれらの子孫が、天然では形成されないかまたは天然には存在しない遺伝的構成（例えば、ゲノム、染色体、またはそれらのセグメント）を含むように、１つ以上の遺伝的突然変異（例えば、１つ以上の多型）を第１の植物または植物細胞から第２の植物または植物細胞（これはそれ自体が天然型であり得る）に遺伝子移入するか、または移入することによって作成し得る。得られる植物、植物細胞、または植物材料は、したがって人工的または非天然型である。したがって、人工的または非天然型植物または植物細胞は、得られる遺伝子配列が第１の植物または植物細胞とは異なる遺伝的背景を含む第２の植物または植物細胞において天然に発生する場合であっても、第１の天然型植物または植物細胞において遺伝子配列を改変することによって作成し得る。ある特定の実施形態では、突然変異は、遺伝子またはポリペプチドなど、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおいて天然に存在する天然型突然変異ではない。遺伝的背景における差異は、表現型的差異によって、またはポリヌクレオチド配列決定、遺伝的マーカー（例えば、ミクロサテライトＲＮＡマーカー）の存在または非存在などの、当該技術分野において既知の分子生物学技法によって検出することができる。
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有結合される少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列も定義する。したがって、ポリヌクレオチドはまた、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。ポリヌクレオチドの多くの変異体は、所与のポリヌクレオチドと同じ目的で使用され得る。したがって、ポリヌクレオチドはまた、実質的に同一のポリヌクレオチドおよびその相補体も包含する。一本鎖は、厳密なハイブリッド形成条件下で所定の配列にハイブリッド形成し得るプローブを提供する。したがって、ポリヌクレオチドは、厳密なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するプローブも包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含有し得る。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、または混成体であり得、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ－ヌクレオチドとリボ－ヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得る。ポリヌクレオチドは、化学的合成法によって、または組み換え法によって得ることができる。
相補的断片をハイブリッド形成するための一本鎖ＤＮＡの特異性は、反応条件の「厳密性」によって決定される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９））。ハイブリッド形成の厳密性は、ＤＮＡ二重鎖を形成する傾向が減少するにつれて増加する。ポリヌクレオチドのハイブリッド形成反応では、厳密性は、例えば、ライブラリから完全長クローンを特定するために使用することができる特異的ハイブリッド形成（高度厳密性）を支持するように選択することができる。低特異性のハイブリッド形成（低度厳密性）を使用して、正確に同じではないが関連した（相同であるが同一ではない）ＤＮＡ分子またはセグメントを特定することができる。ＤＮＡ二本鎖は、（１）相補的塩基対の数、（２）塩基対の種類、（３）反応混合物の塩分濃度（イオン強度）、（４）反応温度、および（５）ＤＮＡ二重鎖の安定性を減少させるホルムアミドなどの特定の有機溶媒の存在によって安定化される。一般に、プローブが長くなるにつれて、適切なアニーリングに必要な温度は高くなる。一般的な手法は温度を変動させることであり、相対温度が高くなるにつれて、反応条件はより厳密になる。「厳密な条件」下でハイブリッド形成するということは、互いに少なくとも６０％相同であるポリヌクレオチド配列がハイブリッド形成されたままである、ハイブリッド形成プロトコルを説明する。一般に、厳密な条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、所与の配列に相補的なプローブの５０％が所与の配列に平衡状態でハイブリッド形成する（定義されたイオン強度、ｐＨ、およびポリヌクレオチド濃度下での）温度である。所与の配列は一般にＴｍで過剰に存在するため、プローブの５０％は平衡状態で占められる。
「厳密なハイブリッド形成条件」は、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドがその特異的配列にのみハイブリッド形成することを可能にする条件である。厳密な条件は配列依存的であり、かつ相違する。厳密な条件は、典型的には、（１）低イオン強度および高温洗浄、例えば、５０℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、（２）ハイブリッド形成中の変性剤、例えば、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、０．１％ポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）、または（３）５０％ホルムアミドを含む。また、洗浄液は典型的には、４２℃で、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを含み、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃で５０％ホルムアミド中での洗浄、続いて５５℃でＥＤＴＡ含有０．１×ＳＳＣからなる高度厳密性洗浄液を含む。好適には、この条件は、互いに少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である配列が、典型的には互いにハイブリッド形成されたままであるようなものである。
「中程度に厳密な条件」は、洗浄溶液、およびポリヌクレオチドがポリヌクレオチドの全体、断片、誘導体、または類似体にハイブリッド形成するような、厳密性が低いハイブリッド形成条件を使用する。一例には、５５℃で、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ液、０．５％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリッド形成、続いて、３７℃で、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄が含まれる。温度、イオン強度等は、プローブの長さ等の実験的要因に適合するように調節することができる。他の中程度厳密性条件が説明されている（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照）。
「低度に厳密な条件」は、洗浄溶液、およびポリヌクレオチドがポリヌクレオチドの全体、断片、誘導体、または類似体にハイブリッド形成するような、中程度厳密性よりも厳密性が低いハイブリッド形成条件を使用する。低度厳密性ハイブリッド形成条件の非限定的な例には、４０℃で、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／体積）硫酸デキストラン中でのハイブリッド形成、続いて、５０℃で、２×ＳＳＣ、２５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄が含まれる。交雑種ハイブリッド形成などの他の低度厳密性の条件は、十分に説明されている（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０を参照）。
「動作可能に連結される」は、遺伝子の発現が、空間的に結合されるプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下で遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子の間の距離は、プロモーターがそれに由来する遺伝子において制御する、プロモーターと遺伝子の間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野において既知であるように、この距離の変動は、プロモーター機能を喪失することなく行い得る。「動作可能に連結される」とは、ある機能が他者によって制御されるような、単一断片におけるポリヌクレオチド断片の会合を指す。例えば、プロモーターがポリヌクレオチド断片の転写を制御することが可能である場合、プロモーターはポリヌクレオチド断片に動作可能に連結されている。
「植物」という用語は、そのライフサイクルまたは発育の任意の段階にある任意の植物、およびその子孫を指す。一実施形態では、植物はタバコ植物であり、これはＮｉｃｏｔｉａｎａ属に属する植物を指す。この用語は、植物全体、植物器官、植物組織、植物珠芽、植物種子、植物細胞、およびその子孫への言及を含む。植物細胞としては、これらに限定されないが、種子、懸濁培養、胚、分裂組織部位、カルス組織、葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉、および花粉粒の細胞が挙げられる。好適な種、栽培種、ハイブリッド、および品種のタバコ植物が本明細書に説明される。
「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド断片」は、本明細書において互換的に使用され、合成、非天然、または変更されたヌクレオチド塩基を任意に含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ヌクレオチド（通常、５’－一リン酸塩形態で発見される）は、以下の一文字表示：アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡの）に対しては「Ａ」、シチジル酸またはデオキシシチジル酸に対しては「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸に対しては「Ｇ」、ウリジル酸に対しては「Ｕ」、デオキシチミジル酸に対しては「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に対しては「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に対しては「Ｙ」、ＧまたはＴに対しては「Ｋ」、ＡまたはＣまたはＴに対しては「Ｈ」、イノシンに対しては「Ｉ」、および任意のヌクレオチドに対しては「Ｎ」で示される。ポリヌクレオチドは、これらに限定されないが、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、もしくはアンチセンスＲＮＡ、またはそれらの断片（複数可）であり得る。その上、ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖、一本鎖および二本鎖の領域の混合物、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子、または一本鎖および二本鎖領域もしくはそれらの断片（複数可）の混合物を有するハイブリッド分子であり得る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはそれらの両方、またはそれらの断片を含む、三重鎖領域で構成され得る。ポリヌクレオチドは、ホスホチオアートなどの１つ以上の改変された塩基を含有することができ、かつペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。一般的に、ポリヌクレオチドは、単離されたかまたはクローン化されたｃＤＮＡの断片、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、もしくは個別ヌクレオチド、または前述の組み合わせから組み立てることができる。本明細書に説明されるポリヌクレオチドはＤＮＡ配列として示されているが、ポリヌクレオチドは、それらの対応するＲＮＡ配列、およびそれらの逆相補体を含むそれらの相補的な（例えば、完全に相補的な）ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。本開示のポリヌクレオチドは、添付の配列表に記載されている。
「ポリペプチド」または「ポリペプチド配列」は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然型アミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸のポリマー、ならびにアミノ酸の天然型ポリマーを指す。これらの用語は、これらに限定されないが、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、水酸化、およびＡＤＰリボース化を含む改変も含む。本開示のポリペプチドは、添付の配列表に記載されている。
「プロモーター」は、細胞におけるポリヌクレオチドの発現を付与、活性化、または増強することが可能である合成または天然由来分子を意味する。この用語は、典型的には上流に位置し、二本鎖ポリヌクレオチド断片に動作可能に連結されたポリヌクレオチドの要素／配列を指す。プロモーターは、対象の天然遺伝子の近傍の領域に完全に由来し得るか、または異なる天然プロモーターもしくは合成ポリヌクレオチドセグメントに由来する異なる要素から構成され得る。プロモーターは、さらに発現を高めたり、ならびに／またはその空間的発現および／もしくは過渡的発現を変更したりするために、１つ以上の特異的転写制御配列を含み得る。プロモーターはまた、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素も含み得、転写の開始部位から数千個ほどの塩基対を配置し得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む発生源に由来し得る。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織、もしくは器官に対して、または発現が起こる成長段階に対して、あるいは生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘発剤等の外部刺激に応答して、構成的または差示的に遺伝子成分の発現を制御し得る。
本明細書で互換的に使用される場合、「組織特異的プロモーター」および「組織優先的プロモーター」は、必ずしもそうではないが主に１つの組織または器官においてのみ発現するが、１つの特定の細胞においても発現し得るプロモーターを指す。「発生的に制御されたプロモーター」は、その機能が発生事象によって決定されるプロモーターを指す。「構成的プロモーター」は、ほとんどの場合にほとんどの細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターを指す。「誘導プロモーター」は、例えば、化合物（化学誘導物質）による内因性もしくは外因性刺激の存在に応じて、または環境、ホルモン、化学、および／もしくは発生シグナルに応じて、動作可能に連結されたＤＮＡ配列を選択的に発現させる。誘導プロモーターまたは制御されたプロモーターの例としては、光、熱、圧力、湛水もしくは乾燥、病原体、植物ホルモン、創傷、またはエタノール、ジャスモン酸、サリチル酸、もしくは薬害軽減剤などの化学物質によって制御されるプロモーターが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「組み換え」は、例えば、化学的合成によるか、または遺伝子組み換え技法によるポリヌクレオチドの単離セグメントの操作による、２つの、そうでなければ分離した配列セグメントの人工的な組み合わせを指す。この用語はまた、異種ポリヌクレオチドの導入によって改変されている細胞もしくはベクター、またはそのように改変された細胞由来の細胞への言及も含むが、意図的な人間の介入なしに発生するものなどの、天然型事象（例えば、偶発突然変異、自然形質転換または形質導入または転位）による細胞またはベクターの変更を包含しない。
「組み換え構築物」は、通常天然では一緒に発見されないポリヌクレオチドの組み合わせを指す。したがって、組み換え構築物は、異なる供給源に由来する制御配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、通常天然で発見されるものとは異なる様式で配列された制御配列およびコード配列を含み得る。組み換え構築物は、組み換えＤＮＡ構築物であり得る。
本明細書で互換的に使用される場合、「制御配列」および「制御要素」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼすポリヌクレオチド配列を指す。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列が挙げられる。「制御配列」および「制御要素」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
「部位特異的ヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ配列を特異的に認識および切断することができる酵素を指す。部位特異的ヌクレアーゼは操作され得る。操作された部位特異的ヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系システム、およびメガヌクレアーゼが挙げられる。
「タバコ」という用語は集合的な意味で使用され、本明細書に説明されるように調製および／または取得される、タバコ作物（例えば、圃場で栽培され、水耕栽培タバコではない複数のタバコ植物）、タバコ植物、ならびに根、茎、葉、花、および種子を含むがこれらに限定されないその部分を指す。「タバコ」は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物およびその製品を指すことが理解される。
「タバコ製品」という用語は、これらに限定されないが、喫煙材料（例えば、紙巻タバコ、葉巻タバコ、およびパイプタバコ）、嗅ぎタバコ、噛みタバコ、ガム、およびトローチ剤、ならびに消費者用タバコ製品の製造のための構成要素、材料、および成分を含む、消費者用タバコ製品を指す。好適には、これらのタバコ製品は、タバコから収穫されるタバコ葉および葉柄から製造され、タバコ調製における従来的な技法に従って切断、乾燥、乾燥処理、および／または発酵される。
「転写ターミネーター」、「終止配列」、または「ターミネーター」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる制御シグナルをコードする他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸配列の付加に影響を及ぼすという特徴がある。
「トランスジェニック」は、そのゲノムが組み換え構築物などの異種ポリヌクレオチドの存在によって変更されている任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部分、または植物を指し、それらの最初のトランスジェニック事象、ならびに最初のトランスジェニック事象から有性交雑または無性繁殖によって作り出されたものが含まれる。この用語は、従来的な植物育種方法によるか、または天然型事象（例えば、無作為な交雑受精、非組み換え型ウイルス感染、非組み換え型細菌形質転換、非組み換え型転位、または偶発突然変異）によるゲノム（染色体または染色体外）の変更を包含しない。
「トランスジェニック植物」は、そのゲノム内に１つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む植物、すなわち、通常その中では発見されず、人為的操作によって問題の植物（またはその植物の祖先）に導入されている、組み換え遺伝子材料を含有する植物を指す。例えば、異種ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが継続世代に伝わるように、安定的にゲノム内に統合される。異種ポリヌクレオチドは、単独で、または組み換え構築物の一部として、ゲノムに統合することができる。また、遺伝的に改良された生殖質の商業開発は、複数の形質を作物植物に導入する段階まで進んでおり、しばしば遺伝子スタッキング手法と称される。当該手法では、対象の異なる特性を付与する複数の遺伝子を植物に導入することができる。遺伝子スタッキングは、これらに限定されないが、同時形質転換、再形質転換、および異なる導入遺伝子を有する交雑系統を含む多くの手段によって達成することができる。したがって、形質転換によって組み換えＤＮＡが導入された植物細胞から成長した植物はトランスジェニック植物であり、（有性生殖または無性生殖にかかわらず）導入された導入遺伝子を含有する植物の全子孫も同様である。トランスジェニック植物という用語は、植物または樹木の全体および植物または樹木の部分、例えば、穀粒、種子、花、葉、根、果実、花粉、葉柄等を包含することが理解される。各異種ポリヌクレオチドは、トランスジェニック植物に異なる形質を付与し得る。
「転写活性化因子様エフェクター」または「ＴＡＬＥ」は、特定のＤＮＡ配列を認識して結合するポリペプチド構造を指す。「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＲＶＤモジュールとしても既知であり、その各々がＤＮＡの単一塩基対を特異的に認識する、縦列型３３～３５アミノ酸反復アレイを含むＤＮＡ結合ドメインを指す。定義された配列を認識するアレイを組み立てるために、ＲＶＤモジュールを任意の順序に配置することができる。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの結合特異性は、ＲＶＤアレイに続いて２０個のアミノ酸の単一短縮型反復によって決定される。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、１２～２７個のＲＶＤモジュールを有し得、その各々がＲＶＤを含有し、ＤＮＡの単一塩基対を認識する。４つの可能性のあるＤＮＡヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧ）の各々を認識する特異的ＲＶＤが特定されている。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインはモジュール式であるため、４つの異なるＤＮＡヌクレオチド認識する反復を一緒に連結して任意の特定のＤＮＡ配列を認識し得る。次いで、これらの標的化ＤＮＡ結合ドメインを触媒ドメインと組み合わせて、人工転写因子、メチルトランスフェラーゼ、インテグラーゼ、ヌクレアーゼ、およびリコンビナーゼを含む、機能性酵素を作り出すことができる。
本明細書で互換的に使用される場合、「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」または「ＴＡＬＥＮ」は、エンドヌクレアーゼＦｏｋＩなどのヌクレアーゼの触媒ドメイン、および通常のＤＮＡ配列を標的化し得る設計されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの、操作された融合ポリペプチドを指す。
「ＴＡＬＥＮモノマー」は、触媒ヌクレアーゼドメインおよび設計されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを有する操作された融合ポリペプチドを指す。２つのＴＡＬＥＮモノマーを設計して、ＴＡＬＥＮ標的領域を標的化および切断し得る。
「導入遺伝子」は、ある生物から単離され、かつ異なる生物に導入されている遺伝子配列を含有する遺伝子または遺伝子材料を指す。この非天然のＤＮＡセグメントは、トランスジェニック生物においてＲＮＡまたはポリペプチドを産生する能力を保持し得るか、またはトランスジェニック生物の遺伝子コードの正常な機能を変更し得る。導入遺伝子の導入は生物の表現型を変化させる可能性を有する。
ポリヌクレオチドに関する「変異体」とは、（ｉ）ポリヌクレオチドの一部分もしくは断片、（ｉｉ）ポリヌクレオチドもしくはその一部分の相補体、（ｉｉｉ）対象のポリヌクレオチドもしくはその相補体と実質的に同一であるポリヌクレオチド、または（ｉｖ）対象のポリヌクレオチド、その相補体、もしくはそれらと実質的に同一のポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチドを意味する。
ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によって配列が相違するが、少なくとも１つの生物学的機能または活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを意味する。変異体はまた、少なくとも１つの生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を類似した特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）を有する異なるアミノ酸で置き換えることは、典型的には軽微な変化を伴うと当該技術分野で認識されている。
「品種」という用語は、同じ種の他の植物から区別される一定の特性を共有する植物の集団を指す。１つ以上の特有の形質を有しながらも、品種は、その品種内の個体間の非常に軽微な全体的変化によってさらに特性付けられる。品種は、しばしば市販されている。
「ベクター」とは、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物、およびポリヌクレオチド共役体などの輸送を可能にするためのポリヌクレオチド構成要素の組み合わせを含むポリヌクレオチド媒体を指す。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。好適なベクターには、円形の二本鎖ヌクレオチドプラスミド、線形の二本鎖ヌクレオチドプラスミド、および他の任意の起源のベクターなど、染色体外の複製が可能なエピソームが含まれる。本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、ポリヌクレオチド（複数可）、ポリヌクレオチド構築物、およびポリヌクレオチド共役体などの発現を可能にするためのポリヌクレオチド構成要素の組み合わせを含むポリヌクレオチド媒体である。好適な発現ベクターには、円形の二本鎖ヌクレオチドプラスミド、線形の二本鎖ヌクレオチドプラスミド、および他の任意の起源の機能的に同等な発現ベクターなど、染色体外の複製が可能なエピソームが含まれる。発現ベクターは、以下に定義されるように、上流に位置し、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物、またはポリヌクレオチド共役体に動作可能に連結された、少なくともプロモーターを含む。
「ジンクフィンガー」」は、ＤＮＡ配列を認識し結合するポリペプチド構造を指す。ジンクフィンガードメインは、ヒトプロテオームにおける最も一般的なＤＮＡ結合モチーフである。単一ジンクフィンガーは約３０個のアミノ酸を含有し、ドメインは、典型的には、１塩基対あたり１つのアミノ酸側鎖の相互作用を介して３つの連続するＤＮＡ塩基対に結合することによって機能する。
「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＺＦＮ」は、完全に組み立てられたときにＤＮＡを切断できる少なくとも１つのヌクレアーゼまたはヌクレアーゼの部分に効果的に連結される少なくとも１つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む、キメラポリペプチド分子を指す。
本明細書に別段定義されない限り、本開示に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって通常理解されている意味を有するものとする。例えば、本明細書に説明される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにポリペプチドおよびポリヌクレオチド化学およびハイブリッド形成に関連して使用される任意の命名および技術は、当該技術分野において周知であり、通常使用されているものである。用語の意味および範囲は明確でなければならないが、あらゆる潜在的な曖昧性が発生した場合には、本明細書に提供される定義がいかなる辞書または外部の定義を越えて優先される。さらに、文脈によって別段指定されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
ポリヌクレオチド
一実施形態では、配列表に示される任意のポリヌクレオチドを含む、本明細書に説明される任意の配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる単離ポリヌクレオチドが提供される。好適には、単離ポリヌクレオチドは、それに対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。好適には、本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）は、配列表に示されるポリペプチド（複数可）の機能または活性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％以上を有する活性ＡＡＴポリペプチドをコードする。
別の実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またそれから本質的になる単離ポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号５もしくは配列番号７に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる単離ポリヌクレオチドが提供される。
特定の実施形態では、配列番号１もしくは配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる単離ポリヌクレオチドが提供される。
好適には、単離ポリペプチド（複数可）は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
好適には、単離ポリペプチド（複数可）は、配列番号５または配列番号７に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
好適には、単離ポリヌクレオチド（複数可）は、配列番号１もしくは配列番号３に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
別の実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して実質的な相同性（すなわち、配列類似性）または実質的な同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号５もしくは配列番号７に対して実質的な相同性（すなわち、配列類似性）または実質的な同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号１もしくは配列番号３に対して実質的な相同性（すなわち、配列類似性）または実質的な同一性を有するポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５のそれらに対して実質的な相同性（すなわち、配列類似性）または実質的な同一性を有する断片が提供され、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５の対応する断片に対して少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは１００％の配列同一性を有する。
別の実施形態では、配列番号５または配列番号７の対応する断片に対して少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する、それらに対して実質的な相同性（すなわち、配列類似性）または実質的な同一性を有する、配列番号５または配列番号７の断片が提供される。
別の実施形態では、配列番号１または配列番号３の対応する断片に対して少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する、それらに対して実質的な相同性（すなわち、配列類似性）または実質的な同一性を有する、配列番号１または配列番号３の断片が提供される。
別の実施形態では、ＡＡＴとして機能するポリペプチドをコードする配列番号５もしくは配列番号７に対して十分なもしくは実質的な程度の同一性または類似性を含むポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、ＡＡＴとして機能するポリペプチドをコードする配列番号１もしくは配列番号３に対して十分なもしくは実質的な程度の同一性または類似性を含むポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、ＡＡＴとして機能するポリペプチドをコードする配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して十分なもしくは実質的な程度の同一性または類似性を含むポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、ＡＡＴとして機能するポリペプチドをコードする配列番号５もしくは配列番号７に対して十分なもしくは実質的な程度の同一性または類似性を含むポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、ＡＡＴとして機能するポリペプチドをコードする配列番号１もしくは配列番号３に対して十分なもしくは実質的な程度の同一性または類似性を含むポリヌクレオチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５として本明細書に指定されているポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドの重合体が提供される。
別の実施形態では、配列番号５もしくは配列番号７として本明細書に指定されているポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドの重合体が提供される。
別の実施形態では、配列番号１もしくは配列番号３として本明細書に指定されているポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドの重合体が提供される。
好適には、本明細書に説明されるポリヌクレオチドは、ＡＡＴポリペプチドをコードする。
本明細書に説明されるように、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号１）およびＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号３）は、タバコ生葉と比較して、４８時間の乾燥処理後に最も発現した遺伝子である。発現のレベルは、タバコ生葉の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１倍であり得る。ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号１）およびＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号３）の使用は、本開示の特定の実施形態において好ましい。ポリヌクレオチドは、未改変もしくは改変デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得るヌクレオチドの重合体を含むことができる。したがって、ポリヌクレオチドは、これらに限定されないが、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、もしくはアンチセンスＲＮＡ、またはそれらの断片（複数可）であり得る。その上、ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子、または一本鎖および二本鎖領域の混合物もしくはそれらの断片（複数可）を含むハイブリッド分子であり得る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはそれらの両方、またはそれらの断片を含む、三重鎖領域で構成され得る。ポリヌクレオチドは、ホスホチオアートなどの１つ以上の改変された塩基を含有することができ、ペプチド核酸であり得る。一般的に、ポリヌクレオチドは、単離されたかもしくはクローン化されたｃＤＮＡの断片、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、または個々のヌクレオチド、あるいは前述の組み合わせから組み立てることができる。本明細書に説明されるポリヌクレオチドはＤＮＡ配列として示されているが、それらは、それらの対応するＲＮＡ配列、およびそれらの逆相補体を含むそれらの相補的な（例えば、完全に相補的な）ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。
ポリヌクレオチドは一般的にリン酸ジエステル結合を含有するが、いくつかの場合では、ポリヌクレオチド類似体は、例えば、ホスホルアミド酸、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、またはＯ－メチルホホロアミダイト連鎖、ならびにペプチドポリヌクレオチドの骨格および連鎖を含む、代替的な骨格を有し得る。他の類似体ポリヌクレオチドには、陽性骨格、非イオン性骨格、および非リボース骨格を有するものが含まれる。リボース－リン酸骨格の改変は、様々な理由で、例えば、このような分子の生理学的環境における、またはバイオチップ上のプローブとしての安定性および半減期を増大させるために行われ得る。天然型ポリヌクレオチドおよび類似体の混合物、あるいは、異なるポリヌクレオチド類似物の混合物、ならびに天然型ポリヌクレオチドおよび類似体の混合物を作製し得る。
例えば、ホスホルアミド酸、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、Ｏ－メチルホホロアミダイト連鎖、ならびにペプチドポリヌクレオチドの骨格および連鎖を含む、様々なポリヌクレオチド類似体が知られている。他の類似体ポリヌクレオチドには、陽性骨格、非イオン性骨格、および非リボース骨格を有するものが含まれる。１つ以上の炭素環式糖を含有するポリヌクレオチドも含まれる。
他の類似体には、ペプチドポリヌクレオチド類似体であるペプチドポリヌクレオチドが含まれる。これらの骨格は、天然型ポリヌクレオチドの多価のリン酸ジエステル骨格とは対照的に、中性条件下で実質的に非イオン性である。これは結果的に有利となり得る。まず、ペプチドポリヌクレオチド骨格は、改善されたハイブリッド形成動態学を呈し得る。ペプチドポリヌクレオチドは、完全マッチ塩基対と比較して、ミスマッチ塩基の融解温度においてより大きな変化を有する。ＤＮＡおよびＲＮＡは、典型的に、内部ミスマッチの融解温度において２～４℃の低下を示す。非イオン性ペプチドポリヌクレオチド骨格では、この低下は７～９℃に近似する。同様に、それらの非イオン性に起因して、これらの骨格に付着した塩基のハイブリッド形成は、塩分濃度に対して比較的鈍感である。さらに、ペプチドポリヌクレオチドは、細胞の酵素によって分解されないか、またはより低い程度に分解されない場合があり、したがってより安定性であり得る。
開示されるポリヌクレオチドおよびその断片の用途の中には、ハイブリッド形成アッセイにおけるプローブ、または増幅アッセイにおいて使用するためのプライマーとしての断片の用途がある。このような断片は、一般的に、ＤＮＡ配列の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０以上の連続ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０または６０以上の連続ヌクレオチドを含む。したがって、一態様では、プローブもしくはプライマーまたは両方の使用を含む、ポリヌクレオチドを検出するための方法も提供される。例示的なプライマーが本明細書に説明される。
ハイブリッド形成条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメータ、および好適な条件を考案するための手引きについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）によって説明されている。遺伝子コードを本明細書に説明されるポリペプチド配列と組み合わせた知識を用いて、縮重オリゴヌクレオチドの組を調製することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ断片が単離され増幅されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プライマーとして有用である。特定の実施形態では、縮重プライマーは、遺伝的ライブラリのためのプローブとして使用することができる。そのようなライブラリには、ｃＤＮＡライブラリ、ゲノムライブラリ、およびさらには電子的な発現配列タグまたはＤＮＡライブラリが含まれる。次いで、この方法によって特定された相同配列をプローブとして使用して、本明細書で特定された配列の相同体を特定し得る。
また、潜在的な用途は、本明細書に説明されるように、低度厳密性条件下で、典型的には中程度厳密性条件下で、および通常は高度厳密性条件下でポリヌクレオチド（複数可）に対してハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド（例えば、プライマーまたはプローブ）の用途である。ハイブリッド形成条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメータ、および好適な条件を考案するための手引きについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に記載されており、当業者であれば、例えば、ポリヌクレオチドの長さまたは塩基組成に基づいて、容易に決定することができる。
中程度および高度に厳密な条件を達成する１つの方法が本明細書に定義される。洗浄温度および洗浄塩分濃度は、当業者にとって既知であり、かつ以下にさらに説明される、ハイブリッド形成反応および二重鎖安定性を支配する基本原則を適用することによって所望の程度の厳密性を達成するために、必要に応じて調整することができることが理解されるべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ）を参照）。ポリヌクレオチドを未知の配列のポリヌクレオチドにハイブリッド形成する場合、混成体の長さは、ハイブリッド形成ポリヌクレオチドの長さであると想定される。既知の配列のポリヌクレオチドをハイブリッド形成する場合、混成体の長さは、ポリヌクレオチドの配列を整列させ、最適な配列補完性のある領域（複数可）を識別することにより決定できる。長さが５０塩基対未満であると予想される混成体のハイブリッド形成温度は、混成体の融解温度より５～１０℃低いべきであり、融解温度は以下の等式によって決定される。長さが１８塩基対未満の混成体では、融解温度（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。長さが１８塩基対を超える混成体では、融解温度（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎは混成体中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオン濃度（１×標準クエン酸ナトリウムの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）である。典型的には、このようなハイブリッド形成ポリヌクレオチドの各々は、ハイブリッド形成の対象となるポリヌクレオチドの長さの少なくとも２５％（一般的には、少なくとも５０％、６０％、または７０％、最も一般的には、少なくとも８０％）である長さを有し、ハイブリッド形成の対象となるポリヌクレオチドと少なくとも６０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）の配列同一性を有する。
当業者であれば理解できるように、直鎖ＤＮＡは、可能性のある２つの配向性：５’－３’方向および３’－５’方向を有する。例えば、第１の配列が５’－３’方向に配置されており、かつ第２の配列が同一のポリヌクレオチド分子／鎖内で５’－３’方向に配置されている場合には、第１の配列および第２の配列は同一の方向に配向されており、すなわち同一の配向性を有する。典型的には、所定のプロモーターの制御下にある関心のプロモーター配列および遺伝子は、同一の配向性で配置される。しかしながら、５’－３’方向に配置されている第１の配列に対して、第２の配列が同一のポリヌクレオチド分子／鎖内で３’－５’方向に配置されている場合には、第１の配列および第２の配列は、アンチセンスの方向に配向されており、すなわちアンチセンス配向性を有する。あるいは、互いに対してアンチセンス配向性を有する２つの配列は、第１の配列（５’－３’方向）および第１の配列の逆相補的配列（５’－３’方向に配置されている第１の配列）が同一のポリヌクレオチド分子／鎖内に配置されている場合に、同一の配向性を有すると説明することができる。本明細書に記載される配列は、５’－３’方向で示されている。
少なくとも１つの改変（例えば、突然変異）が、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号５）、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号７）、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号１）、ＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号３）、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ（配列番号９）、ＮｔＡＡＴ３－Ｔ（配列番号１１）、ＮｔＡＡＴ４－Ｓ（配列番号１３）、およびＮｔＡＡＴ４－Ｔ（配列番号１５）のうちの１つ以上に含まれ得る。
特定の実施形態では、少なくとも１つの改変（例えば、突然変異）が、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号５）およびＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号７）のうちの１つ以上に含まれ得る。
特定の実施形態では、少なくとも１つの改変（例えば、突然変異）が、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号１）およびＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号３）のうちの１つ以上に含まれ得る。
特定の実施形態では、少なくとも１つの改変（例えば、突然変異）が、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号５）、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号７）、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号１）、およびＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号３）のうちの１つ以上に含まれ得る。
特定の実施形態では、少なくとも１つの改変（例えば、突然変異）が、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号５）、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号７）、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号１）、およびＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号３）のうちの１つ以上に含まれ得、一方、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ（配列番号９）、ＮｔＡＡＴ３－Ｔ（配列番号１１）、ＮｔＡＡＴ４－Ｓ（配列番号１３）、およびＮｔＡＡＴ４－Ｔ（配列番号１５）のうちの１つ以上は、改変（複数可）（例えば、突然変異（複数可））を含まない。
特定の実施形態では、少なくとも１つの改変（例えば、突然変異）が、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号５）、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号７）、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号１）、およびＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号３）のうちの１つ以上に含まれ得、一方、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ（配列番号９）、ＮｔＡＡＴ３－Ｔ（配列番号１１）、ＮｔＡＡＴ４－Ｓ（配列番号１３）、およびＮｔＡＡＴ４－Ｔ（配列番号１５）は、改変（複数可）（例えば、突然変異（複数可））を含まない。
ポリペプチド
別の態様では、配列表に示される任意のポリペプチドを含む、本明細書に説明される任意のポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる単離ポリペプチドが提供される。好適には、単離ポリペプチドは、それに対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
一実施形態では、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、本明細書に説明される任意のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号６、配列番号８、配列番号２、配列番号４、配列番号１０、もしくは配列番号１２に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる単離ポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる単離ポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号６もしくは配列番号８に対して少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる単離ポリペプチドが提供される。
別の実施形態では、配列番号６もしくは配列番号８に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは１００％の配列同一性、配列番号２もしくは配列番号４に対して少なくとも９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは１００％の配列同一性、または配列番号１４もしくは配列番号１６に対して少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる単離ポリペプチドが提供される。
ポリペプチドは、配列番号６、配列番号８、配列番号２、配列番号４、配列番号１０、もしくは配列番号１２に対して十分なもしくは実質的な程度の同一性または類似性を含む配列を含み、ＡＡＴとして機能することができる。ポリペプチドは、配列番号６もしくは配列番号８に対して十分なもしくは実質的な程度の同一性または類似性を含む配列を含み、ＡＡＴとして機能することができる。ポリペプチドは、配列番号２もしくは配列番号４に対して十分なもしくは実質的な程度の同一性または類似性を含む配列を含み、ＡＡＴとして機能することができる。ポリペプチド（複数可）の断片は、典型的には、完全長配列の機能または活性の一部またはすべてを保持する。
本明細書に説明されるように、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号１）およびＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号３）は、タバコ生葉と比較して、４８時間の乾燥処理後に最も発現した遺伝子である。発現のレベルは、タバコ生葉の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１倍であり得る。ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号１）およびＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号３）の使用は、本開示の特定の実施形態において好ましい。本明細書に考察されるように、ポリペプチドはまた、任意の種類の変更（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、または置換；グリコシル化状態の変化；再折り畳みもしくは異性化、三次元構造、または自己会合状態に影響を及ぼす変化）の導入によって生成される突然変異体も含み、それらの機能または活性の一部もしくはすべてを依然として有する場合には、意図的に操作するか、または自然に単離することができる。好適には、この機能または活性は調節される。
欠失は、ポリペプチドからの１つ以上のアミノ酸の除去を指す。挿入は、１つ以上のアミノ酸残基がポリペプチド内の所定の部位に導入されることを指す。挿入は、単一または複数のアミノ酸の配列内の挿入を含み得る。置換は、ポリペプチドのアミノ酸を、類似の特性（例えば、類似の疎水性、親水性、抗原性、αヘリックス構造もしくはβシート構造を形成または破損する傾向）を有する他のアミノ酸で置き換えることを指す。アミノ酸置換は、典型的には単一の残基の置換であるが、ポリペプチドに対して課された機能的制約に応じてクラスター化され得、約１～約１０アミノ酸の範囲であり得る。アミノ酸置換は、好ましくは、以下に説明されるような保存的アミノ酸置換である。アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入は、ペプチド合成技法（例えば、固相ペプチド合成）を使用するか、または組み換えＤＮＡ操作によって行うことができる。ポリペプチドの置換、挿入、または欠失変異体を生成するためにＤＮＡ配列を操作する方法は、当該技術分野において周知である。変異体は、サイレント変化を生み出す改変を有し得、機能的に同等なポリペプチドをもたらし得る。物質の二次的な結合が保持されている限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および両親媒性における類似性に基づき、意図的なアミノ酸置換が行われ得る。例えば、負帯電のアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正帯電のアミノ酸は、リシンおよびアルギニンを含み、ならびに類似した親水性値を有する非帯電の極性頭基を備えたアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。保存的置換は、例えば、以下の表に従って行われ得る。２列目の同じ欄にあるアミノ酸、および好ましくは３列目の同じ行にあるアミノ酸は、互いに置換し得る。
ポリペプチドは、成熟ポリペプチドもしくは未熟ポリペプチド、または未熟ポリペプチドに由来するポリペプチドであり得る。ポリペプチドは線形であり得、または既知の方法を使用して環化してもよい。ポリペプチドは、典型的には、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、または少なくとも４０個の連続アミノ酸を含む。
少なくとも１つの改変（例えば、突然変異）が、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号６）、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号８）、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号２）、ＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号４）、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ（配列番号１０）、ＮｔＡＡＴ３－Ｔ（配列番号１２）、ＮｔＡＡＴ４－Ｓ（配列番号１４）、およびＮｔＡＡＴ４－Ｔ（配列番号１６）のうちの１つ以上に含まれ得る。
特定の実施形態では、少なくとも１つの改変（例えば、突然変異）が、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号６）、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号８）、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号２）、およびＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号４）のうちの１つ以上に含まれ得る。
特定の実施形態では、少なくとも１つの改変（例えば、突然変異）が、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号６）およびＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号８）のうちの１つ以上に含まれ得る。
特定の実施形態では、少なくとも１つの改変（例えば、突然変異）が、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号２）およびＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号４）のうちの１つ以上に含まれ得る。
特定の実施形態では、少なくとも１つの改変（例えば、突然変異）が、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号６）、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号８）、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号２）、およびＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号４）のうちの１つ以上に含まれ得、一方、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ（配列番号１０）、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ（配列番号１２）、ＮｔＡＡＴ４－Ｓ（配列番号１４）、およびＮｔＡＡＴ４－Ｔ（配列番号１６）のうちの１つ以上は、改変（例えば、突然変異（複数可））を含まない。
特定の実施形態では、少なくとも１つの改変（例えば、突然変異）が、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号６）、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号８）、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号２）、およびＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号４）のうちの１つ以上に含まれ得、一方、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ（配列番号１０）、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ（配列番号１２）、ＮｔＡＡＴ４－Ｓ（配列番号１４）、およびＮｔＡＡＴ４－Ｔ（配列番号１６）は、改変（例えば、突然変異（複数可））を含まない。
植物の改変
ａ．形質転換
組み換え構築物は、ポリペプチドの発現、機能、または活性を調節するために、植物または植物細胞を形質転換するために使用することができる。組み換えポリヌクレオチド構築物は、１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチドをコードし、ポリペプチドを発現するのに好適な制御領域に動作可能に連結されたポリヌクレオチドを含むことができる。したがって、ポリヌクレオチドは、本明細書に説明されるポリペプチドをコードするコード配列を含むことができる。ポリペプチドの発現、機能、または活性が調節されている植物または植物細胞としては、突然変異型、非天然型、トランスジェニック、人造、または遺伝子組み換え植物または植物細胞を挙げることができる。好適には、トランスジェニック植物または植物細胞は、組み換えＤＮＡの安定した組み込みによって変更されたゲノムを含む。組み換えＤＮＡは、遺伝子組み換えされ、細胞の外部に構築されたＤＮＡを含み、かつ天然型ＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡを含有するＤＮＡを含む。トランスジェニック植物は、最初に形質転換された植物細胞から再生された植物や、形質転換された植物の後の世代または交雑種からの子孫トランスジェニック植物を含むことができる。好適には、トランスジェニック改変は、対照植物と比較して、ポリヌクレオチドまたは本明細書に説明されるポリペプチドの発現または機能または活性を変更する。
組み換えポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、天然ポリペプチドであり得るか、または細胞に対して異種であり得る。いくつかの場合では、組み換え構築物は、発現を調節し、制御領域と動作可能に連結されたポリヌクレオチドを含有する。好適な制御領域の例が、本明細書に説明される。
本明細書に説明されるものなど、組み換えポリヌクレオチド構築物を含有するベクターも提供される。好適なベクター骨格としては、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体、またはバクテリオファージ人工染色体など、当該技術分野で日常的に使用されているものが挙げられる。好適な発現ベクターとしては、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、およびレトロウイルスに由来するプラスミドおよびウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。多数のベクターおよび発現システムが市販されている。
ベクターは、例えば、複製の起源、足場アタッチメント領域、またはマーカーを含むことができる。マーカー遺伝子は、植物細胞に対して選択可能な表現型を付与することができる。例えば、マーカーは、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはハイグロマイシン）または除草剤（例えば、グリホサート、クロルスルフロン、またはフォスフィノスリシン）に対する耐性を付与することができる。さらに、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するように設計されたタグ配列を含むことができる。ルシフェラーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、緑色蛍光ポリペプチド、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、ｃ－ｍｙｃ、またはヘマグルチニン配列などのタグ配列は、典型的には、コードされるポリペプチドとの融合物として発現される。このようなタグは、カルボキシルまたはアミノ末端のいずれかも含めた、ポリペプチド内のどこにおいても挿入することができる。
植物または植物細胞は、安定的に形質転換されるようにそのゲノムに統合された組み換えポリヌクレオチドを有することによって形質転換することができる。本明細書に説明される植物または植物細胞は、安定的に形質転換することができる。安定的に形質転換された細胞は、典型的には、導入されたポリヌクレオチドを毎回の細胞分裂において保持する。植物または植物細胞は、組み換えポリヌクレオチドがそのゲノムに統合されないように、過渡的に形質転換することができる。過渡的に形質転換された細胞は、典型的には、導入された組み換えポリヌクレオチドが十分な数の細胞分裂の後で娘細胞において検出されないように、導入された組み換えポリヌクレオチドのすべてまたは一部を毎回の細胞分裂において失う。
バイオリステック、遺伝子銃技法、アグロバクテリウム媒介形質転換、ウイルスベクター媒介形質転換、凍結融解法、微粒子衝撃、直接的なＤＮＡ取り込み、超音波処理、マイクロインジェクション、植物ウイルス媒介導入、および電気穿孔を含む、植物細胞を形質転換するための多くの方法が、当該技術分野において利用可能である。外来性ＤＮＡを植物染色体に統合するためのアグロバクテリウムシステムは、植物遺伝子工学で広範にわたり研究、改変、および開発されている。制御配列に対してセンスまたはアンチセンスの配向性で動作可能に連結された、主題の精製されたポリペプチドに対応するＤＮＡ配列を含む、裸の組み換えＤＮＡ分子は、従来的な方法によって適切なＴ－ＤＮＡ配列に結合される。これらはポリエチレングリコール技法によって、または電気穿孔技法によってプロトプラストに導入されるが、どちらも標準的な技法である。あるいは、主題の精製されたポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子を含むこのようなベクターは、生きたアグロバクテリウム細胞に導入され、次いで、ＤＮＡを植物細胞に導入する。Ｔ－ＤＮＡベクター配列を伴わない裸のＤＮＡによる形質転換は、プロトプラストのＤＮＡ含有リポソームとの融合によるか、または電気穿孔によって達成することができる。Ｔ－ＤＮＡベクター配列を伴わない裸のＤＮＡは、不活性の高速微粒子銃によって細胞を形質転換するために使用することもできる。
細胞または培養組織が形質転換のための受容体組織として使用される場合、植物は、所望する場合、当業者にとって既知の技法によって形質転換された培養体から再生することができる。
組み換え構築物に含まれる制御領域の選択は、効率、選択可能性、誘導性、所望の発現レベル、および細胞優先的または組織優先的な発現を含むがこれらに限定されない、いくつかの要因に依存する。コード配列に対して制御領域を適切に選択し配置することにより、コード配列の発現を調節することは、当業者にとって日常的な事柄である。ポリヌクレオチドの転写は、類似した様式で調節することができる。いくつかの好適な制御領域は、特定の細胞型においてのみ、または主に特定の細胞型において、転写を開始する。植物ゲノムＤＮＡ内の制御領域の識別および特性付けをするための方法は、当該技術分野において既知である。
好適なプロモーターは、異なる組織または細胞型（例えば、根特異的プロモーター、苗条特異的プロモーター、木部特異的プロモーター）において存在するか、または異なる発育段階中に存在するか、または異なる環境的条件に応じて存在する組織特異的要因によって認識される組織特異的プロモーターを含む。好適なプロモーターは、ほとんどの細胞型で特定の誘導物質を必要とせずに活性化できる構成的プロモーターを含む。ＲＮＡｉポリペプチド産生を制御するための好適なプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ／３５Ｓ）、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓ、またはユビキチンもしくはファゼオリンプロモーターが挙げられる。当業者は、組み換えプロモーターの複数の変形物を生成することができる。
組織特異的プロモーターは、植物組織または生殖組織など特定の細胞または組織において、植物の発育中の特定の時点にのみ活性である転写制御要素である。組織特異的発現は、例えば、ある特定の組織におけるポリヌクレオチドの発現が好ましい場合に、有利であり得る。発育管理下の組織特異的プロモーターの例には、植物組織（例えば、根または葉）または生殖組織（例えば、果実、胚珠、種子、花粉、雌しべ、花、または任意の胚性組織）などの特定の組織においてのみ（または主にそのような組織においてのみ）転写を開始することができるプロモーターが含まれる。生殖組織特異的プロモーターは、例えば、葯特異的、胚珠特異的、胚特異的、胚乳特異的、外皮特異的、種子および種皮特異的、花粉特異的、花弁特異的、咢片特異的、またはそれらの組み合わせであり得る。
好適な葉特異的プロモーターには、ピルビン酸塩、Ｃ４植物（トウモロコシ）由来のオルソリン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター、トウモロコシ由来のｃａｂ－ｍ１Ｃａ＋２プロモーター、シロイヌナズナｍｙｂ関連遺伝子プロモーター（Ａｔｍｙｂ５）、リブロースニリン酸カルボキシラーゼ（ＲＢＣＳ）プロモーター（例えば、葉および人工光源で栽培された苗木において発現されるトマトＲＢＣＳ１、ＲＢＣＳ２、およびＲＢＣＳ３Ａ遺伝子、発育中のトマト果実において発現されるＲＢＣＳ１およびＲＢＣＳ２、または葉身および葉鞘の葉肉細胞においてほぼ排他的に高レベルで発現されるリブロースニリン酸カルボキシラーゼプロモーター）が含まれる。
好適な老化特異的プロモーターには、果実の成熟、老化、および葉の脱離中に活性であるトマトプロモーター、システインプロテアーゼをコードする遺伝子のトウモロコシプロモーター、８２Ｅ４のプロモーター、およびＳＡＧ遺伝子のプロモーターが含まれる。好適な葯特異的プロモーターを使用することができる。当業者にとって既知の好適な根優先的プロモーターを選択し得る。好適な種子優先的プロモーターには、種子特異的プロモーター（種子の発育中に活性であるプロモーター、例えば、種子保存ポリペプチドのプロモーター）および種子発芽プロモーター（種子の発芽中に活性であるプロモーター）の両方が含まれる。このような種子優先的プロモーターには、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘発型メッセージ）、ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａ ｚｅｉｎ）、ｍｉｌｐｓ（ミオ－イノシトール－１－リン酸塩合成酵素）、ｍＺＥ４０－２（Ｚｍ－４０としても既知）、ｎｕｃｌｃ、およびｃｅｌＡ（セルロース合成酵素）が含まれる。Ｇａｍａ－ｚｅｉｎは、胚乳特異的プロモーターである。Ｇｌｏｂ－１は、胚特異的プロモーターである。双子葉植物では、種子特異的プロモーターには、マメベータ－ファゼオリン、ナピン、β－コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリン等が含まれる。単子葉植物体では、種子特異的プロモーターには、トウモロコシ１５ｋＤａ ｚｅｉｎプロモーター、２２ｋＤａ ｚｅｉｎプロモーター、２７ｋＤａ ｚｅｉｎプロモーター、ｇ－ｚｅｉｎプロモーター、２７ｋＤａガンマ－ｚｅｉｎプロモーター（例えば、ｇｚｗ６４Ａプロモーター、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ第Ｓ７８７８０号を参照）、ｗａｘｙプロモーター、シュランケン１プロモーター、シュランケン２プロモーター、グロブリン１プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ第Ｌ２２３４４号を参照）、Ｉｔｐ２プロモーター、ｃｉｍ１プロモーター、トウモロコシｅｎｄ１およびｅｎｄ２プロモーター、ｎｕｃ１プロモーター、Ｚｍ４０プロモーター、ｅｅｐ１およびｅｅｐ２、ｌｅｃ１、チオレドキシンＨプロモーター、ｍｌｉｐ１５プロモーター、ＰＣＮＡ２プロモーター、およびシュランケン－２プロモーターが含まれる。
誘導性プロモーターの例には、病原体の攻撃、嫌気性条件、高温、光、乾燥、低温、または高塩分濃度に反応するプロモーターが含まれる。病原体誘導性プロモーターには、病原性に関連したポリペプチド（ＰＲポリペプチド）に由来するものが含まれ、これらは病原体（例えば、ＰＲポリペプチド、ＳＡＲポリペプチド、ベータ－１，３－グルカナーゼ、キチナーゼ）による感染に続いて誘導される。
植物プロモーターに加えて、好適な他のプロモーターは、細菌性の起源、例えば、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、およびＴｉプラスミドに由来する他のプロモーターから誘導され得るか、ウイルスのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、タバコモザイクウイルスの構成的プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓおよび３５Ｓプロモーター、またはゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）から誘導され得る。
ポリヌクレオチドを植物細胞に導入し、続いて植物ゲノムに挿入するための好適な方法としては、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０－３３４（１９８６））、電気穿孔（Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５６０２－５６０６（１９８６））、アグロバクテリウム媒介形質転換（ＵＳ５，９８１，８４０およびＵＳ５，５６３，０５５）、直接遺伝子導入（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７１７－２７２２（１９８４））、および弾道粒子加速法（例えば、ＵＳ４，９４５，０５０、ＵＳ５，８７９，９１８、ＵＳ５，８８６，２４４、ＵＳ５，９３２，７８２、Ｔｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（１９９５）、およびＭｃＣａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：９２３－９２６（１９８８）を参照）が挙げられる。
ｂ．突然変異
本明細書に説明される１つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける突然変異を含む植物または植物細胞が開示され、該突然変異は、調節されたＡＡＴ機能または活性をもたらす。説明される突然変異は別として、突然変異型植物または植物細胞は、本明細書に説明されるものと同一のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドにおいて、またはゲノム内の１つ以上の他のポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおいて、のいずれかで、１つ以上のさらなる突然変異を有することができる。
（乾燥処理された）植物において、または（乾燥処理された）タバコ植物材料において、本明細書に説明されるようなＡＡＴポリペプチドのレベルを調節するための方法も提供され、該方法は、該植物のゲノム中に、少なくとも１つの遺伝子の発現を調節する１つ以上の突然変異を導入することを含み、該少なくとも１つの遺伝子は、本開示に従う配列から選択される。
また、調節されたレベルのＡＡＴを有する植物を特定するための方法も提供され、該方法は、対象の植物からのポリヌクレオチド試料を、本開示に従う配列における１つ以上の突然変異の存在についてスクリーニングすることと、任意に、特定された突然変異（複数可）を、ＡＡＴのレベルを調節することが既知である突然変異（複数可）と相関付けることとを含む。
また、本開示に従う遺伝子における１つ以上の突然変異に対してヘテロ接合性またはホモ接合性である植物または植物細胞も開示され、該突然変異は、遺伝子の発現またはそれによりコードされるポリペプチドの機能もしくは活性の調節をもたらす。
有性交雑を含む多くの手法を使用して、１つの植物に突然変異を組み合わせることができる。遺伝子の発現またはそれによりコードされるポリペプチドの機能もしくは活性を調節する本開示に従う遺伝子における１つ以上の好都合なヘテロ接合性またはホモ接合性の突然変異を有する植物は、その発現またはそれによりコードされるポリペプチドの機能もしくは活性を調節する１つ以上の他の遺伝子における１つ以上の好都合なヘテロ接合性またはホモ接合性の突然変異を有する植物と交雑することができる。一実施形態では、交雑は、同一の植物内の本開示に従う遺伝子内に、１つ以上の好都合なヘテロ接合性またはホモ接合性の突然変異を導入するために行われる。
植物における１つ以上の本開示のポリペプチドの機能または活性は、そのポリペプチドの機能または活性を抑制するように改変されておらず、かつ同一のプロトコルを使用して栽培、収穫、および乾燥処理されている植物における同一のポリペプチド（複数可）の機能または活性よりも機能または活性が低いまたは高い場合に、増加または減少している。
いくつかの実施形態では、突然変異（複数可）は、突然変異誘発手法を使用して植物または植物細胞中に導入され、導入された突然変異は、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列決定、ＰＣＲ分析、または表現型分析などの、当業者にとって既知の方法を使用して特定または選択される。遺伝子発現に影響を与えるか、またはコードされたポリペプチドの機能を妨げる突然変異は、当該技術分野において周知である方法を使用して決定することができる。遺伝子エクソンにおける挿入性の突然変異は、通常はヌル突然変異体をもたらす。保存された残基における突然変異は、コードされたポリペプチドの代謝機能の抑制に特に有効であり得る。例えば、高度に保存された領域のうちの１つ以上における突然変異は、ポリペプチド機能を変更させる可能性が高いが、それらの高度に保存された領域の外側の突然変異は、ポリペプチド機能にはほとんどまたは全く影響を及ぼさない可能性が高いことが理解されるであろう。さらに、単一ヌクレオチドにおける突然変異は終止コドンを作り出すことができ、これは切断型ポリペプチドをもたらし、切断の程度に応じて機能の喪失をもたらし得る。
突然変異型ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを獲得するための方法も開示される。植物細胞または植物材料を含めた任意の関心の植物は、突然変異誘発を誘導することが既知である様々な方法によって遺伝的に改変することができ、これらの方法には、部位特異的突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、化学誘発型突然変異誘発、放射線誘発型突然変異誘発、改変された塩基を利用した突然変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを利用した突然変異誘発、二本鎖分解突然変異誘発、修復欠損宿主系統を利用した突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、ＤＮＡシャフリング、および他の同等な方法が含まれる。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの断片も開示される。ポリヌクレオチドの断片は、天然ポリペプチドの生物学的機能を保持するポリペプチド断片をコードし得るため、植物における代謝産物輸送ネットワークに関与する。あるいは、ハイブリッド形成プローブまたはＰＣＲプライマーとして有用なポリヌクレオチドの断片は、一般的に、生物学的機能を保持している断片ポリペプチドをコードしない。その上、開示されるポリヌクレオチドの断片は、本明細書で考察したように、組み換え構築物内で組み立てることができるものを含む。ポリヌクレオチドの断片は、少なくとも約２５個のヌクレオチド、約５０個のヌクレオチド、約７５個のヌクレオチド、約１００個のヌクレオチド、約１５０個のヌクレオチド、約２００個のヌクレオチド、約２５０個のヌクレオチド、約３００個のヌクレオチド、約４００個のヌクレオチド、約５００個のヌクレオチド、約６００個のヌクレオチド、約７００個のヌクレオチド、約８００個のヌクレオチド、約９００個のヌクレオチド、約１０００個のヌクレオチド、約１１００個のヌクレオチド、約１２００個のヌクレオチド、約１３００個のヌクレオチド、または約１４００個のヌクレオチドから、本明細書に説明されるポリペプチドをコードする完全長ポリヌクレオチドまでの範囲であり得る。ポリペプチドの断片は、少なくとも約２５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約７５個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸から、本明細書に説明される完全長ポリペプチドまでの範囲であり得る。突然変異型ポリペプチド変異体を使用して、１つ以上の突然変異型ポリペプチド変異体を含む、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物（例えば、突然変異型、非天然型、トランスジェニック、人造、または遺伝子組み換え植物）または植物細胞を作製することができる。好適には、突然変異型ポリペプチド変異体は、未変異のポリペプチドの活性を保持する。突然変異型ポリペプチド変異体の活性は、未変異のポリペプチドと比較して高いか、低いか、またはほぼ同一であり得る。
本明細書に説明されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドにおける突然変異は、人造の突然変異、または合成的な突然変異、または遺伝子組み換えの突然変異を含むことができる。本明細書に説明されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドにおける突然変異は、生体外または生体内の操作工程を含むプロセスによって獲得されるか、または獲得可能である突然変異であり得る。本明細書に説明されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドにおける突然変異は、人間による介入を含むプロセスによって獲得されるか、または獲得可能である突然変異であり得る。
突然変異をポリヌクレオチド内に無作為に導入する方法には、化学的突然変異誘発および放射線突然変異誘発が含まれ得る。化学的突然変異誘発には、突然変異を誘発するための、突然変異誘発性、催奇形性、または発癌性有機化合物などの外因的に付加された化学物質の使用が関与する。主に点突然変異、ならびに短い欠失、挿入、ミスセンス突然変異、単純配列反復、塩基転換、および／または遷移を引き起こす突然変異原は、化学的突然変異原または放射線を含めて、突然変異を引き起こすために使用され得る。突然変異原は、エチルメタンスルホン酸塩、メチルメタンスルホン酸塩、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア、トリエチルメラミン、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソウレア、プロカルバジン、クロランブシル、シクロホスファミド、ジエチル硫酸塩、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェン・マスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、２－アミノプリン、７，１２ジメチル－ベンズ（ａ）アントラセン、酸化エチレン、ヘキサメチルホスホルアミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン、ジエポキシブタン等）、２－メトキシ－６－クロロ－９［３－（エチル－２－クロロ－エチル）アミノプロピルアミノ］アクリジン二塩酸塩、およびホルムアルデヒドを含む。
突然変異原が直接原因ではなかったかもしれない遺伝子座における偶発突然変異もまた、それらが所望の表現型をもたらす場合には企図される。好適な突然変異誘発性物質としては、例えば、イオン化放射線（例えば、Ｘ線、ガンマ線、高速中性子照射、およびＵＶ放射線）も挙げることができる。突然変異誘発性化学物質または放射線の投与量は、致死性または不稔性によって特徴付けられる閾値レベル未満である突然変異頻度が得られるように、各種類の植物組織に対して実験的に決定される。当業者に既知の植物ポリヌクレオチドを調製する任意の方法を使用して、突然変異スクリーニングのための植物ポリヌクレオチドを調製し得る。
突然変異プロセスは、１つ以上の植物交雑工程を含み得る。
突然変異後、スクリーニングを実施して、早熟の終止コドンあるいは非機能性遺伝子を作り出す突然変異を特定することができる。突然変異後、スクリーニングを実施して、上昇または減少したレベルで発現することが可能である機能性遺伝子を作り出す突然変異を特定することができる。突然変異体のスクリーニングは、配列決定によって、または遺伝子もしくはポリペプチドに対して特異的な１つ以上のプローブもしくはプライマーを使用することによって実施することができる。遺伝子発現の調節、ｍＲＮＡの安定性の調節、またはポリペプチドの安定性の調節をもたらすことができる、ポリヌクレオチドにおける特定の突然変異も引き起こすことができる。このような植物は、本明細書では、「非天然型」または「突然変異型」植物と称される。典型的には、突然変異型または非天然型植物には、操作される前には植物内に存在しなかった、外来性または合成的な、または人造のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の少なくとも一部分が含まれるようになる。外来性のヌクレオチドは、単一のヌクレオチド、２つ以上のヌクレオチド、２つ以上の連続ヌクレオチド、または２つ以上の非連続ヌクレオチド、例えば、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、または１５００個以上の連続または非連続ヌクレオチドであり得る。
ｃ．トランスジェニックおよび編集
突然変異誘発以外に、本明細書に説明されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドのうちの１つ以上の発現または機能または活性を調節することができる組成物としては、１つ以上の内在性遺伝子（複数可）の転写を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチド、ＲＮＡ転写物（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム）の翻訳を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチド、１つ以上のポリペプチドの安定性を妨害できる配列特異的ポリペプチド、１つ以上のポリペプチドの酵素機能または基質もしくは調節ポリペプチドに関する１つ以上のポリペプチドの結合機能を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチド、１つ以上のポリペプチドに対して特異性を示す抗体、１つ以上のポリペプチドの安定性または１つ以上のポリペプチドの酵素機能または１つ以上のポリペプチドの結合機能を妨害できる小分子化合物、１つ以上のポリヌクレオチドを結合するジンクフィンガーポリペプチド、および１つ以上のポリヌクレオチドに対して機能を有するメガヌクレアーゼが挙げられる。遺伝子編集技術、遺伝的編集技術、およびゲノム編集技術は、当該技術分野で周知である。
ｄ．ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーポリペプチドを使用して、１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチドの発現または機能または活性を調節することができる。様々な実施形態では、ポリヌクレオチドのコード配列の一部またはすべてを含むゲノムＤＮＡ配列は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発によって改変される。ゲノムＤＮＡ配列で、ジンクフィンガーポリペプチド結合のための一意の部位が検索される。あるいは、ゲノムＤＮＡ配列で、ジンクフィンガーポリペプチド結合のための２つの一意の部位が検索されるが、ここで、両方の部位は対向する鎖上にあり、例えば、１、２、３、４、５、６つ以上の塩基対だけ離れた互いに近い場所にある。したがって、ポリヌクレオチドに結合するジンクフィンガーポリペプチドが提供される。
ジンクフィンガーポリペプチドは、遺伝子内の選択した標的部位を認識するよう操作され得る。ジンクフィンガーポリペプチドは、これらに限定されないが、ファージディスプレイ選択、細菌性ツーハイブリッド選択、または細菌性ワンハイブリッド選択などの選択方法に連結された、切断もしくは拡張または部位特異的突然変異誘発のプロセスによって、天然のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび非天然のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインから得られたモチーフの任意の組み合わせを含むことができる。「非天然のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」という用語は、ポリヌクレオチド標的内にあり、かつ改変の対象となるポリヌクレオチドを含む細胞または生物においては発生しない、３塩基対配列を結合するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを指す。標的遺伝子に対して一意である特定のポリヌクレオチドを結合するジンクフィンガーポリペプチドの設計のための方法は、当該技術分野において既知である。
他の実施形態では、ジンクフィンガーポリペプチドは、ポリヌクレオチドの制御配列に結合するように選択され得る。さらに具体的に言えば、制御配列は、転写開始部位、開始コドン、エクソンの領域、エクソン－イントロンの境界、ターミネーター、または終止コドンを含み得る。したがって、本開示は、本明細書に説明される１つ以上のポリヌクレオチドの近傍またはその内部においてジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発によって生成された突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物または植物細胞、およびジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発によってこのような植物または植物細胞を作製するための方法を提供する。ジンクフィンガーポリペプチドおよびジンクフィンガーヌクレアーゼを植物に送達するための方法は、メガヌクレアーゼの送達について以下に説明する方法と類似している。
ｅ．メガヌクレアーゼ
別の態様では、Ｉ－ＣｒｅＩなどのメガヌクレアーゼを使用して、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック、あるいは遺伝子組み換え植物を生成するための方法が説明される。天然型メガヌクレアーゼならびに組み換えメガヌクレアーゼを使用して、植物のゲノムＤＮＡ内の単一の部位で、または比較的少ない部位で、特異的に二本鎖切断を引き起こし、１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチドの分裂を可能にすることができる。メガヌクレアーゼは、変更されたＤＮＡ認識特性を有する操作されたメガヌクレアーゼであり得る。メガヌクレアーゼポリペプチドは、当該技術分野において既知の様々な異なる機構によって、植物細胞に送達することができる。
本開示は、植物細胞または植物において本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）（または本明細書に説明されるようなそれらの任意の組み合わせ）を不活性化するためのメガヌクレアーゼの使用を包含する。特に、本開示は、メガヌクレアーゼを使用して植物においてポリヌクレオチドを不活性化するための方法を提供し、この方法は、（ａ）本明細書に説明されるポリヌクレオチドを含む植物細胞を提供する工程、（ｂ）メガヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼをコードする構築物を該植物細胞内に導入する工程、および（ｃ）メガヌクレアーゼにポリヌクレオチド（複数可）を実質的に不活性化させる工程を含む。
メガヌクレアーゼを使用して、ポリヌクレオチドのコード領域内のメガヌクレアーゼ認識部位を切断することができる。このような切断は、非相同末端結合による突然変異誘発性ＤＮＡ修復の後で、メガヌクレアーゼ認識部位でのＤＮＡの欠失を頻繁にもたらす。遺伝子コード配列内でのこのような突然変異は、典型的には遺伝子を不活性化するのに十分である。植物細胞を改変するためのこの方法には、まず、好適な形質転換方法を使用した、メガヌクレアーゼ発現カセットの植物細胞への送達が関与する。最高の効率を得るためには、メガヌクレアーゼ発現カセットを選択マーカーに連結し、選択物質の存在下で、首尾よく形質転換された細胞を選択することが望ましい。この手法は、メガヌクレアーゼ発現カセットのゲノムへの統合をもたらすが、これは、植物が規制当局の許可を必要とする可能性が高い場合には望ましくない場合がある。そのような場合には、メガヌクレアーゼ発現カセット（および連結された選択マーカー遺伝子）は、従来的な育種技法を使用して後続する植物の世代において分離し得る。
メガヌクレアーゼ発現カセットの送達後、植物細胞は、当初、使用された特定の形質転換手順にとって典型的である条件下で培養される。これは、形質転換された細胞を、２６℃未満の温度の培地において、しばしば暗所において、培養することを意味し得る。このような標準的な条件を、ある期間にわたって、好ましくは１～４日間使用して、植物細胞を形質転換プロセスから回復させることができる。この当初の回復期間後の任意の時点で培養温度を上昇させ、操作されたメガヌクレアーゼの活性を刺激して、メガヌクレアーゼ認識部位を切断し、突然変異を起こさせ得る。
ｆ．ＴＡＬＥＮ
遺伝子編集の１つの方法には、細胞が修復機構を用いて応答できる二本鎖の分解を誘導する、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用が関与する。ＮＨＥＪは、アニーリングのための配列重複が非常に少ないかまたは全くない二本鎖切断のうちのいずれかの側からＤＮＡを再結合する。この修復機構は、挿入もしくは欠失、または染色体の再配列によるゲノム内のエラーを誘発する。このようなエラーがあると、遺伝子産物はその位置で非機能性にコードされ得る。特定の用途では、ポリヌクレオチドを植物のゲノムから正確に除去することが望ましい場合がある。このような用途は、操作されたメガヌクレアーゼの対を使用して可能であり、その各々が意図された欠失のいずれかの側にあるメガヌクレアーゼ認識部位を切断する。また、遺伝子を認識してそれに結合し、二本鎖切断をゲノムに導入することができるＴＡＬＥＮも使用することができる。したがって、別の態様では、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼを使用して、本明細書に説明されるような突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック、あるいは遺伝子組み換え植物を生成するための方法が企図される。
ｇ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
遺伝子編集の別の方法には、細菌性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用が関与する。細菌および古細菌は、ウイルスおよびプラスミドＤＮＡの侵入から保護する適応免疫系の一部である、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文の反復（ＣＲＩＳＰＲ）と呼ばれる染色体要素を示す。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）がトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドで機能し、標的ＤＮＡ中に二本鎖切断を導入する。Ｃａｓ９による標的切断は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の塩基対合、およびｃｒＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合を必要とする。標的認識は、配列ＮＧＧと一致する、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの存在によって促進される。このシステムは、ゲノム編集のために利用できる。Ｃａｓ９は通常、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡで構成される二重ＲＮＡによってプログラムされる。しかしながら、これらのＲＮＡのコア構成要素は、Ｃａｓ９標的化のために単一の混成体「ガイドＲＮＡ」に組み合わせることができる。部位特異的切断のためにＤＮＡを標的化する非コードＲＮＡガイドの使用は、ＴＡＬＥＮなどの既存の技術よりもはるかに簡単であることが約束される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ戦略を使用して、ヌクレアーゼ複合体を再標的化するには、新しいＲＮＡ配列の導入のみを必要とし、ポリペプチド転写因子の特異性を再設計する必要がない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術を、植物種にわたって広く適用可能なウイルス媒介ゲノム編集プラットフォームを開示している国際出願第ＷＯ２０１５／１８９６９３号の方法において、植物において実施した。タバコラットルウイルス（ＴＲＶ）のＲＮＡ２ゲノムを、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを過剰発現するＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物にガイドＲＮＡを保有および送達するように操作した。本開示の文脈では、ガイドＲＮＡは本明細書に開示される配列のいずれかに由来し得、ＷＯ２０１５／１８９６９３の教示を適用して植物細胞のゲノムを編集し、所望の突然変異型植物を得ることができる。ペースの速い技術の開発は、植物界において広範な適用性を有する多種多様なプロトコルを生み出しており、これは多くの最近の科学評論記事において十分に分類されている（例えば、Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１６）１２：８、およびＦｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．（２０１６）７：５０６）。その用途に特に焦点を当てたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの評論については、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ（２０１５）３３，１，４１－５２）に記載されている。植物ゲノムを操作するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの使用におけるより最近の開発については、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ（２０１７）７，３，２９２－３０２、およびＣｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．（２０１７）３６，１－８に考察されている。植物で使用するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドは、「ａｄｄｇｅｎｅ」、非営利プラスミドリポジトリ（ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ）に列挙されており、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓプラスミドは市販されている。
ｈ．アンチセンス改変
アンチセンス技術は、ポリペプチドの発現を調節するために使用できる別の周知の方法である。抑制される遺伝子のポリヌクレオチドは、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるように、クローン化され、制御領域および転写終結配列と動作可能に連結される。次いで、組み換え構築物は、植物細胞に形質転換され、ＲＮＡのアンチセンス鎖が生成される。ポリヌクレオチドは抑制される遺伝子の全配列である必要はないが、典型的には、抑制される遺伝子のセンス鎖の少なくとも一部分に実質的に相補的であろう。
ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの発現に影響を及ぼすリボザイムまたは触媒ＲＮＡに転写され得る。リボザイムは、実質的に任意の標的ＲＮＡと特異的に対をなし、リン酸ジエステル骨格を特定の位置で切断し、それによって標的ＲＮＡを機能的に不活性化するように設計できる。異種ポリヌクレオチドは、特定のｍＲＮＡ転写産物を切断するように設計されたリボザイムをコードすることができるため、ポリペプチドの発現が阻止される。ハンマーヘッド型リボザイムは特定のｍＲＮＡを破壊するのに有用であるが、ｍＲＮＡを部位特異的認識配列で切断する様々なリボザイムを使用することができる。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接する領域によって指図される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ＲＮＡが５’－ＵＧ－３’ポリヌクレオチド配列を含有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構成および産生は、当該技術分野において既知である。ハンマーヘッド型リボザイム配列を、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）などの安定的ＲＮＡに埋め込んで、生体内で切断効率を高めることができる。
一実施形態では、ＲＮＡ転写物（複数可）の翻訳を干渉できる配列特異的ポリヌクレオチドはＲＮＡを干渉する。ＲＮＡ干渉またはＲＮＡサイレンシングは、特定のｍＲＮＡを酵素分解の標的とすることができる進化的に保存されたプロセスである。二本鎖ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）は、干渉ＲＮＡ経路を開始するために、細胞（例えば、二本鎖ＲＮＡウイルス、または干渉ＲＮＡポリヌクレオチド）によって導入または生成される。二本鎖ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼであるＲＮａｓｅｓ ＩＩＩによって、長さが２１～２４ｂｐの複数の低分子干渉ＲＮＡ二重鎖に転換することができる。その後、ｓｉＲＮＡは、ＡＴＰ依存性プロセスによってｓｉＲＮＡの巻き戻しを促進するＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体によって認識することができる。ｓｉＲＮＡの巻き戻されたアンチセンス鎖は、活性化されたＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体を、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖と相補的な配列を含む標的化されたｍＲＮＡに導く。標的化されたｍＲＮＡおよびアンチセンス鎖は、Ａ型ヘリックスを形成することができ、Ａ型ヘリックスの主要な溝は、活性化されたＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体によって認識され得る。標的ｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ鎖の５’末端の結合部位によって定義された単一部位で、活性化されたＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体によって切断することができる。活性化されたＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体を再利用して、別の切断事象を触媒することができる。
干渉ＲＮＡ発現ベクターは、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、または関連するＲＮＡ変異体の発現レベルを低下させることによってＲＮＡ干渉を示す干渉ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする干渉ＲＮＡ構築物を含み得る。本明細書にさらに説明されるように、発現ベクターは、上流に配置され、干渉ＲＮＡ構築物に動作可能に連結されたプロモーターを含み得る。干渉ＲＮＡ発現ベクターは、好適な最小のコアプロモーター、目的の干渉ＲＮＡ構築物、上流（５’）制御領域、転写終結およびポリアデニル化シグナルを含む下流（３’）制御領域、および当業者にとって既知である様々な選択マーカーなどの他の配列を含み得る。
二本鎖ＲＮＡ分子は、ステムループ構造の単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられたｓｉＲＮＡ分子を含み得、ｓｉＲＮＡ分子の自己相補的センスおよびアンチセンス領域は、ポリヌクレオチド系または非ポリヌクレオチド系リンカー（複数可）、ならびに２つ以上のループ構造を有する環状一本鎖ＲＮＡ、および自己相補的センスおよびアンチセンス鎖を含むステムによって連結されており、環状ＲＮＡは、生体内または生体外のいずれかで処理し、干渉ＲＮＡを媒介できる活性ｓｉＲＮＡ分子を生成できる。
小さなヘアピンＲＮＡ分子の使用も企図される。これらは、逆相補（センス）配列に加えて特定のアンチセンス配列を含み、典型的にはスペーサーまたはループ配列によって分離されている。スペーサーまたはループの切断により、それらがアニーリングして二本鎖ＲＮＡ分子を形成するように、一本鎖のＲＮＡ分子およびその逆相補が提供される（任意に、一方または両方の鎖の３’端または５’端から１、２、３またはそれ以上のヌクレオチドの追加または除去につながり得る追加的な処理工程を用いる）。スペーサーは、アンチセンス配列およびセンス配列が、スペーサーの切断前にアニーリングして二本鎖構造（またはステム）を形成することを可能にするのに十分な長さであり得る（および任意に、一方または両方の鎖の３’端または５’端から１、２、３、４またはそれ以上のヌクレオチドの追加または除去につながり得る後続の処理工程）。スペーサー配列は、典型的には、２本鎖ポリヌクレオチドにアニーリングすると、小さなヘアピンＲＮＡを構成する２つの相補的ポリヌクレオチド領域の間に位置する無関係なポリヌクレオチドである。スペーサー配列は一般的に、約３～約１００個のヌクレオチドを含む。
目的の任意のＲＮＡポリヌクレオチドは、ヘアピン二重鎖を生成するために好適な配列組成、ループサイズ、およびステム長を選択することによって生成できる。ヘアピン二重鎖のステム長を設計するための好適な範囲は、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のヌクレオチドのステム長を含み、これは、約１４～３０個のヌクレオチド、約３０～５０個のヌクレオチド、約５０～１００個のヌクレオチド、約１００～１５０個のヌクレオチド、約１５０～２００個のヌクレオチド、約２００～３００個のヌクレオチド、約３００～４００個のヌクレオチド、約４００～５００個のヌクレオチド、約５００～６００個のヌクレオチド、および約６００～７００個のヌクレオチドなどである。ヘアピン二本鎖のループ長を設計するための好適な範囲には、約４～２５個のヌクレオチド、約２５～５０個のヌクレオチド、またはヘア二本鎖のステム長が相当量である場合はそれ以上のループ長が含まれる。特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子は、長さが約１５～約４０個のヌクレオチドである。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、長さが約１５～約３５個のヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、長さが約１７～約３０個のヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、長さが約１９～約２５個のヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、長さが約２１～約２３個のヌクレオチドである二本鎖ＲＮＡまたはｓｓＲＮＡ分子である。特定の実施形態では、２１個のヌクレオチドより長い二重鎖領域を有するヘアピン構造は、ループ配列および長さに関係なく、効果的なｓｉＲＮＡ指向性サイレンシングを促進し得る。ＲＮＡ干渉の例示的な配列が本明細書に記載される。
標的ｍＲＮＡ配列は、典型的には、長さが約１４～約５０個のヌクレオチドである。したがって、標的ｍＲＮＡは、好ましくは、約２：１～約１：２のＡ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ比率、５’末端でのＡＡジヌクレオチドまたはＣＡジヌクレオチド、標的ｍＲＮＡに固有の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドの配列（すなわち、その配列は同じ植物からの他のｍＲＮＡ配列内に存在しない）、３つを超える連続したグアニン（Ｇ）ヌクレオチドまたは３つを超える連続したシトシン（Ｃ）ヌクレオチドの「ラン」ではない基準のうちの１つ以上を満たす、長さが約１４～約５０個のヌクレオチドの領域をスキャンすることができる。これらの基準は、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して評価することができ、例えば、ＢＬＡＳＴなどのコンピュータプログラムを使用して、公に利用可能なデータベースを検索し、選択された配列が標的ｍＲＮＡに固有であるかを判定することができる。あるいは、配列は、市販されているコンピュータソフトウェア（例えば、市販品であるＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ、Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、およびｓｉＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ）を使用して選択（およびｓｉＲＮＡ配列を設計）することができる。
一実施形態では、標的ｍＲＮＡ配列は、上記の基準のうちの１つ以上を満たす、長さが約１４～約３０個のヌクレオチドであるものが選択される。別の実施形態では、配列は、上記の基準のうちの１つ以上を満たす、長さが約１６～約３０個のヌクレオチドであるものが選択される。さらなる実施形態では、配列は、上記の基準のうちの１つ以上を満たす、長さが約１９～約３０個のヌクレオチドであるものが選択される。別の実施形態では、配列は、上記の基準のうちの１つ以上を満たす、長さが約１９～約２５個のヌクレオチドであるものが選択される。
例示的な実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、本明細書に説明されるポリヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上の連続するヌクレオチドに相補的な特定のアンチセンス配列を含む。
ｓｉＲＮＡ分子に含まれる特定のアンチセンス配列は、相補体と同一または実質的に同一であり得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子に含まれる特定のアンチセンス配列は、標的ｍＲＮＡ配列の相補体と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。配列同一性を決定する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）ソフトウェアのＢＬＡＳＴＮプログラム、またはＮＣＢＩウェブサイトで提供されているものを使用して決定することができる。
植物における二本鎖ＲＮＡ－サイレンシングを誘導するための１つの方法は、ヘアピンＲＮＡを生成する遺伝子構築物を用いた形質転換である（Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０７，３１９－３２０を参照）。このような構築物は、適切なスペーサーによって分離された標的遺伝子配列の逆の領域を含む。スペーサー断片として機能的植物イントロン領域を挿入すると、イントロンがスプライスされたヘアピンＲＮＡが生成されるため、遺伝子サイレンシング誘導の効率がさらに向上する（Ｐｌａｎｔ Ｊ．（２００１），２７，５８１－５９０）。好適には、ステムの長さは、約５０個のヌクレオチド～約１キロベースの長さである。イントロンがスプライスされたヘアピンＲＮＡを生成するための方法は、当該技術分野で十分に説明されている（例えば、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）７２，２，６１５－６１７を参照）。
二本鎖または二本鎖構造を有する干渉ＲＮＡ分子、例えば二本鎖ＲＮＡまたは小さなヘアピンＲＮＡは、平滑末端を有することができるか、または３’もしくは５’オーバーハングを有することができる。本明細書で使用される場合、「オーバーハング」は、一方のＲＮＡ鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて延びるとき（３’オーバーハング）、またはその逆のとき（５’オーバーハング）に、二重鎖構造から突き出している、対をなしていないヌクレオチド（単一もしくは複数）を意味する。オーバーハングを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの改変されたバージョンであり得る。一実施形態では、干渉ＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖は、長さが約１～約６個のヌクレオチドである３’オーバーハングを有する。他の実施形態では、３’オーバーハングは、長さが約１～約５個のヌクレオチド、約１～約３個のヌクレオチド、および約２～約４個のヌクレオチドである。
干渉ＲＮＡ分子が分子の一方の端で３’オーバーハングを含む場合、他方の端は、平滑末端であるか、またはオーバーハング（５’または３’）を有することもできる。干渉ＲＮＡ分子が分子の両端にオーバーハングを含む場合、オーバーハングの長さは同一であり得るか、または異なり得る。一実施形態では、干渉ＲＮＡ分子は、分子の両端に約１～約３個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。さらなる実施形態では、干渉ＲＮＡ分子は、分子の両端に２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを有する二本鎖ＲＮＡである。さらに別の実施形態では、干渉ＲＮＡのオーバーハングを含むヌクレオチドは、ＴＴジヌクレオチドまたはＵＵジヌクレオチドである。
干渉ＲＮＡ分子は、１つ以上の５’または３’キャップ構造を含むことができる。「キャップ構造」という用語は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれる化学的修飾を意味し、これはさらに分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内の送達または局在化を促進し得る。
干渉ＲＮＡ分子に適用可能な別の修飾は、１つ以上の部分または共役体の干渉ＲＮＡ分子への化学的連結であり、干渉ＲＮＡ分子の機能、細胞分布、細胞取り込み、生物学的利用能、または安定性を高める。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で十分に確立された方法によって合成または修飾され得る。化学的修飾は、２’修飾、非天然塩基の導入、リガンドとの共有結合、およびリン酸結合のチオリン酸結合への置換を含み得る。この実施形態では、二重鎖構造の完全性は、少なくとも１つ、典型的には２つの化学的連結によって強化される。
２つの一本鎖の一方または両方のヌクレオチドを修飾して、例えば、限定されないが特定のヌクレアーゼなどの細胞酵素の活性化を調節し得る。細胞酵素の活性化を低減または阻害するための技法は、当該技術分野において既知であり、２’－アミノ修飾、２’－フルオロ修飾、２’－アルキル修飾、非電荷骨格修飾、モルホリノ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、およびホスホルアミド酸を含むが、これらに限定されない。
リガンドは、例えば、その細胞吸収を高めるために干渉ＲＮＡ分子と結合され得る。特定の実施形態では、疎水性リガンドは、細胞膜の直接的な浸透を促進するために分子と結合される。特定の事例では、陽イオン性リガンドのオリゴヌクレオチドとの結合は、しばしばヌクレアーゼに対する耐性の改善をもたらす。
「ゲノム中の標的化誘導性局所的損傷（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）」（ＴＩＬＬＩＮＧ）は、発現、機能、または活性が改変されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生成および／または特定するために使用できる別の変異誘発技術である。ＴＩＬＬＩＮＧは、そのような突然変異を保有する植物の選択も可能にする。ＴＩＬＬＩＮＧは、高密度の突然変異誘発を、高スループットのスクリーニング方法と組み合わせている。ＴＩＬＬＩＮＧの方法は、当該技術分野で周知である（ＭｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８：４５５－４５７およびＳｔｅｍｐｌｅ（２００４）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ５（２）：１４５－５０を参照）。
様々な実施形態は、本明細書に説明される１つ以上のポリヌクレオチドを含む１つ以上のポリヌクレオチドまたは干渉ＲＮＡ構築物を含む発現ベクターを対象とする。
様々な実施形態は、本明細書に説明される１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上の干渉ＲＮＡ構築物を含む発現ベクターを対象とする。
様々な実施形態は、自己アニーリングしてヘアピン構造を形成することができる、本明細書に説明される１つ以上の干渉ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上の干渉ＲＮＡ構築物を含む発現ベクターを対象とし、構築物は、（ａ）本明細書に説明される１つ以上のポリヌクレオチドと、（ｂ）ヘアピン構造のループを形成するスペーサー要素をコードする第２の配列と、（ｃ）第１の配列と同一の配向性に配置された第１の配列の逆相補的配列を含む第３の配列と、を含み、第２の配列は、第１の配列と第３の配列との間に配置され、第２の配列は、第１の配列および第３の配列と動作可能に連結される。
開示された配列は、ヘアピン構造を形成しない様々なポリヌクレオチドを構築するために利用することができる。例えば、二本鎖ＲＮＡは、（１）第１のプロモーターと動作可能に連結することによりＤＮＡの第１の鎖を転写すること、および（２）第２のプロモーターと動作可能に連結することによりＤＮＡ断片の第１の鎖の逆相補的配列を転写することによって形成できる。ポリヌクレオチドの各鎖は、同一の発現ベクターから、または異なる発現ベクターから転写することができる。ＲＮＡ干渉を有するＲＮＡ二重鎖を、酵素学的にｓｉＲＮＡに変換してＲＮＡレベルを調節することができる。
したがって、様々な実施形態は、自己アニーリングが可能な干渉ＲＮＡポリヌクレオチドをコードする、本明細書に説明される１つ以上のポリヌクレオチドまたは干渉ＲＮＡ構築物を含む発現ベクターを対象とし、ここで、構築物は、（ａ）１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチド、および（ｂ）第１の配列と同一の配向性で配置された第１の配列の相補的（例えば、逆相補的）配列を含む第２の配列を含む。
１つ以上の本明細書に説明されるポリペプチド（または本明細書に説明されるようなその任意の組み合わせ）の内在性発現レベルを、遺伝子発現のコサプレッションを促進することにより調節するための様々な組成物および方法が提供される。
ｍＲＮＡの翻訳を調節することによって内在性遺伝子発現レベルを調節するための様々な組成物および方法が提供される。宿主（タバコ）植物細胞を、プロモーターに対してアンチセンスの配向性で配置されている、ポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーターを含む発現ベクターを用いて形質変換し、ｍＲＮＡの一部に対して相補的な配列を有するＲＮＡポリヌクレオチドの発現を可能にすることができる。
ｍＲＮＡの翻訳を調節するための様々な発現ベクターは、ポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーターを含み得、ここで、配列はプロモーターに対してアンチセンスの配向性で配置されている。アンチセンスＲＮＡポリヌクレオチドの長さは異なり得、約１５～２０個のヌクレオチド、約２０～３０個のヌクレオチド、約３０～５０個のヌクレオチド、約５０～７５個のヌクレオチド、約７５～１００個のヌクレオチド、約１００～１５０個のヌクレオチド、約１５０～２００個のヌクレオチド、および約２００～３００個のヌクレオチドであり得る。
ｉ．可動性遺伝要素
あるいは、遺伝子は、トランスポゾン（例えば、ＩＳ要素）を関心の植物のゲノムに導入することにより、不活性化に標的化することができる。これらの可動性遺伝要素は、有性交雑受精によって導入することができ、挿入変異体をポリペプチド機能の損失についてスクリーニングすることができる。親株における分裂された遺伝子は、親株をトランスポゾン誘発型突然変異誘発の対象ではない植物と、例えば、有性交雑受精によって交雑させることによって、他の植物に導入することができる。当業者にとって既知の任意の標準的な育種技法を利用することができる。一実施形態では、１つ以上の遺伝子は、１つ以上のトランスポゾンの挿入により不活性化できる。突然変異は、１つ以上の遺伝子のホモ接合の分裂、１つ以上の遺伝子のヘテロ接合の分裂、または複数の遺伝子が分裂した場合にはホモ接合およびヘテロ接合の分裂の両方の組み合わせをもたらし得る。好適な転移性要素は、レトロトランスポゾン、レトロポゾン、およびＳＩＮＥ様要素を含む。このような方法は、当業者にとって既知である。
ｊ．リボザイム
あるいは、遺伝子は、自己切断および複製の能力がある数多くの小型環状ＲＮＡに由来するリボザイムを植物に導入することにより、不活性化のために標的化することができる。これらのＲＮＡは、単独（ウイロイドＲＮＡ）で、またはヘルパーウイルス（サテライトＲＮＡ）と共に、のいずれかで複製することができる。好適なＲＮＡの例には、アボカドサンブロッチウイロイドに由来するもの、ならびにタバコ輪点ウイルス、ルーサン一過性条斑ウイルス、ベルベットタバコ斑紋ウイルス、テリミノイヌホオズキ斑紋ウイルス、および地下性クローバ斑点ウイルスに由来するサテライトＲＮＡが含まれる。様々な標的ＲＮＡ特異的リボザイムが、当業者に知られている。
突然変異型または非天然型植物または植物細胞は、それらの遺伝子またはそれらの遺伝子産物の発現または機能または活性の調節をもたらす１つ以上の遺伝子における１つ以上の突然変異の任意の組み合わせを有することができる。例えば、突然変異型または非天然型植物または植物細胞は、単一の遺伝子における単一の突然変異、単一の遺伝子における複数の突然変異、２つ以上、３つ以上、もしくは４つ以上の遺伝子における単一の突然変異、または２つ以上、３つ以上、もしくは４つ以上の遺伝子における複数の突然変異を有し得る。このような突然変異の例が本明細書に説明される。さらなる例として、突然変異型または非天然型植物または植物細胞は、遺伝子（複数可）の特定の部分において、例えば、ポリペプチドまたはその一部分の活性部位をコードする遺伝子の一領域において、１つ以上の突然変異を有し得る。さらなる例として、突然変異型または非天然型植物または植物細胞は、１つ以上の遺伝子（複数可）の外部の一領域において、例えば、遺伝子（複数可）の機能または発現を調節する場合には、それが調節する遺伝子の上流または下流の一領域において、１つ以上の突然変異を有し得る。上流要素には、プロモーター、エンハンサー、または転写因子を含めることができる。一部の要素（例えば、エンハンサー）は、調整する遺伝子の上流または下流に位置することができる。一部の要素は、それが調節する遺伝子の数十万塩基対だけ上流または下流に位置することが判明しているため、要素（複数可）はそれが調節する遺伝子の近くに位置する必要はない。突然変異型または非天然型植物または植物細胞は、遺伝子（複数可）の最初の１００個のヌクレオチド内、遺伝子（複数可）の最初の２００個のヌクレオチド内、遺伝子（複数可）の最初の３００個のヌクレオチド内、遺伝子（複数可）の最初の４００個のヌクレオチド内、遺伝子（複数可）の最初の５００個のヌクレオチド内、遺伝子（複数可）の最初の６００個のヌクレオチド内、遺伝子（複数可）の最初の７００個のヌクレオチド内、遺伝子（複数可）の最初の８００個のヌクレオチド内、遺伝子（複数可）の最初の９００個のヌクレオチド内、遺伝子（複数可）の最初の１０００個のヌクレオチド内、遺伝子（複数可）の最初の１１００個のヌクレオチド内、遺伝子（複数可）の最初の１２００個のヌクレオチド内、遺伝子（複数可）の最初の１３００個のヌクレオチド内、遺伝子（複数可）の最初の１４００個のヌクレオチド内、または遺伝子（複数可）の最初の１５００個のヌクレオチド内に位置する、１つ以上の突然変異を有し得る。突然変異型または非天然型植物または植物細胞は、遺伝子（複数可）の１００個のヌクレオチドの第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、または第１５の組、またはそれらの組み合わせの中に位置する、１つ以上の突然変異を有し得る。突然変異型ポリペプチド変異体を含む、突然変異型または非天然型植物または植物細胞（例えば、本明細書に説明されるような、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物または植物細胞等）が開示される。
一実施形態では、植物からの種子は突然変異誘発され、次いで第１世代突然変異型植物に成長する。次いで、第１世代植物は自家受粉がなされ、第１世代植物からの種子が第２世代植物に成長し、次いでこれがその座位で突然変異についてスクリーニングされる。突然変異誘発された植物材料を突然変異についてスクリーニングすることができるが、第２世代植物をスクリーニングすることの利点は、すべての体細胞系突然変異が生殖細胞系突然変異に対応することである。当業者であれば、突然変異型植物を作り出すために、種子、花粉、植物組織または植物細胞を含むがこれらに限定されない様々な植物材料が突然変異誘発され得ることを理解するであろう。しかしながら、突然変異誘発された植物材料の種類は、植物のポリヌクレオチドが突然変異についてスクリーニングされる場合に影響を及ぼし得る。例えば、非突然変異誘発性植物の受粉前に花粉が突然変異誘発の対象となる場合、その受粉の結果生じる種子は第１世代植物に成長する。第１世代植物のすべての細胞は、花粉において作り出された突然変異を含有することになり、したがってこれらの第１世代植物は、次いで、第２世代まで待たずに突然変異についてスクリーニングされ得る。
改変植物、スクリーニング、および交雑の調製
個々の植物、植物細胞、または植物材料から調製されたポリヌクレオチドは、突然変異誘発された植物組織、細胞、または材料を起源とする植物の集団における突然変異についてのスクリーニングを促進するために任意にプールすることができる。植物、植物細胞、または植物材料の、後続する１世代以上の世代をスクリーニングすることができる。任意にプールされる群のサイズは、使用するスクリーニング方法の感受性に依存する。
試料を任意にプールした後、それらを、ＰＣＲなどのポリヌクレオチド特異的増幅技法の対象とすることができる。遺伝子のすぐ隣にある遺伝子または配列に特異的な１つ以上の任意のプライマーまたはプローブを利用して、任意にプールされた試料内で配列を増幅し得る。好適には、１つ以上のプライマーまたはプローブは、有用な突然変異が最も発生する可能性の高い遺伝子座の領域を増幅するように設計される。最も好ましくは、プライマーは、ポリヌクレオチドの領域内での突然変異を検出するように設計される。さらに、プライマー（複数可）およびプローブ（複数可）は、点突然変異についてのスクリーニングを容易にするために、既知の多型部位を避けることが好ましい。増幅産物の検出を促進するために、１つ以上のプライマーまたはプローブを任意の従来的な標識付け方法を使用して標識付けし得る。プライマー（複数可）またはプローブ（複数可）は、当該技術分野でよく理解されている方法を使用して、本明細書に説明される配列に基づいて設計することができる。
増幅産物の検出を促進するために、プライマー（複数可）またはプローブ（複数可）を任意の従来的な標識付け方法を使用して標識付けし得る。これらは、当該技術分野でよく理解されている方法を使用して、本明細書に説明される配列に基づいて設計することができる。
多型は、当該技術分野において既知の手段によって識別し得、いくつかは文献に記載されている。
いくつかの実施形態では、植物は、植物、植物組織、または植物細胞から再生または栽培し得る。植物細胞または植物組織から植物を再生または栽培するための任意の好適な方法は、限定はされないが、組織培養またはプロトプラストからの再生等が使用できる。好適には、植物は、カルス誘導培地、苗条誘導培地、および／または根誘導培地上で形質転換された植物細胞を栽培することによって再生され得る。例えば、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８６）５：８１－８４を参照されたい。次いで、これらの植物を栽培し、同じ形質転換された系統または異なる系統のいずれかで受粉し、所望の表現型特性の発現を有する得られたハイブリッドを特定し得る。２世代以上を栽培して、所望の表現型特性の発現が安定的に維持および継承されることを確実なものとし、次いで、種子を収穫して、所望の表現型特性の発現が達成されることを確実なものとする。したがって、本明細書で使用される場合、「形質転換された種子」は、植物ゲノムに安定的に統合されるヌクレオチド構築物を含有する種子を指す。
したがって、さらなる態様では、突然変異型植物を調製する方法が提供される。方法は、本明細書に説明される機能性ポリヌクレオチド（または本明細書に説明されるようなその任意の組み合わせ）をコードする遺伝子を含む、植物の少なくとも１つの細胞を提供することに関与する。次に、植物の少なくとも１つの細胞が、本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）の機能を調節するのに効果的な条件下で処理される。次いで、少なくとも１つの突然変異型植物細胞を突然変異型植物内に増殖させ、ここで突然変異型植物は、対照植物のそれと比較して調節されたレベルの説明されたポリペプチド（複数可）（または本明細書に説明されるようなそれらの任意の組み合わせ）を有する。突然変異型植物を作製する本方法の一実施形態では、処理工程は、上述の通り、および少なくとも１つの突然変異型植物細胞を得るのに効果的な条件下で、少なくとも１つの細胞を化学的突然変異誘発物質に供することに関与する。本方法の別の実施形態では、処理工程は、少なくとも１つの突然変異型植物細胞を得るのに効果的な条件下で、少なくとも１つの細胞を放射線源に供することに関与する。「突然変異型植物」という用語は、対照植物と比較して遺伝子型が改変されており、好適にはそれが遺伝子工学または遺伝的改変以外の手段によって改変されている、突然変異型植物を含む。
特定の実施形態では、突然変異型植物、突然変異型植物細胞、または突然変異型植物材料は、別の植物、植物細胞、または植物材料において天然に発生し、かつ所望の特性を付与する１つ以上の突然変異を含み得る。この突然変異を、別の植物、植物細胞、または植物材料（例えば、突然変異が誘導された植物とは異なる遺伝的背景を有する植物、植物細胞、または植物材料）に組み込んで（例えば、遺伝子移入して）、それに対する特性を付与することができる。したがって、一例として、第１の植物において天然に発生した突然変異は、第２の植物（例えば、第１の植物とは異なる遺伝的背景を有する第２の植物）に導入され得る。したがって、当業者は、所望の特性を付与する本明細書に説明される遺伝子の１つ以上の突然変異対立遺伝子をそのゲノム内に天然に保有する植物を検索および特定することができる。天然に発生する突然変異対立遺伝子（複数可）を、育種、戻し交雑、および遺伝子移入を含む様々な方法によって第２の植物に移入させて、本明細書に説明される遺伝子において１つ以上の突然変異を有する系統、品種、またはハイブリッドを生成することができる。同じ技法は、第１の植物から第２の植物への１つ以上の非天然型突然変異（複数可）の遺伝子移入にも適用することができる。所望の特性を示す植物は、突然変異型植物のプールからスクリーニングして除外し得る。好適には、選択は、本明細書に説明されるポリヌクレオチド配列の知識を利用して実施される。結果的に、対照と比較した遺伝的特性についてのスクリーニングが可能である。このようなスクリーニングの手法には、本明細書に考察されるような従来的な増幅および／またはハイブリッド形成技法の適用が関与し得る。したがって、本開示のさらなる態様は、突然変異型植物を特定するための方法に関し、方法は、（ａ）植物からのポリヌクレオチドを含む試料を提供する工程、および（ｂ）ポリヌクレオチドの配列を決定する工程を含み、対照植物のポリヌクレオチドと比較したポリヌクレオチドの配列における差異は、該植物が突然変異型植物であることを示す。別の態様では、対照植物と比較して増加または減少したレベルの１つ以上のアミノ酸を蓄積する突然変異型植物を特定するための方法が提供され、方法は、（ａ）スクリーニングされる植物からの試料を提供する工程、（ｂ）該試料が、１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチドにおいて１つ以上の突然変異を含むかどうかを決定する工程、および（ｃ）該植物の少なくとも１つのアミノ酸のレベルを決定する工程を含む。別の態様では、対照植物と比較して増加または減少したレベルの少なくとも１つのアミノ酸を有する突然変異型植物を調製するための方法が提供され、方法は、（ａ）第１の植物からの試料を提供する工程、（ｂ）該試料が、調節されたレベルの少なくとも１つのアミノ酸をもたらす、１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチドにおいて１つ以上の突然変異を含むかどうかを決定する工程、および（ｃ）第２の植物に１つ以上の突然変異を移入する工程を含む。突然変異（複数可）は、遺伝子組み換え、遺伝子操作、遺伝子移入、植物育種、戻し交雑などの、当該技術分野において既知の様々な方法を使用して、第２の植物に移入することができる。一実施形態では、第１の植物は、天然型植物である。一実施形態では、第２の植物は、第１の植物とは異なる遺伝的背景を有する。別の態様では、対照植物と比較して増加または減少したレベルの少なくとも１つのアミノ酸を有する突然変異型植物を調製するための方法が提供され、方法は、（ａ）第１の植物からの試料を提供する工程、（ｂ）該試料が、調節されたレベルの少なくとも１つのアミノ酸をもたらす、１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチドにおいて１つ以上の突然変異を含むかどうかを決定する工程、および（ｃ）第１の植物から第２の植物に１つ以上の突然変異を遺伝子移入する工程を含む。一実施形態では、遺伝子移入の工程は、任意に戻し交雑等を含む、植物育種を含む。一実施形態では、第１の植物は、天然型植物である。一実施形態では、第２の植物は、第１の植物とは異なる遺伝的背景を有する。一実施形態では、第１の植物は、栽培品種または優良栽培品種ではない。一実施形態では、第２の植物は、栽培品種または優良栽培品種である。さらなる態様は、本明細書に説明される方法によって獲得されたか、または獲得可能である突然変異型植物（栽培品種または優良栽培品種の突然変異型植物を含む）に関する。特定の実施形態では、「突然変異型植物」は、１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）の配列内など、植物の特定の領域にのみ局所化された１つ以上の突然変異を有し得る。この実施形態によれば、突然変異型植物の残りのゲノム配列は、突然変異誘発前の植物と同一となるか、または実質的に同一となる。
特定の実施形態では、突然変異型植物は、植物の複数のゲノム領域内、例えば、１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチドの配列内、およびゲノムの１つ以上のさらなる領域内に局所化された１つ以上の突然変異を有し得る。この実施形態によれば、突然変異型植物の残りのゲノム配列は、突然変異誘発前の植物と同一ではなくなるか、または実質的に同一ではなくなる。特定の実施形態では、突然変異型植物は、本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、もしくは５つ以上のエクソンにおいて１つ以上の突然変異を有さない場合があるか、本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）の１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、もしくは５つ以上のイントロンにおいて１つ以上の突然変異を有さない場合があるか、本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）のプロモーターにおいて１つ以上の突然変異を有さない場合があるか、本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）の３’非翻訳領域において１つ以上の突然変異を有さない場合があるか、本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）の５’非翻訳領域において１つ以上の突然変異を有さない場合があるか、本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）のコード領域において１つ以上の突然変異を有さない場合があるか、本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）の非コード領域において１つ以上の突然変異を有さない場合があるか、またはそれらの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、もしくは６つ以上のそれらの部分の任意の組み合わせにおいて１つ以上の突然変異を有さない場合がある。
さらなる態様では、本明細書に説明されるポリヌクレオチドをコードする遺伝子における突然変異を含む植物、植物細胞、または植物材料を特定する方法が提供され、方法は、（ａ）植物、植物細胞、または植物材料を突然変異誘発に供すること、（ｂ）該植物、植物細胞、もしくは植物材料、またはそれらの子孫から試料を得ること、および（ｃ）遺伝子またはその変異体もしくは断片のポリヌクレオチド配列を決定することを含み、ここで、該配列の差異は、その中での１つ以上の突然変異を示す。この方法はまた、転写開始部位、開始コドン、イントロンの領域、エクソン－イントロンの境界、ターミネーター、または終止コドンなど、植物細胞における遺伝子の発現に影響を及ぼす、ゲノム領域において生じる突然変異（複数可）を有する植物の選択を可能にする。
植物科、種、品種、種子、および組織培養
遺伝的改変における使用に好適な植物としては、単子葉および双子葉植物、ならびに植物細胞系が挙げられ、以下の科：Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ、Ａｌｌｉａｃｅａｅ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ、Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ、Ａｒｅｃａｃｅａｅ、Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ、Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ、Ｂｉｘａｃｅａｅ、Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ、Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ、Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ、Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘａｃｅａｅ、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ、Ｃｏｌｃｈｉｃａｃｅａｅ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ、Ｅｐｈｅｄｒａｃｅａｅ、Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌａｃｅａｅ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ、Ｆａｂａｃｅａｅ、Ｌａｍｉａｃｅａｅ、Ｌｉｎａｃｅａｅ、Ｌｙｃｏｐｏｄｉａｃｅａｅ、Ｍａｌｖａｃｅａｅ、Ｍｅｌａｎｔｈｉａｃｅａｅ、Ｍｕｓａｃｅａｅ、Ｍｙｒｔａｃｅａｅ、Ｎｙｓｓａｃｅａｅ、Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ、Ｐｉｎａｃｅａｅ、Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ、Ｐｏａｃｅａｅ、Ｒｏｓａｃｅａｅ、Ｒｕｂｉａｃｅａｅ、Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ、Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ、Ｔａｘａｃｅａｅ、Ｔｈｅａｃｅａｅ、またはＶｉｔａｃｅａｅのうちの１つに属する種が挙げられる。
好適な種としては、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ、Ａｂｉｅｓ、Ａｃｅｒ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ａｌｌｉｕｍ、Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ、Ａｎａｎａｓ、Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ、Ａｒｕｎｄｏ、Ａｔｒｏｐａ、Ｂｅｒｂｅｒｉｓ、Ｂｅｔａ、Ｂｉｘａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ、Ｃａｍｅｌｌｉａ、Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ、Ｃａｎｎａｂｉｓ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ、Ｃｉｎｃｈｏｎａ、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ、Ｃｏｆｆｅａ、Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ、Ｃｏｌｅｕｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｔｕｒａ、Ｄｉａｎｔｈｕｓ、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ、Ｅｌａｅｉｓ、Ｅｐｈｅｄｒａ、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ、Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ、Ｈｅｖｅａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、Ｊａｔｒｏｐｈａ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｌｉｎｕｍ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｌｕｐｉｎｕｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ、Ｍａｎｉｈｏｔ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｍｅｎｔｈａ、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ、Ｍｕｓａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｏｒｙｚａ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐａｐａｖｅｒ、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｉｎｕｓ、Ｐｏａ、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ、Ｒａｕｗｏｌｆｉａ、Ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｒｏｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｓａｌｉｘ、Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ、Ｓｃｏｐｏｌｉａ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｓｏｒｇｈｕｍ、Ｓｐａｒｔｉｎａ、Ｓｐｉｎａｃｅａ、Ｔａｎａｃｅｔｕｍ、Ｔａｘｕｓ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｕｎｉｏｌａ、Ｖｅｒａｔｒｕｍ、Ｖｉｎｃａ、Ｖｉｔｉｓ、およびＺｅａ属のメンバーを挙げることができる。
好適な種としては、Ｐａｎｉｃｕｍ属種、Ｓｏｒｇｈｕｍ属種、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ属種、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属種、Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ属種、Ｐｏｐｕｌｕｓ属種、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇｅｒａｒｄｉｉ（ヒメアブラススキ）、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ（オオガマ）、Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（クサヨシ）、Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ（ギョウギシバ）、Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（ヒロハノウシノケグサ）、Ｓｐａｒｔｉｎａ ｐｅｃｔｉｎａｔａ（プレーリーコードグラス）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ａｒｕｎｄｏ ｄｏｎａｘ（ダンチク）、Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ（ライムギ）、Ｓａｌｉｘ属種（ヤナギ）、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ属種（ユーカリ）、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ（トリティックコムギタイムライムギ）、竹、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ）、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ（ジャトロファ）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（トウゴマ）、Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ（ヤシ）、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（アマ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（テンサイ）、Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ（キャッサバ）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ（レタス）、Ｍｕｓｙｃｌｉｓｅ ａｌｃａ（バナナ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ジャガイモ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ（ブロッコリ、カリフラワー、メキャベツ）、Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（茶）、Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ（イチゴ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ（ココア）、Ｃｏｆｆｅｙｃｌｉｓｅｃａ（コーヒー）、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ（ブドウ）、Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ（パイナップル）、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ（トウガラシおよびアマトウガラシ）、Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ（タマネギ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ（メロン）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ（キュウリ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ（カボチャ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ（カボチャ）、Ｓｐｉｎａｃｅａ ｏｌｅｒａｃｅａ（ホウレンソウ）、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ（スイカ）、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ（オクラ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ（ナス）、Ｒｏｓａ属種（バラ）、Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ（カーネーション）、Ｐｅｔｕｎｉａ属種（ペチュニア）、Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ（ポインセチア）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ（ルピナス）、Ｕｎｉｏｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（オート麦）、ベントグラス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ属種）、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ（ポプラ）、Ｐｉｎｕｓ属種（マツ）、Ａｂｉｅｓ属種（モミ）、Ａｃｅｒ属種（カエデ）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ）、Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ（ブルーグラス）、Ｌｏｌｉｕｍ属種（ドクムギ）およびＰｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ（チモシー）、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ（スイッチグラス）、Ｓｏｒｇｈｕｙｃｌｉｓｅｏｒ（モロコシ、スーダングラス）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ（ススキ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ属種（エネルギーケーン）、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ（ポプラ）、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（キャノーラ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（コムギ）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（ワタ）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（イネ）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ（アルファルファ）、Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（テンサイ）、またはＰｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ（トウジンビエ）を挙げることができる。
様々な実施形態は、遺伝子発現レベルを調節し、それによってポリペプチドの発現レベルが対照と比較して関心の組織内で調節される植物または植物細胞（例えば、タバコ植物または植物細胞）を生成するように改変された、突然変異型タバコ、非天然型タバコ、またはトランスジェニックタバコ植物または植物細胞を対象とする。開示される組成物および方法は、Ｎ．ｒｕｓｔｉｃａおよびＮ．ｔａｂａｃｕｍを含む、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属に属する任意の種（例えば、ＬＡ Ｂ２１、ＬＮ ＫＹ１７１、ＴＩ １４０６、Ｂａｓｍａ、Ｇａｌｐａｏ、Ｐｅｒｉｑｕｅ、Ｂｅｉｎｈａｒｔ １０００－１、およびＰｅｔｉｃｏ）に適用することができる。他の種としては、Ｎ．ａｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｎ．ａｆｒｉｃａｎａ、Ｎ．ａｌａｔａ、Ｎ．ａｍｅｇｈｉｎｏｉ、Ｎ．ａｍｐｌｅｘｉｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ａｒｅｎｔｓｉｉ、Ｎ．ａｔｔｅｎｕａｔａ、Ｎ．ａｚａｍｂｕｊａｅ、Ｎ．ｂｅｎａｖｉｄｅｓｉｉ、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ｎ．ｂｉｇｅｌｏｖｉｉ、Ｎ．ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ、Ｎ．ｃａｖｉｃｏｌａ、Ｎ．ｃｌｅｖｅｌａｎｄｉｉ、Ｎ．ｃｏｒｄｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｃｏｒｙｍｂｏｓａ、Ｎ．ｄｅｂｎｅｙｉ、Ｎ．ｅｘｃｅｌｓｉｏｒ、Ｎ．ｆｏｒｇｅｔｉａｎａ、Ｎ．ｆｒａｇｒａｎｓ、Ｎ．ｇｌａｕｃａ、Ｎ．ｇｌｕｔｉｎｏｓａ、Ｎ．ｇｏｏｄｓｐｅｅｄｉｉ、Ｎ．ｇｏｓｓｅｉ、Ｎ．ｈｙｂｒｉｄ、Ｎ．ｉｎｇｕｌｂａ、Ｎ．ｋａｗａｋａｍｉｉ、Ｎ．ｋｎｉｇｈｔｉａｎａ、Ｎ．ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ、Ｎ．ｌｉｎｅａｒｉｓ、Ｎ．ｌｏｎｇｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｎ．ｍｅｇａｌｏｓｉｐｈｏｎ、Ｎ．ｍｉｅｒｓｉｉ、Ｎ．ｎｏｃｔｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｎｕｄｉｃａｕｌｉｓ、Ｎ．ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｎ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｈｅｓｐｅｒｉｓ、Ｎ．ｏｔｏｐｈｏｒａ、Ｎ．ｐａｎｉｃｕｌａｔａ、Ｎ．ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｐｅｔｕｎｉｏｉｄｅｓ、Ｎ．ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｑｕａｄｒｉｖａｌｖｉｓ、Ｎ．ｒａｉｍｏｎｄｉｉ、Ｎ．ｒｅｐａｎｄａ、Ｎ．ｒｏｓｕｌａｔａ、Ｎ．ｒｏｓｕｌａｔａ ｓｕｂｓｐ．ｉｎｇｕｌｂａ、Ｎ．ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｓｅｔｃｈｅｌｌｉｉ、Ｎ．ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｎ．ｓｏｌａｎｉｆｏｌｉａ、Ｎ．ｓｐｅｇａｚｚｉｎｉｉ、Ｎ．ｓｔｏｃｋｔｏｎｉｉ、Ｎ．ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、Ｎ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｎ．ｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒａ、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ、Ｎ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎ．ｔｒｉｇｏｎｏｐｈｙｌｌａ、Ｎ．ｕｍｂｒａｔｉｃａ、Ｎ．ｕｎｄｕｌａｔａ、Ｎ．ｖｅｌｕｔｉｎａ、Ｎ．ｗｉｇａｎｄｉｏｉｄｅｓ、およびＮ．ｘ ｓａｎｄｅｒａｅが挙げられる。好適には、タバコ植物は、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍである。
タバコ栽培品種および優良タバコ栽培品種の使用も本明細書に企図されている。したがって、トランスジェニック、非天然型、または突然変異型植物は、１つ以上の導入遺伝子、または１つ以上の遺伝子突然変異、またはそれらの組み合わせを含む、タバコ品種または優良タバコ栽培品種であり得る。遺伝子突然変異（複数可）（例えば、１つ以上の多型）は、個々のタバコ品種またはタバコ栽培品種（例えば、優良タバコ栽培品種）において天然には存在しない突然変異であり得るか、または突然変異が個々のタバコ品種またはタバコ栽培品種（例えば、優良タバコ栽培品種）において天然に発生しない場合には、天然に発生する遺伝子突然変異（複数可）であり得る。
特に有用なＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ品種には、バーレー種、ダーク種、熱風送管乾燥処理種、およびオリエント種のタバコが含まれる。品種または栽培品種の非限定的な例は、ＢＤ ６４、ＣＣ １０１、ＣＣ ２００、ＣＣ ２７、ＣＣ ３０１、ＣＣ ４００、ＣＣ ５００、ＣＣ ６００、ＣＣ ７００、ＣＣ ８００、ＣＣ ９００、Ｃｏｋｅｒ １７６、Ｃｏｋｅｒ ３１９、Ｃｏｋｅｒ ３７１ Ｇｏｌｄ、Ｃｏｋｅｒ ４８、ＣＤ ２６３、ＤＦ９１１、ＤＴ ５３８ ＬＣ Ｇａｌｐａｏ ｔｏｂａｃｃｏ、ＧＬ ２６Ｈ、ＧＬ ３５０、ＧＬ ６００、ＧＬ ７３７、ＧＬ ９３９、ＧＬ ９７３、ＨＢ ０４Ｐ、ＨＢ ０４Ｐ ＬＣ、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、Ｈｙｂｒｉｄ ４０３ＬＣ、Ｈｙｂｒｉｄ ４０４ＬＣ、Ｈｙｂｒｉｄ ５０１ ＬＣ、Ｋ １４９、Ｋ ３２６、Ｋ ３４６、Ｋ ３５８、Ｋ３９４、Ｋ ３９９、Ｋ ７３０、ＫＤＨ ９５９、ＫＴ ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ １６０、ＫＹ １７、ＫＹ １７１、ＫＹ ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＹ１４ｘＬ８ ＬＣ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ、ＭｃＮａｉｒ ３７３、ＭｃＮａｉｒ ９４４、ｍｓＫＹ １４ｘＬ８、Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ、Ｎａｒｒｏｗ Ｌｅａｆ Ｍａｄｏｌｅ ＬＣ、ＮＢＨ ９８、Ｎ－１２６、Ｎ－７７７ＬＣ、Ｎ－７３７１ＬＣ、ＮＣ １００、ＮＣ １０２、ＮＣ ２０００、ＮＣ ２９１、ＮＣ ２９７、ＮＣ ２９９、ＮＣ ３、ＮＣ ４、ＮＣ ５、ＮＣ ６、ＮＣ７、ＮＣ ６０６、ＮＣ ７１、ＮＣ ７２、ＮＣ ８１０、ＮＣ ＢＨ １２９、ＮＣ ２００２、Ｎｅａｌ Ｓｍｉｔｈ Ｍａｄｏｌｅ、ＯＸＦＯＲＤ ２０７、ＰＤ ７３０２ ＬＣ、ＰＤ ７３０９ ＬＣ、ＰＤ ７３１２ ＬＣ、’Ｐｅｒｉｑｕｅ’ ｔｏｂａｃｃｏ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ ６１０、Ｒ ６３０、Ｒ ７－１１、Ｒ ７－１２、ＲＧ １７、ＲＧ ８１、ＲＧ Ｈ５１、ＲＧＨ ４、ＲＧＨ ５１、ＲＳ １４１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ １６８、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７２、Ｓｐｅｉｇｈｔ １７９、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２５、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２２７、Ｓｐｅｉｇｈｔ ２３４、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－２８、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｇ－７０、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ－６、Ｓｐｅｉｇｈｔ Ｈ２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ ＮＦ３、ＴＩ １４０６、ＴＩ １２６９、ＴＮ ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ ９０、ＴＮ ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮ Ｄ９４、ＴＮ Ｄ９５０、ＴＲ（Ｔｏｍ Ｒｏｓｓｏｎ）Ｍａｄｏｌｅ、ＶＡ ３０９、ＶＡ３５９、ＡＡ ３７－１、Ｂ１３Ｐ、Ｘａｎｔｈｉ（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ－Ｍｏｒ）、Ｂｅｌ－Ｗ３、７９－６１５、Ｓａｍｓｕｎ Ｈｏｌｍｅｓ ＮＮ、ＫＴＲＤＣ ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｈｙｂｒｉｄ ４９、Ｂｕｒｌｅｙ ２１、ＫＹ８９５９、ＫＹ９、ＭＤ ６０９、ＰＧ０１、ＰＧ０４、ＰＯ１、ＰＯ２、ＰＯ３、ＲＧ１１、ＲＧ ８、ＶＡ５０９、ＡＳ４４、Ｂａｎｋｅｔ Ａ１、Ｂａｓｍａ Ｄｒａｍａ Ｂ８４／３１、Ｂａｓｍａ Ｉ Ｚｉｃｈｎａ ＺＰ４／Ｂ、Ｂａｓｍａ Ｘａｎｔｈｉ ＢＸ ２Ａ、Ｂａｔｅｋ、Ｂｅｓｕｋｉ Ｊｅｍｂｅｒ、Ｃ１０４、Ｃｏｋｅｒ ３４７、Ｃｒｉｏｌｌｏ Ｍｉｓｉｏｎｅｒｏ、Ｄｅｌｃｒｅｓｔ、Ｄｊｅｂｅｌ ８１、ＤＶＨ ４０５、Ｇａｌｐａｏ Ｃｏｍｕｍ、ＨＢ０４Ｐ、Ｈｉｃｋｓ Ｂｒｏａｄｌｅａｆ、Ｋａｂａｋｕｌａｋ Ｅｌａｓｓｏｎａ、Ｋｕｔｓａｇｅ Ｅ１、ＬＡ ＢＵ ２１、ＮＣ ２３２６、ＮＣ ２９７、ＰＶＨ ２１１０、Ｒｅｄ Ｒｕｓｓｉａｎ、Ｓａｍｓｕｎ、Ｓａｐｌａｋ、Ｓｉｍｍａｂａ、Ｔａｌｇａｒ ２８、Ｗｉｓｌｉｃａ、Ｙａｙａｌｄａｇ、Ｐｒｉｌｅｐ ＨＣ－７２、Ｐｒｉｌｅｐ Ｐ２３、Ｐｒｉｌｅｐ ＰＢ １５６／１、Ｐｒｉｌｅｐ Ｐ１２－２／１、Ｙａｋａ ＪＫ－４８、Ｙａｋａ ＪＢ １２５／３、ＴＩ－１０６８、ＫＤＨ－９６０、ＴＩ－１０７０、ＴＷ１３６、Ｂａｓｍａ、ＴＫＦ ４０２８、Ｌ８、ＴＫＦ ２００２、ＧＲ１４１、Ｂａｓｍａ ｘａｎｔｈｉ、ＧＲ１４９、ＧＲ１５３、Ｐｅｔｉｔ Ｈａｖａｎａである。本明細書で具体的に識別されていない場合であっても、上記の低コンバーター亜種も企図されている。
実施形態は、本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）（または本明細書に説明されるようなその任意の組み合わせ）の発現または活性を調節するために修飾されている突然変異型植物、非天然型植物、ハイブリッド植物、またはトランスジェニック植物を生成するための組成物および方法も対象とする。有利なことに、得られた突然変異型植物、非天然型植物、ハイブリッド植物、またはトランスジェニック植物は、全体的な外観において対照植物と類似しているか、または実質的に同一であり得る。成熟度、植物当たりの葉の数、茎の高さ、葉の挿入角度、葉のサイズ（幅および長さ）、節間の距離、および葉身と中央脈の比率など、様々な表現型特性を圃場観察によって評価することができる。
一態様は、本明細書に説明される突然変異型植物、非天然型植物、ハイブリッド植物、またはトランスジェニック植物の種子に関する。好ましくは、種子はタバコ種子である。さらなる態様は、本明細書に説明される突然変異型植物、非天然型植物、ハイブリッド植物、またはトランスジェニック植物の花粉または胚珠に関する。さらに、雄性不稔性を付与するポリヌクレオチドをさらに含む、本明細書に説明される突然変異型植物、非天然型植物、ハイブリッド植物、またはトランスジェニック植物が提供される。
また、本明細書に説明される突然変異型植物、非天然型植物、ハイブリッド植物、もしくはトランスジェニック植物、またはそれらの部分の再生可能な細胞の組織培養も提供され、培養によって、親の形態学的特性および生理学的特性をすべて発現する能力を持つ植物が再生される。再生可能な細胞には、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、根、根端、葯、花およびそれらの部分、胚珠、苗条、幹、茎、随、および果実（さく果、capsule）に由来する細胞、またはそれらに由来するカルスもしくはプロトプラストが含まれるが、これに限定されない。本明細書に説明される植物材料は、乾燥処理されたタバコ材料（例えば、空気乾燥処理されたかまたは日光乾燥処理されたタバコ材料）であり得る。空気および日光乾燥処理されたタバコ品種の例は、バーレー種およびダーク種である。本明細書に説明される植物材料は、バージニア種などの熱風送管乾燥処理されたタバコ材料であり得る。
タバコ乾燥処理に関するＣＯＲＥＳＴＡの推奨は、ＣＯＲＥＳＴＡ Ｇｕｉｄｅ Ｎ°１７，Ａｐｒｉｌ ２０１６，Ｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｌｅａｆ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎに記載されている。
１つの目的は、植物材料、例えば、乾燥処理された葉における少なくとも１つのアミノ酸（例えば、アスパラギン酸）において調節されたレベルをもたらす、調節されたレベルのＮｔＡＡＴを示す突然変異型、トランスジェニック、もしくは非天然型植物またはその部分を提供することである。アスパラギン酸はタバコ葉の加熱の際にアクリルアミドを生じさせることが知られているため、アスパラギン酸のレベルの調節はアクリルアミドのレベルの調節にもつながり得る。また、アスパラギン酸の合成は、アスパラギン、スレオニン、イソロイシン、システイン、およびメチオニンなどの他のアミノ酸の合成にも不可欠である。したがって、これらの他のアミノ酸のうちの１つ以上のレベルは、アスパラギン酸のレベルが調節される場合に調節され得る。特定のアミノ酸（例えば、スレオニン、メチオニン、およびシステイン）は、加熱を生成する煙またはエアロゾル中の硫黄臭をもたらし得る。したがって、これらのアミノ酸レベルの調節により、この硫黄臭の調節も可能になる。
特定の実施形態では、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ、ＮｔＡＡＴ２－Ｔ、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ、ＮｔＡＡＴ３－Ｔ、ＮｔＡＡＴ４－Ｓ、およびＮｔＡＡＴ４－Ｔの活性及び／または発現が調節される。
特定の実施形態では、ＮｔＡＡＴ１－ＳおよびＮｔＡＡＴ１－Ｔの活性および／または発現が調節される。
特定の実施形態では、ＮｔＡＡＴ２－ＳおよびＮｔＡＡＴ２－Ｔの活性および／または発現が調節される。
特定の実施形態では、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ、およびＮｔＡＡＴ２－Ｔの活性および／または発現が調節される。
特定の実施形態では、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ、およびＮｔＡＡＴ２－Ｔのうちの１つ以上の発現および／または活性が調節されるが、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ、ＮｔＡＡＴ３－Ｔ、ＮｔＡＡＴ４－Ｓ、およびＮｔＡＡＴ４－Ｔのうちの１つ以上の発現および／または活性は調節されない。
特定の実施形態では、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ、およびＮｔＡＡＴ２－Ｔのうちの１つ以上の発現および／または活性が調節されるが、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ、ＮｔＡＡＴ３－Ｔ、ＮｔＡＡＴ４－Ｓ、およびＮｔＡＡＴ４－Ｔの発現および／または活性は調節されない。
好適には、突然変異体、トランスジェニック、もしくは非天然型植物またはその部分は、対照植物と実質的に同一の視覚的外観を有する。
したがって、対照細胞または対照植物と比較して少なくとも１つのアミノ酸の調節されたレベルを有する突然変異型、トランスジェニック、または非天然型植物もしくはその部分または植物細胞が本明細書に説明される。突然変異型、トランスジェニック、または非天然型植物または植物細胞は、対応する１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチドの発現を調節することにより、１つ以上の本明細書に説明されるポリペプチドの合成または機能を調節するように改変されている。好適には、少なくとも１つのアミノ酸の調節されたレベルが、少なくとも生葉において、好適には乾燥処理された葉において観察される。
さらなる態様は、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物または細胞に関連し、１つ以上の本明細書に説明されるＡＡＴポリペプチドの発現または機能が調節され、植物の一部（例えば、生葉、好適には乾燥処理された葉または乾燥処理されたタバコ）が、該ポリペプチド（複数可）の発現または機能が調節（例えば、減少）されていない対照植物と比較して、少なくとも１つのアミノ酸において少なくとも５％調節された（例えば、減少した）レベルを有する。特定の実施形態では、植物（例えば、生葉、好適には乾燥処理された葉または乾燥処理されたタバコ）における少なくとも１つのアミノ酸のレベルは、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、もしくは少なくとも２００％以上の量または機能が調節（例えば、減少）され得る。少なくとも１つのアミノ酸のレベルは、検出不能な量まで減少し得る。
さらにさらなる態様は、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物または細胞に由来するか、それらに由来可能である乾燥処理された植物材料（例えば、乾燥処理された葉または乾燥処理されたタバコ）に関し、１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチドの発現またはそれによってコードされるポリペプチドの機能が調節（例えば、減少）され、少なくとも１つのアミノ酸のレベルが対照植物と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、もしくは少なくとも２００％調節（例えば、減少）される。
好適には、該植物またはその部分（例えば、葉）の視覚的外観は、対照植物と実質的に同一である。好適には、植物はタバコ植物またはコーヒー植物である。
実施形態は、１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または機能を調節するために改変されている突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物または植物細胞を生成するための組成物および方法も対象とし、これは、少なくとも１つのアミノ酸の調節された含有量を有する植物または植物構成要素（例えば、葉（例えば、生葉または乾燥処理された葉）またはタバコ）または植物細胞をもたらすことができる。
突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物は、視覚的外観において、対応する対照植物と類似しているか、または実質的に同一であり得る。一実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の葉の重量は、対照植物と実質的に同一である。一実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の葉の数は、対照植物と実質的に同一である。一実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の葉の重量および葉の数は、対照植物と実質的に同一である。一実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の茎の高さは、例えば、圃場移植後１か月、２か月、もしくは３か月以上、または最高の高さまで伸びた後１０日、２０日、３０日、もしくは３６日以上が経過した時点で、対照植物と実質的に同一である。例えば、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の茎の高さは、対照植物の茎の高さよりも低くない。別の実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物のクロロフィル含有量は、対照植物と実質的に同一である。別の実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の茎の高さは、対照植物と実質的に同一であり、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物のクロロフィル含有量は、対照植物と実質的に同一である。他の実施形態では、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の葉のサイズまたは形態または数または彩色は、対照植物と実質的に同一である。好適には、植物はタバコ植物またはコーヒー植物である。
別の態様では、植物の少なくとも一部分（例えば、葉（例えば、乾燥処理された葉）またはタバコ）における少なくとも１つのアミノ酸の量を調節するための方法が提供され、方法は、（ｉ）１つ以上の本明細書に説明されるポリペプチド（または本明細書に説明されるようなそれらの任意の組み合わせ）の発現または機能を調節する工程であって、好適には、ポリペプチド（複数可）が、対応する本明細書に説明されるポリヌクレオチドによってコードされる、工程、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られる突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の少なくとも一部分（例えば、葉（例えば、乾燥処理された葉）またはタバコもしくは煙）における少なくとも１つのアミノ酸のレベルを測定する工程、および（ｉｉｉ）それらにおける少なくとも１つのアミノ酸のレベルが対照植物と比較して調節されている突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物を特定する工程を含む。好適には、該突然変異型、非天然型、またははトランスジェニック植物の視覚的外観は、対照植物と実質的に同一である。好適には、植物はタバコ植物である。
別の態様では、乾燥処理された植物材料の少なくとも一部分（例えば、乾燥処理された葉）における少なくとも１つのアミノ酸の量を調節するための方法が提供され、方法は、（ｉ）１つ以上のポリペプチド（または本明細書に説明されるようなそれらの任意の組み合わせ）の発現または機能を調節する工程であって、好適には、ポリペプチド（複数可）が、対応する本明細書に説明されるポリヌクレオチドによってコードされる、工程、（ｉｉ）植物材料（例えば、１つ以上の葉）を収穫し、ある期間にわたって乾燥処理する工程、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られるか、または工程（ｉｉ）中の乾燥処理された植物材料の少なくとも一部分における少なくとも１つのアミノ酸のレベルを測定する工程、および（ｉｖ）それらにおける少なくとも１つのアミノ酸のレベルが対照植物と比較して調節されている、乾燥処理された植物材料を特定する工程を含む。
対照と比較した発現の増加は約５％～約１００％であるか、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％以上、例えば、２００％、３００％、５００％、１０００％以上の増加であり得、これには、転写性の機能、またはポリヌクレオチド発現もしくはポリペプチド発現、またはそれらの組み合わせにおける増加が含まれる。
対照と比較した機能もしくは活性の増加は約５％～約１００％であるか、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％以上、例えば、２００％、３００％、５００％、１０００％以上の増加であり得る。
対照と比較した発現の減少は約５％～約１００％であるか、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％の減少であり得、これには、転写性の機能、またはポリヌクレオチド発現もしくはポリペプチド発現、またはそれらの組み合わせにおける減少が含まれる。好適には、発現は減少する。
対照と比較した機能または活性の減少は約５％～約１００％であるか、または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは１００％の減少であり得る。好適には、機能または活性は減少する。
本明細書に説明されるポリヌクレオチドおよび組み換え構築物を使用して、関心の植物種、好適にはタバコにおける、本明細書に説明されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または機能または活性を調節することができる。
数多くのポリヌクレオチドをベースにした方法を使用して、植物および植物細胞において遺伝子発現を増加させることできる。一例として、形質転換される植物との適合性のある構築物、ベクター、または発現ベクターを調製することができ、これは、植物または植物細胞において遺伝子を過剰発現する能力のある上流プロモーターと一緒に、関心の遺伝子を含む。例示的なプロモーターが本明細書に説明される。形質転換の後、および好適な条件下で栽培されたとき、プロモーターは、植物、またはその特定の組織においてこの酵素のレベルを調節するために、発現を駆動することができる。例示的な一実施形態では、１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチド（または本明細書に説明されるそれらの任意の組み合わせ）を保有するベクターは、植物または植物細胞において遺伝子を過剰発現するために生成される。ベクターは、植物のすべての組織でその構成的発現を駆動する導入遺伝子の上流に、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターなどの好適なプロモーターを保有する。ベクターはまた、形質転換されたカルスおよび細胞株の選択を与えるために、抗生物質耐性遺伝子を保有する。
プロモーターからの配列の発現は、エンハンサー、クロマチン活性化要素、転写因子応答要素などを含む発現制御配列を含めることにより強化できる。このような制御配列は構成的であり、かつ転写を普遍的な方法で上方調節し得、またはこれらは通性であり、かつ特定のシグナルに応答して転写を上方調節し得る。老化に関連するシグナルおよび乾燥処理中に活性であるシグナルが、特異的に示される。
したがって、様々な実施形態は、ポリヌクレオチドの複数のコピーを植物ゲノムに組み込むことによって、１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチド（または本明細書に説明されるようなそれらの任意の組み合わせ）の発現レベルを調節する方法を対象とし、方法は、１つ以上の本明細書に説明されるポリヌクレオチドと動作可能に連結されるプロモーターを含む発現ベクターで植物細胞宿主を形質転換することを含む。組み換えポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドは、天然ポリペプチドであり得るか、または細胞に対して異種であり得る。
一実施形態では、本開示において使用される植物は、乾燥処理の終了時に高アミノ酸含有量（圃場栽培の場合、約２７．４ｍｇ／ｇを超える乾燥重量遊離アミノ酸含有量）および高アンモニア含有量（圃場栽培の場合、約０．１８％を超える乾燥重量）を有する植物のような、空気乾燥処理された植物である。空気乾燥処理された突然変異型、トランスジェニック、もしくは非天然型植物、またはそれらの部分は、圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約２７．４ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量、例えば、圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約２０ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約１５ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約１０ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約５ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量である、アミノ酸含有量を有することができる。空気乾燥処理された突然変異型、トランスジェニック、もしくは非天然型植物、またはそれらの部分は、圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約０．１８％未満の乾燥重量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約０．１５％未満の乾燥重量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約０．１０％未満の乾燥重量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約０．０５％未満の乾燥重量である、アンモニア含有量を有することができる。
別の実施形態では、本開示で使用する植物は、高アミノ酸含有量（圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約２６．５ｍｇ／ｇを超える乾燥重量遊離アミノ酸含有量）および高アンモニア含有量（圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約０．１４％を超える乾燥重量）を有する植物のような日光乾燥処理された植物である。日光乾燥処理された突然変異型、トランスジェニック、もしくは非天然型植物、またはそれらの部分は、圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約２６．５ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量、例えば、圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約２０ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約２０ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約１５ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約１０ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約５ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量である、アミノ酸含有量を有することができる。日光乾燥処理された突然変異型、トランスジェニック、もしくは非天然型植物、またはそれらの部分は、圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約０．１４％未満の乾燥重量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約０．１０％未満の乾燥重量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約０．０５％未満の乾燥重量である、アンモニア含有量を有することができる。
別の実施形態では、本開示で使用される植物は、熱風送管乾燥処理された植物である。そのような植物は、圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約３ｍｇ／ｇを超える乾燥重量遊離アミノ酸含有量であるアミノ酸含有量）、および圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約０．０２％を超える乾燥重量であるアンモニア含有量）を有する。熱風送管乾燥処理された突然変異型、トランスジェニック、もしくは非天然型植物、またはそれらの部分は、圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約３ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量、例えば、圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約２．５ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約２．０ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約１．５ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約１．０ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約０．５ｍｇ／ｇ未満の乾燥重量遊離アミノ酸含有量である、アミノ酸含有量を有することができる。日光乾燥処理された突然変異型、トランスジェニック、もしくは非天然型植物、またはそれらの部分は、圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約０．０２％未満の乾燥重量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約０．１０％未満の乾燥重量、または圃場栽培の場合、乾燥処理の終了時に約０．０５％未満の乾燥重量である、アンモニア含有量を有することができる。
特定の実施形態では、空気乾燥処理または日光乾燥処理された植物の使用が好ましい。
アミノ酸含有量は、当該技術分野で既知の様々な方法を使用して測定することができる。そのような方法の１つは、Ｍｅｔｈｏｄ ＭＰ １４７１ ｒｅｖ ５ ２０１１，Ｒｅｓａｎａ，Ｉｔａｌｙ：Ｃｈｅｌａｂ Ｓｉｌｌｉｋｅｒ Ｓ．ｒ．ｌ，Ｍｅｒｉｅｕｘ ＮｕｔｒｉＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙである。乾燥処理された植物葉中のアミノ酸決定のために、中間脈を除去した後、乾燥処理された葉片を、必要に応じて、４０℃で２～３日間乾燥させる。次いで、タバコ材料はアミノ酸含有量の分析の前に微粉末（約１００ｕＭ）に粉砕される。植物材料中のアミノ酸含有量を測定するための別の方法は、ＵＮＩ ＥＮ ＩＳＯ １３９０３：２００５に説明される。一実施形態では、植物材料中のアミノ酸含有量を測定するために使用される方法は、ＵＮＩ ＥＮ ＩＳＯ １３９０３：２００５に説明される。
アンモニア含有量は、Ｓｋａｌａｒ：ＭＴ２４－硝酸塩、総アルカロイド、アンモニア、塩化物、ＴＫＮによって決定することができる。乾燥処理された植物葉中のアンモニア決定のために、中間脈を除去した後、乾燥処理された葉片を、必要に応じて、４０℃で２～３日間乾燥させる。次いで、タバコ材料はアンモニア含有量の分析の前に微粉末（約１００ｕＭ）に粉砕される。アンモニア含有量を測定するための他の方法は、当該技術分野で既知であり、Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｎａｄａ （１９９９）Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｍｏｎｉａ ｉｎ ｗｈｏｌｅ ｔｏｂａｃｃｏ．Ｔｏｂａｃｃｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ．Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｎａｄａ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｔ－３０２、およびＴｏｂａｃｃｏ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ （２００２）ＵＫ ｓｍｏｋｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ ｓｔｕｄｙ．Ａｎｎｅｘ Ａ Ｐａｒｔ ５ Ｍｅｔｈｏｄ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｍｏｎｉａ ｙｉｅｌｄｓ ｉｎ ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｄｉｏｎｅｘ ＤＸ－５００ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ，Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｒ ＧＣ１５／Ｍ２４／０２に説明される方法を含む。
本明細書に説明される１つ以上のポリヌクレオチド（または本明細書に説明されるそれらの任意の組み合わせ）の突然変異対立遺伝子を保有する植物は、植物育種プログラムで使用して、有用な系統、品種、およびハイブリッドを作製することができる。特に、突然変異対立遺伝子は、上述した商業的に重要な品種に遺伝子移入される。したがって、本明細書に説明される突然変異型植物、非天然型植物またはトランスジェニック植物を異なる遺伝的同一性を含む植物と交雑することを含む、植物の育種方法が提供される。本方法は、子孫植物を別の植物と交雑すること、および任意で遺伝的形質または遺伝的背景を有する子孫が得られるまで交雑を繰り返すことをさらに含み得る。こうした育種方法が果たしている１つの目的は、望ましい遺伝的特性を他の品種、育種系統、ハイブリッド、または栽培品種、特に商業的利害のあるものに導入することである。別の目的は、単一植物品種、系統、ハイブリッド、または栽培品種における異なる遺伝子の遺伝的改変のスタッキングを容易にすることである。種内ならびに種間の交配が企図される。このような交雑から発生した子孫植物は、育種系統とも称され、本開示の非天然型植物の例である。
一実施形態では、（ａ）突然変異型またはトランスジェニック植物を第２の植物と交雑して、子孫タバコ種子を得ること、（ｂ）植物栽培条件下で子孫タバコ種子を栽培して、非天然型植物を得ること、を含む非天然型植物を生産するための方法が提供される。方法は、（ｃ）前世代の非天然型植物をそれ自体または別の植物と交雑して、子孫タバコ種子を得ることと、（ｄ）工程（ｃ）の子孫タバコ種子を植物栽培条件下で栽培して、さらなる非天然型植物を得ることと、（ｅ）（ｃ）および（ｄ）の交雑および栽培工程を複数回繰り返して、非天然型植物のさらなる世代を生成することと、をさらに含み得る。本方法は、工程（ａ）の前に、特徴付けされた遺伝的同一性を含み、かつ突然変異型またはトランスジェニック植物と同一ではない親株を提供する工程を任意に含み得る。いくつかの実施形態では、育種プログラムに応じて、交雑および栽培工程は、非天然型植物の世代を生成するために、０～２回、０～３回、０～４回、０～５回、０～６回、０～７回、０～８回、０～９回、または０～１０回繰り返される。戻し交雑は、親の１つに近い遺伝的同一性を有する次世代の子孫植物を得るために、子孫がその親の１つまたはその親と遺伝的に類似する別の植物と交雑される、そのような方法の例である。植物育種、特に植物育種の技法は周知であり、本開示の方法において使用することができる。本開示は、これらの方法によって生成された非天然型植物をさらに提供する。特定の実施形態では、植物を選択する工程は除外される。
本明細書に説明される方法のいくつかの実施形態では、変異遺伝子の育種およびスクリーニングから得られる系統は、標準的な圃場手順を使用して圃場で評価される。最初の突然変異誘発されていない親を含む対照遺伝子型が含まれ、エントリーは無作為化完全ブロック設計または他の適切な圃場設計で圃場に配列される。タバコについては、標準的な農耕法が使用され、例えば、タバコは、収穫され、秤量され、乾燥処理の前および乾燥処理中に化学的および他の一般的な試験のために試料抽出される。データの統計分析が実行され、選択した系統の親系統に対する類似性が確認される。選択された植物の細胞遺伝学的分析は、染色体補体および染色体の対合関係を確認するために任意で実行される。
ＤＮＡフィンガープリンティング、一塩基多型、マイクロサテライトマーカー、または同様の技術をマーカー支援選択（ＭＡＳ）育種プログラムで使用して、本明細書に説明した通り、遺伝子の突然変異対立遺伝子を他のタバコに移入または育種し得る。例えば、育種家は、農業的に望ましい遺伝子型を有する突然変異対立遺伝子を含有する遺伝子型をハイブリッド形成したものから、分離集団を作製できる。Ｆ２または戻し交雑世代の植物は、本明細書に列挙される技法のうちの１つを使用して、ゲノム配列またはその断片から開発されたマーカーを使用してスクリーニングすることができる。突然変異対立遺伝子を有すると識別された植物を戻し交雑または自家受粉して、スクリーニングされる第２の集団を作製することができる。予測される継承パターンまたは使用されるＭＡＳ技術に応じて、戻し交雑の各サイクルの前に、選択した植物を自家受粉させて、所望される個々の植物の識別を助ける必要があり得る。戻し交雑または他の育種手順は、反復親の所望の表現型が回復されるまで繰り返すことができる。
本開示によれば、育種プログラムにおいて、成功した交雑種は、稔性であるＦ１植物を産み出す。選択されたＦ１植物は親の１つと交雑することができ、戻し交雑の第１世代の植物は自家受粉して、変異体遺伝子発現（例えば、ヌルバージョンの遺伝子）について再度スクリーニングされる集団を生成する。戻し交雑、自家受粉、およびスクリーニングのプロセスは、例えば、最終的なスクリーニングによって稔性であり、かつ反復親と合理的に類似した植物が生成されるまで少なくとも４回繰り返される。所望する場合、この植物を自家受粉し、その後子孫を再度スクリーニングして、植物が変異体遺伝子発現を示すことを確認する。いくつかの実施形態では、Ｆ２世代の植物集団は、変異体遺伝子発現についてスクリーニングされ、例えば、標準的な方法に従って、例えば本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）（または本明細書に説明されるそれらの任意の組み合わせ）のポリヌクレオチド配列情報に基づくプライマーを用いたＰＣＲ法を使用することにより、遺伝子の欠損のためにポリペプチドを発現しない植物が特定される。
ハイブリッドタバコ品種は、第１の品種の雌性の親株（すなわち、種子親）の自家受粉を防止し、第２の品種の雄性の親株からの花粉が雌性の親株と受粉できるようにし、Ｆ１ハイブリッド種子が雌性の植物において形成されるようにすることで生成できる。雌性の植物の自家受粉は、花の発生の初期段階で花の雄しべを除去することで防止できる。あるいは、花粉形成は、雄性不稔の形成を使用して、雌性の親株で防止することができる。例えば、雄性不稔は、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）またはトランスジェニック雄性不稔により生成でき、導入遺伝子が小胞子生成および／または花粉形成、または自家不適合性を阻害する。ＣＭＳを含む雌性の親株は、特に有用である。雌性の親株がＣＭＳである実施形態では、花粉が雄性の稔性植物から収穫され、手作業でＣＭＳ雌性の親株の柱頭に適用され、得られたＦ１種子が収穫される。
本明細書に説明される品種および系統を使用して、単一交雑タバコＦ１ハイブリッドを形成することができる。そのような実施形態では、親品種の植物は、実質的に均質な隣接した集団として栽培して、雄性の親株から雌性の親株への自然な他家受粉を促進することができる。雌性の親株において形成されたＦ１種子は、従来的な手段によって選択的に収穫される。また、２つの親株品種を大量に栽培して、雌性の親において形成されたＦ１ハイブリッド種子と、自家受粉の結果として雄性の親において形成された種子との混合体を収穫することもできる。あるいは、三原交雑を行うことができ、ここでは単一交雑Ｆ１ハイブリッドが雌性の親として使用され、異なる雄性の親と交雑される。別の代替法として、二重交雑ハイブリッドを作製でき、ここでは異なる２つの単一交雑のＦ１子孫がそれら自体の間で交雑される。
突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物の集団は、所望の特性または表現型を有する集団のメンバーについてスクリーニングまたは選択することができる。例えば、単一形質転換事象の子孫の集団は、それによってコードされるポリペプチド（複数可）の所望のレベルの発現または機能を有する植物についてスクリーニングすることができる。物理的および生化学的方法を使用して、発現または活性レベルを特定することができる。これらには、ポリヌクレオチドの検出のためのサザン分析またはＰＣＲ増幅；ＲＮＡ転写物を検出するためのノーザンブロット、Ｓ１ ＲＮａｓｅ保護、プライマー延長、またはＲＴ－ＰＣＲ増幅；ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素学的アッセイ；ならびにポリペプチドを検出するためのポリペプチドゲル電気泳動、ウエスタンブロット、免疫沈降、および酵素免疫測定法が含まれる。原位置ハイブリッド形成、酵素染色、ならびに免疫染色および酵素アッセイなどの他の技法も、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの存在または発現、機能、もしくは活性を検出するために使用することができる。
１つ以上の組み換えポリヌクレオチド、１つ以上のポリヌクレオチド構築物、１つ以上の二本鎖ＲＮＡ、１つ以上の共役体、または１つ以上のベクター／発現ベクターを含む、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物細胞および植物が本明細書で説明される。
限定はされないが、本明細書に説明される植物およびその部分は、本開示による１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現、機能、または活性が調節される前または後のいずれかに改変することができる。
以下の１つ以上の遺伝的改変が、突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物において存在し得る。
窒素代謝中間体の変換に関与する１つ以上の遺伝子を改変して、少なくとも１つのタバコ特異的ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）のレベルの低下をもたらすことができる。そのような遺伝子の非限定的な例としては、ＷＯ２００６／０９１１９４、ＷＯ２００８／０７０２７４、ＷＯ２００９／０６４７７１、およびＷＯ２０１１／０８８１８０に記載されるＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５、およびＣＹＰ８２Ｅ１０などのニコチンデメチラーゼ、ならびにＷＯ２０１６０４６２８８に記載される硝酸還元酵素をコードするもの含む。
重金属の取り込みまたは重金属の輸送に関与する１つ以上の遺伝子を改変して、重金属含有量の低下をもたらすことができる。非限定的な例には、多剤耐性に関連するポリペプチドファミリー、陽イオン拡散促進物質（ＣＤＦ）ファミリー、Ｚｒｔ－Ｉｒｔ様ポリペプチド（ＺＩＰ）ファミリー、陽イオン交換体（ＣＡＸ）ファミリー、銅輸送体（ＣＯＰＴ）ファミリー、重金属ＡＴＰａｓｅｓファミリー（例えば、ＷＯ２００９／０７４３２５およびＷＯ２０１７／１２９７３９に記載されるＨＭＡ）、自然耐性に関連するマクロファージポリペプチド（例えば、ＮＲＡＭＰ）の相同体ファミリー、およびカドミウムなどの重金属の輸送に関与する、ＷＯ２０１２／０２８３０９に記載されるようなＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体ファミリー（例えば、ＭＲＰ）の他のメンバーに属する遺伝子が含まれる。
他の例示的な改変は、有益なプロファイルを変更するために使用することができるスクロースエステル組成物における変化をもたらす、イソプロピルリンゴ酸シンターゼの調節された発現または機能を有する植物をもたらすことができる（ＷＯ２０１３／０２９７９９を参照）。
他の例示的な改変は、メチオナールのレベルを調整することができる、トレオニンシンターゼの調節された発現または機能を有する植物をもたらすことができる（ＷＯ２０１３／０２９８００を参照）。
他の例示的な改変は、ベータ－ダマセノン含有量を調節して香りプロファイルを変更するための、ネオキサンチンシンターゼ、リコピンベータシクラーゼ、および９－シス－エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼのうちの１つ以上の調節された発現または機能を有する植物をもたらすことができる（ＷＯ２０１３／０６４４９９を参照）。
他の例示的な改変は、その中の硝酸レベルを調整するための、塩素チャネルのＣＬＣファミリーメンバーの調節された発現または機能を有する植物をもたらすことができる（ＷＯ２０１４／０９６２８３およびＷＯ２０１５／１９７７２７を参照）。
他の例示的な改変は、葉中のアスパラギン酸などの１つ以上のアミノ酸のレベルを調節するための１つ以上のＡＡＴの調節された発現または機能と、葉を加熱または燃焼した際に生成されるエアロゾル中のアクリルアミドの調節されたレベルとを有する植物をもたらすことができる（ＷＯ２０１７／０４２１６２を参照）。
他の改変の例には除草剤耐性が含まれ、例えば、グリホサートは、多数の広範囲な除草剤の有効成分である。グリホサート耐性トランスジェニック植物は、ａｒｏＡ遺伝子（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉに由来するグリホサートＥＰＳＰ合成酵素）の導入により開発されている。スルホニル尿素耐性植物は、シロイヌナズナに由来する突然変異ＡＬＳ（アセト乳酸合成酵素）遺伝子の形質転換により生成されている。突然変異Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｈｙｂｒｉｄｕｓに由来する光化学系ＩＩ型のＯＢポリペプチドを植物に導入して、アトラジン耐性トランスジェニック植物が生成されており、ブロモキシニル耐性トランスジェニック植物は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌に由来するｂｘｎ遺伝子を組み込むことによって生成されている。
別の例示的な改変は、昆虫に対して耐性のある植物をもたらす。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）毒素は、最近ブロッコリにおいて例証されたように、Ｂｔ耐性害虫の発生を遅らせる効果的な方法を提供することができ、錐体のｃｒｙ１Ａｃおよびｃｒｙ１ＣＢｔ遺伝子は、いずれかの単一ポリペプチドに対して耐性のあるコナガ（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ）を駆除し、かつ耐性昆虫の進化を有意に遅らせた。
別の例示的な改変は、病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌類）によって生じた疾患に対して耐性のある植物をもたらす。Ｘａ２１遺伝子（斑点細菌病に対して耐性）を発現する植物が、Ｂｔ融合遺伝子およびキチナーゼ遺伝子（イッテンオオメイガに対して耐性かつ鞘翅目に対して耐性）の両方を発現する植物と共に操作されている。
別の例示的な改変は、雄性不稔性などの生殖能力の変更をもたらす。
別の例示的な改変は、非生物的ストレス（例えば、乾燥、温度、塩分）に対して耐性のある植物をもたらし、耐性トランスジェニック植物はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（シロイヌナズナ）に由来するアシルグリセロールリン酸塩酵素を導入することによって作り出され、マンニトールおよびソルビトールの合成に関与するマンニトール脱水素酵素およびソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子は、乾燥への耐性を改善する。
別の例示的な改変は、１つ以上の内在性グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β（１，２）－キシロシルトランスフェラーゼ、およびａ（１，３）－フコシルトランスフェラーゼ）の活性が調節される植物をもたらす（ＷＯ／２０１１／１１７２４９を参照）。
別の例示的な改変は、乾燥処理中に形成されるノルニコチンおよびノルニコチンの代謝産物のレベルが調節できるように、１つ以上のニコチンＮ－デメチラーゼの活性が調節される植物体をもたらす（ＷＯ２０１５１６９９２７を参照）。
他の例示的な改変は、ポリペプチドおよび油の貯蔵能力が改善された植物、光合成効率が高められた植物、貯蔵寿命が延長された植物、炭水化物含有量が増加した植物、および真菌類に対して耐性のある植物をもたらすことができる。また、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）および／またはシスタチオニンガンマ合成酵素（ＣＧＳ）の発現が調節されたトランスジェニック植物も企図される。
ニコチン合成経路に関与する１つ以上の遺伝子を改変して、乾燥処理された場合にニコチンのレベルが調節される植物または植物の部分をもたらすことができる。ニコチン合成遺伝子は、Ａ６２２、ＢＢＬａ、ＢＢＬｂ、ＪＲＥ５Ｌ１、ＪＲＥ５Ｌ２、ＭＡＴＥ１、ＭＡＴＥ２、ＭＰＯ１、ＭＰＯ２、ＭＹＣ２ａ、ＭＹＣ２ｂ、ＮＢＢ１、ｎｉｃ１、ｎｉｃ２、ＮＵＰ１、ＮＵＰ２、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、ＰＭＴ４、およびＱＰＴ、またはそれらの１つ以上の組み合わせからなる群から選択することができる。
１つ以上のアルカロイドの量の制御に関与する１つ以上の遺伝子を改変して、調節されたレベルのアルカロイドを生成する植物または植物の部分をもたらすことができる。アルカロイドレベル制御遺伝子は、ＢＢＬａ、ＢＢＬｂ、ＪＲＥ５Ｌ１、ＪＲＥ５Ｌ２、ＭＡＴＥ１、ＭＡＴＥ２，ＭＹＣ２ａ、ＭＹＣ２ｂ、ｎｉｃ１、ｎｉｃ２、ＮＵＰ１、およびＮＵＰ２、またはそれらうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択することができる。
１つ以上のこのような形質は、別の栽培品種から突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物に遺伝子移入され得るか、またはそれに直接形質転換され得る。
様々な実施形態が、突然変異型植物、非天然型植物、またはトランスジェニック植物、ならびに本開示にしたがって１つ以上のポリヌクレオチドの発現レベルを調節することによってそれによりコードされるポリペプチド（複数可）のレベルを調節するバイオマスを提供する。
本明細書に説明される植物の部分、特にそのような植物の葉身および中央脈は、様々な消費可能製品に組み込むか、またはそれらの製造に使用することができ、エアロゾル形成材料、エアロゾル形成デバイス、喫煙物品、喫煙可能物品、無煙製品、医療もしくは化粧品、静脈内投与製剤、錠剤、散剤、およびタバコ製品が挙げられるが、これらに限定されない。エアロゾル形成材料の例としては、タバコ組成物、タバコ、タバコ抽出物、刻みタバコ、刻みフィラー、乾燥処理タバコ、膨化タバコ、均質化タバコ、再構成タバコ、およびパイプタバコが挙げられる。喫煙物品および喫煙可能物品は、エアロゾル形成デバイスの種類である。喫煙物品または喫煙可能物品の例としては、紙巻タバコ、シガリロ、および葉巻タバコが挙げられる。無煙製品の例には、噛みタバコ、および嗅ぎタバコが含まれる。特定のエアロゾル形成デバイスでは、燃焼ではなく、タバコ組成物または別のエアロゾル形成材料が、１つ以上の電気発熱体によって加熱されて、エアロゾルを生成する。別の種類の加熱式エアロゾル形成デバイスでは、エアロゾルは、可燃性燃料要素または熱源からの熱を、熱源の内部、周囲、または下流に位置し得る物理的に分離されたエアロゾル形成材料に伝達させることによって生成される。無煙タバコ製品および様々なタバコ含有エアロゾル形成材料は、乾燥粒子、断片、顆粒、粉末、またはスラリーのほか、薄片、フィルム、タブ、発泡体、またはビーズなど任意の形式の他の成分への蒸着、それへの混合、それによる包囲、あるいはそれとの組み合わせを含めた、任意の形態のタバコを含有し得る。本明細書で使用される場合、「煙」という用語は、紙巻タバコなどの喫煙物品によって、またはエアロゾル形成材料を燃焼することによって生成されるエアロゾルの種類を説明するために使用される。
一実施形態では、本明細書に説明される突然変異型、トランスジェニック、および非天然型植物に由来する乾燥処理された植物材料も提供される。タバコ生葉を乾燥処理するプロセスは当業者にとって既知であり、本明細書に説明されるような空気乾燥処理、火力乾燥処理、熱風送管乾燥処理、および日光乾燥処理が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、本明細書に説明される突然変異型タバコ植物、トランスジェニックタバコ植物、または非天然型タバコ植物に由来する植物材料（例えば、葉、好ましくは乾燥処理された葉）を含む、タバコ含有エアロゾル形成材料を含むタバコ製品が説明される。本明細書説明されるタバコ製品は、未改変タバコをさらに含み得る、ブレンドタバコ製品であり得る。
作物管理および農業のための製品および方法
突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物は、例えば、農業において、他の用途を有し得る。例えば、本明細書に説明される突然変異型、非天然型、またはトランスジェニック植物を使用して、動物用の飼料および人間用の食品を製造することができる。
本開示はまた、本明細書に説明される突然変異型植物、非天然型植物、またはトランスジェニック植物の栽培、および栽培植物からの種子の収集を含む、種子を生産するための方法も提供する。本明細書に説明される植物由来の種子を、当該技術分野において既知の手段によって調整し、包装材料内に袋詰めして、製造物品を形成することができる。紙および布などの包装材料は、当該技術分野で周知である。種子のパッケージは、標識、例えば、包装材料に固定されたタグまたは標識、その中に入っている種子の性質を説明するパッケージに印刷された標識などを有することができる。
識別、選択、または育種のために植物の遺伝子型判別をするための組成物、方法、およびキットは、ポリヌクレオチドの試料中のポリヌクレオチド（または本明細書に説明されるようなその任意の組み合わせ）の存在を検出する手段を含むことができる。したがって、組成物は、増幅または検出を行うための、１つ以上のポリヌクレオチド、および任意に１つ以上のプローブ、および任意に１つ以上の試薬の少なくとも一部分を特異的に増幅するための１つ以上のプライマーを含むものとして説明される。
したがって、本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）に対応する約１０個以上の連続ポリヌクレオチドを含む、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが開示される。該プライマーまたはプローブは、本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）にハイブリッド形成する（例えば、特異的にハイブリッド形成する）約１５、２０、２５、３０、４０、４５、または５０個以上の連続ポリヌクレオチドを含み得るか、またはそれらからなり得る。いくつかの実施形態では、プライマーまたはプローブは、遺伝子識別（例えば、サザンハイブリッド形成）または単離（例えば、細菌性コロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリッド形成）、または遺伝子検出（例えば、増幅または検出における１つ以上の増幅プライマーとして）の配列依存性方法において使用し得る、約１０～５０個の連続ヌクレオチド、約１０～４０個の連続ヌクレオチド、約１０～３０個の連続ヌクレオチド、または約１５～３０個の連続ヌクレオチドを含み得るか、またはそれらからなり得る。１つ以上の特異的なプライマーまたはプローブを設計して、一部またはすべてのポリヌクレオチド（複数可）を増幅または検出するために使用することができる。特定の例として、２つのプライマーをＰＣＲプロトコルにおいて使用して、ポリヌクレオチド断片を増幅してもよい。また、ＰＣＲは、ポリヌクレオチド配列に由来する１つのプライマーと、ポリヌクレオチド配列の上流または下流の配列（例えば、プロモーター配列、ｍＲＮＡ前駆体の３’端またはベクターに由来する配列）にハイブリッド形成する第２のプライマーとを使用しても実施し得る。ポリヌクレオチドの生体外増幅に有用な温度および等温技法の例は、当該技術分野で周知である。試料は、植物、植物細胞、または植物材料、あるいは本明細書に説明されるような植物、植物細胞、もしくは植物材料から製造されたか、またはそれらに由来するタバコ製品であり得るか、それらに由来し得る。
さらなる態様では、試料中の本明細書に説明されるポリヌクレオチド（複数可）（または本明細書に説明されるようなその任意の組み合わせ）を検出する方法も提供されており、その方法は、（ａ）ポリヌクレオチドを含むか、またはそれを含むとみられている試料を提供する工程、（ｂ）ポリヌクレオチド（複数可）の少なくとも一部分を特異的に検出するために、試料を１つ以上のプライマーまたは１つ以上のプローブと接触させる工程、（ｃ）増幅産物の存在を検出する工程を含み、ここで、増幅産物の存在は、試料中のポリヌクレオチド（複数可）の存在を示すものである。さらなる態様では、ポリヌクレオチド（複数可）の少なくとも一部分を特異的に検出するための１つ以上のプライマーまたはプローブの使用も提供される。ポリヌクレオチド（複数可）の少なくとも一部分を検出するためのキットも提供され、これは、ポリヌクレオチド（複数可）の少なくとも一部分を特異的に検出するための１つ以上のプライマーまたはプローブを含む。キットは、ポリヌクレオチド増幅（例えば、ＰＣＲ）のための試薬、またはプローブハイブリッド形成検出技術（例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリッド形成、またはマイクロアレイ）のための試薬を含み得る。キットは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＬＤＩ質量分析法、または試験片などの抗体結合検出技術のための試薬を含み得る。キットは、ＤＮＡ配列決定のための試薬を含み得る。キットは、試薬およびキットを使用するための説明書を含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の説明される方法についての説明書を含み得る。説明されるキットは、遺伝的同一性の決定、系統学的研究、遺伝子型判別、ハプロタイプ、系図分析、または植物育種に関して、特に共優性評価で有用であり得る。
本開示は、本明細書に説明されるポリヌクレオチドを含む植物、植物細胞、または植物材料の遺伝子型判別の方法も提供する。遺伝子型判別は、染色体対の相同体を区別する手段を提供し、植物の集団において分離個体を識別するために使用することができる。分子マーカー法は、系統学的研究、作物品種間の遺伝的関係の特徴付け、交雑種または体細胞ハイブリッドの識別、単一遺伝形質に影響を及ぼす染色体のセグメントの局所化、マップベースのクローン化、および定量的継承の研究のために使用することができる。遺伝子型判別の具体的な方法は、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）を含む、任意の数の分子マーカー分析技法を援用し得る。ＡＦＬＰは、ポリヌクレオチドの可変性に起因する増幅断片間の対立遺伝子の差異の産物である。したがって、本開示は、１つ以上の遺伝子またはポリヌクレオチド、ならびにこれらの遺伝子またはポリヌクレオチドに遺伝的に関連した染色体配列の分離を、ＡＦＬＰ分析などの技法を使用して追跡する手段をさらに提供する。
本発明は、本発明をさらに詳細に説明するために提供される、以下の実施例においてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を実施するために現時点で企図されている好ましい様式について記載しており、本発明を例証することを意図し、限定することを意図していない。
実施例１：バーレー種、バージニア種、およびオリエント種タバコ葉における乾燥処理後の主要アミノ酸上方制御遺伝子の特定
バーレー種、バージニア種、およびオリエント種タバコ葉の早期乾燥処理時間中の遊離アミノ酸変化に寄与する主要機能を特定するために、収穫時の成熟葉と比較した、４８時間の乾燥処理後の乾燥処理された葉における上方制御された遺伝子の関数についての過剰出現分析（ｌｏｇ２倍変化＞２、調整ｐ値＜０．０５）を、バーレー種、バージニア種、およびオリエント種タバコにおいて実施する。乾燥処理の種類およびタバコの品種とは無関係に、４８時間の乾燥処理後に活性である遊離アミノ酸の産生に関与する遺伝子を特定する。早期乾燥処理中にアスパラギン酸の産生に影響を与え、かつＡＡＴファミリーに属するタバコ遺伝子を調査する。
ＮｔＡＡＴポリヌクレオチドのフルセットをタバコゲノムにおいて特定し、それらはＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号５）、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号７）、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号１）、ＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号３）、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ（配列番号９）、ＮｔＡＡＴ３－Ｔ（配列番号１１）、ＮｔＡＡＴ４－Ｓ（配列番号１３）、およびＮｔＡＡＴ４－Ｔ（配列番号１５）であり、それらの推定ポリペプチド配列は、ＮｔＡＡＴ１－Ｓ（配列番号６）、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号８）、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号２）、ＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号４）、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ（配列番号１０）、ＮｔＡＡＴ３－Ｔ（配列番号１２）、ＮｔＡＡＴ４－Ｓ（配列番号１４）、およびＮｔＡＡＴ４－Ｔ（配列番号１６）である。
遺伝子発現分析は、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ（配列番号１）およびＮｔＡＡＴ２－Ｔ（配列番号３）が、バーレー種、バージニア種、およびオリエント種タバコにおいて、生葉と比較して、４８時間の乾燥処理後に最も発現した遺伝子（１１倍超）であることを示している（表１参照）。興味深いことに、ＮｔＡＡＴ１－Ｔ（配列番号７）は、４８時間の乾燥処理後にも上方制御されているが、その程度は低い（２．５超）。ＮｔＡＡＴ２－ＳおよびＮｔＡＡＴ２－Ｔのみが成熟葉においてすでに上方調節されており、これらの遺伝子がアスパラギン合成のためのアスパラギン酸を提供する主要な駆動体であることを示唆している。
ＮｔＡＡＴ２－ＳおよびＮｔＡＡＴ２－Ｔ遺伝子は、クロロフィルが分解された場合、葉の早期乾燥処理中に高度に発現するだけでなく、花弁においても発現する（表２参照）。それらの発現は、根および葉（表２を参照）ならびに他の組織において非常に低く、ＮｔＡＡＴ２－ＳおよびＮｔＡＡＴ２－Ｔの機能が、非クロロフィルの地上器官における局在化に連結していることを示唆している。同じ観察がＮｔＡＡＴ１－ＳおよびＮｔＡＡＴ１－Ｔにも有効であると思われるが、ただし程度は低い。したがって、出願者は、ＮｔＡＡＴ１－ＳおよびＮｔＡＡＴ１－Ｔも乾燥処理された葉におけるアスパラギン酸合成に寄与することを除外できない。反対に、ＮｔＡＡＴ３－Ｓ／ＮｔＡＡＴ３－ＴおよびＮｔＡＡＴ４－Ｓ／ＮｔＡＡＴ４－Ｔは、すべての植物組織においてより構成的に発現しているように思われる（表２を参照）。
同時発現分析により、ＮｔＡＡＴ２－Ｓ、ＮｔＡＡＴ２－Ｔ、ＮｔＡＳＮ１－Ｓ、およびＮｔＡＳＮ１－Ｔが、早期乾燥処理段階中に同時調節されることを確証した。これについて、３４個の乾燥処理されていないおよび早期乾燥処理されたバーレー種の試料からなるバーレー種乾燥処理トランスクリプトームデータベースを使用した。ＮｔＡＳＮ１－ＳおよびＮｔＡＳＮ１－Ｔでは１６８個の遺伝子が、ならびにＮｔＡＡＴ２－ＳおよびＮｔＡＡＴ２－Ｔでは１２個の遺伝子が同時発現されることを見出した（閾値＞０．９）。このトランスクリプトームの組の中で、ＮｔＡＡＴ２－ＳおよびＮｔＡＡＴ２－ＴならびにＮｔＡＳＮ１－ＳおよびＮｔＡＳＮ１－Ｔ転写物の両方が、他の５つの転写物に関連したＲＮＡ配列（共通の９つの配列）の２組において存在する。そのような乾燥処理中のタイムコース実験に関連した同時発現（図２を参照）ならびに花弁および早期乾燥処理された葉の同時発現（表２およびＷＯ２０１７／０４２１６２を参照）は、ＮｔＡＡＴ２－ＳおよびＮｔＡＡＴ２－ＴならびにＮｔＡＳＮ１－ＳおよびＮｔＡＳＮ１－Ｔの両方が、協調した様式でアミノ酸およびアスパラギンへの硝酸同化に寄与することを示唆する。
バーレー種タバコ植物におけるＮｔＡＡＴ２－ＳおよびＮｔＡＡＴ２－Ｔのサイレンシングを調査して、両方の遺伝子が乾燥処理されたバーレー種の葉においてアスパラギン酸の減少に寄与するかどうかを判断する。ＮｔＡＡＴ２－ＳおよびＮｔＡＡＴ２－Ｔの両方のコード配列内の特定のＤＮＡ断片（配列番号１７）を、ゲートウェイベクター中の強力な構成的ミラビリスモザイクウイルス（ＭＭＶ）プロモーターでクローン化する。ＮｔＡＡＴ２－ＳおよびＮｔＡＡＴ２－Ｔ遺伝子断片は、ＭＭＶとＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリン合成酵素遺伝子の３’ｎｏｓ末端配列との間に隣接している。バーレー種タバコ系統ＴＮ９０ｅ４ｅ５ｅ１０（Ｚｙｖｅｒｔ）を、標準的なアグロバクテリウム媒介形質転換プロトコルを使用して形質転換する。ＴＮ９０ｅ４ｅ５ｅ１０（Ｚｙｖｅｒｔ）は、ＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２、およびＣＹＰ８２Ｅ１０においてノックアウト変異を含有するエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）突然変異誘発型バーレー種の集団からの選択を表し（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１０）７１：１７－１８を参照）、ノルニコチン産生を抑制する。このようなバックグラウンド系統を使用することにより、今後得られるＴＳＮＡデータを解釈する際に、潜在的な混乱を回避することができる。
低アスパラギン酸植物の選択を可能にするために、１６個の独立したＴ０植物葉（Ｅ３２４）および４個のそれぞれの対照系統（ＣＴＥ３２４）を６０時間の乾燥処理後に分析し、対照としてのニコチン（図３参照）、およびアスパラギン酸（図４参照）に対する影響を決定する。Ｔ０植物葉（Ｅ３２４）と対照系統（ＣＴＥ３２４）との間にニコチン含有量の有意な差異はない。最も低いレベルのアスパラギン酸を提示する最良のＴ０系統は、３、８、１３、１６、１７、および２０であり、これらにおけるアスパラギン酸の量は非常に低いレベル（７５ｕｇ／ｇ）で検出されるか、または検出不能であるかのいずれかである。種子を、最も低いレベルのアスパラギン酸を提示するこれらの最良のＴ０系統から収穫する。Ｔ１子孫をｑＰＣＲによってアッセイし、アスパラギン酸含有量およびアスパラギン含有量の両方に関連したＮｔＡＡＴ２－ＳおよびＮｔＡＡＴ２－Ｔのサイレンシング事象の効果を決定する。
アスパラギン酸は、アスパラギン、スレオニン、イソロイシン、システイン、およびメチオニンなどの他のアミノ酸の合成のための主要経路にあるため、ＮｔＡＡＴ遺伝子を（例えば、構成的プロモーターまたは特定の老化プロモーター（例えば、ＳＡＧ１２またはＥ４）のいずれかを用いて）操作することによって、乾燥処理されたタバコ葉の化学的性質を変化させ得る。同様に、遺伝子編集戦略（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓまたは突然変異体選択）を使用するノックアウトＮｔＡＡＴ遺伝子は、アミノ酸葉の化学的性質、ならびに商業用タバコの主要品種の煙およびエアロゾルの化学的性質を変化させ得る。
本明細書に引用または記載されるあらゆる刊行物は、本出願の出願日以前に開示された関連情報を提供する。本明細書における記述は、本発明者らがそのような開示に先だって権利を与えられないことの承認としては解釈されないものとする。上記の明細書で言及したすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の様々な改変および変形が、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、当業者に明らかになるであろう。特定の好ましい実施形態に関連付けて本発明を説明してきたが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための記述された方法の様々な改変は、細胞生物学、分子生物学、および植物生物学、または関連分野の当業者には明らかであり、以下の特許請求の範囲の範囲内に収まるものであることが意図される。
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕植物細胞であって、
（ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチド、
（ｉｉ）（ｉ）に記載した前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号６もしくは配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性、配列番号２、もしくは配列番号１０、もしくは配列番号１２に対して少なくとも９３％の配列同一性、または配列番号４、もしくは配列番号１４、もしくは配列番号１６に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリペプチド、あるいは
（ｉｖ）（ｉ）に記載した前記単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクターを含み、
前記植物細胞が、前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドの発現または活性が改変されていない対照植物細胞と比較して、前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドの発現または活性を調節する少なくとも１つの改変を含む、植物細胞。
〔２〕前記植物細胞が、配列番号５、配列番号７、配列番号１、もしくは配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含み、好適には、前記植物細胞が、配列番号１もしくは配列番号３に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含むか、あるいは
前記植物細胞が、配列番号６もしくは配列番号８に対して少なくとも９５％の配列同一性、または配列番号２に対して少なくとも９３％の配列同一性、または配列番号４に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリペプチドを含み、好適には、前記植物細胞が、配列番号２に対して少なくとも９３％の配列同一性、または配列番号４に対して少なくとも９４％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリペプチドを含む、前記〔１〕に記載の植物細胞。
〔３〕前記少なくとも１つの改変が、前記植物細胞のゲノムの改変、または前記構築物、ベクター、もしくは発現ベクターの改変、またはトランスジェニック改変であり、好ましくは
前記植物細胞のゲノムの前記改変、または前記構築物、ベクター、もしくは発現ベクターの前記改変が、突然変異または編集である、前記〔１〕または〔２〕に記載の植物細胞。
〔４〕前記改変が、前記対照植物細胞と比較して、前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドの発現または活性を減少させ、好ましくは、
前記植物細胞が、前記〔１〕（ｉ）の前記ポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡの少なくとも１９ヌクレオチドに対して少なくとも８０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを含む、前記〔１〕～〔３〕のいずれか一項に記載の植物細胞。
〔５〕前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドの前記調節された発現または活性が、対照植物に由来する乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるアミノ酸のレベルと比較して、前記植物細胞に由来する乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるアミノ酸のレベルを調節し、好適には、前記アミノ酸がアスパラギン酸またはそれに由来する代謝産物であり、かつ／あるいは
前記植物細胞に由来する乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるニコチンのレベルが、対照植物細胞の乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるニコチンのレベルと実質的に同じであり、かつ／あるいは
前記植物細胞に由来する乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるアクリルアミドのレベルが、対照植物に由来する乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるアクリルアミドのレベルと比較して減少し、かつ／あるいは
前記植物細胞に由来する乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるアンモニアのレベルが、対照植物に由来する乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるアミノ酸のレベルと比較して減少する、前記〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の植物細胞。
〔６〕前記〔１〕～〔５〕のいずれか一項に記載の植物細胞を含む、植物またはその部分であって、好ましくは、
前記アスパラギン酸もしくはそれに由来する代謝産物および／またはアンモニアの量が、対照植物またはその部分と比較して、前記植物の少なくとも一部分において改変されている、植物またはその部分。
〔７〕前記〔６〕に記載の植物またはその部分に由来する植物材料、乾燥処理された植物材料、または均質化された植物材料であって、好ましくは、
前記乾燥処理された植物材料が、空気乾燥処理または日光乾燥処理または熱風送管乾燥処理された植物材料であり、好ましくは、
前記植物材料、乾燥処理された植物材料、または均質化された植物材料が、前記〔６〕に記載の植物またはその部分に由来するバイオマス、種子、茎、花、または葉を含む、植物材料、乾燥処理された植物材料、または均質化された植物材料。
〔８〕前記〔１〕～〔５〕のいずれか一項に記載の植物細胞、前記〔６〕に記載の植物の部分、または前記〔７〕に記載の植物材料を含む、タバコ製品。
〔９〕前記〔６〕に記載の植物を生成するための方法であって、
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドを含む植物細胞を提供する工程、
（ｂ）対照植物細胞と比較して、前記ポリヌクレオチドの発現を調節するために前記植物細胞を改変する工程、および
（ｃ）前記植物細胞を植物中に伝播させる工程を含む、方法。
〔１０〕工程（ｃ）が、前記植物細胞を含む挿し木または苗木から前記植物を栽培することを含み、かつ／あるいは
前記植物細胞を改変する前記工程が、ゲノム編集またはゲノム工学によって前記細胞のゲノムを改変することを含み、好ましくは、
前記ゲノム編集またはゲノム工学が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介突然変異誘発、化学的突然変異誘発または放射線突然変異誘発、相同組み換え、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、およびメガヌクレアーゼ媒介突然変異誘発から選択される、前記〔１６〕に記載の方法。
〔１１〕前記植物細胞を改変する前記工程が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、もしくは配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、構成的プロモーターに動作可能に連結されているポリヌクレオチドを含む構築物で前記細胞をトランスフェクトすることを含み、かつ／あるいは
前記植物細胞を改変する前記工程が、前記〔１〕（ｉ）のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡに対して少なくとも８０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを前記細胞へ導入することを含み、好ましくは、
前記植物細胞が、前記〔１〕（ｉ）のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡの少なくとも１９ヌクレオチドに対して少なくとも８０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを発現する構築物でトランスフェクトされる、前記〔９〕または前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕対照植物材料と比較して変更された量のアスパラギン酸もしくはそれに由来する代謝産物、または変更された量のアンモニアを含む、乾燥処理された植物材料を製造する方法であって、
（ａ）前記〔６〕に記載の植物もしくはその部分、または前記〔７〕に記載の植物材料を提供する工程、
（ｂ）任意に、前記植物材料をそこから収穫する工程、および
（ｃ）前記植物材料を乾燥処理する工程を含み、好ましくは、
前記植物材料が、乾燥処理された葉、乾燥処理された茎、もしくは乾燥処理された花、またはそれらの混合物を含み、かつ／あるいは
前記乾燥処理方法が、空気乾燥処理、火力乾燥処理、燻煙乾燥処理、および熱風送管乾燥処理からなる群から選択される、方法。
配列表
配列番号１：ＮｔＡＡＴ２－Ｓのヌクレオチド配列
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配列番号２：配列番号１に記載のＮｔＡＡＴ２－Ｓの推定ポリペプチド配列
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配列番号３：ＮｔＡＡＴ２－Ｔのヌクレオチド配列
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配列番号４：配列番号３に記載のＮｔＡＡＴ２－Ｔの推定ポリペプチド配列
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配列番号５：ＮｔＡＡＴ１－Ｓのヌクレオチド配列
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配列番号６：配列番号５に記載のＮｔＡＡＴ１－Ｓの推定ポリペプチド配列
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配列番号７：ＮｔＡＡＴ１－Ｔのヌクレオチド配列
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配列番号８：配列番号７に記載のＮｔＡＡＴ１－Ｔの推定ポリペプチド配列
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配列番号９：ＮｔＡＡＴ３－Ｓのヌクレオチド配列
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配列番号１０：配列番号９に記載のＮｔＡＡＴ３－Ｓの推定ポリペプチド配列
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配列番号１１：ＮｔＡＡＴ３－Ｔのヌクレオチド配列
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配列番号１２：配列番号１１に記載のＮｔＡＡＴ３－Ｔの推定ポリペプチド配列
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配列番号１３：ＮｔＡＡＴ４－Ｓのヌクレオチド配列
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配列番号１４：配列番号１３に記載のＮｔＡＡＴ４－Ｓの推定ポリペプチド配列
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配列番号１５：ＮｔＡＡＴ４－Ｔのヌクレオチド配列
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ｇａａｇａｔａｔａａａｇｇｔｔａｔｔａｔｃｔｔｃｃｔｃａｃｔｔｔｔｇｔａａｔｃｔｔｔｇｔｇｇｔｔｇａａａｔｔｇｔａａａｇｃａｇｃａｇｔｇａｇｃａｇｔｇｔｃｔｔｔｔｔｃｃｔｔｔｃｔｃｃａｃａａｇｔｃｃａｔｔｇａｔｇｇｔｇｃｃｔｔｔｇｃａｔｇｔｇｇｇａｃａｔｇｃｔｔｔｇａｃｔｔｔｃａｇｔｃｇｔｔｇａａｇｇａｇａｇａｔｇｃｇｔｔａｔｔｃａｔｔｃｔａｇｇａｔａｇｃａｔｔｇｔａｔｃｔｃｃｃａａａｔｇｃｔｔｔｔｔｃｔｇｔｔｔｃｃｔｇｃｔｃｔｔｃｃｔｔｃｃｃａｔｔｔｔｔｇｃａｔｃｇａｔｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇｃｔａａａｃａｔｇｇａｃａａｔｔｔｇｃｇｃｃｃｔｔｇｇｃａａａｔｇｇｃａａｔｇａｃｔｔｇｔｇｔｇｔｔｇｃｔｔｔｔｃｔｔｃｔｃｔｔｔｃｔａｔｔｔｔｔｔｇｇｔａｇｇａｇｔｇａｃｔｔｇｇｔｔｃｔｔｔｃａｇｔｇｔｇａｇｃａｇｔｃａｔａｔｔｔｃｔｇａａａａｔｇａａａａｔｃａｇａｇｇａａｃｔｔｇｇｔｇｃｔｃａｃａｃｔｔａｇａｇａａａｇｔｔｔｇｔｔａｔｇｔｔｔｔｇｇｇａｔｇｔｇａａａｇｇａａｔｔｇａｃａｇａａｃａａｇｔｔｔｇａｔａａｔａｔａｔｔｔｔｔｔｃｔｔｇｔｇａｇｇａｔｇｇａａｔａｔｇｃｔａａａａａｔａｇｇｃｔｇｃａｃｔｃｔｔｔｃｃｔｔｔｔａｇａｔｃｔｔｔａｇｔｔｃｃｔａｔｇｔｃｇｇｔｔｇｔｇａａｔｇｔｃｇａｔｔｔｃｔａｔｔｔｔｃａａｃａｔｔｔｔｃｔｃａｃｇａａｇａａａａｔａｇｇａｔｔａｔｃｃａｇｔａｃｔｇｇａｔｇｔｃｔｃｔｃｃｔａｔｇｔｃｔｇａｔａｔａｔｇｔｇｔａｔｇｔｇｃａｇｔｃｔｔｇｔｔｔｇｃｃｃｇｃｃｔｔｇｃｔｃｔｃｔｃｃｃｃａｃｇｔｃｔａａａａａｃａｇａｇｔｃｔｇａｔｇｇａａａａｇｇｃｔｔｔｔｔｃｃｔｔｃｃａｇｃｔｔｔｔｇｔｇｔａａｇｔｃａｔｔｇａｃａｔａｇｔｔｔａａｔｇａａａｃｔａｃｔｔｇｔｔｔａｔａｇｇｃｔｇｃｔｃｃｔｇａａｇｇａｔｃａｔｔｃａｔｃｔｔｇｃｔｃｃａｔｇｇｃｔｇｔｇｃａｃａｃａａｃｃｃａａｃｔｇｇｔａｔｔｇａｔｃｃｃａｃａａｔｔｇａａｃａａｔｇｇｇａａａａｇａｔｔｇｃｔｇａｔｇｔａａｔｔｃａｇｇａｇａａｇａａｃｃａｃａｔｔｃｃａｔｔｔｔｔｔｇａｔｇｔｔｇｃｃｔａｃｃａｇｇｔａａｔｃｔｇｔｇｃｔａａａｃｃｃａａｔｔａｔｔｔｔｃａｔｔｔｇｇｔｇａａｇｔｔｇｔａｇａａｔｔｃｃａａｇｔｔｔｃｔｔａｇａａｇｔｔｔｔｇａｔｇｇｃｔｇｔｇｔｇｔｇｃｇｔｇｔｇｔｇａａａａｇａａｔｇａａａｇａｔａｔａｇｇａｇａｔｇｇｔｔｔｃａａａａｔａｇｔｇａａａｇａｔｃｔｃｔｃｇｔａｔｔｔｃａｔｔｔｇｔｃｔｔｔｔｇｇｔｇｔｇｔｇｇａｇａｃｔａｔａｃａｔｔｇｔｔｇｔａｔｔｇａｔａｇａｔｇａｇｃｇａａｔｔｔｇａｔｔｇａｔｇｔｔｇｇｔｇｇｔｔａａｇｃｃａｃａｔｇｔｇｔｔａｃｔｔｔｇｔｃｃａｔａｔｔｔｔｔｔｔａｃａｃｃｇｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔｔａｔｃａａｔｇａａａｔｔｔａｃｔｇａｔｔｔｔｔｃａｇｔｇａａａｔｔａｔｔａｇａａｃａａｇａｔｃａｔｃｔｇａａｇｔｃａｔｔｔｃｔｇｔｔｃａｇａｇａａｔｔｇｇａｔｔｇａａｔａｇｃｔｇｔａｔａｃｔａｔａａｔａａｔｃｇａｇａｔｇｃｃｔｃａｔｃｔｇｔｃｔａｃａｃｇｃｔｇｃａｃｔｇｃａｇｇｇａｔｔｃｇｃａａｇｃｇｇｃａｇｃｃｔｔｇａｔｇａａｇａｔｇｃｃｔｃａｔｃｔｇｔｇａｇａｔｔｇｔｔｔｇｃｔｇｃａｃｇｔｇｇｃａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｇｇｔｔｇｃｔｃａａｔｃａｔａｔａｇｔａａａａａｔｃｔｇｇｇｔｃｔｇｔａｔｇｇａｇａａａｇｇａｔｔｇｇａｇｃｔａｔｔａａｔｇｔｔｃｔｔｔｇｃｔｃａｔｃｔｇｃｔｇａｔｇｃａｇｃｇａｃａａｇｇｔａｃａａｃｇｇｃｃａｇｃａｃｔａａｔａａｔｃｔａｃａｔａｔｔｔｃｔｃｃｔｃｔｇｔａｔｔｇｇｔａａａａｔｇａｔｇｔｔｇｃａｃｔｇａａｇａｔｔｔｔｇｇｔｔａａｔｇｔａｔｇａｔｇｃｃａｔｔｔａｔｔｔａｔｇｔｔａｔｇｃａｔｇｔｇｃａｇｔｔｃｔｔｔｃｃｇｔｇｔａｔｇａｔｔｔｇｔｔａｔａｃａａｔａｔａｇｃａａｇａｔｇａｇａｔｇｃｔｔｔａａｔｃｔｃｃｔｔｔｇｇａｔｔｔｔａｔｇｔｇｇｔｔｇａａｃｃａａｔａｔａａｃｔｔｔｔｃｔｔｃｔｇｔｔａａｔｇｇａｔｇｃａｔａｔｃｔａｃｔａａｃｔｔａｃａｇｇｇｔｇａａａａｇｃｃａｇｃｔａａａａａｇｇｃｔｔｇｃｔｃｇａｃｃａａｔｇｔａｃｔｃａａａｔｃｃｃｃｃｃａｔｔｃａｃｇｇｔｇｃｔａｇａａｔｔｇｔｔｇｃｃａａｔｇｔｃｇｔｔｇｇａａｔｔｃｃｔｇａｇｔｔｃｔｔｔｇａｔｇａａｔｇｇａａａｃａａｇａｇａｔｇｇａａａｔｇａｔｇｇｃａｇｇａａｇｇａｔａａａｇａｇｔｇｔｇａｇａｃａｇａａｇｃｔａｔａｔｇａｔａｇｃｃｔｃｔｃｃｇｃｃａａｇｇａｔａａａａｇｔｇｇａａａｇｇａｃｔｇｇｔｃａｔａｃａｔｔｃｔｇａａｇｃａｇａｔｔｇｇａａｔｇｔｔｃｔｃｃｔｔｃａｃａｇｇｃｃｔｃａａｃａａａｇｃｔｃａｇｇｔａａａａｃｃｃｃｇｔｇａａｔｔａａｇｔｔａｔｔｇｃｔｇｔｔｇｃｇｇａａｇｃｃａａａｔａｔａｔａｇａｇａｇｔｇａｔｔａａａｔｃａｃａａｃｔａｃｔａｔａｔｃｔａａａｇｇｔａｇｃｔａｎｇｔａａａｔｇａｇａｃａａｔａａｔａａａａｔｇａａｃａｃｃａｇａａａｔｔａａｔｇａｇｇｔｔｃｇｇｃａａａａｔｔｔｇａｔｔｔｔｔｔｇｃｃｔａｇｔｔｃｔｃｇｇａｃａｃａａｔｃａａｃｔｃａａａｔｔｔａｔｔｔｃａｃｔｃｃａａａａａｔａｃａａａｔｇａａａｔａｃｔａｃａａｇａｇａｇａａａｇａａｇａｔｔｃａａａｔｇｃｃｔｔａｇｇａａａｔａａｇａａｇｇｃａａｇｔｇａｇａｇａｔｇｔｔｔａｃａａａｔｇａａｃａａａａｔｃｃｔｔｇｃｔａｔｔｔａｔａｇａａｇａｇａａａｔｇｇｃｃｔｔａａｔａａｔｇｔｃａｔｇｃａｔｇａｃａｔｃａｔａｔｔａａｇｔｇｔｇａａｃａｔｇｔａａｔｇｔａａａｔｇｃａｃｇａａａａａｔｇｃａｔｃｔａｃｃａａｔｔｔｃｔｔａａｇｇｃｔｔｃａａａｔｇｔｔｃａｃａｃｔａｇｔｔｃａｃａｔｔａａｔｃｔｔｇｔｃａａａａｔｔｃａａｃａａｔｔｇｃｔｇｃａｔｃａｃａａｔａｔｇｃｔｔａａａｔｔｃａａｔｔｔｇａｔｔｔｇｇｔｔｇａｃａａｃｔｔｔｃｔａｇｃｔｔｔｇａｔｃａｔｔｃａｔｃａｃａａａｇｃｇｃａｔｔｃｔｔｃａｃｔｃａｇｃａｃｇｔａｔｔｔｔｔａｔｔａａｇａｃａｔｔｃｔｔｔｃｃｔｔｃｃａｔｔｃｔｇａｃｃｇａｔｔｔｃａｔａａｇｔｔａａａｔａｔｇｃａａａａｇａｔａｇｔｇｃａｇｔｇａｇａｇｔｃｔｃｃｔｔａｃｔｇｇａｔｔａｔａａｃｔａｔｇｇａｃｔａａａｇｔｔａａａｔｇｃａｔａｃａｔｔｔｃｔｔｔｃｃｃｔｇｔａｃｔｔｇｃａｃｔｔｃｔｃｇｔｇｃｔｃａｔａｔｔｔｇａｔａｔｃｔｃｔｔｃｔｔｇｇｃｔａｃａｃａｇａｇｃｇａｇａａｃａｔｇａｃｃａａｃａａｇｔｇｇｃａｔｇｔｇｔａｃａｔｇａｃａａａａｇａｃｇｇｇａｇｇａｔａｔｃｇｔｔｇｇｃｔｇｇａｔｔａｔｃｔｇｃｔｇｃｃａａａｔｇｔｇａａｔａｔｃｔｔｇｃａｇａｔｇｃｃａｔａａｔｔｇａｃｔｃａｔａｃｔａｃａａｔｇｔｃａｇｃｔａａ
配列番号１６：配列番号１５に記載のＮｔＡＡＴ４－Ｔの推定ポリペプチド配列
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配列番号１７：ＡＡＴ２Ｓ／Ｔ ＲＮＡｉ植物を生成するために使用されるヌクレオチド配列
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Claims (11)

  1. 乾燥処理されたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）植物材料であって、
    （ｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなるポリヌクレオチド及び配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなるポリヌクレオチド、あるいは
    （ｉｉ）（ｉ）に記載した前記ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクター、または発現ベクター
    を含み、
    前記乾燥処理された植物材料が、前記ポリヌクレオチドの発現が減少されていない対照の乾燥処理された植物材料と比較して、前記ポリヌクレオチドの発現を減少させる少なくとも１つのＲＮＡｉによる改変を含み、
    減少した発現が、対照の乾燥処理された植物材料におけるアスパラギン酸のレベルと比較して、前記乾燥処理された植物材料におけるアスパラギン酸のレベルを減少させる、乾燥処理された植物材料。
  2. 前記乾燥処理された植物材料が、請求項１（ｉ）の前記ポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡの少なくとも１９ヌクレオチドに対して少なくとも９０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の乾燥処理された植物材料。
  3. 乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるニコチンのレベルが、対照植物の乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるニコチンのレベルと同じであり、かつ／あるいは
    乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるアクリルアミドのレベルが、対照植物に由来する乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるアクリルアミドのレベルと比較して減少し、かつ／あるいは
    乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるアンモニアのレベルが、対照植物に由来する乾燥処理されたまたは乾燥された葉におけるアンモニアのレベルと比較して減少する、
    請求項１または２に記載の乾燥処理された植物材料。
  4. 前記乾燥処理された植物材料が、空気乾燥処理または日光乾燥処理または熱風送管乾燥処理された植物材料である、請求項１～３のいずれか一項に記載の乾燥処理された植物材料。
  5. 前記乾燥処理された植物材料が、バイオマス、種子、茎、花、または葉を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の乾燥処理された植物材料。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の乾燥処理された植物材料を含む、タバコ製品。
  7. 請求項１～５のいずれか一項に記載の乾燥処理された植物材料を生成するための方法であって、
    （ａ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなるポリヌクレオチド及び配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなるポリヌクレオチドを含む植物細胞を提供する工程、
    （ｂ）対照植物細胞と比較して、前記ポリヌクレオチドの発現を減少させるために前記植物細胞をＲＮＡｉにより改変する工程、
    （ｃ）前記植物細胞を植物に再生させる工程、
    （ｄ）植物材料をそこから収穫する工程、および
    （ｅ）前記植物材料を乾燥処理する工程、
    を含む、方法。
  8. 前記植物細胞を改変する前記工程が、請求項１（ｉ）のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡに対して少なくとも９０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを前記細胞へ導入することを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記植物細胞が、請求項１（ｉ）のポリヌクレオチドから転写されたＲＮＡの少なくとも１９ヌクレオチドに対して少なくとも９０％相補的である配列を含む干渉ポリヌクレオチドを発現する構築物でトランスフェクトされる、請求項８に記載の方法。
  10. 前記植物材料が、葉、茎または花を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記乾燥処理の方法が、空気乾燥処理、火力乾燥処理、燻煙乾燥処理、および熱風送管乾燥処理からなる群から選択される、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
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