DE112008003225T5 - Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung derselben - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung verschiedener wirtschaftlich bedeutsamer ertragsbezogener Eigenschaften in Pflanzen. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen durch Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein PATL PATELLIN)-Polypeptid oder ein PRP38(Precursor RNA Processing-Faktor 38)-Polypeptid oder ein ADA2(Adaptor 2)-Polypeptid. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Erhöhung des Tausendkerngewichts, des Gesamtgewichts an Samen und/oder der Anzahl an gefüllten Samen, durch Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäuresequenz, die ein GATA-ähnliches Polypeptid codiert. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener, den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäuresequenz, die ein WD40-Repeat (WDR) 23-ähnliches Polypeptid codiert. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer ein PATL-Polypeptid oder ein RP38-Polypeptid oder ein ADA2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch bislang unbekannte PATL-Nukleinsäuren und -Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind. Die Erfindung stellt ebenfalls Konstrukte bereit, umfassend PRP38 codierende Nukleinsäuren oder ADA2 codierende Nukleinsäuren, die in der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GATA-ähnliches Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen verbesserte ertragsbezogene Eigenschaften und insbesondere erhöhten Samenertrag im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein WDR23-ähnliches Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Ferner betrifft die Erfindung spezifische Nukleinsäuresequenzen, codierend die zuvor erwähnten Polypeptide mit der zuvor erwähnten, den Pflanzenertrag erhöhenden Aktivität, Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Pflanzen, welche die Nukleinsäuresequenzen enthalten.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und beschäftigt sich mit einem Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften durch Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, welche ein PATL-Polypeptid (PATELLIN) oder ein PRP38-Polypeptid (Precursor RNA Processing-Faktor 38) oder ein GATA-ähnliches bzw. GATA-like-Polypeptid oder ein ADA2-Polypeptid (Transcriptional Adaptor 2) oder ein WDR23-ähnliches bzw. WDR23-like-Polypeptid codiert. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer modulierten Expression einer ein PATL-Polypeptid oder PRP38 oder einen GATA-like oder ein ADA2-Polypeptid oder einen WDR23-like codierenden Nukleinsäure, wobei die Pflanzen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt ebenfalls bislang unbekannte PATL- oder PRP38- oder GATA-like- oder ADA2- oder WDR23-like-Nukleinsäuren und -Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
  • In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung außerdem ein Verfahren zur Verbesserung von Pflanzenwachstums-Charakteristika durch Modulieren der Expression, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, welche ein GATA-like-Polypeptid codiert. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit modulierter Expression einer Nukleinsäure, die ein GATA-like-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen verbesserte Wachstumscharakteristika im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen oder anderen Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung stellt auch Konstrukte bereit, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener, den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften durch Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein ”WD40-Repeat (WDR) 23-like”-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein WDR23-like-Polypeptid codiert, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Ferner betrifft die Erfindung spezifische Nukleinsäuresequenzen codierend die zuvor erwähnten Polypeptide mit der zuvor erwähnten, den Pflanzenertrag erhöhenden Aktivität, Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Pflanzen, welche die Nukleinsäuresequenzen enthalten.
  • Die stetig anwachsende Weltbevölkerung und die schwindende Reserve an anbaufähigem Land, das für die Landwirtschaft zur Verfügung steht, treibt die Forschung hin zur Erhöhung der Effizienz der Landwirtschaft. Herkömmliche Methoden für Verbesserungen bei Nutzpflanzen und Gartenpflanzen wenden selektive Züchtungstechniken zum Identifizieren von Pflanzen mit wünschenwerten Merkmalen an. Allerdings weisen derartige selektive Züchtungstechniken mehrere Nachteile dahingehend auf, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, welche häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, welche nicht immer dazu führen können, dass die erwünschte Eigenschaft von Elternpflanzen weitergegeben wird. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben es der Menschheit erlaubt, das Keimplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die gentechnische Manipulation von Pflanzen beinhaltet die Isolierung und Manipulierung von genetischem Material (typischerweise in der Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einbringung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Diese Technologie weist das Vermögen auf, Nutzpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, landwirtschaftlichen oder gärtnerischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.
  • Eine Eigenschaft von besonderem wirtschaftlichen Interesse ist ein erhöhter Ertrag. Der Ertrag ist normalerweise als der messbare Gewinn von ökonomischem Wert aus einer Nutzpflanze definiert. Dies kann in Bezug auf die Quantitiät und/oder Qualität definiert sein. Der Ertrag ist direkt von mehreren Faktoren, wie zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (z. B. der Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blatt-Seneszenz und sonstigem, abhängig. Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und Früh-Wuchskraft können ebenfalls bedeutende Faktoren bei der Bestimmung des Ertrags sein. Das Optimieren der oben erwähnten Faktoren kann daher zu einer Erhöhung des Nutzpflanzenertrags beitragen.
  • Der Samenertrag ist ein besonders wichtiges Merkmal, da die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Nutzpflanzen, wie Mais, Reis, Weizen, Canola und Sojabohne machen über die Hälfte der gesamten menschlichen Kalorienaufnahme aus, ob durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch Verzehr von Fleischprodukten, welche auf Grundlage verarbeiteter Samen erzeugt wurden. Sie stellen ebenfalls eine Quelle für Zucker, öle und viele Arten von Metaboliten, die in industriellen Verfahren verwendet werden, dar. Samen enthalten einen Embryo (die Quelle von neuen Sprossen und Wurzeln) sowie ein Endosperm (die Quelle von Nährstoffen für das Embryowachstum während der Keimung und während des frühen Wachstums der Setzlinge). Die Entwicklung eines Samens beteiligt zahlreiche Gene und erfordert den Transfer von Metaboliten aus den Wurzeln, Blättern und Stengeln in den wachsenden Samen. Das Endosperm assimiliert im Besonderen die Stoffwechselvorläufer von Kohlehydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert sie zu Speichermakromolekülen, um das Korn auszufüllen.
  • Die Pflanzenbiomasse ist der Ertrag für Futterpflanzen, wie Alfalfa, Silomais und Heu. Bei Getreidepflanzen hat man zahlreiche Vertreter für den Ertrag verwendet. Am bedeutendsten unter diesen sind Schätzungen der Pflanzengröße. Die Pflanzengröße kann auf vielen Wegen gemessen werden, abhängig von der Spezies und der Entwicklungsstufe, beinhaltet jedoch das Gesamtpflanzen-Trockengewicht, das oberirdische Trockengewicht, das oberirdische Frischgewicht, die Blattfläche, das Stengelvolumen, die Pflanzenhöhe, den Rosettendurchmesser, die Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, die Triebzahl und die Blattzahl. Viele Spezies halten ein konservatives Verhältnis zwischen der Größe der verschiedenen Teile der Pflanze bei einer gegebenen Entwicklungsstufe ein. Diese allometrischen Beziehungen werden verwendet, um aus einem dieser Größenmaße auf ein anderes zu schließen (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Die Pflanzengröße bei einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann in der Regel mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze, und wird deshalb wahrscheinlich während derselben Zeitdauer ein größeres Gewicht gewinnen (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50:39). Dies kommt zusätzlich zu der potentiellen Fortdauer des mikroumgebungsbezogenen oder genetischen Vorteils hinzu, den die Pflanze hatte, um anfänglich die höhere Größe zu erreichen. Es existiert eine starke genetische Komponente hinsichtlich Pflanzengröße und Wachstumsrate (z. B. ter Steege et al., 2005, Plant Physiology 139: 1078), und daher besteht, für eine Auswahl an diversen Genotypen, wahrscheinlich eine Korrelation der Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung mit der Größe unter einer anderen (Hittalmani et al., 2003, Theoretical Applied Genetics 107: 679). Auf diese Weise wird eine Standardumgebung als Stellvertreter für die vielfältigen und dynamischen Umgebungen benutzt, welche von Nutzpflanzen auf dem Feld an unterschiedlichen Örtlichkeiten und Zeitpunkten angetroffen werden.
  • Eine andere bedeutende Eigenschaft für viele Nutzpflanzen ist die Früh-Wuchskraft. Die Verbesserung der Früh-Wuchskraft ist ein wichtiges Ziel bei modernen Reis-Züchtungsprogrammen sowohl in gemäßigten als auch tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind wichtig für eine korrekte Bodenverankerung bei in Wasser ausgesätem Reis. Falls Reis direkt in überflutete Ackerfelder ausgesät wird, und falls die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen müssen, stehen längere Sprosse bzw. Triebe mit der Wuchskraft in Zusammenhang. Wo eine Aussaat mit Drillvorrichtung praktiziert wird, sind längere Mesokotyle und Koleoptile für eine günstige Setzlingsemergenz bedeutsam. Die Fähigkeit, Früh-Wuchskraft künstlich in Pflanzen einzubringen, wäre für die Landwirtschaft von großer Bedeutung. Zum Beispiel war eine geringe Früh-Wuchskraft eine Einschränkung bei der Einführung von Mais (Zea Mais L.)-Hybriden auf Basis von ”Corn Belt”-Keimplasma im europäischen Atlantikraum.
  • Der Ernteindex, das Verhältnis von Samenertrag zu oberirdischem Trockengewicht, ist unter vielen Umweltbedingungen verhältnismäßig stabil, und somit kann häufig eine beständige Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag erhalten werden (z. B. Rebetzke et al., 2002, Crop Science 42: 739). Diese Prozesse sind intrinsisch verknüpft, weil die Mehrheit der Kornbiomasse von der aktuellen oder gespeicherten photosynthetischen Produktivität seitens der Blätter und des Stengels der Pflanze abhängig ist (Gardener et al., 1985, Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68–73). Deshalb ist das Selektieren hinsichtlich der Pflanzengröße sogar bei frühen Entwicklungsstadien, als ein Indikator für den zukünftigen potentiellen Ertrag verwendet worden (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric. Ecosys. & Environ. 105: 213). Beim Testen hinsichtlich der Auswirkung von genetischen Unterschieden auf die Stresstoleranz ist die Fähigkeit zur Standardisierung von Bodeneigenschaften, Temperatur, Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit sowie Lichtintensität ein spezifischer Vorteil von Gewächshaus- oder Pflanzenwachstumskammer-Umgebungen im Vergleich zu Feldbedingungen. Allerdings können künstliche Beschränkungen hinsichtlich des Ertrags aufgrund geringer Bestäubung wegen des Fehlens von Wind oder Insekten oder wegen ungenügendem Raum für die reife Wurzel oder das Laubkronenwachstum (canopy growth) die Anwendung dieser regulierten Umgebungen zum Testen von Ertragsunterschieden begrenzen. Deshalb sind Messungen der Pflanzengröße in der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus Standardpraktiken, um Hinweise auf potentielle genetische Ertragsvorteile bereitzustellen.
  • Ein anderes Merkmal von Bedeutung ist jenes der verbesserten Toleranz gegenüber abiotischem Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweiten Ernteverlust, wobei die Durchschnittserträge für die meisten wichtigen Nutzpflanzen um mehr als 50% reduziert werden (Wang et al. (2003) Plants 218: 1–14). Abiotische Stressformen können durch Dürre, Salzgehalt, Temperatur-Extreme, chemische Toxizität, Überschuss oder Mangel an Nährstoffen (Makroelemente und/oder Mikroelemente), Strahlung und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit zur Erhöhung der Pflanzentoleranz gegenüber abiotischem Stress wäre weltweit für Landwirte von großem wirtschaftlichen Vorteil und würde den Anbau von Nutzpflanzen während ungünstigen Bedingungen und in Territorien gestatten, auf welchen eine Kultivierung von Nutzpflanzen ansonsten nicht möglich sein könnte.
  • Der Nutzpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben erwähnten Faktoren erhöht werden.
  • Abhängig von der Endanwendung kann die Modifikation bestimmter Ertragseigenschaften gegenüber anderen bevorzugt sein. Beispielsweise kann für Anwendungen, wie Futtermittel- oder Holzproduktion, oder Biotreibstoff-Ressourcen, ein Zuwachs bei den vegetativen Teilen einer Pflanze wünschenswert sein, und für Anwendungen, wie Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann ein Zuwachs hinsichtlich der Samenparameter besonders erwünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können, abhängig vom Verwendungszweck, manche gegenüber anderen bevorzugt seien. Verschiedene Mechanismen können zur Erhöhung des Samenertrags beitragen, ungeachtet dessen, ob diese in Form einer erhöhten Samengröße oder einer erhöhten Samenzahl erfolgt.
  • Eine Vorgehensweise zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann durch Modifikation der inhärenten Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie etwa dem Zellzyklus oder verschiedenen Signalleitungswegen, die am Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind.
  • Es ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen gesteigert werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäure, die ein PATL-Polypeptid (Patellin) oder einen PRP38 (Precursor RNA Processing-Faktor 38) oder ein ADA2-Polypeptid (Transcriptional Adaptor 2) oder ein WD40-Repeat (WDR) 23-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze moduliert.
  • Es ist ferner festgestellt worden, dass verschiedene Wachstumsmerkmale in Pflanzen verbessert werden können, indem die Expression einer Nukleinsäure, die einen ”GATA-like” (Protein von Interesse) in einer Pflanze codiert, in einer Pflanze moduliert wird.
  • Die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhte Samen-Füllrate, erhöhte Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Ernteindex oder erhöhtes Tausendkerngewicht.
  • Lipide sind Substanzen, die in nicht-polaren Lösungsmitteln, wie Chloroform oder Ether, löslich sind. Lipide sind essentielle Komponenten in lebenden Organismen. Lipid, wie etwa Glykolipide, Phospholipide und Cholesterin, sind Schlüssel-Strukturkomponenten von Zellmembranen, und Triglyceride sind die biologischen Energiequellen-Moleküle. Phosphatidylinositid (PtdIns) und Phosphatidylcholin (PtdCho) sind Beispiele von Phospholipiden.
  • Wechselwirkungen zwischen Lipiden und Proteinen wirken bei der Ziellenkung bzw. dem Targeting von Proteinen und Glykolipiden, die an einer Vielzahl von Prozessen wie etwa der Zellsignalleitung und der Zellproliferation beteiligt sind, zu spezifischen Membran- und intrazellulären Örtlichkeiten. Verschiedene Proteine stehen mit der Biosynthese, dem Transport und der Aufnahme von Lipiden in Zusammenhang. Ferner weisen an der Signaltransduktion und dem Proteintargeting beteiligte Schlüsselproteine lipidabgeleitete Gruppen auf, die post-translational an dieselben hinzugefügt wurden (Stryer, L. (1995) Biochemistry, W. H. Freeman and Co., New York N. Y., S. 264–267, 934).
  • Phosphatidylinositol/Phosphatidylcholin-Transfer-Proteine (PIPTs) sind ubiquitäre Proteine, welche an der koordinierten Regulierung des PtdIns- und PtdCho-Metabolismus durch Erleichtern des Transfers zwischen den unterschiedlichen Membrankompartimenten von eukaryotischen Zellen beteiligt sind. In Hefe handelt es sich bei dem hauptsächlichen PIPT um das SEC14-Protein, welches für Sekretion aus dem Trans-Golgi-Netzwerk essentiell ist (Bankatis et al., 1989, J. Cell Biol. 108: 1271–81). Ähnliche Proteine sind in Pflanzen und anderen höheren Organismen gefunden worden. Es wurde beschrieben, dass mehrere SEC14-Homologe in Pflanzen ungefähr 25% Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit zum SEC14-Protein der Hefe S. cerevisiae aufweisen, und in einigen Fällen wurde die vermutete PtdIns/PtdCho-Transferfunktion experimentell durch Komplementation der temperaturempfindlichen Hefemutante sec14-1 bestätigt (Jouannic et al., 1998). Pflanzliche SEC14-Proteine spielen berichtetermaßen eine Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen, wie etwa der Cytokinese, dem Hyperosmose-Stress-induzierten Signalleitungsweg, dem Vesikel-Trafficking zwischen verschiedenen Membranen oder der Membranbiogenese während der Nodulation (Allen-Baume et al., 2002; FEBs Letters 531: 74–80; Peterman et al., 2004. Plant Phys. 136: 3080–3094; Monks et al., 2001, Plant Cell 13: 1205–19; Kapranov et al., 2001 Plant Cell 13: 1369–1382).
  • Es wurde berichtet, dass das Patellin1-Protein (PATL1), ein Mitglied der SEC14-Homolog-Proteinfamilie, in Arabidopsis thaliana während der Cytokinese an der Zellplatte lokalisiert ist, und gezeigtermaßen PtdIns bindende Aktivität besitzt. PATL1 ist ein Mitglied einer kleinen Familie von sechs Proteinen in Arabidopsis, welche durch das Vorhandensein von zwei konservierten Domänen gekennzeichnet sind, einer SEC14- und einer GOLD(Golgi dynamics)-Domäne.
  • Die SEC14-Domäne wird im SEC14-Protein von Hefe sowie in RhoGAPs, RhoGEFs und dem RasGAP Neurofibromin (NF1) gefunden. Sie wird ebenfalls gefunden im C-Terminus verschiedener Retinaldehyd/Retinal-bindender Proteine (CRAL-BP), welche funktionelle Komponenten des Sehzyklus sein können, sowie im Trio-Protein, einem multifunktionalen Faktor, welcher Signale integriert und verstärkt, die an der Aktin-Neumodellierung beteiligt sind. SEC14 wird manchmal als CRAL TRIO-Domäne bezeichnet. Die SEC14-Domäne ist an der Lipidbindung beteiligt (Sha und Luo, 1999, Biochim. Biophys. Acta. 1441: 268–77).
  • Die GOLD-Domäne ist ein Proteinmodul, welches in mehreren eukaryotischen Golgi- und Lipid-”Traffic-Proteinen” gefunden wird. Sie ist typischerweise zwischen 90 und 150 Aminosäuren lang. Der Großteil des in der GOLD-Domänen-Superfamilie beobachteten Größenunterschieds ist auf ein einziges großes Insert von geringer Komplexität zurückführbar, welches in einigen Versionen der Domäne beobachtet wird. GOLD-Domänen treten in Proteinen auf, welche mit Membranen Wechselwirken können oder welche eine Rolle in der Wechselwirkung verschiedener Proteine mit Cytoskelett-Filamenten spielen können, wie etwa die tierischen SEC14-Proteine oder das Oxysterol-Bindungsprotein-Homolog 3 (OSH3) von Hefe. Es wird vorhergesagt, dass die GOLD-Domäne verschiedenartige Protein-Protein-Wechselwirkungen vermittelt (Anantharaman et al., 2002. Genome Biol. 3).
  • Die Patentanmeldung WO 2004/090141 beschreibt ein partielles PATL-Protein, das an der Stresstoleranz beteiligt ist.
  • Die Synthese und Funktion von Botschafter-RNA (mRNA) in einer Zelle erfordert eine Reihe von Ereignissen, einschließlich Transkription, Prozessierung, Transport, Translation und Abbau. Als RNA-Prozessierung werden die Ereignisse bezeichnet, welche RNA posttranskriptionell modifizieren. In eukaryotischen Organismen enthält die Mehrheit der in Entstehung begriffenen Prä-mRNA Introns, welche herausgespleißt werden, was zur präzisen Ligation von Exons unter Erzeugung einer reifen mRNA führt, welche die RNA-Form ist, die von den Ribosomen zum Trarislatieren in ein Protein verwendet wird. Die posttranskriptionale Modifikation von RNAs beinhaltet ebenfalls das ”Capping” am 5'-Ende und die Polyadenylierung am 3'-Ende, welche die Stabilität und die Effizienz der Translation beeinflusst. Die Beziehung zwischen mRNA-Translation und -Umsatz ist kritisch für die Regulierung der Genexpression und das korrekte Funktionieren der Zelle. In eukaryotischen Organismen sind einige Dutzend Proteine am RNA-Metabolismus beteiligt. Ein Beispiel eines derartigen Proteins ist der Prä-mRNA-Splicing-Faktor PRP38.
  • Hefe-PRP38 wurde in einer genetischen Rasteruntersuchung von temperaturempfindlichen Mutanten von Saccharomyces cerevisiae, welche hinsichtlich Prä-mRNA-Splicing defekt sind, identifiziert (Blanton et al., 1992, Mol. Cel. Biol. 12, 3939–3947). Die Exzision von intervenierenden Sequenzen aus eukaryotischen Prä-mRNA-Transkripten findet im Zellkern auf einer großen komplexen Struktur statt, welche als das Spliceosom bezeichnet wird. Das Spliceosom steuert die Intronentfernung durch einen zweistufigen Mechanismus, umfassend (i) Spalten an der 5'-Spleißstelle und Ligation des 5'-terminalen Nukleotids des Introns an ein Adenosin nahe dem 3'-Ende auf dem Intron, und (ii) Spalten an der 3'-Spleißstelle und Exon-Ligation. Der Zusammenbau des Spliceosoms findet durch die sequenzielle Hinzufügung der U1-, U2, U4/U6- und U5-snRNPs (kleine ribonukleäre Proteine bzw. Small Ribonuclear Proteins U1–U6) statt. An einem späten Zeitpunkt im Zusammenbauvorgang dissoziiert das U4 aus dem Spliceosom. Die katalytischen Ereignisse des Splicings, welche zur Intronentfernung in Prä-mRNA-Molekülen führen, finden angenommenermaßen anschließend an die U4-Dissoziation statt. Gemäß Berichten, ist PRP38 in Hefe für den Spliceosom-Zusammenbau verzichtbar, aber es ist für Konformationsänderungen erforderlich, welche zur katalytischen Aktivierung des Spliceosoms führen (Xie et al. (1998) EMBO Journal, Band 17, S. 2938–2946).
  • In Arabidopsis thaliana wurde das PRP38-Protein (AtPRP38) als SRL1 (SR like 1) bezeichnet, und zwar gemäß seiner Sequenzähnlichkeit mit SR-Proteinen (Forment et al., Plant J. 2002 Jun; 30(5): 511–9). Allerdings ist PRP38 von anderen SR-Proteinen strukturell verschieden. Typischerweise umfassen SR-Proteine eine RRM-Domäne (RNA-Eindungs-Domäne) und eine RS-Domäne (Kalyna und Barta, Biochem. Soc Trans., 2004 32: 561–4.), wohingegen AtPRP38 die RS-Domäne umfasst, jedoch keine RRM-Domäne besitzt.
  • Die WO 01/81599 beschreibt Verfahren zum Verbessern der Stresstoleranz in Hefe und Pflanzen unter Verwendung von Nukleinsäuren, welche mehrere SR-Proteine codieren. SRL1 sowie andere Proteine, welche beim Prä-mRNA-Splicing wirken, spielen festgestelltermaßen eine bedeutende Rolle in Pflanzenantworten auf abiotische Stressformen (Lee et al., 2006, Plant Cell. Jul; 18(7): 1736–49).
  • Die GATA-Familie bildet eine der wichtigen Familien des Cys2/Cys2-Typ-Zinkfinger-Transkriptionsfaktors in Eukaryoten (angetroffen z. B. in zellulärem Schleimpilz, Pflanzen, Pilzen, Nematoden, Insekten, Stachelhäutern, Wirbeltieren) und enthält entweder 1 oder 2 hochkonservierte Zinkfinger-DNA-Eindungs-Domänen. Der DNA-bindende Konsensus ist CX2CX17-20CX2C und enthält das Zinkatom, welches von den konservierten 4 Cysteinen koordiniert wird (Omichinski et al., 1993; Reyes et al., 2004). Auf diese Domäne folgt in der Regel eine basische Region. Sie bindet charakteristischerweise DNA an der GATA-Erkennungssequenz (A/T)GATA(A/G) (Martin und Orkin, 1990; Omichinski et al., 2003). Tierische GATAs enthalten typischerweise 17 Reste zwischen dem zweiten und dritten Cystein, wohingegen dies bei Pilzen 17–18 (selten 19 oder 20) sein können. Pflanzen weisen 18 oder 20 Reste zwischen dem zweiten und dritten Cystein auf.
  • Das ursprüngliche GATA1 wurde als ein Transkriptionsfaktor identifiziert, der zur Förderung der Expression von Globingenen in Menschen benötigt wird (Pevny et al., 1991). Das erste pflanzliche GATA (NTL1) wurde aus Tabak als ein Pflanzenhomolog des Neurospora crassa-Transkriptionsfaktors NIT2 isoliert, einem Protein, welches die Expression der Gene für Stickstoffmetabolismus-Enzyme während stickstofflimitierenden Bedingungen aktiviert. NTL1 enthält 18 Abstandhalterreste bzw. ”Spacings” zwischen dem zweiten und dem dritten Cystein (CX2CX18CX2C) (Daniel-Vedele und Caboche, 1997). Die Genome von Arabidopsis thaliana und Oryza sativa weisen 29 bzw. 28 Genorte auf, welche für vermutliche GATA-Transkriptionsfaktoren (CX2CX18 oder 20CX2C) codieren (Reges et al., 2004): Arabidopsis weist nur Proteine mit einer GATA-Domäne auf, während Oryza sativa zwei Proteine mit zwei und ein Protein mit drei GATA-Domänen aufweist. Die Reis-Transkriptionsfaktoren-Datenbank (DRTF, Gao et al., Bioinformatics 2006, 22, 1286–1287) gibt 28 GATAs in Indica und 23 in Japonica an. Die GATA-Transkriptionsfaktor-Familie in Reis und Arabidopsis kann in 7 Subfamilien unterteilt werden, von denen einige in beiden Arten vertreten sind, aber andere ausschließlich bei einer von diesen vorkommen.
  • Eine ektopische Expression eines GATA-ähnlichen Proteins (HAN) unter der Steuerung des starken konstitutiven 35S-Promotors beeinflusste die Pflanzenlebensfähigkeit und -entwicklung ernsthaft (Zhao et al., Plant Cell 16, 2586–2600, 2004). Die transformierten Pflanzen waren zwergenwüchsig mit abnorm geformten Blättern und kleineren und fehlgebildeten Blütenständen. US 2007/0250956 offenbart OsGATA11 und dessen Verwendung zur Erhöhung des Samenertrags.
  • Die Regulierung der Transkription in Pflanzen unterliegt vielen biologischen Prozessen, wie etwa der Anpassung an die Umwelt und der Regulierung der metabolischen und physiologischen Gleichgewichte. Deshalb kann das Verändern von Gentranskription in einer Pflanze zu tiefgreifenden Modifikationen von Pflanzenwachstum und -entwicklung führen. Diese Eigenschaft kann verwendet werden, um die Leistung von Nutzpflanzen zu verbessern. Es gibt Hunderte von Genen, welche Genexpression regulieren, und nur von einigen wenigen von diesen hat man gezeigt, einen vorteilhaften Effekt auf Merkmale von Interesse für die landwirtschaftliche Industrie zu besitzen, wenn ihre Expression in der Pflanze moduliert wird (Vinocur und Altman, 2005, Current Opinion in Biotechnology 16, 123–132; Gutterson und Reuber 2004. Current Opinion in Plant Biology, 7, 465–471). Die Verfügbarkeit der Modulierung von Genexpression zur Steigerung von Ertragseigenschaften würde dazu beitragen, die Nutzpflanzenleistung zu verbessern, und letztendlich einen Vorteil für, auf Landwirtschaft basierende Industriezweige bringen.
  • In Eukaryoten ist Genexpression an Chromatinmodifikationen gekoppelt, welche dazu führen, dass Promotoren für RNA-Polymerase II und andere Komponenten des Transkriptionsapparates besser zugänglich werden. Zwei Hauptklassen von Proteinkomplexen beeinflussen die Chromatindynamik. Eine Klasse umfasst ATP-abhängige Chromatin-Neumodellierungs-Maschinen (SWI/SNF-verwandte Komplexe), und eine zweite Klasse umfasst Komplexe, welche Histonproteine modifizieren. Eine derartige Histonmodifikation, vermittelt von Histon-Acetyltransferasen (HATs), kann durch Acetylierung von spezifischen Lysinresten, welche im N-Terminus von Kernhistonen vorhanden sind, erfolgen (Narlikar et al., 2002, Cell 108, 475–487). Eine der prototypischen Histon-Acetyltransferasen, welche als ein Transkriptions-Coaktivator wirkt, ist als Gcn5 bekannt. In Hefe bildet Gcn5 spezielle Proteinkomplexe, welche bekanntermaßen verschiedene Adaptorproteine, wie ADA, SAGA, SALSA und SLIK [18–20], umfassen. In höheren Eukaryoten, einschließlich Pflanzen, sind homologe Komplexe identifiziert worden. In Arabidopsis thaliana wurden zwei paraloge Gene, welche ADA2-Proteine codieren, beschrieben (Stockinger et al., 2001, Nucleic Acid Research 29, 1524–1533).
  • Allgemeine Transkriptionsfaktoren rekrutieren RNA-Polymerase II zur TATA-Box von Promotoren, während Transkriptionsaktivatoren an spezifische DNA-Sequenzen binden, welche als die ”Upstream”-Aktivierungs-Stellen” (UAS) bezeichnet werden. Allgemeine Transkriptionsfaktoren können direkt mit dem Transkriptionsaktivator, oder über die Adaptor-Proteine, interagieren. Typischerweise interagieren Adaptorproteine mit dem Transkriptionsaktivator über die Aktivierungsdomäne, obwohl Interaktionen über die DNA-Eindungs-Domäne ebenfalls beschrieben worden sind (Mao et al., 2006. Biochimica et Biophysica Acta 1759 69–79).
  • Nach Berichten steigern ADA2-Proteine in Arabidopsis thaliana die Fähigkeit von GCN5, Histone in vitro zu acetylieren, und modulieren die Substratspezifität von GCN5. Darüber hinaus kann GCN5 die ADA2-Proteine an einem Motiv acetylieren, welches einzigartig für die pflanzlichen Homologen ist und bei pilzlichen und tierischen Homologen fehlt (Mao et al., 2006). Es wurde festgestellt, dass T-DNA-Insertionsmutationen in ADA2b und GCN5 pleiotrope Auswirkungen auf das Pflanzenwachstum und die Entwicklung besitzen, einschließlich Zwergengröße, fehlerhafte Wurzelentwicklung und kurze Blütenblätter und Staubblätter in den Blüten (Vlachonasios et al., 2003, The Plant Cell, Band 15, 626–638).
  • Gene, welche Transkriptions-Adaptorproteine codieren, die aus anderen Pflanzenspezies stammen, sind ebenfalls beschrieben worden ( WO 0003026 ).
  • Die Regulation vieler verschiedener zellulärer Prozesse erfordert die Verwendung von Proteinwechselwirkungsdomänen, um die Assoziation von Polypeptiden miteinander, sowie mit Phospholipiden, kleinen Molekülen oder Nukleinsäuren, zu lenken. Eine solche Protein-Wechselwirkungsdomäne wird als der WD-Repeat bezeichnet (siehe Übersichtsartikel, Smith et al. (1999) TIBS 24: 181–185). WD-Repeat enthaltende Proteine sind in den meisten Organismen in großem Ausmaß vertreten, wobei beispielsweise mehr als 300 in H. sapiens, mehr als 104 in C. elegans, mehr als 390 in A. thaliana und mehr als 90 in S. cerevisiae gezählt werden. Obwohl wegen der Gegenwart von WD-Repeats (zwischen 4 und 16 Kopien in einem Polypeptid) strukturell verwandt, besitzen diese Proteine sehr verschiedenartige Funktionen.
  • Der WD-Repeat ist auf der Ebene der Primärsequenz lose durch ein Gly-His(GH)-Dipeptid definiert, welches 10–20 Reste N-Terminal von einem Trp-Asp(WD)-Dipeptid liegt (lokalisiert am C-Terminus des Motivs), und ist typischerweise ungefähr 40 (jedoch bis zu 60) Reste lang (daher der Name ”WD40”). Allerdings ist weder das GH-Dipeptid noch das WD-Dipeptid absolut konserviert. Zwischen GH und WD befindet sich eine konservierte Kernsequenz, welche man mit Hilfe von Algorithmen identifizieren kann, die beispielsweise bei InterPro verfügbar sind, welches am European Bioinformatics Institute (EBI) in Großbritannien bereitgehalten wird. InterPro ist eine Datenbank von Proteinfamilien, Domänen und funktionellen Stellen, in welcher in bekannten Proteinen gefundene, identifizierbare Charakteristika auf unbekannte Proteinsequenzen angewandt, bzw. damit verglichen, werden können.
  • Es wird vorhergesagt, dass WD40-Proteine eine Beta-Propeller-artige Struktur (eine zirkulär wiederkehrende Struktur) ausbilden, welche drei potenzielle wechselwirkende Oberflächen enthält: die Spitze, den Boden und den Umfang. Dieser ausgedehnte Oberflächenbereich gestattet es einem WD40-Protein, mit mehreren Proteinen reversibel Komplexe auszubilden, wodurch sequenzielle und/oder gleichzeitige Wechselwirkungen koordiniert werden, an denen mehrere Sätze von Proteinen beteiligt sind.
  • Zu den sehr bedeutsamen Proteinkomplexen, welche WD40-Proteine beteiligen, zählt eine Klasse von Multiprotein-Ubiquitin-E3-Ligasen, bei denen Cullin 4 (CUL4) und ”damaged DNA”-bindendes Protein 1 (DDB1) die Kernproteine sind (Riga et al. (2007) Cell Division 2: 5; Angers et al. (2006) Nature 443: 590–593; Higa et al. (2006) Nature Cell Biol. 8(11): 1277–1283; He et al. (2006) Genes & Development 20: 2949–2954). Dieser Komplex dockt mit WD40-Proteinen als molekulare Adaptoren für einen Substrat-Rekrutierungsmechanismus, wobei das Substrat anschließend ubiquitinyliert und zerstört wird. Diese WD40-Proteine bilden eine Unterklasse, welche als DCAF bezeichnet wird (DDB1-CUL4A-assoziierter Faktor), und umfassen zwei konservierte DxR-Motive am Ende von zwei aufeinanderfolgenden WD40-Repeats (He et al. (2006), siehe oben).
  • Ein derartiges WD40-Protein, WDR23 (WD-Repeat 23; ebenfalls bezeichnet als DCAF11) weist eine signifikante Primärsequenzidentität zu einem in Pflanzen gefundenen WD40-Protein auf. Dieses WD40-Protein wurde zuerst in Lithospermum eythrorhizon als Klon bzw. ”clone” 14B identifiziert (LEC14B; NCBI-Zugangsnummer D83074).
  • In der Patentanmeldung WO 2002/016655 bezieht sich die SEQ ID NR: 2577 auf eine Arabidopsis thaliana-Nukleinsäuresequenz, die ein ”WDR23-like”- bzw. WDR23-ähnliches Polypeptid codiert, und es wird ein Verfahren zum Identifizieren eines Stresszustands, welchem eine Pflanzenzelle ausgesetzt worden ist, unter Verwendung von einer oder mehreren beliebigen von SEQ ID NR: 1 bis SEQ ID NR: 5379 beschrieben. In der U. S.-Patentanmeldung US 2004/034888 bezieht sich SEQ ID NR: 13 294 auf eine Arabidopsis thaliana-Nukleinsäuresequenz, die ein WDR23-ähnliches Polypeptid codiert, und es wird ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit einer verbesserten Eigenschaft beschrieben, wobei eine oder mehrere beliebige von SEQ ID NR: 1 bis SEQ ID NR: 36 564 verwendet werden.
  • Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein PRP38-Polypeptid codiert, Pflanzen ergibt, welche gesteigerte (oder verbesserte) ertragsbezogene Eigenschaften, insbesondere erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, aufweisen, auch bei Bedingungen, welche von osmotischem Stress, der durch Salz, Dürre, Kälte oder Frost hervorgerufen wurde, verschieden sind.
  • Ebenfalls überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung (vorzugsweise Erhöhung) der Expression einer Nukleinsäure, die ein GATA-like-Polypeptid codiert, Pflanzen mit signifikant erhöhtem Tausendkerngewicht (TKW) im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt, während andere Samenertragsparameter, wie die Anzahl an Samen (gefüllte Samen oder Gesamtzahl an Samen) nicht signifikant erhöht wurden.
  • Ferner wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, die ein ADA2-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Ertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
  • Außerdem ist nun überraschenderweise festgestellt worden, dass die Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein WDR23-like-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
  • Darüber hinaus wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, die ein PATL-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Ertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verbesserung (oder Steigerung) von ertragsbezogenen Eigenschaften in einer Planze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, die ein PATL-Polypeptid oder ein PRP38- oder ein ADA2-Polypeptid codiert, in einer Planze.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Erhöhung des Tausendkerngewichts (TKW) im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend die Modulierung (vorzugsweise Erhöhung) der Expression einer Nukleinsäure, welche ein GATA-like-Polypeptid codiert, in einer Planze.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Planzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein WDR23-like-Polypeptid codiert, wie hierin definiert, in einer Planze. Die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhte Samen-Füllrate, erhöhte Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Ernteindex oder erhöhtes Tausendkerngewicht.
  • Definitionen
  • Polypeptid(e)/Protein(e)
  • Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet und betreffen Aminosäuren in einer polymeren Form von beliebiger Länge, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
  • Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en) Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül” werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden, in einer polymeren unverzweigten Form von beliebiger Länge.
  • Kontrollpflanze(n)
  • Die Auswahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein routinemäßiger Teil eines experimentellen Ansatzes und kann entsprechende Wildtyp-Pflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das Gen von Interesse einschließen. Die Kontrollpflanze stammt typischerweise aus der gleichen Pflanzenart oder sogar aus der gleichen Varietät, wie die zu untersuchende Pflanze. Die Kontrollpflanze kann eine Nullizygote der zu untersuchenden Pflanze sein. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, einschließlich Samen und Samenteilen.
  • Homolog(e)
  • ”Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme, welche Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen im Vergleich zum betreffenden unmodifizierten Protein aufweisen und eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind, besitzen.
  • Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
  • Eine Insertion bezieht sich darauf, dass ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorherbestimmte Stelle in einem Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Intra-Sequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren umfassen. Im Allgemeinen werden Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Resten, sein. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG®-Epitop, IacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.
  • Eine Substitution bezieht sich auf die Ersetzung von Aminosäuren des Proteins mit anderen Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie etwa einer ähnlichen Hydrophobizität, Hydrophilizität, Antigenizität, Neigung zur Bildung oder Aufbrechung von α-helikalen Strukturen oder β-Blatt-Strukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise an Einzelresten vorhanden, aber können abhängig von den funktionellen Erfordernissen, welche dem Polypeptid auferlegt sind, gehäuft vorliegen; Insertionen werden üblicherweise in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten vorliegen. Die Aminosauresubstitutionen sind vorzugsweise konservative Aminosäuresubstitutionen. Tabellen hinsichtlich konservativer Substitution sind im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe z. B. Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) sowie die nachstehende Tabelle 1). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen
    Rest Konservative Substitutionen Rest Konservative Substitutionen
    Ala Ser Leu Ile; Val
    Arg Lys Lys Arg; Gln
    Asn Gln; His Met Leu; Ile
    Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr
    Gln Asn Ser Thr; Gly
    Cys Ser Thr Ser; Val
    Glu Asp Trp Tyr
    Gly Pro Tyr Trp; Phe
    His Asn; Gln Val Ile; Leu
    Ile Leu, Val
  • Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen können mit Hilfe von auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Peptidsynthesetechniken, wie etwa der Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, leicht ausgeführt werden. Verfahren für die Manipulierung von DNA-Sequenzen zur Erzeugung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel sind Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), Quick-Change-ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige ortsgerichtete Mutagenese-Protokolle ein.
  • Derivate
  • ”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche im Vergleich zur Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie dem Patellin, oder dem Precursor-RNA-Processing-Faktor 38 oder einem GATA-ähnlichen Polypeptid oder dem Adaptor 2 oder dem WDR23-ähnlichen Polypeptid, Substitutionen von Aminosäuren mit nicht-natürlichen vorkommenden Aminosäureresten, oder Additionen von nicht-natürlich vorkommenden Aminosäureresten, umfassen können. ”Derivate” eines Proteins beinhalten außerdem Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche natürlich vorkommende, veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristylierte, sulfatierte, etc.) oder nicht-natürlich veränderte Aminosäurereste, im Vergleich zur der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids, umfassen. Ein Derivat kann außerdem eine oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder -Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, aus der es abgeleitet ist, wie zum Beispiel ein Reportermolekül oder einen anderen Ligand, der kovalent oder nicht-kovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie etwa ein Reportermolekül, das gebunden ist, um deren Nachweis zu erleichtern, sowie nicht-natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zur Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins, umfassen. Ferner zählen zu ”Derivaten” ebenfalls Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Übersichtsartikel über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
  • Ortholog(e)/Paralog(e)
  • Orthologe und Paraloge umfassen evolutionäre Konzepte, die zur Beschreibung der ancestralen Beziehungen von Genen zur Anwendung kommen. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Spezies, welche durch Duplikation eines ancestralen Gens hervorgegangen sind; Orthologe sind Gene aus unterschiedlichen Organismen, welche durch Speziation hervorgegangen sind und ebenfalls von einem gemeinsamen ancestralen Gen abgeleitet sind.
  • Domäne
  • Der Begriff ”Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen entlang eines Alignments von Sequenzen evolutionär verwandter Proteine konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen variieren können, deuten Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen hochkonserviert sind, auf Aminosäuren hin, die wahrscheinlich in der Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins wesentlich sind. Identifiziert durch das hohe Ausmaß an Konservierung in alignierten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen, können sie als Identifikatoren verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein beliebiges, fragliches Polypeptid einer früher identifizierten Polypeptidfamilie angehört.
  • Motiv/Consensus-Sequenz/Signatur
  • Der Begriff ”Motiv” oder ”Consensus-Sequenz” oder ”Signatur” bezieht sich auf eine kurze, konservierte Region in der Sequenz von evolutionär verwandten Proteinen. Motive sind häufig hochkonservierte Teile von Domänen, aber können ebenfalls lediglich einen Teil der Domäne einschließen oder außerhalb einer konservierten Domäne liegen (wenn alle der Aminosäuren des Motives außerhalb einer definierten Domäne liegen).
  • Hybridisierung
  • Der Begriff ”Hybridisierung”, wie hierin definiert, ist ein Verfahren, wobei im wesentlichen homologe, komplementäre Nukleotidsequenzen miteinander annealen bzw. sich aneinander anlagern. Das Hybridisierungsverfahren kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuren liegen in Lösung vor. Das Hybridisierungsverfahren kann ebenfalls stattfinden, wobei eine der komplementären Nukleinsäuren an eine Matrix, wie magnetische Kügelchen, Sepharose-Kügelchen oder ein beliebiges anderes Harz, immobilisiert ist. Das Hybridisierungsverfahren kann ferner stattfinden, wobei eine der komplementären Nukleinsäuren an einem festen Träger immobilisiert ist, wie etwa einer Nitrozellulose- oder Nylonmembran, oder z. B. durch Photolithografie beispielsweise an einen silikatischen Glasträger immobilisiert ist (wobei man letzteres als Nukleinsäure-Arrays oder Mikroarrays oder als Nukleinsäure-Chips kennt). Um zu ermöglichen, dass eine Hybridisierung stattfindet, werden die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufzuschmelzen und/oder Haarnadeln oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuren zu entfernen.
  • Der Begriff ”Stringenz” bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Strigenz einer Hybridisierung wird von Bedingungen, wie der Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und der Hybridisierungspufferzusammensetzung, beeinflusst. Im Allgemeinen werden Niederstringenzbedingungen so gewählt, dass sie um etwa 30°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert sind. Mittlere Stringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 20°C unterhalb von Tm liegt, und Hochstringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 10°C unterhalb der Tm liegt. Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen werden in der Regel zum Isolieren von hybridisierenden Sequenzen angewandt, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweisen.
  • Allerdings können Nukleinsäuren hinsichtlich der Sequenz abweichen und immer noch ein im Wesentlichen identisches Polypeptid codieren, und zwar aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes. Deshalb können manchmal mittelstringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich sein, um derartige Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren.
  • Die Tm ist die Temperatur bei definierter Ionenstärke und pH, bei welcher 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Die Tm ist von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung sowie der Länge der Sonde abhängig. Zum Beispiel hybridisieren längere Sequenzen spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Rate der Hybridisierung wird bei etwa 16°C bis 32°C unter der Tm erhalten. Das Vorhandensein von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung verringert die elektrostatische Abstoßung zwischen den zwei Nukleinsäure-Strängen, wodurch die Hybridbildung gefördert wird; dieser Effekt ist für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4 M sichtbar (für höhere Konzentrationen kann dieser Effekt vernachlässigt werden). Formamid senkt die Schmelztemperatur von DNA-DNA und DNA-RNA-Doppelsträngen um 0,6 bis 0,7°C für jedes Prozent an Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid gestattet, dass die Hybridisierung bei 30 bis 45°C durchgeführt werden kann, obwohl die Rate bzw. Geschwindigkeit der Hybridisierung vermindert wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die thermische Stabilität der Duplizes. Im Durchschnitt, und für große Sonden, sinkt die Tm um etwa 1°C je Prozent an Basenfehlpaarung. Die Tm kann mit Hilfe der folgenden Gleichungen, abhängig von den Typen der Hybride, berechnet werden:
    • 1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): Tm = 81,5°C + 16,6 × log10[Na+]a + 0,41 × %[G/Cb] – 500 × [Lc]4 – 0,61 × % Formamid
    • 2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: Tm = 79,8 + 18,5(log10[Na+]a) + 0,58(%G/Cb) + 11,8(%G/Cb)2 – 820/Lc
    • 3) Oligo-DNA- oder Oligo-RNAd-Hybride: Für < 20 Nukleotide: Tm = 2 (In) Für 20–35 Nukleotide: Tm = 22 + 1,46(In)
    a
    oder für ein sonstiges einwertiges Kation, aber nur exakt im Bereich von 0,01–0,4 M.
    b
    nur exakt für %GC im Bereich von 30% bis 75%.
    c
    L = Länge des Duplex in Basenpaaren.
    d
    Oligo, Oligonukleotid; In = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. v. G/C) + (Anz. v. A/T).
  • Nicht-spezifische Bindung kann unter Anwendung einer von vielen bekannten Techniken reguliert werden, wie z. B. Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusetzungen von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nicht-homologe Sonden kann eine Serie von Hybridisierungen durchgeführt werden mittels Variieren von einem von (i) progressivem Senken der Annealing-Temperatur (zum Beispiel von 68°C auf 42°C) oder (ii) progressivem Senken der Formamidkonzentration (zum Beispiel von 50% auf 0%). Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während einer Hybridisierung verändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt die Spezifität der Hybridisierung in der Regel auch von der Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten ab. Um den aus nicht-spezifischer Hybridisierung resultierenden Hintergrund zu entfernen, werden Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu den kritischen Faktoren bei derartigen Waschschritten zählen die Ionenstärke und Temperatur der letztendlichen Waschlösung: je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur, umso höher ist die Stringenz des Waschschritts. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unter der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, welches mindestens das Zweifache von demjenigen des Hintergrundes ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays oder Genamplifikations-Nachweisverfahren wie oben angegeben beschaffen. Auch können mehr oder weniger stringente Bedingungen gewählt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während des Waschens abgeändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
  • Zum Beispiel umfassen typische Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC. Beispiele von Mittelstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die vorhergesehene Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Wenn Nukleinsäuren von bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge bestimmt werden durch Alignieren der Sequenzen und Identifizieren der hierin beschriebenen konservierten Regionen. 1 × SSC steht für 0,15 M NaCl and 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagenz, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,5% Natriumpyrophosphat, enthalten.
  • Für die Zwecke des Definierens der Höhe der Stringenz kann auf Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder auf Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 und jährliche Aktualisierungen) Bezug genommen werden.
  • Splice-Variante
  • Der Begriff ”Splice-Variante” wie hierin verwendet, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in welchen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verschoben oder hinzugefügt worden sind, oder in welchen Introns verkürzt oder verlängert worden sind. Derartige Varianten werden solche sein, in denen die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen erhalten bleibt; dies kann durch selektives Beibehalten von funktionellen Segmenten des Proteins bewirkt werden. Derartige Splice-Varianten können in der Natur vorgefunden oder vom Menschen erzeugt sein. Verfahren zum Vorhersagen und Isolieren derartiger Splice-Varianten sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel Foissac und Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
  • Allelische Variante
  • Allele oder allelische Varianten sind alternative Formen eines gegebenen Gens, welche an der gleichen chromosomalen Position lokalisiert sind. Allelische Varianten umfassen Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), sowie ”Kleine Insertion-Deletions-Polymorphismen” (INDELs). Die Größe von INDELs beträgt in der Regel weniger als 100 bp. SNPs und INDELs bilden die größte Gruppe an Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
  • Gen-Shuffling/gerichtete Evolution
  • Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution besteht aus Iterationen des DNA-Shuffling, gefolgt von einem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuren oder Abschnitten davon zu erzeugen, welche Proteine mit einer modifizierten biologischen Aktivität codieren (Castle et al., (2004) Science 304 (5674): 1151–4; U.S.-Patente 5 811 238 und 6 395 547 ).
  • Regulatorisches Element/Steuerungssequenz/Promotor
  • Die Begriffe ”regulatorisches Element”, ”Steuerungssequenz” und ”Promotor” werden hierin alle austauschbar verwendet und beziehen sich, wobei sie in einem weiten Kontext zu verstehen sind, auf regulatorische Nukleinsäuresequenzen, die zum Bewirken der Expression der Sequenzen in der Lage sind, an welche sie ligiert sind. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäure-Steuerungssequenz, welche sich stromaufwärts vom transkriptionellen Start eines Gens befindet und welche an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verbundenen Nukleinsäure gesteuert wird. Bei den zuvor erwähnten Begriffen sind transkriptionelle regulatorische Sequenzen eingeschlossen, die aus einem klassischen eukaryotischen genomischen Gen abgeleitet sind (einschließend die TATA-Box, welche für eine exakte Transkriptionsinitiation erforderlich ist, mit oder ohne einer CCAAT-Box-Sequenz), sowie weitere regulatorische Elemente (d. h. ”Upstream-Aktivierende Sequenzen”, ”Enhancer” und ”Silencer”), welche die Genexpression in Antwort auf entwicklungsmäßige und/oder externe Stimuli oder in einer gewebespezifischen Weise verändern. Ebenfalls innerhalb des Begriffs eingeschlossen ist eine transkriptionelle regulatorische Sequenz eines klassischen prokaryotischen Gens, wobei er in diesem Fall eine –35-Box-Sequenz und/oder transkriptionsregulierende –10-Box-Sequenzen einschließen kann. Der Begriff ”regulatorisches Element” beinhaltet außerdem ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, welches die Expression eines Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ herbeiführt, aktiviert oder steigert.
  • Ein ”Pflanzenpromotor” umfasst regulatorische Elemente, welche die Expression eines codierenden Sequenzsegments in Pflanzenzellen vermitteln. Folglich muss ein Pflanzenpromotor nicht von pflanzlichem Ursprung sein, sondern kann aus Viren oder Mikroorganismen stammen, beispielsweise aus Viren, welche Pflanzenzellen angreifen. Der ”Pflanzenpromotor” kann auch aus einer Pflanzenzelle stammen, z. B. aus der Pflanze, welche mit der Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden soll und hierin beschrieben ist. Dies gilt auch für andere regulatorische ”Pflanzen”-Signale, wie etwa ”Pflanzen”-Terminatoren. Die Promotoren stromaufwärts der Nukleotidsequenzen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -Insertion(en) und/oder -Deletion(en) modifiziert sein, ohne die Funktionalität oder Aktivität von entweder den Promotoren, dem offenen Leserahmen (ORF) oder der 3'-regulatorischen Region, wie Terminatoren oder sonstigen 3'-regulatorischen Regionen, welche sich entfernt vom ORF befinden, zu stören. Es ist ferner möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht wird, oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar Promotoren aus heterologen Organismen, ersetzt werden. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuremolekül, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder diesen umfassen, welcher das Gen zum richtigen Zeitpunkt und beim erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
  • Für die Identifizierung von funktionell äquivalenten Promotoren können die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, zum Beispiel durch funktionsfähiges Verknüpfen des Promotors an ein Reportergen und Testen des Expressionsspiegels und -musters des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze. Zu geeigneten, allgemein bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase. Die Promotoraktivität wird durch Messen der enzymatischen Aktivität der Beta-Glucuronidase oder Beta-Galactosidase getestet. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit denjenigen eines Referenzpromotors verglichen werden (wie etwa jenem, der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren von mRNA-Spiegeln oder durch Vergleich von mRNA-Spiegeln der, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten, Nukleinsäure mit mRNA-Spiegeln von Haushaltsgenen, wie etwa 18S-rRNA, geassayt werden, wobei im Fachgebiet bekannte Verfahren, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Neid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994) zur Anwendung kommen. Mit ”schwacher Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor bezeichnet, der die Expression einer codierenden Sequenz auf einem geringen Spiegel antreibt. Mit ”geringer Spiegel” werden Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis etwa 1/100000 Transkripte, bis etwa 1/5000000 Transkripten pro Zelle gemeint. Demgegenüber treibt ein ”starker Promotor” die Expression einer codierenden Sequenz bei einem hohen Spiegel oder bei etwa 1/10 Transkripte bis etwa 1/100 Transkripte bis etwa 1/1000 Transkripte pro Zelle an. Mit ”mittelstarker Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor gemeint, der die Expression einer codierenden Sequenz bei einem niedrigeren Spiegel als ein starker Promotor antreibt, insbesondere bei einem Spiegel, welcher in allen Fällen unterhalb demjenigen liegt, der unter der Steuerung eines 35S-CaMV-Promotors erhalten wird. Typischerweise ist ein mittelstarker Promotor in der Lage zum Antreiben der Expression einer Nukleinsäure in mindestens 3, 5,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mal geringerem Ausmaß als demjenigen des 35S-CaMV-Promotors.
  • Funktionsfähig verbunden
  • Der Begriff ”funktionsfähig verbunden”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine funktionale Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem Gen von Interesse, so dass die Promotorsequenz in der Lage ist, die Transkription des Gens von Interesse zu initiieren.
  • Konstitutiver Promotor
  • Ein ”konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der während den meisten, aber nicht notwendigerweise allen, Phasen des Wachstums und der Entwicklung, sowie unter den meisten Umweltbedingungen, in mindestens einer/einem Zelle, Gewebe oder Organ transkriptionell aktiv ist. Die nachstehende Tabelle 2 gibt Beispiele von konstitutiven Promotoren an. Tabelle 2: Beispiele von konstitutiven Promotoren
    Genquelle Literatur-Bezugsstelle
    Actin McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990
    HMGP WO 2004/070039
    CAMV 35S Odell et al., Nature, 313: 810–812, 1985
    CaMV 19S Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
    GOS2 de Pater et al., Plant J. Nov; 2(6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
    Ubiquitin Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
    Reis-Cyclophilin Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25(5): 837–43, 1994
    Mais-H3-Histon Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
    Alfalfa-H3-Histon Wu et al., Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
    Actin 2 An et al., Plant J. 10(1); 107–121, 1996
    34S FMV Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
    kleine Rubisco-Untereinheit US 4 962 028
    OCS Leisner (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
    SAD1 Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
    SAD2 Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
    Nos Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831–7846
    V-ATPase WO 01/14572
    Super-Promoter WO 95/14098
    G-Box-Proteine WO 94/12015
  • Ubiquitärer Promotor
  • Ein ubiquitärer Promotor ist in im Wesentlichen allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
  • Entwicklungsmäßig regulierter Promotor
  • Ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor ist während bestimmter Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, die entwicklungsbedingten Änderungen unterliegen, aktiv.
  • Induzierbarer Promotor
  • Ein induzierbarer Promotor zeigt induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation in Antwort auf eine Chemikalie (zur Übersicht siehe Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen umweltmäßigen oder physikalischen Stimulus, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt wird, oder ”pathogeninduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze der Exposition an verschiedene Pathogene ausgesetzt wird.
  • Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
  • Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein solcher, der fähig ist, Transkription in bestimmten Organen oder Geweben präferentiell zu initiieren, wie etwa Blättern, Wurzeln, Samengewebe etc. Zum Beispiel ist ein ”wurzelspezifischer Promotor” ein Promotor, der vorwiegend in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Promotoren, die zum Initiieren der Transkription nur in bestimmten Zellen fähig sind, werden hierin als ”zellspezifisch” bezeichnet.
  • Beispiele wurzelspezifischer Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle i aufgeführt: Tabelle i: Beispiele von wurzelsezifischen Promotoren
    Gen-Quelle Literatur-Bezugsstelle
    Reis-RCc3 Xu et al. (1995) Plant Mol. Biol. 27(2): 237–48
    Arabidopsis-Phosphat-Transporter PHT1 Kovama et al., 2005
    Medicago-Phosphat-Transporter Xiao et al., 2006
    Arabidopsis Pyk10 Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346
    Tabakwurzelspezifische Gene R87, RD2, RD5, RH12 Conkling et al. (1990) Plant Phys. 93(3): 1203–1211
    Gerste, wurzelspezifisches Lectin Lerner & Raikhel (1989) Plant Phys. 91: 124–129
    wurzelspezifisches Hydroxyprolin-reiches Protein Keller & Lamb (1989) Genes & Dev. 3: 1639–1646
    Arabidopsis CDC27B/hobbit Blilou et al. (2002) Genes & Dev. 16: 2566–2575
  • Ein samenspezifischer Promotor is hauptsächlich in Samengewebe transkriptionell aktiv, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in Samengewebe (in Fällen von Leckexpression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004), wobei diese Offenbarung, als ob sie vollständig dargelegt ist, hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist, und in der nachstehenden Tabelle ii angegeben. Tabelle ii: Beispiele samenspezifischer Promotoren
    Gen-Quelle Literatur-Bezugsstelle
    samenspezifische Gene Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
    Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.;
    Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
    Paranuss-Albumin Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992.
    Legumin Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988.
    Glutelin (Reis) Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
    Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987.
    Zein Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32 1990
    NapA Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996.
    Weizen-LMW- und HMW-Glutenin-1 Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
    Weizen-SPA Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
    α, β, γ-Gliadine von Weizen EMBO J. 3: 1409–15, 1984
    Gerste Itr1-Promotor Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
    Gerste B1, C, D, Hordein Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
    Gerste DOF Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
    blz2 EP99106056.7
    Synthetischer Promotor Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998.
    Reis Prolamin NRP33 Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
    Reis a-Globulin Glb-1 Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
    Reis OSH1 Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
    Reis α-Globulin REB/OHP-1 Nakase et al., Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
    Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase Trans. Res. 6: 157–68, 1997
    Mais ESR-Genfamilie Plant J. 12: 235–46, 1997
    Sorghum α-Kafirin DeRose et al., Plant Mol. Biol. 32: 1029–35, 1996
    KNOX Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
    Reis Oleosin Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998
    Sonnenblume Oleosin Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
    PRO0117, putatives ribosomales 40S Protein von Reis WO 2004/070039
    PRO0136, Reis-Alanin-Aminotransferase Unveröffentlicht
    PRO0147, Trypsininhibitor ITR1 (Gerste) Unveröffentlicht
    PRO0151, Reis WSI18 WO 2004/070039
    PRO0175, Reis RAB21 WO 2004/070039
    PRO005 WO 2004/070039
    PRO0095 WO 2004/070039
    α-Amylase (Amy32b) Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
    Cathepsin β-ähnliches Gen Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
    Gerste Ltp2 Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
    Chi26 Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
    Mais B-Peru Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998
  • Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie hierin definiert, ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschlug beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle iii gezeigt. Tabelle iii: Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren
    Gen Expression Bezugsstelle
    Mais, Orthophosphat-Dikinase blattspezifisch Fukavama et al., 2001
    Mais, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase blattspezifisch Kausch et al., 2001
    Reis, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase blattspezifisch Liu et al., 2003
    Reis, kleine Rubisco-Untereinheit blattspezifisch Nomura et al., 2000
    Reis, beta-Expansin EXBP9 spross-spezifisch WO 2004/070039
    Straucherbse, kleine Rubisco-Untereinheit blattspezifisch Panguluri et al., 2005
    Erbse RBCS3A blattspezifisch
  • Ein weiteres Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist ein meristemspezifischer Promotor, der vorwiegend in meristematischem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine gewisse Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Beispiele von meristemspezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle iv gezeigt. Tabelle iv: Beispiele von meristemspezifischen Promotoren
    Gen-Quelle Expressionsmuster Bezugsstelle
    Reis-OSH1 Spross-Apikalmeristem, von globulärer Embryostufe bis Setzlingsstadium Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
    Reis-Metallothionein meristemspezifisch BAD87835.1
    WAK1 & WAK2 Spross- und Wurzel-Apikal-meristeme, und in expan-dierenden Blättern und Kelchblättern Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318
  • Terminator
  • Der Begriff ”Terminator” beinhaltet eine Steuerungssequenz, welche eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit ist, welche die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines Primärtranskripts und die Termination der Transkription signalisiert. Der Terminator kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel aus den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Genen oder alternativ aus einem anderen Pflanzengen oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen anderen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
  • Modulierung
  • Der Begriff ”Modulierung” bedeutet in Bezug auf Expression oder Genexpression ein Verfahren, in welchem der Expressionsspiegel durch die Genexpression im Vergleich zur Kontrollpflanze verändert wird, wobei der Expressionsspiegel erhöht oder verringert werden kann. Die ursprüngliche, nicht modulierte Expression kann jede Art von Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation sein. Der Begriff ”Modulieren der Aktivität” soll jedwede Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder codierten Proteine bedeuten, welche zu einem erhöhten Ertrag und/oder erhöhten Wachtsum der Pflanzen führt.
  • Expression
  • Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet insbesondere die Transkription von einem Gen oder Genen oder einem gentechnischen Konstrukt zu struktureller RNA (rRNA, tRNA) oder zu mRNA mit oder ohne anschließende Translation der letzteren zu einem Protein. Das Verfahren beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des resultierendens mRNA-Produkts.
  • Erhöhte Expression/Überexpression
  • Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression”, wie hierin verwendet, bedeutet eine beliebige Form von Expression, welche zusätzlich zum ursprünglichen Wildtyp-Expressionsspiegel erfolgt.
  • Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert und beinhalten zum Beispiel die durch geeignete Promotoren angetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder von Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, welche als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (typischerweise stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, welche das Polypeptid von Interesse codiert, hochreguliert wird. Beispielsweise können endogene Promotoren in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution geändert werden (siehe Kmiec, US 5 565 350 ; Zarling et al., WO 9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der richtigen Orientierung und im richtigen Abstand zu einem Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
  • Wenn eine Polypeptidexpression gewünscht wird, ist es im Allgemeinen wünschenswert, eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer codierenden Polynukleotidregion einzuschließen. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Die 3'-End-Sequenz, welche hinzugefügt i werden soll, kann zum Beispiel aus den Genen für Nopalin-Synthase oder Octopin-Synthase oder alternativ dazu aus einem anderen Pflanzengen, oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen sonstigen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
  • Auch eine Intronsequenz kann an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder die codierende Sequenz der partiellen codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert. Der Einschluss eines spleißbaren Introns in der Transkriptionseinheit sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Expressionskonstrukten erhöht gezeigtermaßen die Genexpression sowohl auf der mRNA- als auch Protein-Ebene bis zu 1000-fach (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev. 1: 1183–1200). Eine derartige Intron-Verstärkung der Genexpression ist typischerweise am größten bei Platzierung nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1, 2 und 6, sowie des Bronze-1-Introns sind im Fachgebiet bekannt. Für allgemeine Informationen siehe: The Maize Handbook, Kapitel 116, Hrsg.: Freeling und Walbot, Springer, N. Y. (1994).
  • Endogenes Gen
  • Die Bezugnahme hierin auf ein ”endogenes” Gen bezieht sich nicht nur auf das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form (d. h. ohne dass irgendein menschlicher Eingriff stattgefunden hat) vorgefunden wird, sondern bezieht sich außerdem auf das gleiche Gen (oder ein(e) im Wesentlichen homologe(s) Nukleinsäure/Gen) in einer isolierten Form, welches anschließend in eine Pflanze (wieder) eingeführt wird (ein Transgen). Zum Beispiel kann eine transgene Pflanze, die ein derartiges Transgen enthält, eine erhebliche Reduktion der Transgen-Expression und/oder eine erhebliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren. Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder vom Menschen, zum Beispiel durch chemische Synthese, erzeugt werden.
  • Verringerte Expression
  • Eine Bezugnahme hierin auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” von Expression wird verwendet, um eine Verringerung der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptidspiegel und/oder der Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen zu bezeichnen. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung beträgt, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Verringerung im Vergleich zu derjenigen von Kontrollpflanzen.
  • Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze wird eine ausreichende Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz benötigt. Um ein ”Gensilencing” durchzuführen kann diese so gering wie 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide sein, wobei sie alternativ so groß sein kann, wie das gesamte Gen (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder zum Teil oder insgesamt). Die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden kann aus der Nukleinsäure, welche das Patellin oder den Precursor-RNA-Processing-Faktor 38 oder den Adaptor 2 oder ein WDR23-ähnliches Polypeptid (Zielgene) codiert, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Patellins oder des Precursor-RNA-Processing-Faktor 38 oder des Adaptor 2 oder eines WDR23-ähnlichen Polypeptids in der Lage ist, abgeleitet sein. Vorzugsweise ist die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden in der Lage, Wasserstoffbrücken mit dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang) zu bilden, und weiter bevorzugt besitzt die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zum Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, welche ein (funktionales) Polypeptid codiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen, hierin erörterten, Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
  • Beispiele verschiedener Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der Expression, in einer Pflanze, eines endogenen Gens oder zur Senkung der Spiegel und/oder Aktivität eines Proteins sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Der Fachmann wird ohne weiteres in der Lage sein, die bekannten Verfahren zum Silencing so zu adaptieren, dass eine Reduktion der Expression eines endogenen Gens in einer ganzen Pflanze oder in Teilen davon erzielt wird, zum Beispiel durch Verwendung eines geeigneten Promotors.
  • Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann unter Anwendung von routinemäßigen Hilfsmitteln und Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder substantielle Eliminierung von endogener Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, eines genetischen Konstrukts, in welches die Nukleinsäure (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von einem beliebigen von dem Patellin- oder dem Precursor-RNA-Processing-Faktor 38- oder dem Adaptor 2- oder einem WDR23-ähnlichen Polypeptid in der Lage ist) als ein invertierter Repeat (teilweise oder vollständig), getrennt durch einen Spacer bzw. Abstandhalter (nicht-codierende DNA), einkloniert ist. Ein anderes Verfahren für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung von endogener Genexpression erfolgt durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines invertierten Repeats einer Nukleinsäuresequenz oder eines Teils davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Patellin- oder des Precursor-RNA-Processing-Faktor 38- oder des Adaptor 2- oder eines WDR23-like-Polypeptids in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur fähig ist. Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von dem Patellin- oder dem Precursor-RNA-Processing-Faktor 38- oder dem Adaptor 2- oder einem WDR23-ähnlichen Polypeptid in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden. Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zum Inhibieren von dessen Funktion in planta oder Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Künstliche und/oder natürliche MicroRNAs (miRNAs) können verwendet werden, um Genexpression und/oder mRNA-Translation auszuknocken. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19–24 Nukleotiden. Artifizielle MicroRNAs (amiRNAs), welche typischerweise eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, können in spezifischer Weise gentechnisch erzeugt werden, um die Genexpression von einzelnen oder mehreren Genen von Interesse negativ zu regulieren. Determinanten der Pflanzen-MicroRNA-Zielauswahl sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können eingesetzt werden, um beim Entwurf von spezifischen amiRNAs zu helfen (Schwab et al., (2005) Dev. Cell 8(4): 517–27). Zweckdienliche Hilfsmittel für den Entwurf und die Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorläufern sind ebenfalls öffentlich verfügbar (Schwab et al., (2006) Plant Cell 18(5): 1121–33).
  • In einem bevorzugten derartigen Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im Wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines invertierten Repeats einer Nukleinsäure oder eines Teiles davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von dem Patellin- oder dem Precursor-RNA-Processing-Faktor 38- oder dem Adaptor 2- oder einem WDR23-ähnlichen Polypeptid in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur fähig ist. Der ”Inverted Repeat” wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Steuerungssequenzen umfasst. Eine nicht-codierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Abstandhalter, zum Beispiel ein Matrix-Anheftungs-Region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker, etc.) ist zwischen den zwei invertierten Nukleinsäuren, welche den ”Inverted Repeat” bilden, befindlich. Nach der Transkription des Inverted Repeat wird eine chimäre RNA mit einer selbst-komplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als die Haarnadel-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, welche in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet die rnRNA-Transkripte weiter, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die in Polypeptide translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Für weitere allgemeine Einzelheiten, siehe zum Beispiel Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ).
  • Die Ausführung der Verfahren der Erfindung beruht nicht auf dem Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem genetischen Konstrukt, in welches die Nukleinsäure als ein ”Inverted Repeat” einkloniert ist, sondern es können ein oder mehrere beliebige von einigen, allgemein bekannten ”Gen-Silencing”-Verfahren zur Anwendung kommen, um die gleichen Effekte zu erzielen.
  • Ein derartiges Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing von Genexpression (Herunterregulieren). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze von einer doppelsträngigen RNA-Sequenz (dsRNA) ausgelöst, welche im Wesentlichen ähnlich zum endogenen Zielgen ist. Diese dsRNA wird von der Pflanze zu etwa 20 bis etwa 26 Nukleotiden weiterprozessiert, welche als kurze interferierende RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, welcher das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
  • Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von dem Patellin oder dem Precursor-RNA-Processing-Faktor 38 oder dem Adaptor 2 in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense-Orientierung” bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche homolog zu einem mRNA-Transkript davon ist. Deswegen wird man in eine Pflanze mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz einführen. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens verringern, was zur Entstehung eines Phänomens führt, welches als Co-Suppression bekannt ist. Die Reduktion der Genexpression wird noch erheblicher sein, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da eine positive Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und der Auslösung von Co-Suppression besteht.
  • Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die ein Protein codiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem endogenen Gen, welches stumm gemacht bzw. gesilenct werden soll. Die Komplementarität kann in der ”codierenden Region” und/oder in der ”nicht-codierenden Region” eines Gens lokalisiert sein. Der Begriff ”codierende Region” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff ”nicht-codierende Region” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die codierende Region flankieren und welche transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (ebenfalls bezeichnet als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen).
  • Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß den Regeln der Watson-und-Crick-Basenpaarung entworfen werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zur gesamten Nukleinsäuresequenz (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von dem Patellin oder dem Precursor-RNA-Processing-Faktor 38 oder dem Adaptor 2 in der Lage ist) komplementär sein, aber kann ebenfalls ein Oligonukleotid sein, welches den Antisense zu lediglich einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der 5'- und 3'-UTR der mRNA) darstellt. Zum Beispiel kann die Antisense-Oligonukleotidsequenz komplementär zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid codiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotidsequenz ist im Fachgebiet bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kann unter Anwendung von chemischer Synthese sowie enzymatischer Ligationsreaktionen mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedenartig modifizierte Nukleotide verwendet werden, entworfen zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildeten Duplex, wobei z. B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden können. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Zyklisierung und 'Caps' sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, wie etwa Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
  • Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in welchen eine Nukleinsäuresequenz in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h., die von der inserierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird bezüglich einer Zielnukleinsäure von Interesse eine Antisense-Orientierung aufweisen). Vorzugsweise findet die Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäurekonstrukts statt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verknüpftes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
  • Die zum Silencing in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküle (ob in eine Pflanze eingeführt oder in situ erzeugt) hybridisieren oder binden an ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, um dadurch die Expressions des Proteins zu inhibieren, z. B. durch Inhibieren von Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex erfolgen, oder, zum Beispiel im Fall einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, welche an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer spezifischen Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ dazu können Antisense-Nukleinsäuresequenzen modifiziert sein, um ausgewählte Zellen anzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Für die systemische Verabreichung können Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, welche an Zelloberflächen-Rezeptoren oder -Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen zugeführt werden.
  • Gemäß eines weiteren Aspekts ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezifische, doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann außerdem ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FERS Lett. 215, 327–330) umfassen.
  • Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der endogenen Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen durchgeführt werden. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, wie einer mRNA, zu der sie eine komplementäre Region besitzen, in der Lage sind. Somit können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme; beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) verwendet werden, um ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, wodurch die Anzahl an mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entworfen werden (siehe zum Beispiel: Cech et al., U.S.-Patent Nr. 4 987 071 ; und Cech et al., U.S.-Patent Nr. 5 116 742 ). Alternativ dazu können mRNA-Transkripte, welche einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist auf dem Fachgebiet bekannt (z. B., Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
  • Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden.
  • Gen-Silencing kann auch auftreten, wenn eine Mutation auf einem endogenen Gen und/oder eine Mutation auf einem isolierten Gen/Nukleinsäure, welche(s) anschließend in eine Pflanze eingebracht wird, vorhanden ist. Die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzung(en) können daher ein Polypeptid vorsehen, das noch zum Binden an interagierende Proteine (wie etwa Rezeptorproteine) in der Lage ist, aber seine normale Funktion nicht aufzeigen kann (wie etwa Signalleitungs-Ligand).
  • Ein weiteres Vorgehen für das Gen-Silencing besteht im Ziellenken von Nukleinsäuresequenzen, die zur regulatorischen Region des Gens (z. B. dem Promotor und/oder Enhancern) komplementär sind, wodurch tripelhelikale Strukturen gebildet werden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36, 1992; und Maher, L. J., Bioassays 14, 807–15, 1992.
  • Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zum Inhibieren von dessen Funktion in Pflanzen oder Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Insbesondere kann es in Betracht gezogen werden, dass vom Menschen geschaffene Moleküle zum Inhibieren der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder zur Störung des Signalleitungsweges, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
  • Alternativ dazu kann ein Screening-Programm angesetzt werden, um natürliche Varianten eines Gens in einer Pflanzenpopulation zu identifizieren, wobei die Varianten Polypeptide mit verringerter Aktivität codieren. Solche natürlichen Varianten können beispielsweise auch zur Ausführung von homologer Rekombination angewandt werden.
  • Künstliche und/oder natürliche MicroRNAs (miRNAs) können verwendet werden, um Genexpression und/oder mRNA-Translation auszuknocken. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19–24 Nukleotiden. Sie funktionieren vorwiegend zum Regulieren der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen MicroRNAs (miRNAs) weisen eine perfekte oder beinahe perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Allerdings gibt es natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Sie werden aus längeren nicht-codierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch Doppelstrang-spezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Nach der Prozessierung werden sie in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) durch Binden an dessen Hauptkomponente, ein Argonaute-Protein, eingebaut. MiRNAs dienen als die Spezifitätskomponenten des RISC, da sie mit Zielnukleinsäuren, vorwiegend mRNAs, im Cytoplasma eine Rasenpaarung eingehen. Anschließende regulatorische Ereignisse beinhalten die Ziel-mRNA-Spaltung und -Zerstörung und/oder die Translationsinhibition. Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich deshalb häufig in verringerten mRNA-Spiegeln von Zielgenen.
  • Artifizielle MikroRNAs (amiRNAs), welche typischerweise eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, können in spezifischer Weise gentechnisch erzeugt werden, um die Genexpression von einzelnen oder mehreren Genen von Interesse negativ zu regulieren. Determinanten der Pflanzen-MikroRNA-Zielauswahl sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können eingesetzt werden, um beim Entwurf von spezifischen amiRNAs zu helfen (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517–527, 2005). Zweckdienliche Hilfsmittel für den Entwurf und die Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorläufern sind ebenfalls öffentlich verfügbar (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121–1133, 2006).
  • Für eine optimale Leistung erfordern die Gen-Silencing-Techniken, die zum Reduzieren der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze angewandt werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotyledonen Pflanzen für die Transformation monokotyledoner Pflanzen, und aus dikotyledonen Pflanzen für die Transformation dikotyledoner Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer beliebigen gegebenen Pflanzenspezies in diese selbe Spezies eingebracht. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Allerdings ist es kein absolutes Erfordernis, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz aus derselben Pflanzenspezies stammt, wie die Pflanze, in welcher sie eingeführt wird. Es ist ausreichend, dass eine wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäure besteht.
  • Beispiele verschiedener Verfahren für die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze sind oben beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die oben genannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch Verwenden eines geeigneten Promotors.
  • Selektierbares Marker(gen)/Reportergen
  • Unter ”selektierbarer Marker, ”selektierbares Markergen” oder ”Reportergen” ist ein beliebiges Gen eingeschlossen, welches einen Phänotyp an eine Zelle vermittelt, in der es exprimiert wird, so dass die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen erleichtert wird, die mit einem Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung transfiziert oder transformiert sind. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuremoleküle durch eine Reihe unterschiedlicher Prinzipien. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, welche Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz vermitteln, welche eine neue metabolische Eigenschaft einbringen oder welche eine visuelle Selektion zulassen. Zu Beispielen von selektierbaren Markergenen zählen Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie etwa nptll, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, welche Resistenz zum Beispiel gegen Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chlorampenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin vermitteln) sowie gegen Herbizide vermitteln (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta® vermittelt; aroA oder gox, welche Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, welche zum Beispiel Resistenz gegen Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff vermitteln), oder Gene, die ein metabolisches Merkmal bereitstellen (wie etwa manA, das Pflanzen gestattet, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, oder Xylose-Isomerase für die Verwertung von Xylose, oder antinutritive Marker, wie die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Bildung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS oder β-Galactosidase mit seinen gefärbten Substraten, beispielsweise X-Gal), Lumineszenz (wie etwa das Luciferin/Luciferase-System) oder Fluoreszenz (Grün-fluoreszierendes Protein, GFP, und Derivate davon). Diese Liste repräsentiert nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit derartigen Markern vertraut. Es werden, abhängig von dem Organismus und dem Selektionsverfahren, unterschiedliche Marker bevorzugt.
  • Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuren in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeteten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie denjenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktional sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuremoleküle, die einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem separaten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäure transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind im Fachgebiet bekannt, verwendbare Techniken sind oben im Abschnitt 'Definitionen' beschrieben.
  • Da die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich oder unerwünscht sind, sobald die Nukleinsäuren erfolgreich eingebracht worden sind, wendet das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuren in vorteilhafter Weise Techniken an, welche die Entfernung oder Exzision dieser Markergene ermöglichen. Ein derartiges Verfahren ist die sogenannte Co-Transformation. Das Co-Transformations-Verfahren verwendet zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäure trägt und ein zweiter die Markergen(e) trägt. Ein großer Anteil an Transformanten empfängt oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Im Fall der Transformation mit Agrobakterien empfangen die Transformanten in der Regel nur einen Teil des Vektors, d. h. die von der T-DNA flankierte Sequenz, welche üblicherweise die Expressionskassette darstellt. Die Markergene können anschließend durch Ausführen von Kreuzungen aus der transformierten Pflanze entfernt werden. In einem anderen Verfahren werden in ein Transposon integrierte Markergene für die Transformation gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäure verwendet (bekannt als Ac/Ds-Technologie). Die Transformanten können mit einer Transposase-Quelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäurekonstrukt, welches die Expression einer Transposase vermittelt, transient oder stabil transformiert. In einigen Fällen (ungefähr 10%), springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle heraus, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen durch Ausführen von Kreuzungen elimiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, welche das Detektieren derartiger Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen; deren Vorteil besteht darin, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieses Typs ist das sogenannte Cre/Iox-System. Cre1 ist eine Rekombinase, welche die zwischen den IoxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Wenn das Markergen zwischen die IoxP-Sequenzen integriert ist, wird es entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und zwar durch die Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Selbstverständlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewandt werden.
  • Transgenisch/Transgen/Rekombinant
  • Für die Zwecke der Erfindung bedeuten ”transgenisch”, ”Transgen” oder ”rekombinant”, zum Beispiel in Hinsicht auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, umfassend die Nukleinsäuresequenz, oder einen Organismus, der mit den Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren gemäß der Erfindung transformiert ist, wobei alle diese Konstruktionen durch rekombinante Verfahren bewerkstelligt werden, in welchen entweder
    • (a) die Nukleinsäuresequenzen, welche in den Verfahren der Erfindung nützliche Proteine codieren, oder
    • (b) genetische Steuerungsequenz(en), welche funktionsfähig mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verknüpft sind, wie beispielsweise ein Promotor, oder
    • (c) a) und b)
    nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung lokalisiert sind oder durch rekombinante Verfahren modifiziert worden sind, wobei es möglich ist, dass die Modifikation zum Beispiel die Form einer Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion von einem oder mehreren Nukleotidresten annimmt. Es versteht sich, dass mit der natürlichen genetischen Umgebung der natürliche genomische oder chromosomale Locus bzw. Genort in der Ursprungspflanze oder das Vorhandensein in einer genomischen Bibliothek gemeint ist. Im Falle einer genomischen Bibliothek wird die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz vorzugsweise zumindest teilweise beibehalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz mindestens auf einer Seite und besitzt eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, vorzugsweise mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, am stärksten bevorzugt mindestens 5000 bp. Eine natürlich vorkommende Expressionskassette – zum Beispiel die natürlich vorkommende Kombination des natürlichen Promotors der Nukleinsäuresequenzen mit der entsprechenden Nukleinsäuresequenz, welche ein in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliches Polypeptid codiert, wie oben definiert – wird zu einer transgenen Expressionskassette, wenn diese Expressionskassette durch nicht-natürliche, synthetische (”künstliche”) Verfahren, wie zum Beispiel mutagene Behandlung, modifiziert wird. Geeignete Verfahren sind zum Beispiel in US 5 565 350 oder WO 00/15815 beschrieben.
  • Es versteht sich daher, dass mit einer transgenen Pflanze für die Absichten der Erfindung, wie oben, gemeint ist, dass die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuren nicht an ihrem natürlichen Genort im Genom der Pflanze vorliegen, wobei es möglich ist, dass die Nukleinsäuren homolog oder heterolog exprimiert werden. Wie erwähnt, bedeutet ”transgen” jedoch ebenfalls, dass, obwohl die erfindungsgemäßen oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren an ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegen, die Sequenz in Bezug auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Es versteht sich, dass ”transgen” vorzugsweise die Expression der Nukleinsäuren gemäß der Erfindung an einem unnatürlichen Genort im Genom, d. h. homolog, bedeutet, oder dass vorzugsweise eine heterologe Expression der Nukleinsäuren stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen sind hierin erwähnt.
  • Transformation
  • Der Begriff ”Einbringung” oder ”Transformation”, wie hierin darauf Bezug genommen wird, beinhaltet den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des für den Transfer angewandten Verfahrens. Pflanzengewebe, das zur anschließenden klonalen Vermehrung in der Lage ist, ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem genetischen Konstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert, und eine gesamte Pflanze daraus regeneriert werden. Das gewählte, jeweilige Gewebe wird von den klonalen Propagationssystemen abhängen, welche für die zu transformierende jeweilige Spezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele schließen Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Callusgewebe, existierendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonmeristem und Hypokotylmeristem) ein. Das Polynukleotid kann transient oder stabil in eine Wirtszelle eingebracht und kann nicht-integriert, zum Beispiel als ein Plasmid, beibehalten werden. Alternativ dazu kann es in das Wirtsgenom integriert werden. Die resultierende, transformierte Pflanzenzelle kann dann zum Regenerieren einer transformierten Pflanze auf eine Weise, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, verwendet werden.
  • Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenspezies ist heutzutage eine durchaus routinemäßige Technik. In vorteilhafter Weise kann ein beliebiges von mehreren Transformationsverfahren angewandt werden, um das Gen von Interesse in eine geeignete Vorfahrenzelle einzubringen. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren können für transiente oder für stabile Transformationen angewandt werden. Transformationsverfahren beinhalten die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme freier DNA erhöhen, direkte Injektion der DNA in die Pflanze, Beschuss mit einer Partikelkanone, Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen sowie Mikroprojektion. Man kann Verfahren auswählen unter dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72–74; Negrutiu, I., et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 363–373); der Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al. (1985) BiolTechnol. 3, 1099–1102); der Mikroinjektion in Pflanzenmaterial hinein (Crossway, A., et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179–185); dem Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Teilchen (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), der Infektion mit (nicht-integrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, einschließlich transgener Nutzpflanzen, werden vorzugsweise durch Agrobacteriumvermittelte Transformation hergestellt. Ein vorteilhaftes Transformationsverfahren ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck ist es zum Beispiel möglich, den Agrobakterien zu gestatten, auf Pflanzensamen einzuwirken, oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien zu inokulieren. Es hat sich gemäß der Erfindung als besonders zweckmäßig erwiesen, zu gestatten, dass eine Suspension transformierter Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest auf die Blütenanlagen einwirkt. Die Pflanze wird anschließend weiter wachsen gelassen, bis die Samen der behandelten Pflanze erhalten werden (Clough und Bent, Plant J. (1998) 16, 735–743). Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis schließen allgemein bekannte Verfahren für die Reistransformation ein, wie etwa diejenigen, welche in einem beliebigen von Folgendem beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), wobei diese Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargelegt wären. Im Falle von Mais-Transformation ist das bevorzugte Verfahren beschaffen, wie entweder in Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Die Verfahren sind beispielsweise ferner in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128–143, sowie in Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225) beschrieben. Die Nukleinsäuren oder das Konstrukt, welche(s) exprimiert werden sollen, wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der zum Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie etwa Pflanzen, welche als Modell herangezogen werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung nicht als Nutzpflanze betrachtet) oder Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, beispielsweise durch Eintauchen von zerquetschten Blättern oder zerhackten Blättern in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877, beschrieben oder ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38.
  • Zusätzlich zur Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, ist es ebenfalls möglich, die Zellen von Pflanzenmeristemen und insbesondere diejenigen Zellen, welche sich zu Gameten entwickeln, zu transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung, wodurch es zur Entstehung transgener Pflanzen kommt. So werden beispielsweise Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und Samen werden aus den sich entwickelnden Pflanzen erhalten, von denen ein gewisser Anteil transformiert und somit transgen ist [Feldman, KA, und Marks, MD (1987). Mol. Gen Genet. 208: 274–289; Feldmann, K., (1992). In: C. Koncz, N-H. Chua und J. Shell (Hrsg.), Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren basieren auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Schnittstelle im Zentrum der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch in ähnlicher Weise transformierte Samen zu einem späteren Zeitpunkt erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen Genet., 245: 363–370). Ein besonders effektives Verfahren ist jedoch das Vakuuminfiltrationsverfahren mit seinen Modifikationen, wie dem ”floral dip”-Verfahren. Im Falle von Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N. (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], wohingegen im Fall des ”floral dip”-Verfahrens das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer tensidbehandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ, und Bent, AF (1998) The Plant J. 16, 735–743]. In beiden Fällen wird ein gewisser Anteil an transgenen Samen geerntet, und diese Samen können von nicht-transgenen Samen durch Kultivieren unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen unterschieden werden. Darüber hinaus besitzt die stabile Transformation von Plastiden Vorteile, weil Plastiden in den meisten Nutzpflanzen maternal vererbt werden, was das Risiko eines Transgen-Flusses durch Pollen verringert oder eliminiert. Die Transformation des Chloroplastengenoms wird im Allgemeinen durch ein Verfahren bewirkt, das in Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] schematisch geschildert worden ist. Kurz gesagt, werden die zu transformierenden Sequenzen zusammen mit einem selektierbaren Markergen zwischen flankierende Sequenzen, die homolog zum Chloroplastengenom sind, kloniert. Diese homologen flankierenden Sequenzen lenken die ortsspezifische Integration in das Plastom. Plastidale Transformation ist für viele verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden, und eine Übersicht erhält man in Bock (2001) "Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology". J. Mol. Biol., 21. Sep. 2001; 312 (3): 425–38, oder Maliga, P. (2003) "Progress towards commercialization of plastid transformation technology". Trends Biotechnol. 21, 20-28. In jüngster Zeit ist über einen weiteren biotechnologischen Fortschritt in Form von markerfreien Plastidentransformanten, welche mittels eines transienten, cointegrierten Markergens hergestellt werden können, berichtet worden (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
  • T-DNA-Aktivierungs-Tagging
  • T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, üblicherweise enthaltend einen Promotor (es kann sich auch um einen Translations-Enhancer oder einen Intron handeln), in die genomische Region des Gens von Interesse oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der codierenden Region eines Gens in einer derartigen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Typischerweise wird die Regulierung der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor zerstört, und das Gen kommt unter die Kontrolle des neu eingebrachten Promotors. Der Promotor ist typischerweise in einer T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom inseriert, zum Beispiel durch Agrobacterium-Infektion, und führt zur modifizierten Expression von Genen nahe der inserierten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression von Genen nahe dem eingebrachten Promotor.
  • TILLING
  • Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die zum Erzeugen und/oder Identifizieren von Nukleinsäuren nützlich ist, welche Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität codieren. TILLING erlaubt auch die Selektion von Pflanzen, welche derartige Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufzeigen, entweder hinsichtlich Stärke oder Lokalisierung oder Zeitgebung (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufzeigen, als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. TILLING vereinigt Hochdichte-Mutagenese mit Hochdurchsatz-Screeningverfahren. Die beim TILLING typischerweise befolgten Schritte sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei, GP, und Koncz, C (1992), in: Methods in Arabidopsis Research, Koncz, C, Chua, NH, Schell, J (Hrsg.), Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) in: Meyerowitz. EM, Somerville. CR (Hrsg.), "Arabidopsis". Cold Spring Harbor Laborastory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner, J., und Caspar, T. (1998) in: J. Martinez-Zapater, J. Salinas, (Hrsg.), Methods an Molecular Biology, Bd. 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Vereinigen bzw. Poolen der Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer Region von Interesse; (d) Denaturieren und Annealen, um die Bildung von Heteroduplexen zu gestatten; (e) DHPLC, wobei die Gegenwart eines Heteroduplex in einem Pool als ein Extra-Peak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifikation des Mutanten-Individuums; und (g) Sequenzieren des Mutanten-PCR-Produkts. Verfahren für TILLING sind im Fachgebiet allgemein bekannt (McCallum et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18: 455–457; übersichtmäßig zusammengefasst von Stemple (2004) Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50).
  • Homologe Rekombination
  • Homologe Rekombination gestattet die Einbringung einer gewählten Nukleinsäure an einer definierten gewählten Position in einem Genom. Homologe Rekombination ist eine Standardtechnologie, die in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe oder das Moos Physcomitrella, routinemäßig angewandt wird. Verfahren zur Durchführung homologer Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen beschrieben worden (Offringa et al. (1990) EMBO J. 9(10): 3077–84) sondern auch für Nutzpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al. (2002) Nat. Biotech. 20(10): 1030–4; lida und Terada (2004) Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132–8), und es existieren Vorgehensweisen, welche, ungeachtet des Zielorganismus, allgemein anwendbar sind (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
  • Ertrag
  • Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen einen messbaren Gewinn von wirtschaftlichem Wert, typischerweise in Bezug auf eine spezifizierte Nutzpflanze, ein Gebiet und eine Zeitperiode. Individuelle Pflanzenteile tragen auf Basis ihrer Anzahl, Größe und/oder Gewicht direkt zum Ertrag bei, oder die tatsächliche Ausbeute ist der Ertrag pro Quadratmeter für eine Nutzpflanze und pro Jahr, was mittels Dividieren der Gesamtproduktion (einschließlich sowohl geernteter und geschätzter Produktion) durch die bepflanzten Quadratmeter bestimmt wird. Der Begriff ”Ertrag” an einer Pflanze kann sich auf vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf die reproduktiven Organe und/oder auf Verbreitungseinheiten (wie Samen) dieser Pflanze beziehen.
  • Früh-Wuchskraft
  • ”Früh-Wuchskraft” bezieht sich auf aktives gesundes, richtig ausgewogenes Wachstum, insbesondere während der frühen Stadien des Pflanzenwachstums, und kann aus einer erhöhten Pflanzenfitness resultieren, beispielsweise aufgrund dessen, dass die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. Optimieren der Verwendung von Energieresourcen und der Aufteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Früh-Wuchskraft zeigen außerdem erhöhtes Setzlings-Überleben und eine bessere Hervorbringung der Nutzpflanze, was häufig zu sehr gleichmäßigen Feldern (wobei die Nutzpflanze in gleichmäßiger Weise wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen die verschieden Stadien der Entwicklung im Wesentlichen zur gleichen Zeit erreicht) und oftmals zu einem besserem und höheren Ertrag führt. Deshalb kann die Früh-Wuchskraft durch Messen verschiedener Faktoren, wie etwa Tausendkerngewicht, Prozentsatz der Keimung, Prozentsatz der Emergenz, Setzlingswachstum, Setzlingshöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und vielen anderen, bestimmt werden.
  • Erhöhen/Verbessern/Steigern
  • Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”steigern” sind austauschbar und sollen im Sinn der Patentanmeldung mindestens 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, weiter bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen bedeuten, wie hierin definiert.
  • Samenertrag
  • Erhöhter Samenertrag kann sich als eines oder mehrere der folgenden manifestieren: a) eine Erhöhung der Samenbiomasse (Gesamtsamengewicht), welche auf Einzelsamen-Basis und/oder pro Pflanze und/oder pro Quadratmeter bezogen sein kann; b) erhöhte Anzahl von Blüten pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl von (gefüllten) Samen; d) erhöhte Samen-Füllrate (welche als das Verhältnis zwischen der Zahl gefüllter Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Ernteindex, der als ein Verhältnis des Ertrags an erntefähigen Teilen, wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse, ausgedrückt wird; f) erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW) und g) erhöhte Anzahl an Hauptrispen, was aus der gezählten Zahl gefüllter Samen und deren Gesamtgewicht extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKW kann aus erhöhter Samengröße und/oder erhöhtem Samengewicht resultieren, und kann auch aus einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße resultieren.
  • Eine Erhöhung im Samenertrag kann sich auch als eine Erhöhung in Samengröße und/oder Samenvolumen manifestieren. Ferner kann sich eine Erhöhung des Samenertrags auch als eine Erhöhung bei Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder Samenumfang manifestieren. Erhöhter Samenertrag kann auch zu modifierter Architektur führen, oder kann wegen einer modifierten Architektur auftreten.
  • Grünheits-Index
  • Der ”Grünheits-Index”, wie hierin verwendet, wird aus Digitalbildern von Pflanzen berechnet. Für jeden Pixel, der zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehört, wird das Verhältnis des Grünwerts gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell zum Codieren von Farbe) berechnet. Der Grünheits-Index wird als der Prozentsatz an Pixeln ausgedrückt, für den das Grün-zu-Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit wird der Grünheits-Index von Pflanzen in der letzten Abbildung vor dem Aufblühen gemessen. Im Gegensatz dazu wird der Grünheits-Index von Pflanzen unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen in der ersten Abbildung nach der Dürre gemessen.
  • Pflanze
  • Der Begriff ”Pflanze”, wie hierin verwendet, umfasst ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen sowie Pflanzenteile, einschließlich Samen, Sprosse, Stengel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der zuvor genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst. Der Begriff ”Pflanze” beinhaltet außerdem Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Callusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der zuvor genannten das Gen/die Nukleinsäure von Interesse umfasst.
  • Zu Pflanzen, welche in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen, einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher, ausgewählt aus der Liste, die unter anderem Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allrum spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Olsamenraps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus Iongan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia Vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., So/anum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticale sp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare), Tropaeolur minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp. umfasst.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein PATL-Polypeptid oder ein PRP38-Polypeptid oder ein GATA-like-Polypeptid oder ein ADA2-Polypeptid oder ein WDR23-like-Polypeptid codiert, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Merkmalen im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Steigern von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein PATL-Polypeptid oder ein PRP38-Polypeptid oder ein GATA-like-Polypeptid oder ein ADA2-Polypeptid oder ein WDR23-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze und gegebenenfalls das Selektieren von Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
  • In einer Ausführungsform ist nun überraschend festgestellt worden, dass das Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein ”GATA-like”-Polypeptid codiert, Pflanzen mit einem erhöhten Tausendkerngewicht (TKW) im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Gemäß einer Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung des TKW in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, umfassend das Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, welche ein GATA-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
  • In einer anderen Ausführungsform ist es nun festgestellt worden, dass das Erhöhen der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, welche ein WDR23-ähnliches bzw. ”WDR23-like”-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen ergibt. Die Erfindung sieht Nukleinsäuresequenzen, welche WDR23-like-Polypeptide codieren, sowie WDR23-like-Polypeptide vor, wobei die erhöhte Expression der isolierten Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen die ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung (vorzugsweise Erhöhung) der Expression einer Nukleinsäure, welche ein PATL-Polypeptid oder ein PRP38-Polypeptid oder ein GATA-ähnliches Polypeptid oder ADA2-Polypeptid oder ein WDR23-like-Polypeptid codiert, erfolgt durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, codierend ein PATL-Polypeptid oder ein PRP38-Polypeptid oder GATA-like-Polypeptid oder ADA2-Polypeptid oder ein WDR23-like-Polypeptid, in einer Pflanze und gegebenenfalls Selektieren von Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
  • Jegliche Bezugnahme hierin nachstehend auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” versteht sich so, dass ein PATL-Polypeptid oder ein PRP38-Polypeptid oder GATA-like-Polypeptid oder ADA2-Polypeptid oder WDR23-like-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede Bezugnahme hierin auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die in der Lage ist, solch ein PATL-Polypeptid oder ein PRP38-Polypeptid oder GATA-like-Polypeptid oder ADA2-Polypeptid oder WDR23-like-Polypeptid zu codieren. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und deshalb bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist), ist eine beliebige Nukleinsäure, codierend den Typ von Protein, der nun beschrieben werden wird, ebenfalls bezeichnet als ”PATL-Nukleinsäure” oder ”PATL-Gen” oder ”PRP38-Nukleinsäure” oder ”PRP38-Gen” oder ”GATA-like-Nukleinsäure” oder ”GATA-like-Gen” oder ”ADA2-Nukleinsäure” oder ”ADA2-Gen” oder ”WDR23-like Nukleinsäuresequenz” oder ”WDR23-like-Gen”.
  • Ein ”PATL-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf jedwedes Polypeptid, umfassend:
    • (i) eine SEC14-Domäne und/oder
    • (ii) eine GOLD-Domäne
  • Die SEC14- und GOLD-Domänen sind typischerweise in der C-terminalen Region von PATL-Polypeptiden lokalisiert. Der N-Terminus von PATL-Polypeptiden ist von variabler Länge und besitzt eine divergentere Aminosäuresequenz-Zusammensetzung als der C-Terminus. Der N-Terminus ist gekennzeichnet durch eine Anreicherung an sauren Aminosäuren (PI-isoelektrischer Punkt – ungefähr 4), wie etwa Glutaminsäure (E), und er enthält zahlreiche EEK(Glutaminsäure-Glutaminsäure-Lysin)-Wiederholungen. Darüber hinaus wird vorhergesagt. dass die N-Terminus-Sequenz eine oder mehrere ”Coiled Coils” umfasst, bei welchen es sich um ein übliches Proteinoligomerisierungs-Faltungsmotiv handelt. Die ”Coiled Coil”-Domäne enthält gewöhnlicherweise hydrophobe und hydrophile Aminosäurereste, die Alpha-Helizes bilden, welche in einer cytoplasmatischen Umgebung die hydrophoben Stränge gegeneinander wickeln bzw. falten können, und zwar zwischen den hydrophilen Aminosäuren, was eine thermodynamische Antriebskraft für die Dimerisierung bereitstellt. ”Coiled Coils” können leicht unter Anwendung von Verfahren und Software identifiziert werden, welche im Fachgebiet gut beschrieben sind, wie etwa COILs oder PAIRCIOL2 (Lupas et al., 1991. Science, 252, 1162–1164; MacDonnell et al., 2006. Bioinformatics.; 22(3): 356–8). Die 1 zeigt die charakteristischen EEK-Repeats und eine ”Coiled Coil”-Domäne, wie in SEQ ID NR: 2 vorhanden.
  • Bevorzugte PATL-Polypeptide, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, umfassen einen sauren N-Terminus, der eines oder mehrere der folgenden Merkmale aufweist:
    • (i) einen isoelektrischen Punkt von, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, weniger als 5, 4,5, 4, 3,5, oder 3;
    • (ii) eine oder mehrere ”Coiled Coils”, vorzugsweise, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, eines, zwei, drei, vier oder fünf.
    • (iii) ein oder mehrere EEK-Repeats, vorzugsweise in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, einen, zwei, drei, vier, fünf, sechs oder sieben.
  • Der N-Terminus eines PATL-Polypeptids, wie hierin aufgeführt, ist der Abschnitt des Proteins, der sich am N-Terminus der SEC 14-Domäne erstreckt.
  • Der isoelektrische Punkt eines Polypeptids, das heißt der pH-Wert, bei dem ein jeweiliges Molekül oder eine jeweilige Oberfläche keine elektrische Nettoladung trägt, kann durch Verfahren berechnet werden, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind (Stryer, 1995), wobei zum Beispiel die Henderson-Hasselbalch-Gleichung (Henderson (1908), Am. J. Physiol., 21, 173–179; Hasselbalch (1917), Biochemische Zeitschrift, 78, 112–144. de Livie (2003) J. Chem. Educ., 80, 146) verwendet wird.
  • Typischerweise umfassen PATL-Polypeptide eine SEC14-Domäne, welche auf den oben beschriebenen N-Terminus folgt. Die SEC14-Domäne in PATL-Polypeptiden schließt eine Region mit Homologie zum Hefe-Sec14p-Protein ein, welche die Phospholipid-Bindungstasche umfasst. Die an Lipidbindung und/oder -transfer beteiligten Aminosäurereste E, K und G im Hefe-Sec14p sind in PATL-Polypeptiden konserviert, wobei sie in SEQ ID NR: 2 dem E434, K465 und G493 entsprechen (1). Die Glutaminsäure E434 und das Lysin K465 von SEQ ID NR: 2 sind die homologen Reste zu E207 und K239 des Hefe-Sec14p-Proteins, welche eine Salzbrücke bilden, die an der Selektivität für PtdIns und der Bindung an selbiges beteiligt ist. Die hydrophobe Tasche des Hefe-Sec14P ist auch in PATL-Polypeptiden konserviert.
  • PATL-Polypeptide können eine GOLD-Domäne umfassen, welche typischerweise am C-Terminus gefunden wird. Die GOLD-Domäne in PATL-Polypeptid ist reich an Lysinresten und enthält die konservierte Sequenz KX(10-11)(K/R/T)KKKX(0-1)(L/V/A)(L/V/A)YR (siehe 2), welche ähnlich zum PtdIns (4,5)P2-Bindungsmotiv ist, das in Clathrin-ummantelten Vesikel-Proteinen gefunden wird.
  • Ein in den Verfahren der Erfindung nützliches, bevorzugtes PATL-Polypeptid umfasst mindestens eine der folgenden Domänen:
    • (i) eine SEC14-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 71 repräsentiert: Ipeldsvvfyrgadreghpvcynvygefqdkdlyekafgdeekrerflkwriqllergilsqldfspsgicsmvqvtdlknsppmlgkhravtrqavallqdnypefiakkvfinvpwwylaankmmspfltqrtkskfifaspaksaetlfryiapeqvpvqfgglfk, oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 71 repräsentierten Domäne oder zu einer beliebigen SEC14-Domäne, wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden;
    • (ii) eine GOLD-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 72 repräsentiert: sdavteltikpssketveipvtenstigwelrvlgwevsygaeftpdaeggytvivgktrkvpaneepimkgsfkvgepgkivltinnpaskkkkllyrskv, oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 72 repräsentierten Domäne oder zu einer beliebigen GOLD-Domäne wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden.
  • Weiter bevorzugt umfasst ein in den Verfahren der Erfindung nützliches PATL-Polypeptid mindestens eines der konservierten Motive, Motiv Ia und Motiv IIa, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 69/L(L/T)KFLRAR bzw. SEQ ID NR: 70/(L/F)(Q/E)DNYPEF.
  • Die in den Verfahren der Erfindung nützlichen PATL-Polypeptide sind vorzugsweise diejenigen mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 98% oder mehr Sequenzidentität zu einem beliebigen der in Tabelle A angegebenen Polypeptide.
  • Eine SEC14-Domäne und eine GOLD-Domäne, welche in einem PATL-Polypeptid enthalten sind, können mittels Durchsuchen von speziellen Datenbanken identifiziert werden, enthaltend Sammlungen von multiplen Sequenz-Alignments und Hidden-Markov-Modellen, die konservierte Proteindomänen und -familien abdecken, wie etwa Pfam, das am Sanger Institute, Großbritannien, verfügbar ist. Alternativ dazu können die oben erwähnten Domänen gefunden werden mittels Scannen der ”The Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites(InterPro)”-Datenbank, um ein signifikantes Sequenz-Alignment mit bekannten SEC14- oder GOLD-Domänen zu detektieren (siehe Beispiel 4). Die InterPro-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine zum Ableiten von Proteinsignaturen verwenden. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien bereitgestellt. Ein signifikantes Alignment zwischen der Sequenz zweier Polypeptide oder zweier Domänen, wie hierin definiert, ist ein Alignment mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, einem e-Wert, geringer als e–5 (e hoch minus 5), 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75, 1·e–100, 1·e–200, 1·e–300, 1·e–400, 1·e–500, 1·e–600, 1·e–700 und 1·e–800. Die Polypeptidsequenzen können mit Hilfe eines beliebigen der im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren aligniert werden, einschließlich globalen und lokalen Alignmentverfahren, wie Blast-Algorithmen, z. B. dem Algorithmus, der in Altschul, SF, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10, beschrieben ist. Die Wahrscheinlichkeit, dass das Alignment mit einer gegebenen Sequenz auftritt, wird als Grundlage für die Identifizierung ähnlicher Polypeptide herangezogen. Ein Parameter, der typischerweise angewandt wird, um eine derartige Wahrscheinlichkeit zu vertreten, ist der sogenannte e-Wert (E-Wert). Der E-Wert ist ein Maß der Zuverlässigkeit der S-Wertung (S score). Die 5-Wertung ist ein Maß der Ähnlichkeit der zwei Sequenzen, die aligniert werden. Der e-Wert beschreibt, wie oft eine gegebene S-Wertung der Erwartung nach rein zufällig auftritt. Der e-Wert kann so hoch wie 1,0 sein.
  • Vorzugsweise umfassen in den Verfahren der Erfindung nützliche PATL-Polypeptide mindestens eine der folgenden Domänen:
    • (i) eine SEC14-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, einem e-Wert, geringer als e–5 (e hoch minus 5), 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75, 1·e–100, 1·e–200, 1·e–300, 1·e–400, 1·e–500, 1·e–600, 1·e–700 und 1·e–800 wenn sie mit einer bekannten SEC14-Domäne aligniert wird, weiter bevorzugt, wenn sie mit einer beliebigen der SEC14-Domänen von Tabelle C aligniert wird;
    • (ii) eine GOLD-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, einem e-Wert, geringer als e–5 (e hoch minus 5), 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75, 1·e–100, 1·e–200, 1·e–300, 1·e–400, 1·e–500, 1·e–600, 1·e–700 und 1·e–800, wenn sie mit einer bekannten GOLD-Domäne aligniert wird, weiter bevorzugt, wenn sie mit einer beliebigen der GOLD-Domänen von Tabelle C aligniert wird.
  • Vorzugsweise ist die in den Verfahren der Erfindung nützliche PATL-Polypeptidsequenz eine solche, die sich bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist, bei einer beliebigen der Sequenzen in dem Baum, weiter bevorzugt bei den Sequenzen in Gruppe Ia, die SEQ ID NR: 2 umfasst, clustern bzw. einordnen lässt.
  • Der Begriff ”Domäne” sowie ”Motiv” ist im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert. Es existieren Spezialdatenbanken für die Identifizierung von Domänen, wie zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Hrsg.: Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., S. 53–61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134-D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002)). Eine Auswahl an Werkzeugen für die Analyse von Proteinsequenzen in silico ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Schweizer Institut für Bioinformatik; Gasteiger et al., "ExPASy: the Proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis", Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788(2003)) verfügbar. Domänen oder Motive können auch unter Anwendung von Routinetechniken, wie etwa durch Sequenzalignment, identifiziert werden.
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA zu derartigen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständige Sequenz überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welches die Anzahl an Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl an Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem zum Beispiel der ClustalW-Multiple-Sequenz-Alignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen paarweisen Alignment-Parametern und einer Bewertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket (Campanella et al., BMC Bioinformatics. 10. Juli 2003; 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarityldentity matrices using Protein or DNA sequences) verfügbar sind. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können, anstatt der Verwendung von Volllängensequenzen zur Identifizierung von Homologen, auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, wobei die oben erwähnten Programme unter Anwendung der Standardparameter verwendet werden. Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol. 147(1); 195–7).
  • Ferner weisen die PATL-Polypeptide typischerweise Phosphatidylinositid (PtdIns) und/oder Phosphatidylcholin (PtdCho) bindende Aktivität auf. Vorzugsweise binden sie Phosphatidylinositol. Phosphatidylinositol bezieht sich auf ein beliebiges Glycophospholipid, dessen sn-Glycerol-3-Phosphat-Rest mit der 1-Hydroxylgruppe von 1D-myo-Inositol verestert ist.
  • Alternativ dazu katalysieren PATL-Polypeptide typischerweise den Transfer von Phosphatidylinositol und Phosphatidylcholin zwischen Membranen in vitro. Verfahren zum Assay auf PtdIns/PtdCho-Bindung und/oder Transfer durch Membranen sind im Fachgebiet allgemein bekannt (Bankaitis VA, et al. (1990). Nature 347: 561–2; Peterman et al.(2004)).
  • Alternativ können PATL-Nukleinsäuren in einem funktionellen Komplementationstest durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, den defekten Wachstumsphänotyp von temperaturempfindlichen Saccharomyces cerevisiae-sec14-Mutanten zu komplementieren. In diesem In-vivo-Test sind die PATL-Nukleinsäuren in der Lage, ein PATL-Polypeptid in Hefe zu exprimieren. Mehrere temperaturempfindliche S. cerevisiae-sec14-Mutantenstämme und Verfahren für ihre Komplementation sind im Fachgebiet allgemein bekannt (Kearns et al. (1998) EMBO J. 17, 4004–17; Kapranov et al. (2001); Lee et al. (2000) Biochym. Biophys. Acta 1486: 55–71).
  • Darüber hinaus ergeben PATL-Polypeptide, PRP38-Polypeptide, GATA-like-Polypeptide, oder ADA2-Polypeptide, wenn sie gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie in den Beispielen 7 und 8 dargestellt, in Reis exprimiert und ausgewertet werden, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere einem oder mehreren von Gesamt-Samengewicht, Samen-Füllrate, Anzahl an gefüllten Samen und Gesamtzahl an Blüten pro Rispe.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch das Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 1, codierend die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2, oder SEQ ID NR: 76, codierend die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 77, oder SEQ ID NR: 128, codierend die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 129, oder SEQ ID NR: 181, codierend die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 182, oder SEQ ID NR: 215, codierend die WDR23-like-Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 216, veranschaulicht. Jedoch ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung können unter Verwendung einer/eines beliebigen PATL-codierenden Nukleinsäure oder PATL-Polypeptids, PRP38-codierenden Nukleinsäure oder PRP38-Polypeptids, oder ”GATA-like”-codierenden Nukleinsäure oder ”GATA-like”-Polypeptids oder ADA2-codierenden Nukleinsäure oder ADA2-Polypeptids, oder eines WDR23-like-Polypeptids, wie hierin definiert, vorteilhaft durchgeführt werden
  • Beispiele von Nukleinsäuren, welche PATL-Polypeptide oder PRP38-Polypeptide oder GATA-like-Polypeptide oder ADA2-Polypeptide oder WDR23-like-Polypeptide codieren, sind in der Tabelle A von Beispiel 1 hierin angegeben. Derartige Nukleinsäuren sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des PATL-Polypeptids, repräsentiert durch SEQ ID NR: 2, oder des PRP38-Polypeptids, repräsentiert durch SEQ ID NR: 77, oder des GATA-like-Polypeptids, repräsentiert durch SEQ ID NR: 129, oder des ADA2-Polypeptids, repräsentiert durch SEQ ID NR: 182, oder des WDR23-like-Polypeptids, repräsentiert durch SEQ ID NR: 216, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert gemeint sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Typischerweise beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. Man benutzt im allgemeinen BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist, zurück geBLASTet (zweiter BLAST) (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 2 ist, erfolgt der zweite BLAST daher gegen Oryza sativa-Sequenzen; oder falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 76 oder SEQ ID NR: 77, SEQ ID NR: 128 oder SEQ ID NR: 129, SEQ ID NR: 181 oder SEQ ID NR: 182, oder SEQ ID NR: 215 oder SEQ ID NR: 216 ist, erfolgt der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer bzw. ”hit” aus dem ersten Blast aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt.
  • PRP38-Domäne bezieht sich auf eine konservierte Aminosäuresequenz, die in Polypeptiden gefunden wird, welche als Prä-mRNA-Prozessierungsfaktoren wirken können. Sie weist typischerweise eine Länge von etwa 170 Aminosäuren auf, aber ist zum Beispiel im Polypeptid Ostta_PRP38_1 kürzer und im Polypeptid Vitvi_PRP38_1 länger (siehe Tabelle C). PRP38-Domänen können repräsentiert werden durch eine beliebige der PRP38-Domänensequenzen von Tabelle C und durch eine beliebige Polypeptiddomäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% oder mehr Sequenzidentität zu einer beliebigen der PRP38-Domänen von Tabelle C. PRP38-Domänen können ein oder mehrere hochkonservierte Sequenzmotive umfassen, wie durch SEQ ID NR: 123 und SEQ ID NR: 124 repräsentiert.
  • Alternativ dazu, kann eine PRP38-Domäne als eine beliebige Polypeptiddomäne definiert werden, die signifikant mit einem bekannten PRP38-Polypeptid, vorzugsweise mit einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A, aligniert. Ein signifikantes Alignment zwischen zwei Polypeptiden oder zwei Domänen, wie hierin definiert, ist ein Alignment mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, einem e-Wert, geringer als e–5 (e hoch minus 5), 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75, 1·e–100, 1·e–200, 1·e–300, 1·e–400, 1·e–500, 1·e–600, 1·e–700 und 1·e–800. Die Polypeptidsequenzen können mit Hilfe eines beliebigen der im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren aligniert werden, einschließlich globalen und lokalen Alignmentverfahren, wie Blast-Algorithmen, z. B. dem Algorithmus, der in Altschul, SF, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10, beschrieben ist. Die Wahrscheinlichkeit, dass das Alignment mit einer gegebenen Sequenz auftritt, wird als Grundlage für die Identifizierung ähnlicher Polypeptide herangezogen. Ein Parameter, welcher typischerweise angewandt wird, um eine derartige Wahrscheinlichkeit zu vertreten, ist der sogenannte e-Wert (E-Wert). Der E-Wert ist ein Maß der Zuverlässigkeit der S-Wertung. Die S-Wertung ist ein Maß der Ähnlichkeit der Suchsequenz zu der bekannten Sequenz, welche die PRP38-Domäne umfasst. Der e-Wert beschreibt, wie oft eine gegebene S-Wertung der Erwartung nach rein zufällig auftritt. Der e-Wert-Ausschluss kann so hoch wie 1,0 sein.
  • Vorzugsweise umfassen in den Verfahren der Erfindung nützliche PRP38-Polypeptide eine PRP38-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, einem e-Wert, geringer als e–5, 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75, 1·e–100, 1·e–200, 1·e–300, 1·e–400, 1·e–500, 1·e–600, 1·e–700 und 1·e–800, wenn sie mit einer bekannten PRP38-Domäne aligniert wird, weiter bevorzugt, wenn sie mit einer beliebigen der PRP38-Domänen von Tabelle C aligniert wird.
  • Eine PRP38-Domäne, die in einem Polypeptid auftritt, kann durch Durchsuchen von speziellen Datenbanken identifiziert werden, enthaltend Sammlungen von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, welche konservierte Proteindomänen und -familien abdecken, wie etwa Pfam, welches am Sanger Institute, Großbritannien, erhältlich ist. Das Beispiel 2 hierin zeigt die Ergebnisse einer Pfam-Suche unter Verwendung von PRP38-Polypeptiden als Suchsequenz.
  • Eine DUF1777-Domäne ist eine konservierte Aminosäuresequenz, die in einer kleinen Untergruppe der bislang beschriebenen Proteine gefunden wird. Sie ist typischerweise 140 bis 150 Aminosäuren lang, obwohl auch erheblich kürzere Versionen gefunden werden, siehe zum Beispiel die DUF1777-Domäne des Chlre_PRP38_1-Polypeptids (Tabelle C). DUF1777-Domänen sind basierend auf Sequenzhomologie in verschiedenen lebenden Organismen identifiziert worden. Eine Zusammenstellung von DUF-Domänen kann man in der Pfam-Datenbank finden, die am Sanger Institute (GB) verfügbar ist. Das Vorhandensein einer DUF1777-Domäne in einem Polypeptid kann leicht durch Durchsuchen von speziellen Datenbanken identifiziert werden, enthaltend Sammlungen von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, welche konservierte Proteindomänen und -familien abdecken, wie etwa Pfam. Ein Polypeptid, das eine DUF1777-Domäne umfasst, wird bei einer Suche in der Pfam-Datenbank als ein Übereinstimmungstreffer mit einer früher bekannten DUF1777-Domäne registriert bzw. eingestuft werden. Die Aminosäuresequenzen von DUF1777-Domänen in Proteinen von eukaryotischem Ursprung sind häufig stark divergent, wobei nur einige wenige Aminosäurereste exakt konserviert sind. in der Regel ist der e-Wert eines Alignments von zwei DUF1777-Domänen hoch, typischerweise größer als 0,001, noch typischer über 0,01.
  • Vorzugsweise umfassen in den Verfahren der Erfindung nützliche PRP38-Polypeptide eine DUF1777-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, einem e-Wert, geringer als 1·e–5, 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75, 1·e–100, 1·e–200, 1·e–300, 1·e–400, 1·e–500, 1·e–600, 1·e–700 und 1·e–800, wenn sie mit einer bekannten DUF1777-Domäne aligniert wird, weiter bevorzugt wenn sie mit einer beliebigen der DUF1777-Domänen von Tabelle C aligniert wird.
  • Weiter bevorzugt umfassen in den Verfahren der Erfindung nützliche PRP38-Polypeptide eine DUF1777 mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% oder mehr Sequenzidentität zu einer beliebigen der DUF1777-Domänen von Tabelle C.
  • Eine DUF1777-Domäne, die in einem Polypeptid auftritt, kann durch Durchsuchen von speziellen Datenbanken identifiziert werden, enthaltend Sammlungen von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, welche konservierte Proteindomänen und -familien abdecken, wie etwa Pfam, welches am Sanger Institute, Großbritannien, erhältlich ist. Das Beispiel 2 hierin zeigt die Ergebnisse einer Pfam-Suche unter Verwendung von PRP38-Polypeptiden als Suchsequenz.
  • PRP38-Polypeptide können eine RS-Domäne umfassen. Eine RS-Domäne ist eine Polypeptidregion, die reich an den Aminosäureresten Arginine (R) und Serin (S) ist. RS-Domänen umfassen eine Vielzahl von Dipeptiden, wie repräsentiert durch die Sequenz RS (Arginin-Serin), RE (Arginin-Glutaminsäure), RD (Arginin-Asparaginsäure). In der Regel sind die Dipeptide über eine Region des PRP38-Polypeptids verteilt, welche sich über 4 bis 150 Aminosäuren erstreckt. Die oben erwähnten Dipeptide können in Clustern auftreten, wobei solche Cluster ausschließlich aus einem oder mehreren beliebigen der Dipeptide RS, RE, RD aufgebaut ist und typischerweise zwischen 4 und 40 Aminosäuren lang ist.
  • Vorzugsweise umfassen die in den Verfahren der Erfindung nützlichen PRP38-Polypeptide eines oder mehrere der Dipeptide RS, RE, RD in einem Abschnitt von 4, 6, 8, 10, 12, 14, 20, 24, 30, 40, 50, 100, oder mehr, bis zu einem Maximum von 150 Aminosäuren.
  • Weiter bevorzugt umfassen die in den Verfahren der Erfindung nützlichen PRP38-Polypeptide zwei oder mehr Dipeptid-Cluster, die ausschließlich RS-, RE- und/oder RD-Aminosäurereste enthalten. Weiter bevorzugt umfasst das PRP38-Polypeptid 4 Dipeptid-Cluster, am stärksten bevorzugt den Dipeptid-Cluster, der durch RSRSRSRS repräsentiert ist.
  • PRP38-Polypeptide können außerdem ein oder mehrere beliebige der folgenden konservierten Sequenzmotive umfassen:
    • (iv) SEQ ID NR: 120/Motiv Ib: RRPPSVKASLSVSFGQRAPHRASTRDSSPVRRT, oder ein Motiv mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv Ib; und/oder
    • (v) SEQ ID NR: 121/Motiv IIb: SPYIRA(I/V)GFLYLRY, oder ein Motiv mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv IIb; und/oder
    • (vi) SEQ ID NR: 122/Motiv IIIb: KLKDLYGD, oder ein Motiv mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu Motiv IIIb.
  • Vorzugsweise umfassen in den Verfahren der Erfindung nützliche PRP38-Polypeptide ein beliebiges oder mehrere der folgenden Motive:
    • (i) Motiv 1b (SEQ ID NR: 120), wobei ein beliebiger Aminosäurerest durch eine konservative Aminosäure substitutiert sein kann und/oder bis zu 50% der Aminosäurereste durch eine nicht-konservative Aminosäure substitutiert sein können.
    • (ii) Motiv 1b (SEQ ID NR: 121), wobei ein beliebiger Aminosäurerest durch eine konservative Aminosäure substitutiert sein kann und/oder bis zu 50% der Aminosäurereste durch eine nicht-konservative Aminosäure substitutiert sein können.
    • (iii) Motiv 1b (SEQ ID NR: 122), wobei ein beliebiger Aminosäurerest durch eine konservative Aminosäure substitutiert sein kann und/oder bis zu 50% der Aminosäurereste durch eine nicht-konservative Aminosäure substitutiert sein können.
  • Die in den Verfahren der Erfindung nützlichen PRP38-Polypeptide sind vorzugsweise diejenigen mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%; 98% oder mehr Sequenzidentität zu einem beliebigen in der Tabelle A angegebenen Polypeptid.
  • Vorzugsweise ist die in den Verfahren der Erfindung nützliche PRP38-Polypeptidsequenz eine solche, welche sich, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 8 abgebildet ist, bei einer beliebigen der Sequenzen in Gruppe Ib, welche SEQ ID NR: 77 umfasst, einordnen bzw. clustern lässt.
  • In PRP38-Polypeptiden wird die PRP38-Domäne typischerweise am N-Terminus, und die DUF1777-Domäne am C-Terminus gefunden. PRP38-Polypeptide weisen typischerweise einen sauren C-Terminus auf und sind im Zellkern lokalisiert.
  • Ferner weisen PRP38-Polypeptide typischerweise Prä-mRNA-Splicing-Aktivität auf. Hilfsmittel und Techniken zum Messen der Prä-mRNA-Splicing-Aktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt (Blanton, S., et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12(9): 3939–47; Stevens, SW, und Abelson, J, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 96(13): 7226–31; Gottschalk, A., et al. (1999) EMBO J. 18(16): 4535–48; Pandit, S., et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 103(37): 13700–5).
  • Darüber hinaus ergeben PRP38-Polypeptide, wenn sie in Reis gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie in den Beispielen 7 und 8 geschildert, exprimiert werden, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Merkmalen, insbesondere einem oder mehreren beliebigen von oberirdischer Blattbiomasse, Emergenz-Wuchskraft, Gesamtsamengewicht, Samenfüllrate, Ernteindex und Gesamtzahl an Samen.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 76 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 77 codiert, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer/eines beliebigen PRP38-codierenden Nukleinsäure oder PRP38-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
  • Ein ”GATA-like-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf einen beliebigen Zn-Finger-Transkriptionsfaktor, der eine GATA-Domäne umfasst (wie zum Beispiel definiert in der SMART-Datenbank unter Eintrag SM00401). Vorzugsweise umfasst das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche ”GATA-like-Polypeptid” eine einzelne GATA-Domäne mit 18 oder 20 Aminosäuren zwischen dem zweiten und dem dritten Cys-Rest des Zn-Fingers, weiter bevorzugt liegen 18 Aminosäuren zwischen dem zweiten und dem dritten Cys-Rest des Zn-Fingers (CX2CX18CX2C). Der Begriff ”Zinkfinger” oder ”Zn-Finger” ist im Fachgebiet bekannt und bezieht sich auf das Sequenzmotiv, in welchem Cysteine und/oder Histidine ein Zinkatom koordinieren, wodurch lokale Peptidstrukturen gebildet werden, die für spezifische Funktionen erforderlich sind.
  • Weiter bevorzugt gehört das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche GATA-like-Polypeptid zur Subfamilie II, wie von Reyes et al. (Plant Physiol. 134, 1718–1732, 2004) definiert. Subfamilie II-GATA-Transkriptionsfaktoren bestehen in der Regel aus Genen mit 2 oder 3 Exons, wobei der Zinkfinger zwischen den 2 letzten Exons geteilt worden ist. Außerdem weisen Subfamilie II-GATA-Transkriptionsfaktoren 18 Reste in der Zn-Finger-Schleife auf.
  • Die GATA-Domäne im, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen, GATA-like-Polypeptid umfasst vorzugsweise einen Zn-Finger vom Klasse-B-Typ, wie in Reyes et al. (2004) definiert. Klasse B-Zn-Finger-Domänen weisen 18 Reste in der Zn-Finger-Schleife auf und sind ferner durch das Vorhandensein eines konservierten Ser-Rests (in Position 27 der in 11 gezeigten GATA-Domäne) und eines konservierten IRX(R/K)K-Motivs gekennzeichnet.
  • Vorzugsweise umfasst die GATA-Domäne Motiv 1c und/oder Motiv 2c: Motiv 1c (SEQ ID NR: 130):
    C(S/A/T)(D/E/N)CXT(T/S/A)(K/S)TP(L/M)WR(S/G/N)GP
    worin X eine beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise ist X eines von N, K, G, H, D.
  • Motiv 2c (SEQ ID NR: 131): GPKSLCNACGIRX (R/K)K
    worin X eine beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise ist X eines von Q, H, N, S, Y, F.
  • Vorzugsweise umfasst das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche GATA-like-Polypeptid auch das Motiv 3c (SEQ ID NR: 132):
    (A/S)(A/W)X(L/C)(L/N)(M/L/V)(T/L/A)(L/D)(S/R)
    worin X eine beliebige Aminosäure sein kann, vorzugsweise ist X eines von M, L, V, I, R.
  • Alternativ dazu weist das Homolog eines GATA-like-Proteins, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 14%, 15%, 20%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamtsequenzidentität zu der Aminosäure, die durch SEQ ID NR: 129 repräsentiert ist, auf, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein die GATA-Domäne, wie oben definiert, und eines oder mehrere der obenstehenden konservierten Motive umfasst. Die Gesamtsequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern, ermittelt. Im Vergleich zu der Gesamtsequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive, wie etwa die GATA-Domäne, betrachtet werden.
  • Vorzugsweise lässt sich die Polypeptidsequenz, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 11 oder 14 in Reges et al. (2004) abgebildet ist, eher bei der ”Subfamilie II”-Gruppe von GATA-like-Polypeptiden, wie definiert in Reges et al. (2004), umfassend die durch SEQ ID NR: 129 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
  • Darüber hinaus weisen GATA-like-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise DNA-Bindungs-Aktivität auf. Die Consensus-DNA-Sequenz, welche von dem GATA-Zn-Finger erkannt wird, ist [AT]GATA[AG]. Hilfsmittel und Techniken zum Messen von DNA-Bindungs-Aktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt, siehe zum Beispiel Teakle et al. (Plant Mol. Biol. 50, 43–57, 2002) oder Ghirlando und Trainor (J. Biol. Chem. 278, 45620–45628, 2003).
  • Ferner ergeben GATA-like-Polypeptide, wenn sie gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung in Reis exprimiert werden, wie in den Beispielen 7 und 8 geschildert, Pflanzen mit erhöhtem Tausendkerngewicht.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 128 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 129 codiert, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung können in vorteilhafter Weise unter Verwendung einer/eines beliebigen ”GATA-like” codierenden Nukleinsäure oder GATA-like-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
  • Ein ”ADA2-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezeichnet ein beliebiges transkriptionales Adaptor-Polypeptid, umfassend zwei oder mehr der folgenden Motive:
    • (vii) eine Zink (Zn)-Finger-ZZ-Typ-Domäne
    • (viii) eine SANT-DNA-Eindungs-Domäne
    • (ix) eine Calcium-EF Hand-Domäne
    • (x) eine SWIRM-Domäne
  • Ein Prototyp der Domäne vom Zink (Zn)-Finger-ZZ-Typ ist in Dystrophin, CBP/p300-Protein, vorhanden. Die Cys-x2-Cys-Motive in ZZ-Domänen erinnern an die Cys-x2-Cys-” Knuckles” bzw. -Knöchel, welche in Zinkfingern vorkommen. Vier bis sechs Cysteinreste in der Domänensequenz sind für das Koordinieren von Zinkionen verantwortlich, wodurch die Struktur verstärkt wird (Ponting et al., Trends Biochem. Sci. 1996; 21: 11–13). Die Zinkfinger-ZZ-Typ-Domäne in ADA2-Polypeptiden könnte an der Erleichterung von Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sein. Von einem Fragment von ADA2a- und ADA2b-Proteinen aus Arabidopsis thaliana, das die ZZ-Zinkfinger-Domäne umfasst, wurde gezeigt, dass es an GCN5-Protein bindet (Mao et al., 2006).
  • Bei einer SANT-DNA-Bindungs-Domäne handelt es sich um eine Subfamilie der Myb-DNA-Bindungs-Domäne (Aasland et al., 1996, Trends Biochem. Sci. 1996; 21: 87–88). Polypeptide, welche SANT-DNA-Eindungs-Domänen umfassen, erkennen spezifisch die Sequenz YAAC(G/T)G, welche in einem Genpromotor vorhanden ist. Bevorzugte ADA-Polypeptide, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, binden an einen Genpromotor, der die Sequenz YAAC(G/T)G umfasst (worin Y für C oder T stehen kann).
  • Die SWIRM-Domäne (Pfam-Zugangsnummer PF04433) ist eine kleine, alpha-helikale Domäne von etwa 85 Aminosäureresten, die in eukaryotischen chromosomalen Proteinen gefunden wird. Sie ist nach den Proteinen SWI3, RSC8 und MOIRA benannt, in denen sie zuerst erkannt worden ist. Es wird vorhergesagt, dass diese Domäne Protein-Protein-Wechselwirkungen beim Zusammenbau von Chromatin-Protein-Komplexen vermittelt (Lenkart et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2006; 103: 2057–2062).
  • Eine Calcium (Ca) bindende EF-Hand-Domäne besteht aus einer zwölf Reste großen Schleife, die auf beiden Seiten von einer zwölf Reste großen alpha-helikalen Domäne flankiert ist. In einer EF-Hand-Schleife wird das Calciumion in einer pentagonal-bipyramidalen Konfiguration koordiniert. Die an der Bindung beteiligten sechs Reste befinden sich an den Positionen 1, 3, 5, 7, 9 und 12; diese Reste werden mit X, Y, Z, -Y, -X und -Z bezeichnet. Das invariante Glu oder Asp an der Position 12 stellt zwei Sauerstoffe zur ”Ligandenanheftung” von Ca (zweizähniger Ligand) bereit (Finn und Forsen 1995 Structure, 3: 7–11).
  • Ein bevorzugtes, in den Verfahren der Erfindung nützliches, ADA2-Polypeptid umfasst zwei oder mehrere der folgenden Domänen:
    • (i) eine Zink(Zn)-Finger-ZZ-Typ-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 207: kpglyccnycdkdlsglvrfkcavcmdfdlcvecfsvgvelnrhkn, oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 207 repräsentierten Domäne oder zu einer beliebigen Zn-Finger-ZZ-Typ-Domäne, wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden;
    • (ii) eine SANT-DNA-Eindungs-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 208: vtsdwnadeeillleaiatygfgnwkevadhvgsktttecikhfnsaym, oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 208 repräsentierten Domäne oder zu einer beliebigen SANT-Domäne, wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden;
    • (iii) eine Ca-bindende EF-Hand-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 209: dndaeglladmef, oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 209 repräsentierten Domäne oder zu einer beliebigen Ca-bindenden EF-Hand-Domäne, wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden;
    • (iv) eine SWIRM-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 210: priysgldtwdvdgllgadllsetekkmcnetrilpvhylkmldiltreikkgqikkksdaysffkvepskvdrvydmlvhkgigdst, oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 210 repräsentierten Domäne oder zu einer beliebigen SWRIM-Domäne, wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden.
  • Die in den Verfahren der Erfindung nützlichen ADA2-Polypeptide sind vorzugsweise diejenigen mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 98% oder mehr Sequenzidentität zu einem beliebigen, in der Tabelle A angegebenen Polypeptid.
  • Eine Zink(Zn)-Finger-ZZ-Typ-Domäne, eine SANT-DNA-Eindungs-, eine Calcium-EF-Hand-Domäne und eine SWIRM-Domäne, die in einem Polypeptid enthalten sind, können durch Durchsuchen von speziellen Datenbanken identifiziert werden, welche Sammlungen von multiplen Sequenz-Alignments und Hidden-Markov-Modellen, die konservierte Proteindomänen und -familien abdecken, enthalten, wie etwa Pfam, das am Sanger Institute, Großbritannien, verfügbar ist. Alternativ dazu können die oben erwähnten Domänen gefunden werden mittels Durchrastern der ”The Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites” (InterPro)-Datenbank, um ein signifikantes Sequenzalignment mit einer bekannten Zink(Zn)-Finger-ZZ-Typ-Domäne, einer SANT-DNA-Eindungs-, einer Calcium-EF-Hand-Domäne und einer SWIRM-Domäne zu detektieren. Die InterPro-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine zum Ableiten von Proteinsignaturen verwenden. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien bereitgehalten. Ein signifikantes Alignment zwischen der Sequenz zweier Polypeptide oder zweier Domänen, wie hierin definiert, ist ein Alignment mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, einem e-Wert, geringer als e–5 (e hoch minus 5), 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75, 1·e–100, 1·e–200, 1·e–300, 1·e–400, 1·e–500, 1·e–600, 1·e–700 und 1·e–800. Die Polypeptidsequenzen können mit Hilfe eines beliebigen der im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren aligniert werden, einschließlich globalen und lokalen Alignmentverfahren, wie Blast-Algorithmen, z. B. dem Algorithmus, der in Altschul, SF, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10, beschrieben ist. Die Wahrscheinlichkeit, dass das Alignment mit einer gegebenen Sequenz auftritt, wird als Grundlage für die Identifizierung ähnlicher Polypeptide herangezogen. Ein Parameter, welcher typischerweise verwendet wird, um eine derartige Wahrscheinlichkeit zu vertreten, ist der sogenannte e-Wert (E-Wert). Der E-Wert ist ein Maß der Zuverlässigkeit der S-Wertung. Die S-Wertung ist ein Maß der Ahnlichkeit der zwei Sequenzen, die aligniert werden. Der e-Wert beschreibt, wie oft, der Erwartung nach, eine gegebene S-Wertung rein zufällig auftritt. Der e-Wert kann so hoch wie 1,0 sein.
  • Vorzugsweise umfassen in den Verfahren der Erfindung nützliche ADA2-Polypeptide zwei oder mehr der folgenden Domänen:
    • (i) eine Zink (Zn)-Finger-ZZ-Typ-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, einem e-Wert, geringer als e–5, 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75, 1·e–100, 1·e–200, 1·e–300, 1·e–400, 1·e–500, 1·e–600, 1·e–700 und 1·e–800, wenn sie mit einer bekannten Zn-Finger-ZZ-Typ-Domäne aligniert wird, weiter bevorzugt, wenn sie mit einer beliebigen der Zn-Finger-ZZ-Typ-(Domänen) von Tabelle C aligniert wird;
    • (ii) eine SANT-DNA-Bindungsdomäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, einem e-Wert, geringer als e–5, 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75, 1·e–100, 1·e–200, 1·e–300, 1·e–400, 1·e–500, 1·e–600,, 1·e–700 und 1·e–800 wenn sie mit einer bekannten SANT-DNA-Bindungsdomäne aligniert wird, weiter bevorzugt, wenn sie mit einer beliebigen der SANT-DNA-Bindungsdomäne-Domänen von Tabelle C aligniert wird;
    • (iii) eine Calcium-EF-Hand-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, einem e-Wert, geringer als e–5, 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75, 1·e–100, 1·e–200, 1.e–300, 1·e–400, 1·e–500, 1·e–600, 1·e–700 und 1·e–800 wenn sie mit einer bekannten Calcium-EF-Hand-Domäne aligniert wird, weiter bevorzugt, wenn sie mit einer beliebigen der Calcium-EF-Hand-Domänen von Tabelle C aligniert wird;
    • (iv) eine SWIRM-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, einem e-Wert, geringer als e–5, 1·e–10, 1·e–15, 1·e–20, 1·e–25, 1·e–50, 1·e–75, 1·e–100, 1·e–200, 1·e–300, 1·e–400, 1·e–500, 1·e–600, 1·e–700 und 1·e–800 wenn sie mit einer bekannten SWIRM-Domäne aligniert wird, weiter bevorzugt, wenn sie mit einer beliebigen der SWIRM-Domäne-Domänen von Tabelle C aligniert wird.
  • Alternativ dazu kann ein ADA2-Polypeptid als ein beliebiges Polypeptid definiert werden, das signifikant mit einem bekannten ADA2-Polypeptid, vorzugsweise mit einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A, aligniert.
  • Vorzugsweise ist die in den Verfahren der Erfindung nützliche ADA2-Polypeptidsequenz eine solche, welche sich, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 17 abgebildet ist, bei einer beliebigen der Sequenzen im Baum, weiter bevorzugt bei den Sequenzen in der Gruppe Id, welche SEQ ID NR: 182 umfasst, einordnen lässt.
  • Typischerweise wird in ADA2-Polypeptiden die Zn-Finger-ZZ-Domane am N-Terminus gefunden, die SANT-DNA-Bindungsdomäne im zentralen Abschnitt, und die SWIRM-Domäne wird am C-Terminus gefunden. ADA2-Polypeptid sind typischerweise im Zellkern lokalisiert.
  • Die pflanzlichen ADA2-Polypeptide können ein nukleares Lokalisationssignal umfassen, wie zum Beispiel jenes, das in 15 für die SEQ ID NR: 182 gezeigt ist.
  • Darüber hinaus steigern ADA2-Polypeptide typischerweise die Fähigkeit von GCN5, Histone in vitro zu acetylieren, und ermöglichen GCN5, nucleosomale Histone zu acetylieren. Hilfsmittel und Techniken zum Messen der Histonacetylation sind früher beschrieben worden (Stockinger et al., 2001; Mao et al., 2006). Die Regulierung der Aktivität von ADA2-Polypeptiden von pflanzlichem Ursprung in Pflanzenzellen kann über Acetylierung stattfinden. Es ist vorgeschlagen worden, dass die Lysinreste K257 und K215 in ADA2a in ADA2b von Arabidopsis thaliana acetyliert sein könnten.
  • Die Erfindung stellt WDR23-like-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen und WDR23-like-Polypeptide bereit, wobei die erhöhte Expression der isolierten Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhöht.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein WDR23-like-Polypeptid codiert, bereitgestellt, umfassend:
    • (i) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 219, SEQ ID NR: 225 oder SEQ ID NR: 229 repräsentiert;
    • (ii) das Komplement einer isolierten Nukleinsauresequenz, wie durch SEQ ID NR: 219, SEQ ID NR: 225 oder SEQ ID NR: 229 repräsentiert;
    • (iii) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 220, SEQ ID NR: 226 oder SEQ ID NR: 230 repräsentiert;
    • (iv) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die aus einer Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 220, SEQ ID NR: 226 oder SEQ ID NR: 230, als ein Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes abgeleitet ist;
    • (v) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die zum stringenten Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 219, SEQ ID NR: 225 oder SEQ ID NR: 229, oder an ihr Komplement, in der Lage ist;
    • (vi) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, aufweisend in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität mit einer Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 220, SEQ ID NR: 226 oder SEQ ID NR: 230 repräsentiert;
    • (iv) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, umfassend eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer ”Conserved Domain”, wie durch SEQ ID NR: 271 repräsentiert.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls ein isoliertes WDR23-like-Polypeptid bereitgestellt, umfassend:
    • (i) eine Polypeptidsequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 220, SEQ ID NR: 226 oder SEQ ID NR: 230;
    • (ii) eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Aminosäuresequenzidentität zu einer Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 220, SEQ ID NR: 226 oder SEQ ID NR: 230 repräsentiert;
    • (iii) ein Polypeptid, umfassend eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer ”Conserved Domain”, wie durch SEQ ID NR: 271 repräsentiert;
    • (iii) Derivate von einer beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in (i) bis (iii) oben stehend angegeben sind.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, umfassend das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein WDR23-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein WDR23-like-Polypeptid codiert, besteht im Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein WDR23-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
  • Jegliche hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Polypeptid” versteht sich so, dass ein WDR23-like-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäuresequenz” versteht sich so, dass eine Nukleinsäuresequenz gemeint ist, die zum Codieren eines derartigen WDR23-like-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäuresequenz, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist) ist eine beliebige Nukleinsäuresequenz, welche den Typ von Polypeptid codiert, der nun beschrieben wird, wobei sie hierin nachstehend ebenfalls als ”WDR23-like-Nukleinsäuresequenz” oder ”WDR23-like-Gen” bezeichnet wird.
  • Ein ”WDR23-like-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein beliebiges Polypeptid, umfassend eine Domäne mit mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Conserved Domain (CD), wie sie von SEQ ID NR: 271 repräsentiert wird.
  • Alternativ oder zusätzlich dazu, bezieht sich ein ”WDR23-like-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf ein beliebiges Polypeptid, umfassend: (i) mindestens vier WD40-Repeats mit der PFAM-Zugangsnummer PF00400; und (ii) mindestens zwei konservierte DxR-Motive am Ende von zwei aufeinanderfolgenden WD40-Repeats.
  • Alternativ oder zusätzlich dazu, bezieht sich ein ”WDR23-like-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf ein beliebiges Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem WDR23-like-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 216, oder zu einer beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A hierin angegeben sind.
  • Eine Analysis der Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 216 ist hierin nachstehend in Beispiel 4 wiedergegeben. Zum Beispiel umfasst ein WDR23-like-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 216, mindestens vier WD40-Repeats mit der PFAM-Zugangsnummer PF00400. Domänen können auch mit Hilfe von Routinetechniken identifiziert werden, wie etwa durch Sequenzalignment. Ein Alignment der Volllängenpolypeptide von Tabelle A hierin ist in der 23 gezeigt. Derartige Alignments sind zur Identifizierung der meisten konservierten Domänen unter den WDR23-like-Polypeptiden nützlich, wie etwa der Conserved Domain (CD), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 271 (enthalten in SEQ ID NR: 216).
  • Verfahren für das Alignment von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASIA und TFASTA zu solchen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständigen Sequenzen überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welches die Anzahl von Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl von Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem zum Beispiel der ClustaIW-Mehrfach-Sequenzalignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen Parametern für paarweises Alignment und einer Wertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket (Campanella et al., (2003) BMC Bioinformatics, 10: 29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using Protein oder DNA sequences) verfügbar sind. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können, anstatt der Verwendung von Volllängensequenzen zur Identifizierung von Homologen, auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäuresequenz oder Polypeptidsequenz oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, wobei die oben erwähnten Programme unter Anwendung der Standardparameter benutzt werden. Das Beispiel 3 hierin beschreibt in Tabelle B den Prozentsatz der Identität zwischen dem WDR23-like-Polypeptid, wie durch SEQ ID NR: 216 repräsentiert, und den in Tabelle A aufgelisteten Volllängen-WDR23-like-Polypeptiden, der so niedrig wie 54% Aminosäuresequenzidentität sein kann. Der Prozentsatz der Identität kann auf 69% erhöht werden, wenn die Identitätsberechnung zwischen der Conserved Domain (CD), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 271 (enthalten in SEQ ID NR: 216), und der Conserved Domain der WDR23-like-Polypeptide von Tabelle A, und repräsentiert in 23, durchgeführt wird. Die Ergebnisse derartiger Berechnungen sind in der Tabelle B der vorliegenden Patentanmeldung wiedergegeben.
  • Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Die Kenntnis der Lokalisierung eines Proteins hilft dabei, seine Funktion aufzuklären. Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisation bis zum Tagging von Proteinen unter Einsatz von Grün-fluoreszierendem Protein (GFP) oder beta-Glucuronidase (GUS). Derartige Verfahren sind exakt, wenngleich arbeitsintensiv im Vergleich zu computergestützten Verfahren. Kürzlich sind große Fortschritte bei der computergestützten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht worden. Unter den, einem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannten, Algorithmen sind bei den ExPASy-Proteomics-Werkzeugen, welche vom Swiss Institute for Bioinformatics (Schweizer Institut für Bioinformatik) bereitgestellt werden, zum Beispiel PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale, TMHMM und andere verfügbar.
  • Ferner sind in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche WDR23-like-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise in der Lage zur Wechselwirkung mit anderen Polypeptiden, und zwar über ihre WD40-Repeat-Motive. Für Protein-Protein-Aktivität gibt es zahlreiche Assays, wie etwa Hefe-Zwei-Hybrid-Assays, Tandem-Affinitätsreinigung (TAP), gefolgt von Massenspektrometrie, Co-Affinitätsreinigung, etc.
  • Hoch-eingestufte Übereinstimmungstreffer sind diejenigen mit einem niedrigen E-Wert. Je niedriger der E-Wert, umso signifikanter die Wertung (oder in anderen Worten, umso niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Fachgebiet allgemein bekannt. Zusätzlich zu E-Werten, werden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei über eine bestimmte Länge hinweg verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen). Im Fall von großen Familien kann ClustaIW eingesetzt werden, gefolgt von einem Nachbarkopplungs- bzw. ”Neighbour joining”-Baum, um bei der Visualisierung der Einordnung bzw. Clusterung verwandter Gene zu helfen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
  • Auch Nukleinsäurevarianten können bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Zu Beispielen solcher Varianten zählen Nukleinsäuren, die Homologe und Derivate von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” wie hierin definiert beschaffen sind. Außerdem sind Nukleinsäuren in den Verfahren der Erfindung nützlich, welche Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, besitzen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität, wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind.
  • Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuren, die PATL- oder PRP38- oder GATA-like- oder ADA2- oder WDR23-like-Polypeptide codieren, Nukleinsäuren, die hybridisieren an Nukleinsäuren, die PATL- oder PRP38- oder GATA-like- oder ADA2- oder WDR23-like-Polypeptide codieren, Splice-Varianten von Nukleinsäuren, die PATL- oder PRP38- oder GATA-like- oder ADA2- oder WDR23-like-Polypeptide codieren, allelische Varianten von Nukleinsäuren, die PATL- oder PRP38- oder GATA-like- oder ADA2- oder WDR23-like-Polypeptide codieren, sowie Varianten von Nukleinsäuren, die PATL- oder PRP38- oder GATA-like- oder ADA2- oder WDR23-like-Polypeptide codieren, welche durch Gen-Shuffling erhalten werden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Splice-Variante, allelische Variante und Gen-Shuffling sind wie hierin beschrieben beschaffen.
  • Nukleinsäuren, die PATL- oder PRP38- oder GATA-like- oder ADA2- oder WDR23-like-Polypeptide codieren, müssen nicht Volllängenukleinsäuren sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit Volllänge angewiesen ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einem Abschnitt von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
  • Ein Abschnitt einer Nukleinsäure kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäure hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere codierende (oder nicht-codierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere codierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
  • Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, codieren ein PATL- oder PRP38- oder ADA2-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in der Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen auf. Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, umfassen eine Proteindomäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%; 98% oder mehr Sequenzidentität zu einer beliebigen der konservierten Domänen, die in Tabelle C definiert sind. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist, bei einer beliebigen der Sequenzen in dem Baum, weiter bevorzugt bei den Sequenzen in der Gruppe Ia, welche die SEQ ID NR: 2 umfasst, einordnen lässt. Weiter bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 76, am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt beschaffen, wie es durch SEQ ID NR: 82 repräsentiert wird. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn es in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 8 abgebildet ist, bei einer beliebigen der Sequenzen in Gruppe Ib, welche die SEQ ID NR: 77 umfasst, einordnen lässt.
  • In Bezug auf GATA-like-Polypeptide, codieren Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, ein GATA-like-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in der Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 128. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, die sich, wenn sie in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet wird, wie demjenigen, der in 11 oder 14 in Reges et al. (2004) abgebildet ist, eher bei der ”Subfamilie II”-Gruppe von GATA-like-Polypeptiden, wie definiert in Reges et al. (2004), umfassend die durch SEQ ID NR: 129 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt.
  • Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, codieren ein WDR23-like-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, eine Länge von mindestens 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1480 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptidsequenz-Polypeptid, umfassend eine Domäne mit mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Conserved Domain (CD), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 271. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 215.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Nukleinsäure, die unter Bedingungen verringerter Stringenz, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, die ein PATL- oder PRP38- oder GATA-like- oder ADA2- oder WDR23-like-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, oder mit einem Abschnitt davon, wie hierin definiert, in der Lage ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren in der Lage ist, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure in der Lage ist, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert.
  • In den Verfahren der Erfindung nützliche hybridisierende Sequenzen codieren ein PATL- oder PRP38- oder GATA-like- oder ADA2- oder WDR23-like-Polypeptid, wie hierin definiert, aufweisend im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder einen Abschnitt von einer beliebigen dieser Sequenzen, in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder die hybridisierende Sequenz ist zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure in der Lage, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 1, oder an einen Abschnitt davon, oder an SEQ ID NR: 76 oder an einen Abschnitt davon, oder an SEQ ID NR: 128 oder an einen Abschnitt davon, oder an SEQ ID NR: 181 oder an einen Abschnitt davon in der Lage. In Bezug auf die WDR23-like-Sequenzen ist die hybridisierende Sequenz vorzugsweise zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz in der Lage, die eine Polypeptidsequenz codiert, welche eine Domäne mit mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Conserved Domain (CD), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 271, umfasst. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 215, oder an einen Abschnitt davon, in der Lage.
  • Vorzugsweise codiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, sofern in Volllänge und in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet, wie demjenigen, der in 3 dargestellt ist, bei einer beliebigen der Sequenzen im Baum, weiter bevorzugt bei den Sequenzen in Gruppe Ia, welche die SEQ ID NR: 2 umfasst, einordnen lässt, oder sich im Fall von demjenigen, der in 8 dargestellt ist, bei einer beliebigen der Sequenzen in Gruppe Ib, welche die SEQ ID NR: 77 umfasst, einordnen lässt. Außerdem codiert die hybridisierende Sequenz vorzugsweise ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, sofern in Volllänge und in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet, wie demjenigen, der in 11 oder 14 in Reyes et al. (2004) abgebildet ist, eher bei der ”Subfamilie II”-Gruppe von GATA-ähnlichen Polypeptiden, wie definiert in Reyes et al. (2004), umfassend die durch SEQ ID NR: 129 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen lässt
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Splice-Variante, die ein PATL- oder PRP38- oder GATA-like- oder ADA2- oder WDR23-like-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert, wobei eine Splice-Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Splice-Variante von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder von einer Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
  • Bevorzugte Splice-Varianten sind Splice-Varianten einer von SEQ ID NR: 1 repräsentierten Nukleinsäure oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Weiter bevorzugt ist die Splice-Variante eine Variante von SEQ ID NR: 1. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 3 dargestellt ist, bei einer beliebigen der Sequenzen im Baum, weiter bevorzugt bei den Sequenzen in Gruppe Ia, welche die SEQ ID NR: 2 umfasst, einordnen.
  • Andere bevorzugte Splice-Varianten sind Splice-Varianten einer von SEQ ID NR: 76 repräsentierten Nukleinsäure oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 77 codiert. Weiter bevorzugt ist die Splice-Variante eine Variante von SEQ ID NR: 76, am stärksten bevorzugt wird eine Splice-Variante, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 80. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 8 dargestellt ist, bei einer beliebigen der Sequenzen in Gruppe Ib, welche die SEQ ID NR: 77 umfasst, einordnen.
  • Weiter bevorzugte Splice-Varianten sind Splice-Varianten einer von SEQ ID NR: 128 repräsentierten Nukleinsäure oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 129 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 11 oder 14 in Reyes et al. (2004) abgebildet ist, eher bei der ”Subfamilie II”-Gruppe von GATA-ähnlichen Polypeptiden, wie definiert in Reyes et al. (2004), umfassend die durch SEQ ID NR: 129 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
  • Weitere bevorzugte Splice-Varianten sind Splice-Varianten einer von SEQ ID NR: 181 repräsentierten Nukleinsäure oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 182 codiert. Weiter bevorzugt ist die Splice-Variante eine Variante von SEQ ID NR: 181. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 17 dargestellt ist, bei einer beliebigen der Sequenzen im Baum, weiter bevorzugt bei den Sequenzen in der Gruppe Id, welche die SEQ ID NR: 182 umfasst, einordnen.
  • Bei dem humanen Ortholog WRD23 sind mehrere Isoformen (NCBI-Eintrag AK057636.1) vorhanden, so dass auch für pflanzliche Nukleinsäuresequenzen, die WRD23-like-Polypeptide codieren, Splice-Varianten vorhergesagt werden.
  • In Bezug auf die WDR23-like Sequenzen handelt es sich bei bevorzugten Splice-Varianten um Splice-Varianten einer von SEQ ID NR: 215 repräsentierten Nukleinsäuresequenz oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 216 codiert. Vorzugsweise ist die Splice-Variante eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die eine Polypeptidsequenz codiert, umfassend eine Domäne mit mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Conserved Domain (CD), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 271.
  • Eine andere Nukleinsäurevariante, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein PATL- oder PRP38- oder GATA-like- oder ADA2- oder WDR23-like-Polypeptid, wie hierin oben definiert, codiert, wobei eine allelische Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelischen Variante von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelischen Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert.
  • Die allelischen Varianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das PATL-Polypeptid von SEQ ID NR: 2 und eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 abgebildeten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 1 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 3 dargestellt ist, bei einer beliebigen der Sequenzen im Baum, weiter bevorzugt bei den Sequenzen in Gruppe Ia, welche die SEQ ID NR: 2 umfasst, einordnen.
  • Andere allelische Varianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das PRP38-Polypeptid von SEQ ID NR: 77 und eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 abgebildeten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 76 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 77 codiert.
  • Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 8 dargestellt ist, bei einer beliebigen der Sequenzen in Gruppe Ib, welche die SEQ ID NR: 77 umfasst, einordnen.
  • In Hinsicht auf die GATA-like-Polypeptide weisen die allelischen Varianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das GATA-like-Polypeptid von SEQ ID NR: 129 und eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 abgebildeten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
  • Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 128 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 129 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 11 oder 14 in Reyes et al. (2004) abgebildet ist, eher bei der ”Subfamilie II”-Gruppe von GATA-ähnlichen Polypeptiden, wie definiert in Reyes et al. (2004), umfassend die durch SEQ ID NR: 129 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
  • In Hinsicht auf ADA2-Polypeptide, weisen die allelischen Varianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das ADA2-Polypeptid von SEQ ID NR: 182 und eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 abgebildeten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 181 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 182 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 17 dargestellt ist, bei einer beliebigen der Sequenzen im Baum, weiter bevorzugt bei den Sequenzen in Gruppe Id, welche die SEQ ID NR: 182 umfasst, einordnen.
  • In Hinsicht auf WDR23-like-Polypeptide weisen die allelischen Varianten, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das WDR23-like-Polypeptid von SEQ ID NR: 216 und eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 abgebildeten Polypeptidsequenzen auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 215 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 216 codiert. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante einer Polypeptidsequenz, umfassend eine Domäne mit mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Conserved Domain (CD), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 271.
  • Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls zur Anwendung kommen, um Varianten von Nukleinsäuren zu erzeugen, welche PATL- oder PRP38- oder GATA-like- oder ADA2- oder WDR23-like-Polypeptide codieren, wie oben definiert, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” wie hierin definiert beschaffen ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Variante einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert, wobei die Varianten-Nukleinsäure durch Gen-Shuffling erhalten wird.
  • Vorzugsweise lässt sich die Aminosäuresequenz, die von der durch Gen-Shuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codiert wird, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 3 abgebildet ist, bei einer beliebigen der Sequenzen im Baum, weiter bevorzugt bei den Sequenzen in Gruppe Ia, welche die SEQ ID NR: 2 umfasst, oder SEQ ID NR: 77, einordnen. Ebenfalls lässt sich die Aminosäuresequenz, die von der durch Gen-Shuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codiert wird, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 11 oder 14 in Reges et al. (2004) abgebildet ist, vorzugsweise eher bei der ”Subfamilie II”-Gruppe von GATA-ähnlichen Polypeptiden, wie definiert in Reges et al. (2004), umfassend die durch SEQ ID NR: 129 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen. In Hinsicht auf ADA2 lässt sich die Aminosäuresequenz, die von der durch Gen-Shuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codiert wird, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 17 dargestellt ist, vorzugsweise bei einer beliebigen der Sequenzen im Baum, weiter bevorzugt bei den Sequenzen in Gruppe Id, welche die SEQ ID NR: 182 umfasst, einordnen. In Hinsicht auf WDR23 codiert die durch Gen-Shuffling erhaltene Varianten-Nukleinsäuresequenz eine Polypeptidsequenz, umfassend eine Domäne mit mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Conserved Domain (CD), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 271.
  • Darüber hinaus können Nukleinsäure-Varianten auch durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Es sind mehrere Verfahren verfügbar, um eine ortsgerichtete Mutagenese zu bewirken, wobei die häufigsten PCR-basierende Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).
  • PATL- oder PRP38- oder GATA-like- oder ADA2-Polypeptide codierende Nukleinsäuren können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die PATL- oder die GATA-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt einer monokotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, und am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa. Vorzugsweise stammt die PRP38-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, und am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana. Vorzugsweise stammt die ADA2-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, und am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Arabidopsis thaliana. WDR23-like-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Die ein WDR23-like-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz stammt aus der Domäne der Eukaryota, vorzugsweise aus dem Pflanzenreich, weiter bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze. Weiter bevorzugt stammt die ein WDR23-like-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt stammt die ein WDR23-like-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana.
  • Die vorliegende Erfindung stellt in vorteilhafter Weise bislang unbekannte PATL-Nukleinsäuren und -Polypeptidsequenzen zur Verfügung.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, umfassend:
    • (i) eine Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 9; SEQ ID NR: 11; SEQ ID NR: 13; SEQ ID NR: 15; SEQ ID NR: 17; SEQ ID NR: 19; SEQ ID NR: 21; SEQ ID NR: 23; SEQ ID NR: 25 und SEQ ID NR: 27;
    • (ii) eine Nukleinsäure oder ein Fragment davon, die/das zu einer beliebigen der in (i) angegebenen SEQ ID NRn komplementär ist;
    • (iii) eine Nukleinsäure, codierend ein PATL-Polypeptid, mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, angegeben in SEQ ID NR: 10; SEQ ID NR: 12; SEQ ID NR: 14; SEQ ID NR: 16; SEQ ID NR: 18; SEQ ID NR: 20; SEQ ID NR: 22; SEQ ID NR: 24; SEQ ID NR: 26 und SEQ ID NR: 28;
    • (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen zum Hybridisieren an eine beliebige der in (i), (ii) oder (iii) obenstehend angegebenen Nukleinsäuren befähigt ist.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, umfassend:
    • (i) eine Aminosäuresequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, angegeben in SEQ ID NR: 10; SEQ ID NR: 12; SEQ ID NR: 14; SEQ ID NR: 16; SEQ ID NR: 18; SEQ ID NR: 20; SEQ ID NR: 22; SEQ ID NR: 24; SEQ ID NR: 26 und SEQ ID NR: 28;
    • (ii) Derivate von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, die in (i) angegeben sind.
  • Die Ausführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften. Insbesondere ergibt die Ausführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hierin ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
  • Es versteht sich, dass die Bezugnahme hierin auf gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften eine Erhöhung der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeutet, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile unterhalb des Erdbodens einschließen kann. Insbesondere handelt es sich bei derartigen erntefähigen Teilen um Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
  • Wenn man Mais als ein Beispiel heranzieht, kann sich die Ertragserhöhung, unter anderem, als eines oder mehreres der folgenden manifestieren: Erhöhung der Anzahl an Pflanzen, welche pro Quadratmeter hervorgebracht werden, eine Erhöhung der Anzahl von Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Ackerreihen, der Anzahl der Kerne pro Reihe, des Kerngewichts, des Tausendkerngewichts, der Ährenlänge/Durchmesser, Erhöhung der Samen-Füllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100 ist). Wenn man Reis als Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung unter anderem als eine Erhöhung bei einem oder mehreren der folgenden manifestieren: Anzahl an Pflanzen pro Quadratmeter, Anzahl an Rispen pro Pflanze, Anzahl an Ährchen pro Rispe, Anzahl an Blüten (Blütchen) pro Rispe (welche ausgedrückt wird als ein Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen gegenüber der Anzahl an Hauptrispen), Erhöhung der Samenfüllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit 100, ist), Erhöhung des Tausendkerngewichts.
  • Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vor, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein PATL- oder PRP38- oder ein GATA-ähnliches oder ADA2- oder ein WDR23-ähnliches Polypeptid codiert, wie hierin definiert, umfasst.
  • Da die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung erhöhten Ertrag aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen eine erhöhte Wachstumsrate (wenigstens während eines Teils ihres Lebenszyklus) im Vergleich zur Wachstumsrate von Kontrollpflanzen bei einem entsprechenden Stadium in ihrem Lebenszyklus aufzeigen.
  • Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen überall in der gesamten Pflanze herrschen. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Der Lebenszyklus einer Pflanze kann sich so verstehen, dass die Zeit gemeint ist, welche benötigt wird, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, an welchem die Pflanze trockene reife Samen erzeugt hat, die ähnlich zum Ausgangsmaterial sind. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Früh-Wuchskraft, Wachstumsrate, Grünheits-Index, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann an einer oder mehreren Stufen im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Pflanzenlebenszyklus stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der frühen Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann eine erhöhte Wuchskraft reflektieren. Die Erhöhung in der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, was gestattet, dass Pflanzen später ausgesät und/oder früher abgeerntet werden, als es sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt kann mit einer früheren Blütezeit erreicht werden). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie das weitere Aussäen von Samen derselben Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel Säen und Ernten von Reispflanzen, gefolgt von Säen und Ernten weiterer Reispflanzen, sämtlich innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht wird, kann sie, in ähnlicher Weise, das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel das Säen und Ernten von Maispflanzen, gefolgt zum Beispiel von Aussaat und gegebenenfalls Ernte von Sojabohne, Kartoffel oder einer beliebigen anderen geeigneten Pflanze). Im Falle mancher Nutzpflanzen kann auch das mehrmalige Abernten vom gleichen Wurzelstock möglich sein. Das Andern des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Quadratmeter führen (aufgrund einer Erhöhung der Mehrmaligkeit (z. B. in einem Jahr), bei der eine beliebige jeweilige Pflanze angebaut und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch die Kultivierung transgener Pflanzen in einem weiteren geographischen Gebiet als bei ihren Wildtyp-Gegenstücken zulassen, da die territorialen Eingrenzungen für den Anbau einer Nutzpflanze häufig von nachteiligen Umweltbedingungen entweder zur Zeit des Pflanzens (frühe Jahreszeit) oder zur Zeit des Erntens (späte Jahreszeit) bestimmt werden. Derartige nachteilige Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt wird. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven ermittelt werden, wobei es sich bei derartigen Parametern, unter anderem, um T-Mid (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 90% ihrer maximalen Größe zu erreichen) handeln kann.
  • Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung, ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure umfasst, welche ein PATL- oder PRP38- oder ein GATA-ähnliches oder ADA2- oder ein WDR23-ähnliches Polypeptid, wie hierin definiert, codiert.
  • Eine Erhöhung in Ertrag und/oder Wachstumsrate findet unter typischen landwirtschafltichen Wachstumsbedingungen statt, welche die alltäglichen Stressarten umfassen, denen Pflanzen ausgesetzt sind. Pflanzen antworten typischerweise auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Mäßige bzw. milde oder alltägliche Stressformen sind demgegenüber Stressarten, denen eine Pflanze ausgesetzt ist, welche nicht dazu führen, dass die Pflanze das Wachstum vollständig, ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums, einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, weiter bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen. Auf Grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) werden starke Stressformen bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig angetroffen. Eine unter typischen landwirtschaftlichen Bedingungen kultivierte Pflanze kann häufig mäßigen Stressformen ausgesetzt sein. Als eine Konsequenz ist das, von mäßigem Stress induzierte, beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Milde Stressformen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressformen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressformen können zurückzuführen sein auf Dürre oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, der von einem Wasserstress (insbesondere wegen Dürre), Salzstress, oxidativen Stress oder einem ionischen Stress verursacht wird.
  • In Bezug auf den ”GATA-like” findet im Vergleich zu Kontrollpflanzen eine Erhöhung hinsichtlich Ertrag und/oder Wachstumsrate ungeachtet dessen statt, ob sich die Pflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen befindet oder ob die Pflanze verschiedenen Stressformen ausgesetzt ist. In Hinsicht auf WDR23, treten erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften ungeachtet dessen auf, ob sich die Pflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen befindet oder ob die Pflanze verschiedenen Stressformen ausgesetzt ist, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Mäßiger Stress ist demgegenüber als jeglicher Stress definiert, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig, ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums, einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, weiter bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen. Auf Grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) werden starke Stressformen bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig angetroffen. Als eine Konsequenz ist das, von mäßigem Stress induzierte, beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressformen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressformen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressformen können zurückzuführen sein auf Dürre oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen. Biotische Stressformen sind typischerweise diejenigen Stressarten, welchen von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit.
  • Im Besonderen können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen mit milder Dürre durchgeführt werden, wodurch man Pflanzen mit erhöhtem Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhält. Wie in Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen umweltbedingten Stressformen häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stress-Proteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit. Der Begriff Nicht-Stress-Bedingungen, wie hierin verwendet, beinhaltet die gelegentlichen oder alltäglichen mäßigen Stressformen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist, wie hierin definiert, aber beinhaltet nicht starke Stressformen.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt Pflanzen, die unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen von mäßiger Dürre kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrag in, unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter mäßigen Dürrebedingungen kultivierten Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein PATL- oder PRP38- oder ein GATA-like- oder ADA2- oder ein WDR23-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
  • Die Durchführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen, welche bei Kultivierung unter Bedingungen mit Nährstoffmangel, insbesondere unter Bedingungen mit Stickstoffmangel, erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, welche unter Bedingungen von Nährstoffmangel kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein PATL- oder PRP38- oder ein GATA-like- oder ADA2- oder ein WDR23-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Nährstoffmangel kann aus einem Mangel an Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und sonstigen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren. In Bezug auf WDR23 handelt es sich bei der verringerten Nährstoffverfügbarkeit vorzugsweise um verringerte Stickstoffverfügbarkeit.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen), die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, codierend ein PATL- oder PRP38- oder ein GATA-like- oder ADA2- oder ein WDR23-like-Polypeptid, wie oben definiert.
  • Die Erfindung sieht außerdem genetische Konstrukte und Vektoren zum Erleichtern des Einbringens und/oder der Expression von Nukleinsäuren in Pflanzen vor, welche PATL- oder PRP38- oder ein GATA-like- oder ADA2- oder ein WDR23-like-Polypeptide codieren. Die Genkonstrukte können in Vektoren inseriert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren des Gens von Interesse in Pflanzen hinein und für die Expression desselben in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hierin definiert, in den Verfahren der Erfindung vor.
  • Im Genaueren stellt die vorliegende Erfindung ein Konstrukt bereit, umfassend:
    • (a) eine Nukleinsäure, codierend ein PATL- oder PRP38- oder ein GATA-like- oder ADA2- oder ein WDR23-like-Polypeptid, wie oben definiert;
    • (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
    • (c) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, welche ein PATL- oder PRP38- oder ein GATA-like- oder ADA2- oder ein WDR23-like-Polypeptid codiert, wie oben definiert beschaffen. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert beschaffen.
  • In Hinsicht auf WDR23 ist eine der Steuerungssequenzen eines Konstrukts vorzugsweise ein konstitutiver Promotor, der aus einem Pflanzengenom isoliert wurde. Ein Beispiel eines konstitutiven pflanzlichen Promotors ist ein GOS2-Promotor, weiter bevorzugt ein Reis-GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 272. Alternativ dazu ist eine der Steuerungssequenzen eines Konstrukts ein meristemspezifischer Promotor, der aus einem Pflanzengenom isoliert wurde. Ein Beispiel eines pflanzlichen meristemspezifischen Promotors ist ein Metallothionein(MT)-Promotor, weiter bevorzugt ein Reis-MT-Promotor, am stärksten bevorzugt ein MT-Promotor, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 273.
  • Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit den genetischen Elementen gut vertraut, welche auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen erfolgreich zu transformieren und Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig an eine oder mehrere Steuerungssequenzen (mindestens an einen Promotor) verknüpft.
  • In vorteilhafter Weise kann ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz zu erhöhen. Ein konstitutiver Promotor ist in den Verfahren besonders nützlich. Vorzugsweise ist der konstitutive Promotor ebenfalls ein ubiquitärer Promotor. In Bezug auf die GATA-like-Polypeptide ist der Promotor von mittlerer Stärke. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin.
  • Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die PATL-Polypeptid codierende Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 1 repräsentiert wird, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer PATL-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen konstitutiven Promotor oder unter Steuerung durch einen Grüngewebe-Promotor begrenzt ist.
  • Es sollte ferner klar sein, dass die Anwendbarkeit der Erfindung nicht auf die PRP38-Polypeptid codierende Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 76, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer PRP38-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung eines konstitutiven Promotors oder unter Steuerung durch einen wurzelspezifischen Promotor begrenzt ist.
  • Es sollte außerdem klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung weder auf die GATA-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 128, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer GATA-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
  • Es sollte ebenfalls klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die ADA2-Polypeptid codierende Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 181, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer ADA2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen konstitutiven Promotor oder unter Steuerung durch einen Grüngewebe-Promotor begrenzt ist.
  • Es sollte auch klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf eine das WDR23-like-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 215, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer WDR23-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz unter Steuerung durch einen konstitutiven oder meristemspezifischen Promotor begrenzt ist.
  • Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein HMG-(high mobility group), ebenfalls bezeichnet als HMGP-Promotor, vorzugsweise ein HMG-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 33 ist, am stärksten bevorzugt ist der konstitutive Promotor beschaffen, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 33. Der für grünes Gewebe spezifische Promotor ist vorzugsweise ein EXP9-(Expansin), ebenfalls bezeichnet als EXP-, ebenfalls bezeichnet als HMGP-Promotor, vorzugsweise ein EXP-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der für grünes Gewebe spezifische Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 34 ist, am stärksten bevorzugt ist der konstitutive Promotor beschaffen, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 34. Siehe Tabelle 2 im hierin beschriebenen Abschnitt ”Definitionen” für Bezugsstellen, welche den HMG- und EXP-Promotor beschreiben, und für weitere Beispiele von konstitutiven und Grüngewebespezifischen Promotoren.
  • In Bezug auf PRP38 ist der konstitutive Promotor vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ähnlich ist zu SEQ ID NR: 127, am stärksten bevorzugt ist der konstitutive Promotor beschaffen, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 127. Siehe Tabelle ii im hierin beschriebenen Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren.
  • In Bezug auf die GATA-like-Polypeptide ist der konstitutive Promotor vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ähnlich ist zu SEQ ID NR: 135, am stärksten bevorzugt ist der konstitutive Promotor beschaffen, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 135. Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die im Wesentlichen ähnlich oder identisch zur SEQ ID NR. 136 ist, umfassend den GOS2-Promotor und die Nukleinsäure, die das GATA-like-Polypeptid von SEQ ID NR: 129 codiert.
  • In Bezug auf ADA2-Polypeptide, ist der konstitutive Promotor vorzugsweise ein HMG-(high mobility group), ebenfalls bezeichnet als HMGP-Promotor, vorzugsweise ein HMG-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ahnlich zu SEQ ID NR: 213 ist, am stärksten bevorzugt ist der konstitutive Promotor beschaffen, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 213. Der für grünes Gewebe spezifische Promotor ist vorzugsweise ein EXP9-(Expansin), ebenfalls bezeichnet als EXP-, ebenfalls bezeichnet als HMGP-Promotor, vorzugsweise ein EXP-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der für grünes Gewebe spezifische Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 214 ist, am stärksten bevorzugt ist der konstitutive Promotor beschaffen, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 214. Siehe Tabelle iii im hierin beschriebenen Abschnitt ”Definitionen” für Bezugsstellen, welche den HMG- und EXP-Promotor beschreiben, und für weitere Beispiele von konstitutiven und Grüngewebe-spezifischen Promotoren.
  • Weitere regulatorische Elemente können transkriptionelle sowie translationale Enhancer einschließen. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Terminator- und Enhancersequenzen, welche zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Außerdem kann eine Intron-Sequenz an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder in der codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert, wie es im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben wird. Andere Steuerungssequenzen (neben Promotor, Enhancer, Silencer, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Derartige Sequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt oder können von ihm ohne weiteres erhalten werden.
  • Die genetischen Konstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprung-Sequenz enthalten, welche für die Beibehaltung und/oder Replikation in einem spezifischen Zelltyp erfordert wird. Ein Beispiel besteht in dem Fall, dass ein genetisches Konstrukt in einer Bakterienzelle als ein episomales genetisches Element beibehalten werden muss (z. B. Plasmid- oder Cosmid-Molekül). Bevorzugte Replikationsursprünge schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den f1-ori und colE1 ein.
  • Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuren umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben. Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
  • Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Einbringen und die Expression, in einer Pflanze, von einer beliebigen Nukleinsäure, codierend ein PATL- oder PRP38- oder ein GATA-like, oder ADA2- oder ein WDR23-like-Polypeptid, wie hierin oben definiert.
  • Im Genaueren, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Samenertrag bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    • (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, einer PATL- oder PRP38- oder ADA2-Polypeptid codierenden Nukleinsäure; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern, und gegebenenfalls
    • (iii) Selektieren von Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften
  • In Bezug auf die GATA-like-Polypeptide, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem TKW, bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    • (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze oder Pflanzenzelle, einer GATA-like-Polypeptid oder einer WDR23-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  • Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines PATL- oder PRP38- oder eines GATA-like- oder ADA2- oder eines WDR23-like-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
  • Die Nukleinsäure kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” wird hierin ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
  • Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann auf dem Gebiet vertraut ist. Geeignete Verfahren können in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer gefunden werden.
  • Im Allgemeinen werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen, nach der Transformation, hinsichtlich des Vorhandenseins eines oder mehrerer Marker selektiert, welche von, mit dem Gen von Interesse cotransferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen codiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial, in der Regel, selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nicht-transformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und nach einer anfänglichen Wachstumsperiode einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterzogen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Kultivieren der Samen, nötigenfalls nach einer Sterilisierung, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ dazu durchrastert man die transformierten Pflanzen hinsichtlich des Vorhandenseins eines selektierbaren Markers, wie etwa denjenigen, welche oben beschrieben sind.
  • Im Anschluss an DNA-Transfer und Regeneration können die vermeintlich transformierten Pflanzen außerdem zum Beispiel unter Anwendung von Southern-Analyse hinsichtlich des Vorhandenseins des Gens von Interesse, der Kopienzahl und/oder der genomischen Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich dazu können die Expressionsspiegel der neu eingebrachten DNA unter Anwenden von Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei diese beiden Techniken dem Fachmann mit Durchschnittskenntnissen auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
  • Die erzeugten, transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) geselbstet und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken weiter vermehrt werden. Die erzeugten, transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen; klonale Transformanten (z. B. wobei alle Zellen transformiert sind, um die Expressionskassette zu enthalten); Propfungen von transformierten und nicht-transformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock an einen nicht-transformierten Spross gepropft wird) sein.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich in deutlicher Weise auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime bzw. Verbreitungseinheiten davon. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich weiterhin dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primären transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, weiche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung darin besteht, dass die Nachkommen dieselben genotypischen und/oder phänotypischen Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform in den Verfahren gemäß der Erfindung hervorgebracht werden.
  • Die Erfindung umfasst auch Wirtszellen, enthaltend eine isolierte Nukleinsäure, codierend ein PATL- oder PRP38- oder ein GATA-like- oder ADA2- oder ein WDR23-like-Polypeptid, wie hierin oben definiert. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuren oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind, im Prinzip, in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
  • Die Verfahren der Erfindung sind in vorteilhafter Weise auf eine beliebige Pflanze anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäumen oder Sträuchern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Nutzpflanze. Zu Beispielen von Nutzpflanzen zählen Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Alfalfa, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt ist die Pflanze eine monokotyledone Pflanze. Zu Beispielen von monokotyledonen Pflanzen zählt Zuckerrohr. Weiter bevorzugt ist die Pflanze ein Getreide. Zu Beispielen von Getreiden zählen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
  • Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze, wie etwa, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stengel, Wurzeln, Rhizome, Knollen und Zwiebeln, oder auch auf eine isolierte Nukleinsäuresequenz, codierend ein ”WDR23-like” (wie hierin oben definiert), die funktionsfähig mit einem pflanzlichen konstitutiven Promotor verbunden ist. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
  • Gemäß eines bevorzugten Merkmals der Erfindung, ist die modulierte Expression eine erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen, oder Genprodukten, sind im Fachgebiet allgemein dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
  • Wie oben erwähnt, erfolgt ein bevorzugtes Verfahren zur Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, codierend ein PATL- oder PRP38- oder ein GATA-like- oder ADA2- oder ein WDR23-like-Polypeptid durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein PATL- oder PRP38- oder ein GATA-like- oder ADA2- oder ein WDR23-like-Polypeptid; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften, auch unter Anwendung anderer allgemein bekannter Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, codierend PATL- oder PRP38- oder ein GATA-like- oder ADA2- oder ein WDR23-like-Polypeptid, wie hierin beschrieben, sowie die Verwendung dieser PATL- oder PRP38- oder eines GATA-like, oder ADA2- oder eines WDR23-like-Polypeptide(s) in der Steigerung beliebiger der zuvor erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen unter normalen Wachstumsbedingungen, unter abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen (vorzugsweise osmotischen Stress-Wachstumsbedingungen) sowie unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit.
  • Nukleinsäuren, codierend PATL oder PRP38, oder ein GATA-like- oder ADA2- oder ein WDR23-like-Polypeptid, die hierin beschrieben sind, oder die PATL- oder PRP38-, oder GATA-like- oder ADA2- oder WDR23-like-Polypeptid(e) selbst, können Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein PATL- oder PRP38-, oder ein GATA-like- oder ADA2- oder ein WDR23-like-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Nukleinsäuren/Gene, oder die PATL- oder PRP38-, oder ein GATA-like- oder ADA2-, oder ein WDR23-ähnliches, Polypeptid(e) selbst, können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben definiert, in den Verfahren der Erfindung zu selektieren.
  • Allelische Varianten einer/eines PATL oder PRP38 oder einen GATA-like oder ADA2 oder ein WDR23-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure/Gens können ebenfalls Anwendung in Marker-unterstützten Züchtungsprogrammen finden. Solche Züchtungsprogramme erfordern machmal das Einbringen von allelischer Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von allelischen Varianten von, unabsichtlich verursachtem, sogenannten ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung allelischer Varianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen allelischen Varianten der betreffenden Sequenz, welche einen erhöhten Ertrag ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene allelische Varianten der betreffenden Sequenz enthalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige allelische Variante identifiziert worden ist, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
  • Nukleinsäuren, codierend PATL- oder PRP38- oder ein GATA-like, oder ADA2, oder ein WDR23-like-Polypeptid(e), können ebenfalls als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, sowie als Marker für mit diesen Genen gekoppelte Merkmale verwendet werden. Derartige Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwicklen. Eine derartige Verwendung von PATL oder PRP38, oder ein GATA-like oder ADA2 oder ein WDR23-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäuren erfordert lediglich eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die PATL oder PRP38 oder ein GATA-like oder ADA2 oder ein WDR23-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäuren können als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J., Fritsch, EF., und Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laborstory Manual) von restriktionsverdauter pflanzlicher genomischer DNA können mit den PATL oder PRP38 oder GATA-like oder ADA2 oder ein WDR23-like codierenden Nukleinsäuren sondiert werden. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181) unterzogen werden, um eine genetische Karte zu erstellen. Darüber hinaus können die Nukleinsäuren verwendet werden, um Southern-Blots zu sondieren, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs aus einer Auswahl von Individuen enthalten, welche Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und verwendet, um die Position der PATL- oder PRP38-, oder ein GATA-like- oder ADA2- oder ein WDR23-like-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in der genetischen Karte zu berechnen, welche zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
  • Die Herstellung und Anwendung von Pflanzengen-abgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung wird in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41, beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwenden der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Interkross-Populationen, Rückkreuzungspopulationen, wahllos gekreuzte Populationen, nah-isogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
  • Die Nukleinsäuresonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al., in: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346, und darin zitierte Literaturstellen).
  • In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresonden bei der direkten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH)-Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl derzeitige Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (mehrere kb bis einige hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), können Verbesserungen der Empfindlichkeit eine Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
  • Eine Vielzahl von auf Nukleinsäure-Amplifikation basierenden Verfahren zur genetischen und physikalischen Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuren durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotid-Verlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping bzw. Bestrahlungs-Hybridkartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäure verwendet, um Primerpaare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlangerungsreaktionen zu entwerfen und herzustellen. Das Entwerfen derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. In Verfahren unter Anwendung von PCR-basierter genetischer Kartierung kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
  • Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen zu Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften kombiniert werden, wie weiteren ertragssteigernden Eigenschaften, Toleranz gegen abiotische und biotische Stressformen, Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
  • In einer Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf die nachfolgend zusammengefassten Gegenstände:
  • Punkt 1A Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein PATELLIN-Polypeptid codiert, in einer Pflanze und gegebenenfalls Selektieren von Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
  • Punkt 2A Verfahren gemäß Punkt 1A, wobei das PATELLIN-Polypeptid mindestens eine der folgenden Domänen umfasst:
    • (i) eine SEC14-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 71 repräsentiert: lpeldsvvfyrgadreghpvcynvygefqdkdlyekafgdeekrerflkwriqllergilsqldfspsgicsmvqvtdlknsppmlgkhravtrqavallqdnypefiakkvfinvpwwylaankmmspfltqrtkskfifaspaksaetlfryiapeqvpvqfgglfk oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% oder oder mehr Sequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 71 repräsentierten Domäne oder zu einer beliebigen SEC14-Domäne, wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden;
    • (ii) eine GOLD-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 72 repräsentiert: sdavteltikpssketveipvtenstigwelrvlgwevsygaeftpdaeggytvivgktrkvpaneepimkgsfkvgepgkivltinnpaskkkkllyrskv, oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 72 repräsentierten Domäne oder zu einer beliebigen GOLD-Domäne, wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden.
  • Punkt 3A Verfahren gemäß Punkt 1A oder 2A, wobei die modulierte Expression bewirkt wird durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein PATELLIN-Polypeptid codiert.
  • Punkt 4A Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die ein PATELLIN-Polypeptid codierende Nukleinsäure ein beliebiges der in Tabelle A aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure ist oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
  • Punkt 5A Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A angegebenen Proteine codiert.
  • Punkt 6A Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  • Punkt 7A Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1A bis 6A, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen von Stickstoffmangel erhalten werden.
  • Punkt 8A Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3A bis 7A, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor verbunden ist, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis.
  • Punkt 9A Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die ein PATELLIN-Polypeptid codierende Nukleinsäure von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, weiter bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa ist.
  • Punkt 10A Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein PATELLIN-Polypeptid codiert.
  • Punkt 11A Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein beliebiges der folgenden Merkmale umfasst:
    • (i) eine Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 9; SEQ ID NR: 11; SEQ ID NR: 13; SEQ ID NR: 15; SEQ ID NR: 17; SEQ ID NR: 19; SEQ ID NR: 21; SEQ ID NR: 23; SEQ ID NR: 25 und SEQ ID NR: 27;
    • (ii) ein Nukleinsäurefragment, das zu einer beliebigen der in (i) angegebenen SEQ ID NRn komplementär ist;
    • (iii) eine Nukleinsäure, codierend ein PATELLIN-Polypeptid mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, angegeben in SEQ ID NR: 10; SEQ ID NR: 12; SEQ ID NR: 14; SEQ ID NR: 16; SEQ ID NR: 18; SEQ ID NR: 20; SEQ ID NR: 22; SEQ ID NR: 24; SEQ ID NR: 26 und SEQ ID NR: 28;
    • (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen zum Hybridisieren an eine beliebige der in (i), (ii) oder (iii) obenstehend angegebenen Nukleinsäuren befähigt ist.
  • Punkt 12A Isoliertes Polypeptid, umfassend:
    • (I) eine Aminosäuresequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, angegeben in SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 16, SEQ ID NR: 18, SEQ ID NR: 20, SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 24; SEQ ID NR: 26 und SEQ ID NR: 28;
    • (ii) Derivate von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, die in (i) angegeben sind.
  • Punkt 13A Konstrukt, umfassend:
    • (I) Nukleinsäure, codierend ein PATELLIN-Polypeptid, wie definiert in den Punkten 1A, 2A oder 12A, oder eine Nukleinsäure gemäß Punkt 11;
    • (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
    • (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Punkt 14A Konstrukt gemäß Punkt 13A, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis ist.
  • Punkt 15A Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 13A oder 14A in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Punkt 16A Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 13A oder 14A transformiert ist.
  • Punkt 17A Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
    • (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein PATELLIN-Polypeptid, wie definiert in Punkt 1A, 2A oder 12A, oder einer Nukleinsäure gemäß Punkt 11A; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls
    • (iii) Selektieren von Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
  • Punkt 18A Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, resultierend aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, codierend ein PATELLIN-Polypeptid, wie definiert in Punkt 1A oder 2A, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
  • Punkt 19A Transgene Pflanze gemäß Punkt 11A, 16A oder 18A, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
  • Punkt 20A Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 19A, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Spross-Biomasse und/oder Samen sind.
  • Punkt 21A Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 19A und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 20A abgeleitet sind.
  • Punkt 22A Verwendung einer Nukleinsäure, die ein PATELLIN-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Spross-Biomasse in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Punkt 1B Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein PRP38-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
  • Punkt 26 Verfahren gemäß Punkt 1B, wobei das PRP38-Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst:
    • (i) eine DUF1777-Domäne
    • (ii) eine RS-Domäne
    • (iii) Motiv 1a (SEQ ID NR: 120), worin ein beliebiger Aminosäurerest durch eine konservative Aminosäure substitutiert sein kann und/oder bis zu 50% der Aminosäurereste durch eine nicht-konservative Aminosäure substitutiert sein können.
    • (iv) Motiv 1a (SEQ ID NR: 121), worin ein beliebiger Aminosäurerest durch eine konservative Aminosäure substitutiert sein kann und/oder bis zu 50% der Aminosäurereste durch eine nicht-konservative Aminosäure substitutiert sein können.
    • (v) Motiv 1a (SEQ ID NR: 122), worin ein beliebiger Aminosäurerest durch eine konservative Aminosäure substitutiert sein kann und/oder bis zu 50% der Aminosäurereste durch eine nicht-konservative Aminosäure substitutiert sein können.
  • Punkt 36 Verfahren gemäß Punkt 1B oder 2B, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein PRP38-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
  • Punkt 4B Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die ein PRP38-Polypeptid codierende Nukleinsäure ein beliebiges der in Tabelle A aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure ist oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
  • Punkt 5B Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A angegebenen Proteine codiert.
  • Punkt 6B Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhte Biomasse und/oder erhöhten Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  • Punkt 7B Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1B bis 6B, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stress-Bedingungen erhalten werden.
  • Punkt 8B Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1B bis 6B, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen von Stickstoffmangel erhalten werden.
  • Punkt 9B Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3B bis 8B, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor verbunden ist, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis.
  • Punkt 10B Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die ein PRP38-Polypeptid codierende Nukleinsäure von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, weiter bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana ist.
  • Punkt 11B Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein PRP38-Polypeptid codiert.
  • Punkt 12B Konstrukt, umfassend:
    • (i) Nukleinsäure, codierend ein PRP38-Polypeptid, wie definiert in den Punkten 1 oder 2;
    • (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
    • (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Punkt 13B Konstrukt gemäß Punkt 12B, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis ist.
  • Punkt 14B Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 12B oder 13B in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Punkt 15B Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 12B oder 13B transformiert ist.
  • Punkt 16B Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
    • (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein PRP38-Polypeptid, wie definiert in Punkt 1B oder 2B; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  • Punkt 17B Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, resultierend aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, codierend ein PRP38-Polypeptid, wie definiert in Punkt 1B oder 2B, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
  • Punkt 18B Transgene Pflanze gemäß Punkt 11B, 15B oder 17B, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
  • Punkt 19B Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 18B, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Spross-Biomasse und/oder Samen sind.
  • Punkt 20B Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 18B und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19B abgeleitet sind.
  • Punkt 21B Verwendung einer Nukleinsäure, die ein PRP38-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Spross-Biomasse in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Punkt 1C Verfahren zur Erhöhung von einem oder mehreren von Tausendkerngewicht, Gesamtgewicht von Samen und Anzahl an gefüllten Samen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, codierend ein GATA-like-Polypeptid, wobei das GATA-ähnliche Polypeptid der Subfamilie II der GATA-Transkriptionsfaktoren angehört und eine GATA-Domäne umfasst.
  • Punkt 2C Verfahren gemäß Punkt 1C, wobei das GATA-ähnliche Polypeptid eines oder mehrere der folgenden Motive umfasst:
    • (i) Motiv 1c: C(S/A/T)(D/E/N)CXT(T/S/A)(K/S)TP(L/M)WR(S/G/N)GP (SEQ ID NR: 130),
    • (ii) Motiv 2c: GPKSLCNACGIRX(R/K)K (SEQ ID NR: 131),
    • (iii) Motiv 3c: (A/S)(A/W)X(L/C)(L/N)(M/L/V)(T/L/A)(L/D)(S/R) (SEQ ID NR: 132) Punkt 3C Verfahren gemäß Punkt 1C oder 2C, wobei die modulierte Expression bewirkt wird durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein GATA-like-Polypeptid codiert.
  • Punkt 4C Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die ein GATA-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure ein beliebiges der in Tabelle A aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure ist oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
  • Punkt 5C Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A angegebenen Proteine codiert.
  • Punkt 6C Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1C bis 5C, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Nicht-Stress-Bedingungen erhalten werden.
  • Punkt 7C Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3C bis 6C, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor verbunden ist, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis.
  • Punkt 8C Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die ein GATA-like-Polypeptid codierende Nukleinsäure von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer monokotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, weiter bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa ist.
  • Punkt 9C Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein GATA-like-Polypeptid codiert, welche funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise einem GOS2-Promotor, weiter bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis verbunden ist.
  • Punkt 10C Konstrukt, umfassend:
    • (i) Nukleinsäure, codierend ein GATA-like-Polypeptid, wie definiert in den Punkten 1C oder 2C;
    • (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen von pflanzlichem Ursprung, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
    • (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Punkt 11C Konstrukt gemäß Punkt 10C, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis ist.
  • Punkt 12C Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 10C oder 11C in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Samenertrag, welcher eines oder mehrere von Tausendkerngewicht, Gesamtgewicht von Samen und Anzahl an gefüllten Samen umfasst, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Punkt 13C Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 10C oder 11C transformiert ist.
  • Punkt 14C Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
    • (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein GATA-like-Polypeptid, wie definiert in Punkt 1C oder 2C, codiert und funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor von pflanzlichem Ursprung verbunden ist; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  • Punkt 15C Transgene Pflanze mit erhöhtem Tausendkerngewicht, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, resultierend aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, codierend ein GATA-like-Polypeptid, wie definiert in Punkt 1C oder 2C, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
  • Punkt 16C Transgene Pflanze gemäß Punkt 9C, 13C oder 15C, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
  • Punkt 17C Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 17C, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
  • Punkt 18C Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 16C und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 17C abgeleitet sind.
  • Punkt 19C Verwendung einer Nukleinsäure, die ein GATA-like-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung von einem oder mehreren von Tausendkerngewicht, Gesamtgewicht von Samen und Anzahl an gefüllten Samen in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Punkt 1D Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein ADA2-Polypeptid codiert, und gegebenenfalls Selektieren von Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
  • Punkt 2D Verfahren gemäß Punkt 1 D, wobei das ADA2-Polypeptid zwei oder mehrere der folgenden Motive umfasst:
    • (i) eine Zink(Zn)-Finger-ZZ-Typ-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 207: kpglyccnycdkdlsglvrfkcavcmdfdlcvecfsvgvelnrhkn oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 207 repräsentierten Domäne oder zu einer beliebigen Zn-Finger-ZZ-Typ-Domäne, wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden;
    • (ii) eine SANT-DNA-Eindungs-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 208: vtsdwnadeeillleaiatygfgnwkevadhvgsktttecikhfnsaym, oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 208 repräsentierten Domäne oder zu einer beliebigen SANT-Domäne, wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden;
    • (iii) eine Ca-bindende EF-Hand-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 209: dndaeqlladmef, oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 209 repräsentierten Domäne oder zu einer beliebigen Ca-bindenden EF-Hand-Domäne, wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden;
    • (iv) eine SWIRM-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 210: priysgldtwdvdgllgadllsetekkmcnetrilpvhylkmldiltreikkgqikkksdaysffkvepskvdrvydmlvhkgigdst, oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 210 repräsentierten Domäne oder zu einer beliebigen SWRIM-Domäne, wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden;
  • Punkt 3D Verfahren gemäß Punkt 1D oder 2D, wobei die modulierte Expression bewirkt wird durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein ADA2-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
  • Punkt 4D Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die ein ADA2-Polypeptid codierende Nukleinsäure ein beliebiges der in Tabelle A aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure ist oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
  • Punkt 5D Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A angegebenen Proteine codiert.
  • Punkt 6D Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  • Punkt 7D Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1D bis 6D, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen von mäßigem Stress erhalten werden.
  • Punkt 8D Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 1D bis 6D, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen von Stickstoffmangel erhalten werden.
  • Punkt 9D Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3D bis 8D, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem HMGP-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem HMGP-Promotor aus Reis, verbunden ist.
  • Punkt 10D Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die ein ADA2-Polypeptid codierende Nukleinsäure von pflanzlichem Ursprung, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, weiter bevorzugt aus der Gattung Arabidopsis, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana ist.
  • Punkt 11D Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein ADA2-Polypeptid codiert.
  • Punkt 12D Konstrukt, umfassend:
    • (i) Nukleinsäure, codierend ein ADA2-Polypeptid, wie definiert in den Punkten 1D oder 2D;
    • (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
    • (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • Punkt 13D Konstrukt gemäß Punkt 12D, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein HMGP-Promotor, am stärksten bevorzugt ein HMGP-Promotor aus Reis ist.
  • Punkt 14D Verwendung eines Konstrukts gemäß Punkt 12D oder 13D in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Punkt 15D Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 12D oder 13D transformiert ist.
  • Punkt 16D Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
    • (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, die ein ADA2-Polypeptid codiert, wie definiert in Punkt 1D oder 2D; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls
    • (iii) Selektieren von Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften
  • Punkt 17D Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, resultierend aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, codierend ein ADA2-Polypeptid, wie definiert in Punkt 10 oder 2D, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
  • Punkt 18D Transgene Pflanze gemäß Punkt 11D, 15D oder 17D, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
  • Punkt 19D Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 19, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Spross-Biomasse und/oder Samen sind.
  • Punkt 20D Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 18D und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19D abgeleitet sind.
  • Punkt 21D Verwendung einer Nukleinsäure, die ein ADA2-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Spross-Biomasse in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  • Punkt 1E Eine isolierte Nukleinsäuresequenz, codierend ein WD40-Repeat (WDR) 23-like Polypeptid, umfassend:
    • (i) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 219, SEQ ID NR: 225, oder SEQ ID NR: 229 repräsentiert;
    • (ii) das Komplement einer isolierten Nukleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 219, SEQ ID NR: 225, oder SEQ ID NR: 229 repräsentiert;
    • (iii) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 220, SEQ ID NR: 226, oder SEQ ID NR: 230;
    • (iv) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die aus einer Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 220, SEQ ID NR: 226, oder SEQ ID NR: 230, als ein Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes abgeleitet ist;
    • (v) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die zum stringenten Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 219, SEQ ID NR: 225, oder SEQ ID NR: 229, oder an ihr Komplement, in der Lage ist;
    • (vi) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, aufweisend in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität mit einer Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 220, SEQ ID NR: 226, oder SEQ ID NR: 230 repräsentiert;
    • (vii) eine isolierte Nukleinsäuresequenz, welche ein Polypeptid codiert, umfassend eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Conserved Domain, wie durch SEQ ID NR: 271 repräsentiert.
  • Punkt 2E Isoliertes WDR23-like-Polypeptid, umfassend:
    • (i) eine Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 220, SEQ ID NR: 226, oder SEQ ID NR: 230;
    • (ii) eine Polypeptidsequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Aminosäuresequenzidentität zu einer Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 220, SEQ ID NR: 226, oder SEQ ID NR: 230 repräsentiert;
    • (I) ein Polypeptid, umfassend eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Conserved Domain, wie durch SEQ ID NR: 271 repräsentiert;
    • (ii) Derivate von einer beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in (i) bis (iii) oben stehend angegeben sind.
  • Punkt 3E Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein WDR23-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, wobei das WDR23-like-Polypeptid eine Domäne mit mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer Conserved Domain (CD), wie durch SEQ ID NR: 271 repräsentiert, umfasst, und gegebenenfalls Selektieren von Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften.
  • Punkt 4E Verfahren gemäß Punkt 3E, wobei das WDR23-like-Polypeptid umfasst: (i) mindestens vier WD40-Repeats mit einer PFAM-Zugangsnummer PF00400; und (ii) mindestens zwei konservierte DxR-Motive am Ende von zwei aufeinanderfolgenden WD40-Repeats.
  • Punkt 5E Verfahren gemäß Punkt 3E oder 4E, wobei das WDR23-like-Polypeptid, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu dem WDR23-like-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 216, oder zu einer beliebigen der Polypeptidsequenzen, die in Tabelle A hierin angegeben sind, oder zu einem WDR23-like Polypeptid, wie in Punkt 2E definiert, aufweist.
  • Punkt 6E Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3E bis 5E, wobei die ein WDR23-like-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz durch eine beliebige der in Tabelle A angegebenen Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NRn oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die zum Hybridisieren mit einer beliebigen der in Tabelle A angegebenen Nukleinsäuresequenzen-SEQ ID NRn in der Lage ist, repräsentiert wird.
  • Punkt 7E Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3E bis 6E, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A angegebenen Polypeptidsequenz-SEQ ID NRn codiert.
  • Punkt 8E Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3E bis 7E, wobei die erhöhte Expression bewirkt wird durch ein oder mehrere beliebige von: T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING oder homologe Rekombination.
  • Punkt 9E Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3E bis 8E, wobei die erhöhte Expression bewirkt wird durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein WDR23-like-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
  • Punkt 10E Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3E bis 9E, wobei es sich bei der erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft handelt um eine oder mehrere von: erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhte Samen-Füllrate, erhöhte Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Ernteindex oder erhöhtes Tausendkerngewicht.
  • Punkt 11E Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3E bis 10E, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem pflanzlichen konstitutiven Promotor, weiter bevorzugt mit einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 272, verbunden ist.
  • Punkt 12E Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3E bis 10E, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem meristem-spezifischen Promotor, vorzugsweise mit einem pflanzlichen Metallothionein-Promotor, weiter bevorzugt mit einem Metallothionein-Promotor aus Reis, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 273, verbunden ist.
  • Punkt 13E Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3E bis 12E, wobei die ein WDR23-like-Polypeptid codierende Nukleinsäuresequenz aus dem Pflanzenreich, bevorzugt aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana stammt.
  • Punkt 14E Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen), oder Pflanzenzellen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 3E bis 13E, wobei die Pflanze, der Teil oder die Zelle davon, ein isoliertes Nukleinsäure-Transgen umfasst, das ein WDR23-like-Polypeptid codiert, welches funktionsfähig mit einem pflanzlichen konstitutiven Promotor verbunden ist.
  • Punkt 15E Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen), oder Pflanzenzellen, umfassend ein isoliertes Nukleinsäure-Transgen gemäß Punkt 1E, oder umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, codierend ein WDR23-like-Polypeptid gemäß Punkt 2E.
  • Punkt 16E Konstrukt, umfassend:
    • (a) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein WDR23-like-Polypeptid, wie definiert in einem beliebigen der Punkte 1E, 2E, oder 3E bis 7E;
    • (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
    • (c) Transkriptionsterminationssequenz.
  • Punkt 17E Konstrukt gemäß Punkt 16E, wobei die Steuerungssequenz ein pflanzlicher konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, weiter bevorzugt ein Reis-GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt ein GOS2-Promotor, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 272, ist.
  • Punkt 18E Konstrukt gemäß Punkt 16E, wobei die Steuerungssequenz ein meristemspezifischer Promotor, vorzugsweise ein Metallothionein (MT)-Promotor, weiter bevorzugt ein Reis-MT-Promotor, am stärksten bevorzugt ein MT-Promotor, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 273, ist.
  • Punkt 19E Verwendung eines Konstrukts gemäß einem beliebigen der Punkte 16E bis 18E in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei es sich bei den erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften um eine oder mehrere von folgenden handelt: erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhte Samen-Füllrate, erhöhte Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Ernteindex oder erhöhtes Tausendkerngewicht.
  • Punkt 20E Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt gemäß einem beliebigen der Punkte 16E bis 18E transformiert ist.
  • Punkt 21E Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend:
    • (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle, von einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein WDR23-like-Polypeptid, wie definiert in einem beliebigen der Punkte 1E oder 3E bis 7E; und
    • (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
  • Punkt 22E Transgene Pflanze mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, resultierend aus erhöhter Expression einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein WDR23-like-Polypeptid, wie definiert in einem beliebigen der Punkte 1E, 3E bis 7E, die funktionsfähig mit einem in Pflanzen exprimierbaren Promotor verbunden ist, oder transgene Pflanzenzelle oder transgener Pflanzenteil, welche(r) aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
  • Punkt 23E Transgene Pflanze gemäß Punkt 14E, 15E, 20E oder 22E, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete tansgene Pflanzenzelle.
  • Punkt 24E Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 23E, umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein WDR23-like-Polypeptid codiert, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
  • Punkt 25E Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Punkt 23E und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 24E abgeleitet sind.
  • Punkt 26E Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, die ein WDR23-like-Polypeptid codiert, wie definiert in einem beliebigen der Punkte 1E, 3E bis 7E, bei der Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften, umfassend eines oder mehrere von: erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhte Samen-Füllrate, erhöhte Anzahl an gefüllten Samen, erhöhter Ernteindex oder erhöhtes Tausendkerngewicht.
  • Beschreibung der Figuren
  • Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren beschrieben, in denen:
  • 1 die Sequenz von SEQ ID NR: 2 wiedergibt. Domänenstruktur und funktionell relevante Aminosäuren sind hervorgehoben. SEC14- und GOLD-Domänen sind in fettgedruckter bzw. doppelt unterstrichener Formatierung gezeigt. Aminosäurereste, die an der PtdIns/PtdChs-Bindungs/Transfer-Aktivität beteiligt sind, sind eingekastet, wohingegen hydrophobe Reste, welche die lipidbindende Tasche auskleiden, unterstrichen sind. Eine Salzbrücken-Domäne ist in kleingedruckten Buchstaben dargestellt. Die ”Coiled coil”-Region ist mit einer Wellenlinie unterstrichen.
  • 2 repräsentiert ein multiples Alignment einer Auswahl von PALT-Polypeptiden von Tabelle A1.
  • 3 zeigt einen phylogenetischen Baum einer Auswahl von PALT-Polypeptiden von Tabelle Al.
  • 4 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression einer PALT-codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors in Oryza sativa.
  • 5 zeigt ausführlich Beispiele von Sequenzen, die in der Ausführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
  • 6 repräsentiert die Sequenz von SEQ ID NR: 77. Konservierte Domänen und Motive sind angegeben: die PRP38-Domäne ist unterstrichen, die DUF1777-Domäne ist in fettgedruckten Buchstaben angegeben, die Motive Ib, IIb, IIIb und IVb sind eingekastet.
  • 7 repräsentiert ein multiples Alignment der PRP38-Polypeptide von Tabelle A2.
  • 8 zeigt einen phylogenetischen Baum der PRP38-Polypeptide von Tabelle A2.
  • 9 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression einer PRP38-codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors in Oryza sativa (pGOS2).
  • 10 zeigt ausführlich Beispiele von Sequenzen, die in der Ausführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
  • 11 repräsentiert die Domänenstruktur von SEQ ID NR: 129, wobei die GATA-Domäne in Fettdruck und die konservierten Motive 1c bis 3c unterstrichen formatiert sind.
  • 12 repräsentiert ein multiples Alignment von Subgruppe II-GATA-like-Polypeptiden. Die Punkte zeigen konservierte Reste, die Doppelpunkte zeigen hochkonservierte Reste, und die Asterisken zeigen identische Aminosäuren.
  • 13 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression einer GATA-like-codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-GOS2-Promotors in Oryza sativa (pGOS2::GATA-like).
  • 14 zeigt ausführlich Beispiele von Sequenzen, die in der Ausführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
  • 15 repräsentiert die Sequenz von SEQ ID NR: 182. Konservierte Domänen und Motive sind angegeben. Ein vermutetes ”KRKK”-Zellkern-Lokalisationssignal ist eingekastet, eine Zink-Finger-ZZ-Typ-Domäne ist in Fettdruck hervorgehoben, eine SANT-DNA-Bindungsdomäne ist unterstrichen und in fettgedruckten Buchstaben gezeigt, eine Ca-bindende EF-Hand-Domäne ist kursiv and unterstrichen dargestellt, und die SWIRM-Domäne ist mit einer Doppellinie unterstrichen. Der relevante Lys(K)-Rest, der im zentralen Teil des Proteins liegt und vermutlich die Acetylierung von ADA2 vermittelt, ist eingekastet.
  • 16 gibt ein multiples Alignment der ADA2-Polypeptide von Tabelle A4 wieder.
  • 17 zeigt einen phylogenetischen Baum der ADA2-Polypeptide von Tabelle A4.
  • 18 und 19 repräsentieren die binären Vektoren für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer ADA2-codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung eines Reis-HMGP-Promotors (18) und unter dem EXP9-Promotor (19).
  • 20 zeigt ausführlich Beispiele von Sequenzen, die in der Durchführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
  • 21 repräsentiert einen Cartoon der Struktur eines ”WRD23-like”, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 216. Die WD40-Repeats, entsprechend PFAM-Eintrag PF00400, sind schematisch wiedergegeben.
  • 22 zeigt die Funktion des WRD23 in Homo sapiens. WRD23 ist Teil eines Multiprotein-Ubiquitin-E3-Ligase-Komplexes, bei dem Cullin 4 (CUL4) und ”damaged DNA”-bindendes Protein 1 (DDB1) die Kernproteine sind (Riga et al. (2007) Cell Division 2: 5; Angers et al. (2006) Nature 443: 590–593; Higa et al. (2006) Nature Cell Biol. 8(11): 1277–1283; He et al. (2006) Genes & Development 20: 2949–2954). Dieser Komplex dockt mit WD40-Proteinen, wie WRD23, als molekulare Adaptoren für den Substratrekrutierungsmechanismus, wobei das Substrat anschließend ubiquitinyliert und zerstört wird.
  • 23 zeigt ein Sequenzalignment, repräsentierend die DxR-Motive, konserviert in zwei aufeinanderfolgenden Blättern des WD40, im WRD23 aus Homo sapiens (NCBI-Eintrag AK057636), Aspergillus niger (NCBI-Eintrag CAK40817) und den pflanzlichen ”WRD23-like”-Polypeptiden von Tabelle A5.
  • 24 zeigt ein mittels AlignX (aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation) durchgeführtes Mehrfach-Sequenzalignment der WDR23-like-Polypeptide von Tabelle A5. Der Beginn und das Ende der Conserved Domain (CD), zum Beispiel wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 271, wird unter Verwendung von Klammern gezeigt. Die WD40-Repeats, entsprechend PF00400, sind durch Xe unter der Consensus-Sequenz markiert. Die DxR-Motive sind ebenfalls unter der Consensus-Sequenz gekennzeichnet.
  • 25 zeigt den binären Vektor für erhöhte Expression, in Oryza sativa, einer Nukleinsäuresequenz, die ein WDR23-like-Polypeptid codiert, unter der Steuerung eines in Pflanzen exprimierbaren Promotors, wie einem GOS2-Promotor oder Metallothionein-Promotor, beide aus Reis.
  • 26 zeigt ausführlich Beispiele von Sequenzen, die in der Durchführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche alleinig der Veranschaulichung dienen. Mit den folgenden Beispielen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung vollständig zu definieren oder anderweitig zu begrenzen.
  • DNA-Manipulation: Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D.
  • Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) und Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
  • Beispiel 1: Identifikation von Sequenzen, die mit der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind
  • Sequenzen (Volllängen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz verwandt sind, wurden unter denjenigen, welche in der ”Entrez Nucleotides”-Datenbank am National Center for Biotechnology Information (NCBI) bereitgehalten werden, mit Hilfe von Datenbank-Sequenzsuchwerkzeugen identifiziert, wie etwa dem Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Das Programm wurde eingesetzt, um Regionen mit lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen durch Vergleichen von Nukleinsäure- oder Polypeptidsequenzen mit Sequenzdatenbanken und durch Berechnen der statistischen Signifikanz von Übereinstimmungen zu finden. Zum Beispiel wurde das Polypeptid, welches von der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Nukleinsäure codiert wird, für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, mit Standardvorgaben und abgeschaltetem Filter zum Ignorieren von Sequenzen geringer Komplexität. Das Analyse-Ergebnis wurde mittels paarweisem Vergleich betrachtet, und gemäß der Wahrscheinlichkeitswertung (E-Wert) eingestuft, wobei die Wertung die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass ein jeweiliges Alignment rein zufällig auftritt (je niedriger der E-Wert, umso signifikanter ist der Übereinstimmungstreffer). Zusätzlich zu E-Werten wurden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen) über eine bestimmte Länge hinweg.
  • Die Tabelle A stellt eine Liste von Nukleinsäuresequenzen bereit, die verwandt mit der Nukleinsäuresequenz sind, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
  • Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A” ist als den Inhalt von Tabelle A1 und/oder A2 und/oder A3 und/oder A4 und/oder A5 bezeichnend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A1” ist als den Inhalt von Tabelle A1 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A2” ist als den Inhalt von Tabelle A2 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A3” ist als den Inhalt von Tabelle A3 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A4” ist als den Inhalt von Tabelle A4 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A5” ist als den Inhalt von Tabelle A5 angebend aufzufassen. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A1. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A2. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A3. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A4. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A5.
  • Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle B” ist als den Inhalt von Tabelle B1 und/oder B2 und/oder B3 und/oder B4 und/oder B5 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle B1” ist als den Inhalt von Tabelle B1 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle B2” ist als den Inhalt von Tabelle B2 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle B3” ist als den Inhalt von Tabelle B3 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle B4” ist als den Inhalt von Tabelle B4 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle B5” ist als den Inhalt von Tabelle B5 angebend aufzufassen. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle B” die Tabelle B1. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle B” die Tabelle B2. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle B” die Tabelle B3. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle B” die Tabelle B4. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle B” die Tabelle B5.
  • Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle C” ist als den Inhalt von Tabelle C1 und/oder C2 und/oder C3 und/oder C4 und/oder C5 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle C1” ist als den Inhalt von Tabelle C1 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle C2” ist als den Inhalt von Tabelle C2 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle C3” ist als den Inhalt von Tabelle C3 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle C4” ist als den Inhalt von Tabelle C4 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle C5” ist als den Inhalt von Tabelle C5 angebend aufzufassen. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle C” die Tabelle C1. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle C” die Tabelle C2. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle C” die Tabelle C3. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle C” die Tabelle C4. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle C” die Tabelle C5.
  • Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle D” ist als den Inhalt von Tabelle D1 und/oder D2 und/oder D3 und/oder D4 und/oder D5 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle D1” ist als den Inhalt von Tabelle D1 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle D2” ist als den Inhalt von Tabelle D2 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle D3” ist als den Inhalt von Tabelle D3 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle D4” ist als den Inhalt von Tabelle D4 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle D5” ist als den Inhalt von Tabelle D5 angebend aufzufassen. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle D” die Tabelle D1. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle D” die Tabelle D2. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle D” die Tabelle D3. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle D” die Tabelle D4. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff ”Tabelle D” die Tabelle D5. Tabelle A1: Beispiele von PATL-Nukleinsäuren und -Polypeptiden:
    Name Ursprungs-Spezies Nukleinsäure SEQ ID NR: Polypeptid SEQ ID NR:
    Orysa_PATL_1 Oryza sativa 1 2
    Orysa_PATL_2 Oryza sativa 3 4
    Orysa_PATL_3 Oryza sativa 5 6
    Orysa_PATL_4 Oryza sativa 7 8
    Brana_PATL_1 Brasica napus 9 10
    Helan_PATL 1 Heliantus annus 11 12
    Zeama_PATL_1 Zea mays 13 14
    Glyma_PATL_1 Glycine max 15 16
    Triaes_PATL_2 Triticum aestivum 17 18
    Triaes_PATL_3 Triticum aestivum 19 20
    Glyma_PATL_2 Glycine max 21 22
    Glyma_PATL_3 Glycine max 23 24
    Zeama_PATL_2 Zea mays 25 26
    Zeama_PATL_4 Zea mays 27 28
    Sacof_PATL_1 Saccharum officinarum 29 30
    Sacof_PATL_2 Saccharum officinarum 31 32
    Sacof_PATL_3 Saccharum officinarum 33 34
    Sacof_PATL_4 Saccharum officinarum 35 36
    Triae_PATL_1 Triticum aestivum 37 38
    Arath_PATL_1 Arabdidopsis thaliana 39 40
    Arath_PATL_2 Arabdidopsis thaliana 41 42
    Arath_PATL_3 Arabdidopsis thaliana 43 44
    Arath_PATL 4 Arabdidopsis thaliana 45 46
    Arath_PATL_5 Arabdidopsis thaliana 47 48
    Arath_PATL_6 Arabdidopsis thaliana 49 50
    Poptr_PATL_1 Populus trichocarpa 51 52
    Poptr_PATL_2 Populus trichocarpa 53 54
    Poptr_PATL_3 Populus trichocarpa 55 56
    Poptr_PATL 4 Populus trichocarpa 57 58
    Lyces_PATL_1 Lycopersicum esculentum 59 60
    Medtr_PATL_1 Medicago truncatula 61 62
    Betvu_PATL_1 Beta vulgaris 63 64
    Chlre_PATL_1 Chlamydomonas reinhardtii 65 66
    Dicdi_PATL_1 Dictyostelium discoideum 67 68
    Tabelle A2: Beispiele von PRP38-Nukleinsäuren und -Polypeptiden:
    Name Ursprungs-Spezies Nukleinsäure SEQ ID NR: Polypeptid SEQ ID NR:
    Arath_PRP38_1 Arabidopsis thaliana SEQ ID NR: 76 SEQ ID NR: 77
    Arath_PRP38_2 Arabidopsis thaliana SEQ 1D NA: 78 SEQ ID NR: 79
    Arath_PRP38_3 Arabidopsis thaliana SEQ ID NR: 80 SEQ ID NR: 81
    Arath_PRP38_4 Arabidopsis thaliana SEQ ID NR: 82 SEQ ID NR: 83
    Arath_PRP38_5 Arabidopsis thaliana SEQ ID NR: 84 SEQ ID NR: 85
    brasy_PRP38_1 Brachypodium sylvaticum SEQ ID NR: 86 SEQ ID NR: 87
    brasy_PRP38_2 Brachypodium sylvaticum SEQ ID NR: 88 SEQ ID NR: 89
    Chlre_PRP38_1 Chlamydomonas reinhardtii SEQ ID NR: 90 SEQ ID NR: 91
    Horvu_PRP38_1 Hordeum vulgare SEQ ID NR: 92 SEQ ID NR: 93
    Lyces_PRP38_1 Lycopersicum esculentum SEQ ID NA: 94 SEQ ID NA: 95
    Medtr_PRP38_1 Medicago truncatula SEQ ID NR: 96 SEQ ID NR: 97
    Orysa_PRP38_1 Oryza sativa SEQ ID NR: 98 SEQ ID NR: 99
    Orysa_PRP38_2 Oryza sativa SEQ ID NR: 100 SEQ ID NR: 101
    Ostta_PRP38_1 Osfreococcus tauri SEQ ID NR: 102 SEQ ID NR: 103
    Ostta_PRP38_2 Osfreococcus tauri SEQ ID NR: 104 SEQ ID NR: 105
    Poptr_PRP38_1 Populus trichocarpa SEQ ID NR: 106 SEQ ID NR: 107
    Poptr_PRP38_2 Populus trichocarpa SEQ ID NR: 108 SEQ ID NR: 109
    Sacof_PRP38_1 Saccharum officiarum SEQ ID NR: 110 SEQ ID NR: 111
    Sacof_PRP38_3 Saccharum officiarum SEQ ID NR: 112 SEQ ID NR: 113
    Schce_PRP38_1 Saccharomyces cerevisie SEQ ID NR: 114 SEQ ID NR: 115
    Tnae_PRP38_1 Triticum aestivum SEQ ID NR: 116 SEQ ID NR: 117
    Vitvi_PRP38_1 Vitisvinifera SEQ ID NR: 118 SEQ ID NR: 119
    Tabelle A3: Beisiele von ”GATA-like”-Poletiden:
    Pflanzen-Quelle Nukleinsäure SEQ ID NR: Protein SEQ ID NR:
    Oryza sativa 128 129
    Oryza sativa 137 138
    Oryza sativa 139 140
    Oryza sativa 141 142
    Oryza sativa 143 144
    Oryza sativa 145 146
    Arabidopsis thaliana 147 148
    Arabidopsis thaliana 149 150
    Arabidopsis thaliana 151 152
    Arabidopsis thaliana 153 154
    Arabidopsis thaliana 155 156
    Arabidopsis thaliana 157 158
    Arabidopsis thaliana 137 138
    Vitis vinifera 139 140
    Vitis vinifera 141 142
    Arabidopsis thaliana 143 144
    Vitis vinifera 145 146
    Vitis vinifera 147 148
    Oryza sativa 149 150
    Oryza sativa 151 152
    Arabidopsis thaliana 153 154
    Oryza sativa 155 156
    Tabelle A4: Beispiele von ADA2-Nukleinsäuren und -Polypeptiden:
    Name Ursprungs-Spezies Nukleinsäure SEQ ID NR: Polypeptid SEQ ID NR:
    Arath_ADA2_1 Arabidopsis thaliana 181 182
    Arath_ADA2_2 Arabidopsis thaliana 183 184
    Dicdi_ADA2_1 Dictyostelium discoideum 185 186
    Lyces_ADA2_1 Lycopersicum esculentum 187 188
    Lyces_ADA2_2 Lycopersicum esculentum 189 190
    Ostlu_ADA2_1 Ostreococcus lucimarinus 191 192
    Orysa_ADA2_1 Oryza sativa 193 194
    Poptr_ADA2_1 Populus trichocarpa 195 196
    Poptr_ADA2_2 Populus trichocarpa 197 198
    Poptr_ADA2_3 Populus trichocarpa 199 200
    Vitvi_ADA2_1 Vitits vinifera 201 202
    Zeama_ADA_1 Zea mays 203 204
    Zeama_ADA_2 Zea mays 205 206
    Tabelle A5: Beispiele von ”WDR23-like”-Polypeptidsequenzen und codierenden Nukleinsäuresequenzen:
    Name Quellorganismus Öffentliche DatenbankZugangsnummer Nukleinsäuresequenz SEQ ID NR: Polypeptidsequenz SEQ ID NR: Status
    Arath_WDR23 Arabidopsis thaliana AT4G03020 215 216 Volllänge
    Aqufo_WDR23 Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens DR934238, DT758266 217 218 Volllänge
    Brana_WDR23 Brassica napus Proprietar 219 220 Volllänge
    Glyma_WDR23 Glycine max EH262769.1, BE807607.1, BM178842.1 221 222 Volllänge
    Goshi_WDR23 Gossypium hirsutum DT571300, DW224686.1 I 223 224 Volllänge
    Helan_WDR23 Helianthus annuus Propnetar 225 226 Volllänge
    Horvu_WDR23 II Hordeum vulgare TA42103_4513 227 228 Volllänge
    Linus_WDR23 Linum usitatissum Proprietar 229 230 Volllänge
    Liter_WDR23 (oder LEC14B) Lithospermum erythrorhizon D83074.1 231 232 Volllänge
    Lyces_WDR23 Lycopersicon esculentum BT013732.1 233 234 Volllänge
    Medtr_WDR23 Medicago truncatula TC107985 235 236 Volllänge
    Orysa_WDR23 Oryza sativa NM_001062054 (0s05g0407200) 237 238 Volllänge
    Pinra_WDR23 Pinus radiata AEB27202 239 240 Volllänge
    Poptr_WDR23 Populus tremuloides scaff_XIV.822 [1577]f[31-1497] 241 242 Volllänge
    Pruar_WDR23 (LEC14B) Prunus armeniaca U82760.1 243 244 Volllänge
    Sacof_WDR23 II Saccharum officinarum CA119761, CA209562.1, CA198970.1 245 246 Volllänge
    Triae_WRD23 Triticum aestivum TA81375_4565 247 248 Volllänge
    Triae_WRD23 II Triticum aestivum EA148218 249 250 Volllänge
    Vitvi_WDR23 Vitis vinifera EV236978.1, CB002670, EV235943 251 252 Volllänge
    Zeama_WDR23 Zea mays DT943774.1, DV536181.1, EE042623.2 253 254 Volllänge
    Zeama_WDR23 II Zea mays CO527332.1, CF004625.1, E3408231.1, DV163655.1 255 256 Volllänge
    Citsi_WDR23 Citrus sinensis DN620350, CN186594.1 257 258 Partiell
    Glyma_WRD23 II Glycine max BQ741328.1, 31471220.1, CX708493.1 259 260 Partiell
    Horvu_WDR23 I Hordeum vulgare BQ753299 261 262 Partiell
    Horvu_WDR23 III Hordeum vulgare 60471803.1, BM370019.2 263 264 Partiell
    Pinta_WDR23 Pinus taeda CV034652, CX652385 265 266 Partiell
    Sacof_WDR23 Saccharum ofticinarum CA146950, CF570656 267 268 Partiell
    Sorbi_WDR23 Sorghum bicolor C3928406.1, BE599991, CF770659.1 269 270 Partiell
  • In Hinsicht auf die WDR23-like-Proteine sind in einigen Fällen verwandte Sequenzen provisorisch zusammengetragen und von Forschungsinstitutionen, wie The Institute for Genomic Research (TIGR), öffentlich zugänglich gemacht worden. Die Datenbank ”Eukaryotic Gene Orthologs” (EGO) kann verwendet werden, um derartige verwandte Sequenzen, entweder durch Stichwort-Suche oder durch Verwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäuresequenz oder Polypeptidsequenz von Interesse, zu identifizieren. In anderen Fällen sind spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für jeweilige Organismen erstellt worden, wie etwa vom Joint Genome Institute. In noch anderen Fällen werden die Sequenzen nach einer privaten, proprietären Sequenzierung erhalten, und so wurden Sammlungs-Maßnahmen zum Beispiel für Brassica napus, Helianthus annus und Linum usitatissum vorgenommen.
  • Beispiel 2: Alignment von PATL-, PRP38-, GATA-like-, ADA2- und WDR23-like-Polypeptidsequenzen
  • Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde unter Verwendung des Programms AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weitverbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Vorgabewerte waren für den Lückenöffnungsstrafwert (gap open penalty) ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert (gap extension penalty) von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Die Sequenzkonservierung zwischen PATL-Polypeptiden war am C-Terminus höher als am N-Terminus. Eine Consensus-Sequenz ist angegeben. Konservierte Aminosäuren sind angezeigt. Die PATL-Polypeptide sind in 2 aligniert. Der Vergleich von 1 und 2 enthüllte die Gegenwart der konservierten Domänen und von Schlüssel-Aminosäureresten, die in 1 angegeben sind, in den PATL-Polypeptiden von 2. Ein phylogenetischer Baum von PATL-Polypeptiden (3) wurde mit Hilfe eines Neighbour-joining-Clusterungsalgorithmus erstellt, wie er im Programm AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) zur Verfügung gestellt wird.
  • Die Sequenzkonservierung unter PRP38-Polypeptiden lag im Wesentlichen in der N-terminalen PRP38-Domäne der Polypeptide, wobei die N-terminale Domäne üblicherweise hinsichtlich Sequenzlänge und -zusammensetzung variabler ist, und hinsichtlich saurer Aminosäuren angereichert ist. Die PRP38-Polypeptide sind in der 7 aligniert. Ein phylogenetischer Baum von PRP38-Polypeptiden (8) wurde mit Hilfe eines Neighbour-joining-Clusterungsalgorithmus erstellt, wie er im Programm AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) zur Verfügung gestellt wird.
  • Die Sequenzkonservierung unter GATA-like-Polypeptiden lag im Wesentlichen in der GATA-Domäne der Polypeptide und im C-Terminus, wobei die N-terminale Domäne üblicherweise hinsichtlich Sequenzlänge und -zusammensetzung variabler ist. Die GATA-like-Polypeptide sind in 12 aligniert.
  • Die Sequenzkonservierung unter ADA2-Polypeptiden lag im Wesentlichen entlang der konservierten Zn-Finger-ZZ-Typ-, SANT-DNA-Eindungs- und SWIRM-Domänen der Polypeptide vor. Eine Consensus-Sequenz ist angegeben. Die Zn-Finger-ZZ-Typ-Domane war hinsichtlich Cysteinresten angereichert. Die ADA2-Polypeptide sind in 16 aligniert. Ein phylogenetischer Baum von ADA2-Polypeptiden (17) wurde mit Hilfe eines Neighbourjoining-Clusterungsalgorithmus erstellt, wie er im Programm AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) zur Verfügung gestellt wird.
  • Multiples Sequenzalignment der Volllängen-WDR23-like-Polypeptidsequenzen in Tabelle A5 wurde unter Verwendung des AlignX-Algorithmus (aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation) durchgeführt. Die Ergebnisse des Alignments sind in den 23 und 24 der vorliegenden Patentanmeldung gezeigt.
  • Die 23 zeigt ein Sequenzalignment, repräsentierend die DxR-Motive, konserviert in zwei aufeinanderfolgenden Blättern des WD40, im WRD23 aus Homo sapiens (NCBI-Eintrag AK057636), Aspergillus niger (NCBI-Eintrag CAK40817) und den pflanzlichen WRD23-like-Polypeptiden von Tabelle A5.
  • In der 24, wird der Beginn und das Ende der Conserved Domair (CD), zum Beispiel wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 271, unter Verwendung von Klammern gezeigt. Die WD40-Repeats, entsprechend PF00400, sind durch Xe unter der Consensus-Sequenz markiert. Die DxR-Motive sind ebenfalls unter der Consensus-Sequenz angegeben.
  • Beispiel 3: Berechnung der globalen prozentualen Identität zwischen Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
  • Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT(Matrix Global Alignment Tool)-Software (BMC Bioinformatics. 2003 4: 29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software wurde bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programm führt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12, und einem Lücken-Erweiterungsstrafwert von 2) durch, berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide) und platziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
  • Die im Vergleich verwendeten Parameter waren folgende:
    Wertungsmatrix: Blosum 62
    Erstlücke: 12
    Lückenerweiterung: 2
  • Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B1 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben (normal formatiert).
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den PATL-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, kann so gering wie 23,7% Aminosäureidentität, verglichen mit dem Polypeptid Orysa_PATL_1 (SEQ ID NR: 2), sein.
  • Tabelle B1: MatGAT-Ergebnisse for globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen.
    Figure 01280001
  • In Bezug auf die PRP38-Polypeptide sind Ergebnisse der AlignX-Software-Analyse in der Tabelle B2 für die globale Identität über die volle Länge von ausgewählten Polypeptidsequenzen aus Tabelle A2 im Vergleich zum Polypeptid Arath_PRP38_1 (Tabelle A2) gezeigt. Tabelle B2: Sequenzähnlichkeit zwischen PRP38-Polypeptiden
    PRP38-Polypeptid % Sequenzähnlichkeit zu SEQ ID NR: 77
    Arath_PRP38_5 23,6
    brasy_PRP38_1 63,5
    brasy_PRP38_2 32,1
    Chlre_PRP38_1 40,6
    Horvu_PRP38_1 56,1
    Lyces_PRP38_1 60,7
    Medtr_PRP38_1 25,4
    Orysa_PRP38_1 60,9
    Orysa_PRP38_2 25,9
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den PRP38-Polypeptidsequenzen von Tabelle B2, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, kann so gering wie 23,6% Aminosäureidentität, verglichen mit SEQ ID NR: 77, sein.
  • In Hinsicht auf die GATA-like-Proteine waren die im Vergleich verwendeten Parameter die folgenden:
    Wertungsmatrix: Blosum 62
    Erstlücke: 11
    Lückenerweiterung: 1
  • Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B3 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz der Identität ist oberhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben, und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben (normal formatiert).
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den GATA-like-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, kann so gering wie 14% Aminosäureidentität, verglichen mit SEQ ID NR: 129, sein.
  • Figure 01310001
  • In Hinsicht auf die ADA2-Polypeptide waren die im Vergleich verwendeten Parameter die folenden:
    Wertungsmatrix: Blosum 62
    Erstlücke: 12
    Lückenerweiterung: 2
  • Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B4 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt. Der Prozentsatz an Identität ist oberhalb der Diagonale in Fettdruck angegeben und der Prozentsatz der Ähnlichkeit ist unterhalb der Diagonale angegeben (normal formatiert).
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den ADA2-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, kann so gering wie 21,2% Aminosäureidentität, verglichen mit dem Polypeptid Arath_ADA2_1 (SEQ ID NR: 182), sein. Tabelle B4: MatGAT-Ergebnisse für globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen. Tabelle B4: Sequenzähnlichkeit zwischen ADA2-Polypeptiden
    Figure 01320001
  • In Hinsicht auf die WDR23-like-Proteine waren die im Vergleich verwendeten Parameter die folgenden:
    Wertungsmatrix: Blosum 62
    Erstlücke: 12
    Lückenerweiterung: 2
  • Ergebnisse der Software-Analyse sind in der Tabelle B5 für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt (unter Ausschluß der partiellen Polypeptidsequenzen).
  • Figure 01340001
  • Figure 01350001
  • Die gleiche Analyse wurde zwischen der Conserved Domain (CD), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 271 (und enthalten in SEQ ID NR: 216), und der Conserved Domain der Volllängen-Polypeptide von Tabelle A5 (wie in 24 hervorgehoben) durchgeführt, und die Ergebnisse sind in Tabelle B5.1 gezeigt.
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen den Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, kann so gering wie 54% Aminosäureidentität, verglichen mit SEQ ID NR: 216, sein.
  • Der Prozentsatz der Identität zwischen der Conserved Domain (CD), wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 271 (und enthalten in SEQ ID NR: 216), und der Conserved Domain der Polypeptide von Tabelle A5 (wie in der 24 hervorgehoben) steigt auf 69% Aminosäureidentität, wie in Tabelle B5.1 gezeigt.
  • Beispiel 4: Identifizierung von Domänen, enthalten in Polypeptidsequenzen, die zur Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
  • Konservierte Domänen-Proteine wurden durch Durchsuchen der InterPro-Datenbank identifiziert. Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites” (InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für die üblicherweise verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine zum Ableiten von Proteinsignaturen verwenden. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, Panther, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Pfam ist eine große Sammlung von Mehrfach-Sequenzalignments und Hidden-Markov-Modellen, welche zahlreiche häufige Proteindomänen und -familien abdecken. Pfam wird am Server des Sanger Institute in Großbritannien bereitgehalten bzw. gehostet. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien bereitgehalten.
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der durch SEQ ID NR: 2 repräsentierten Polypeptidsequenz sind in der Tabelle C5 wiedergegeben. Tabelle C5: InterPro-Scan-Ergebnisse (Haupt-Zugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 2. Abkürzungen von Datenbanken in den Datenbank-Zugangsnummern: PF: Pfam; PS: Prosite; SM: Smart; SSF: Superfamily.
    Figure 01370001
  • Figure 01380001
  • Figure 01390001
  • Figure 01400001
  • Die Ergebnisse des Pfam-Scans der durch SEQ ID NR: 77 repräsentierten Polypeptidsequenz sind in der Tabelle C2 wiedergegeben. Tabelle C2: Pfam-Scan-Ergebnisse (Haupt-Zugangsnummern) der Polypeptidsequenz von Tabelle A2. Die Aminosäurekoordinaten, welche die Domäne (Domänen-Name) im gescannten Polypeptid (Suchpolypeptid) begrenzen, sind angegeben. Der e-Wert des Alignments des Suchpolypeptids zum Überstimmungstreffer im Pfam-Eintrag ist angegeben.
    Suchpolypeptid Domänen-Name Aminosäure-Koordinate: Start Aminosäure-Koordinate: Ende E-Wert
    Arath_PRP38_1 PRP38 1 170 2,4e-31
    Arath_PRP38_1 DUF1777 255 389 0,026
    Arath_PRP38_4 DUF1777 87 221 0,026
    Arath_PRP38_5 PRP38 1 177 9,3e-65
    Arath_PRP38_5 DUF1777 208 355 0,15
    Brasy_PRP38_1 PRP38 1 169 1,5e-24
    Brasy_PRP38_1 DUF1777 251 392 0,14
    Brasy_PRP38_2 PRP38 1 162 1E-15
    Chlre_PRP38_1 PRP38 1 169 1,9e-22
    Chlre_PRP38_1 DUF1777 289 354 0,77
    Horvu_PRP38_1 PRP38 1 169 2,1e-29
    Lyces_PRP38_1 PRP38 1 170 3,5e-26
    Lyces_PRP38_1 DUF1777 266 428 0,024
    Medtr_PRP38_1 PRP38 1 177 5E-71
    Orysa_PRP38_1 PRP38 1 169 2,9e-29
    Orysa_PRP38_1 DUF1777 270 434 0,1
    Orysa_PRP38_2 PRP38 1 177 5,5e-75
    Orysa_PRP38_2 DUF1777 235 392 0,071
    Ostta_PRP38_1 PRP38 1 146 6,5e-41
    Ostta_PRP38_2 PRP38 16 191 7,1e-10
    Poptr_PRP38_1 PRP38 1 169 5,8e-29
    Poptr_PRP38_1 DUF1777 263 414 0,0074
    Poptr_PRP38_2 PRP38 1 169 3,7e-26
    Poptr_PRP38_2 DUF1777 258 414 0,23
    Sacof_PRP38_1 PRP38 1 169 8,6e-27
    Sacof_PRP38_3 PRP38 1 169 3,3e-27
    Sacof_PRP38_3 DUF1777 263 375 0,067
    Schce_PRP38_1 PRP38 6 221 2,8e-150
    Triae_PRP38_1 PRP38 1 177 4,6e-71
    Triae_PRP38_1 DUF1777 220 371 0,17
    Vitvi_PRP38_1 PRP38 1 177 4,6e-71
    Vitvi_PRP38_1 DUF1777 220 371 0,17
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch die SEQ ID NR: 129 repräsentiert, sind in der Tabelle C3 wiedergegeben. Tabelle C3: Ergebnisse des InterPro-Scans (Haupt-Zugangsnummern) der von SEQ ID NR: 129 repräsentierten Polypeptidsequenz.
    Datenbank Zugangsnummer Zugangsname Aminosäurekoordinaten auf SEQ ID NR. 129
    InterPro IPR000679 Zn-finger, GATA type
    HMMPfam PF00320 GATA T[178–213] 1.9E-14
    HMMSmart SM00401 ZnF_GATA T[172–223] 1.1 E-16
    ProfileScan PS50114 GATA_ZN_FINGER_2 T[176–208] 12.268
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch die SEQ ID NR: 182 repräsentiert, sind in der Tabelle C4 wiedergegeben. Tabelle C4: Ergebnisse des InterPro-Scans (Haupt-Zugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 182 repräsentiert. Tabelle C4: Pfam-Scan-Ergebnisse (Haupt-Zugangsnummern) der Polypeptidsequenz von Tabelle A4. Die Aminosäurekoordinaten, welche die Domäne (Domänen-Name) im gescannten Polypeptid (Suchpolypeptid) begrenzen, sind angegeben. Der e-Wert des Alignments des Suchpolypeptids zum Überstimmungstreffer im Pfam-Eintrag ist angegeben.
    INTERPRO-Scan Zn-Finger-ZZ-Typ (PFAM)/Aminosäurekoordinaten (Start-Ende) SANT-DNA-Bindung (SMART)/Aminosäurekoordinaten (Start-Ende) Ca-bindende EF-Hand (PROSITE)/Aminosäurekoordinaten (Start-Ende) SWIRM (PFAM)/Aminosäurekoordinaten (Start-Ende)
    At ADA2a 47–92 107–156 287–299 461–547
    OI ADA2_1 27–72 87–136 371–457
    Ot ADA2_1 26–71 86–135
    Pt ADA2_1 55–100 115–164 271–283 454–540
    Vv ADA2_1 45–90 105–154 286–298 474–560
    At ADA22_b 41–86 101–150 241–253 397–483
    Pt ADA2_2 44–89 104–153 304–316 474–560
    Pt ADA2_3 44–89 104–153 303–315 473–559
    Vv ADA2_2 1–40 55–104 241–253 397–483
    SI ADA2_2 43–88 103–152 457–543
    Hv ADA2_1 45–90 105–154
    Os ADA2_1 47–92 107–156 290–302 476–562
    Os ADA2_3 47–92 107–156 390–402 576–662
    Zr ADA2_1 47–92 107–156 293–305 474–559
    Zr ADA2_2 47–92 107–156 293–305 474–559
    SI ADA2_1 44–89 104–153 288–300 474–560
  • Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch die SEQ ID NR: 216 repräsentiert, sind in der Tabelle C5 wiedergegeben. Tabelle C5: Ergebnisse des InterPro-Scans der von SEQ ID NR: 216 repräsentierten Polypeptidsequenz
    InterPro-Zugangsnummer und -name Name der integrierten Datenbank Zugangsnummer in integrierter Datenbank Zugangsname in integrierter Datenbank
    IPR0001680 WD40 repeat PFAM PF00400 WD40
    IPR0001680 WD40 repeat Smart SM00320 WD40
    IPR0001680 WD40 repeat ProfileScan PS50082 WD_repeats_2
    IPR0001680 WD40 repeat ProfileScan PS50294 WD_REPEATS_REGION
    IPR0001680 WD40 repeat FPrtntScan PR00320 GPROTEINBRPT
    IPR011046 WD40 repeat-like SuperFamily SSF50978 WD40_like
    IPR15943 WD40/YVTN repeat-like Gene3D G3DSA: 2.130.10.10 WD40/YVTN repeat-like
  • Beispiel 5: Klonierung der in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenz
  • Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bibliothek aus Arabidopsis thaliana-Setzlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl PCR-Mix durchgeführt. In Bezug auf PATL, waren die verwendeten Primer SEQ ID NR: 73: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcggaggagccac-3' und SEQ ID NR: 74; 5'- ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgtggtgaatctggtgatcagg-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, wurde danach ausgeführt, wobei darin das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch gemäß der Gateway-Terminologie ein ”Eintritts”- bzw. ”Entry-Klon”, pOrysa_PATL_1, hergestellt wurde.
  • Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway®-Technologie, käuflich erworben. Der Eintritts-Klon, umfassend SEQ ID NR: 1, wurde danach in einer LR-Reaktion mit zwei, zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinations-Vektoren eingesetzt. Ein erster Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 75) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurden die resultierenden Expressionsvektoren pGOS2::Orysa_PATL_1 (4) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • In Bezug auf das PRP38 waren die verwendeten Primer SEQ ID NR: 125: 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcggagatacagtcaaa 3' und SEQ ID NR: 126; 5' ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcacctccaagaggaacca 3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, wurde danach ausgeführt, wobei darin das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch gemäß der Gateway-Terminologie ein ”Eintritts-Klon”, pPRP38, hergestellt wurde. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway®-Technologie, käuflich erworben. Der Eintritts-Klon, umfassend SEQ ID NR: 76, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 127) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::PRP38 (9) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • In Bezug auf GATA waren die verwendeten Primer prm10133 (SEQ ID NR: 133; Sense, Startcodon in Fettdruck):
    5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAAACAATGTCTACTATCTACATGAGCCA 3'
    und prm10134 (SEQ ID NR: 134; rückwärts, komplementär):
    5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGCTAGCTAGTTTTGATCAGC 3',
    welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, wurde danach ausgeführt, wobei darin das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch gemäß der Gateway-Terminologie ein ”Eintritts-Klon”, pGATA-like, hergestellt wurde. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway®-Technologie, käuflich erworben. Der Eintritts-Klon, umfassend SEQ ID NR: 128, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 135) für wurzelspezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::GATA-like (13) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 177 wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bibliothek aus Oryza sativa-Setzlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm10106 (SEQ ID NR: 179; Sense, Startcodon in Fettdruck): 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgcttcaccattactacagc-3' und prm10107 (SEQ ID NR: 180; rückwärts, komplementär): 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtccaacgctaatgctacact-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Das weitere Klonierungsvorgehen war wie oben beschrieben.
  • In Hinsicht auf ADA2 waren die verwendeten Primer SEQ ID NR: 211: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAAACAATGGGTCGTTCGAAACTAGC-3' und SEQ ID NR: 212; 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCATGTTAGGACCATGAAGCT ATG-3', welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde, ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren, gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, wurde danach ausgeführt, wobei darin das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch gemäß der Gateway-Terminologie ein ”Eintritts-Klon”, pAtADA2_1, hergestellt wurde. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway®-Technologie, käuflich erworben. Der Eintritts-Klon, umfassend SEQ ID NR: 181, wurde dann in einer LR-Reaktion mit zwei zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektoren eingesetzt. Ein erster Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-HMGP-Promotor (SEQ ID NR: 213) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert. Auf einem zweiten Vektor mit denselben funktionellen Elementen innerhalb der T-DNA-Borders, wie oben beschrieben, war ein Reis-EXP9-Promotor (SEQ ID NR: 214) stromaufwärts der Gateway-Kassette lokalisiert.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurden die resultierenden Expressionsvektoren pHMG::Arath_ADA2_1 (18) und pEXP9::Arath_ADA2_1 (19) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) sowie Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
  • In Hinsicht auf das WDR23-like-Polypeptid, wurde die Arabidopsis thaliana-cDNA, codierend eine WDR23-like-Polypeptidsequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 216, durch PCR amplifiziert, wobei als Matrize cDNA verwendet wurde, die aus mRNA synthetisiert wurde, welche aus verschiedenen Geweben von unter verschiedenen Bedingungen kultiviertem Arabidopsis thaliana extrahiert worden war. Es wurden die folgenden Primer, welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen, zur PCR-Amplifikation verwendet:
    • (v) Prm 09100 (SEQ ID NR: 274, Sense):
      Figure 01480001
    • (vi) Prm 09101 (SEQ ID NR: 275, rückwärts, komplementär):
      Figure 01480002
  • Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment der erwarteten Länge (beinhaltend die attB-Stellen) wurde amplifiziert und ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, wurde danach ausgeführt, wobei darin das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Eintritts-Klon” hergestellt wurde. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway®-Technologie, käuflich erworben.
  • Beispiel 5A: Topologie-Vorhersage der Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
  • TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryotischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung bzw. Ortszuweisung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Prä-Sequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten, und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Server der Technischen Universität von Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgehalten.
  • Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
  • Mehrere Parameter wurden ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschluss-Einstellungen (keine, vordefinierter Satz von Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierter Satz von Ausschlussbedingungen) sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (ja oder nein).
  • Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie sie von SEQ ID NR: 129 repräsentiert ist, sind in der Tabelle D3 wiedergegeben. Die Organismengruppe ”Pflanze” wurde angewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen (cutoffs) definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert. Bei der subzellulären Lokalisierung der durch SEQ ID NR: 129 repräsentierten Polypeptidsequenz kann es sich um das Cytoplasma oder den Zellkern handeln, wobei kein Transitpeptid vorhergesagt wird. Tabelle D3: TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 129
    Länge (AS) 353
    Chloroplasten-Transitpeptid 0,067
    Mitochondriales Transitpeptid 0,169
    Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid 0,186
    Sonstiges subzelluläres Targeting 0,804
    Vorhergesagte Lokalisierung /
    Zuverlässigkeitsklasse 2
    Vorhergesagte Transitpeptid-Länge /
  • Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:
    • • ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
    • • Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
    • • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Canada;
    • • TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark
  • Beispiel 6: Pflanzentransformation
  • Transformation von Reis
  • Das Agrobacterium, welches den Expressionsvektor enthielt, wurde zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-japonica-Kultivars Nipponbare wurden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wurde durchgeführt mittels Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl2, gefolgt von sechsmaligem, 15-minütigem Waschen mit sterilen destilliertem Wasser. Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium keimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Callus-Induktions-Medium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Calli durch Subkultivieren auf dem gleichen Medium weitere 2 Wochen lang vervielfältigt oder vermehrt. Embryogene Callus-Stücke wurden 3 Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
  • Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher den Expressionsvektor enthielt, wurde für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den geeigneten Antibiotika inokuliert und 3 Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann abgesammelt und in flüssigem Cokultivierungs-Medium zu einer Dichte (OD600) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt, und die Calli wurden 15 Minuten lang in der Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes, Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25° C inkubiert. Cokultivierte Calli wurden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmittels wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials auf ein Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht, wurde das embryogene Potential freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf einem Auxin-enthaltenden Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
  • Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden für ein Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen wurden dann drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).
  • Transformation von Mais
  • Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Abwandlung des Verfahrens durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wird. Die Transformation in Mais ist Genotyp-abhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden aus der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) abgeerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryos werden auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden 2 bis 3 Wochen lang, oder bis sich Sprosse entwickeln, im Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C während 2 bis 3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Weizen-Transformation
  • Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech. 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexico) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Callus-Induktionsmedium, und dann Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petrischalen werden im Licht bei 25°C während 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und während 2–3 Wochen, bis sich Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Sojabohne
  • Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens transformiert, welches in U. S.-Patent 5 164 310 von Texas A & M beschrieben ist. Mehrere kommerzielle Sojabohnenvarietäten sind einer Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Ausäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten Jung-Setzlingen herausgeschnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden herausgeschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, welches den Expressionsvektor enthält. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und in Selektionsmedien überführt. Regenerierte Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht. Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Raps/Canola
  • Kotyledonäre Petiolen bzw. Keimblattstiele sowie Hypokotyle von einem 5 – 6 Tage alten Jungsämling werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep. 17: 183–188) transformiert. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Ausäen oberflächensterilisiert. Die Keimblattstiel-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden von den In-vitro-Sämlingen abgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des Schnittendes des Blattstiel-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Blattstiel-Explantate in MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) während 7 Tagen überführt und danach auf MSBAP-3-Medium mit Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf Bewurzelungsmedium (MSO) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Alfalfa
  • Ein sich regenerierender Klon von Alfalfa (Medicago sativa) wird unter Anwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Transformation von Alfalfa ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Alfalfa-Varietät ausgewählt werden, wie es durch Brown, DCW, und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111–112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Petiolen-Explantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunklen auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K2SO4 und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum zum Inhibieren des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach einigen Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryonen werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Transformation von Baumwolle
  • Baumwolle wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens gemäß des Verfahrens transformiert, das in US 5 159 135 beschrieben ist. Baumwolle-Samen werden in 3% Natriumhypochlorit-Lösung während 20 Minuten oberflächensterilisiert und in destilliertem Wasser mit 500 μg/ml Cefotaxim gewaschen. Die Samen werden dann für die Keimung auf SH-Medium mit 50 μg/ml Benomyl überführt. Hypokotyle von 4 bis 6 Tage alten Setzlingen werden entfernt, in Stücke von 0,5 cm geschnitten und auf 0,8%igen Agar platziert. Eine Agrobacterium-Suspension (ungefähr 108 Zellen pro ml, verdünnt aus einer Übernachtkultur, transformiert mit dem Gen von Interesse und geeigneten Selektionsmarkern) wird für die Inokulation der Hypokotyl-Explantate verwendet. Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur und Beleuchtung überführt man die Gewebe auf ein festes Medium (1,6 g/l Gelrite) mit Murashigeund-Skoog-Salzen mit B5-Vitaminen (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151–158 (1968)), 0,1 mg/l 2,4-D, 0,1 mg/l 6-Furfurylaminopurin und 750 μg/ml MgCl2, sowie mit 50 bis 100 μg/ml Cefotaxim und 400–500 μg/ml Carbenicillin zum Abtöten restlicher Bakterien. Individuelle Zelllinien werden nach zwei bis drei Monaten (mit Unterkulturen alle vier bis sechs Wochen) isoliert und werden auf selektivem Medium zur Gewebevermehrung weiter kultiviert (30°C, 16 h Lichtperiode). Transformierte Gewebe werden anschließend auf nicht-selektivem Medium während 2 bis 3 Monaten weiter kultiviert, was zur Entstehung von somatischen Embryonen führt. Gesund aussehende Embryonen von mindestens 4 mm Länge werden in Röhrchen mit SH-Medium in feinem Vermiculit, das mit 0,1 mg/l Indolessigsäure, 6-Furfurylaminopurin und Gibberellinsäure ergänzt ist, überführt. Die Embryonen werden bei 30°C mit einer Lichtperiode von 16 h kultiviert, und Pflänzchen beim 2- bis 3-Blattstadium werden in Blumentöpfe mit Vermiculit und Nährstoffen überführt. Die Pflanzen werden gehärtet und anschließend für die weitere Kultivierung ins Gewächshaus gebracht.
  • In Hinblick auf ”WDR23-like”-Gene, wird die Transformation von Baumwolle (Gossypium hirsutum L.) unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens auf Hypokotylen-Explantaten durchgeführt. Die kommerziellen Kultivare, wie Coker 130 oder Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX) sind standardmäßige Varietäten, die für die Transformation verwendet werden, aber es können auch andere Varietäten verwendet werden. Die Samen werden oberflächensterilisiert und im Dunkeln keimen gelassen. Hypokotyl-Explantate werden aus den gekeimten Setzlingen zu Längen von etwa 1–1,5 Zentimeter ausgeschnitten. Das Hypokotyl-Explantat wird im Agrobacterium tumefaciens-Inokulum, das den Expressionsvektor enthält, 5 Minuten lang untergetaucht und dann etwa 48 Stunden lang auf MS +1,8 mg/l KNO3 + 2% Glucose bei 24°C im Dunklen cokultiviert. Die Explantate werden auf das gleiche Medium überführt, das geeignete bakterielle und pflanzliche selektierbare Marker enthält (mehrmalig erneuert), bis embryogene Calli zu beobachten sind. Die Calli werden getrennt und subkultiviert, bis somatische Embryonen erscheinen. Aus den somatischen Embryonen abgeleitete Pflänzchen werden auf Bewurzelungsmedium heranreifen gelassen, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Blumentopferde im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen hergestellt, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
  • Beispiel 6B Expressionsvektorkonstruktion unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 215 repräsentiert
  • Der Eintritts-Klon, umfassend SEQ ID NR: 215, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 272) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert. Außerdem wurde ein zweiter Destinationsvektor für Oryza sativa-Transformation, mit einem Reis-Metallothionein-Promotor (MT; SEQ ID NR: 273) für meristemspezifische Expression, hergestellt.
  • Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurden die resultierenden Expressionsvektoren, pGOS2::WDR23-like und pMT::WDR23-like (25), unabhängig gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stamm LBA4044 transformiert.
  • Beispiel 7: Vorgehen zur phänotypischen Auswertung
  • 7.1 Auswertungsansatz
  • Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Sechs Ereignisse, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote), und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen (Nicht-Stress-Bedingungen) bestanden in kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunklen sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%. Es wurde eine häufige Bewässerung vorgenommen, um den Bedürfnissen der Pflanzen an Wasser und Nährstoffen zu genügen, so dass diese mit einem gesunden Aussehen heranwuchsen und sich entwickelten.
  • Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
  • Dürre-Screen
  • Pflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens näherten. Sie werden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, in welchem die Bewässerung weggelassen wurde. Feuchtigkeitssonden wurden in zufällig ausgewählten Blumentöpfen eingesteckt, um den Bodenwassergehalt (SWC) zu überwachen. Als der SWC unter bestimmte Schwellenwerte fiel, wurden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wurde. Die Pflanzen wurden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen werden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
  • Screenen hinsichtlich Stickstoffverwendungseffizienz
  • Reispflanzen aus T2-Samen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe wurden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff (N)-Gehalt enthielt, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
  • 7.2 Statistische Analyse: F-Test
  • Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parametern von allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsereignisse hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert für Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgesetzt. Ein signifikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Gens ist, welche die Unterschiede beim Phänotyp verursacht.
  • Weil zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse ausgeführt. Dies ist nützlich, um die Konsistenz der Effekte über die zwei Experimente hinweg zu überprüfen, und, sofern dies der Fall ist, Beweise aus beiden Experimenten zu sammeln, damit die Konfidenz bei der Schlussfolgerung erhöht wird. Das angewandte Verfahren war ein Misch-Modell-Vorgehen, welches die Mehrfachebenen-Struktur der Daten (d. h. Experiment-Ereignis-Segreganten) berücksichtigt. P-Werte wurden durch Vergleichen des Wahrscheinlichkeitsverhältnis-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhalten.
  • 7.3 Gemessene Parameter
  • Messung von Biomassen-bezogenen Parametern
  • Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen. Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die sich vom Hintergrund unterscheiden lassen, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln heraus aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der oberirdischen Pflanzenteile korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche an dem Zeitpunkt gemessen wird, an dem die Pflanze ihre maximale Blatt-Biomasse erreicht hatte. Die Früh-Wuchskraft ist die oberirdische Pflanzen(Setzlings)-Fläche drei Wochen nach der Keimung. Die Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als eine Erhöhung der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als das Maximum der Biomasse von Wurzeln, das während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird) oder als eine Erhöhung im Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
  • Die Früh-Wuchskraft wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterschieden, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimetern ausgedrückt wird. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
  • Messungen von Samen-bezogenen Parametern
  • Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage gewogen. Die Anzahl an gefüllten Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen bestimmt, welche nach dem Trennungsschritt verblieb. Der Gesamtsamenertrag wurde durch Wiegen aller, von einer Pflanze abgeernteten, gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde durch Zählen der Anzahl der von einer Pflanze geernteten Hülsen gemessen. Das Tausendkerngewicht (TKW) wird aus der gezählten Anzahl gefüllter Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Ernteindex (HI) ist in der vorliegenden Erfindung definiert als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamenertrag und der oberirdischen Fläche (mm2), multipliziert mit einem Faktor 106. Die Gesamtzahl an Blüten pro Rispe, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl an Samen und der Anzahl an reifen Hauptrispen. Die Samen-Füllrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist der Anteil (ausgedrückt als ein %-Wert) der Anzahl gefüllter Samen gegenüber der Gesamtzahl an Samen (oder Blütchen).
  • Salzstress-Screen
  • Pflanzen werden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfaser und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wird während der ersten zwei Wochen nach dem Umpflanzen der Pflänzchen in das Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen werden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt wurde.
  • Screen bei verringerter Nährstoff(Stickstoff)-Verfügbarkeit
  • Pflanzen aus sechs Ereignissen (T2-Samen) werden in Blumentopferde unter Normalbedingungen, mit Ausnahme der Nährstofflösung, wachsen gelassen. Die Töpfe werden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff (N)-Gehalt, in der Regel zwischen 7- bis 8-mal weniger, enthält. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt wurde.
  • Beispiel 8: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche die Nukleinsäure Orysa_PATL_1 (SEQ ID NR: 1) vom GOS2-Promotor aus exprimieren und welche in einem Gewächshaus unter Nicht-Stress-Bedingungen wachsen gelassen wurden (Example 7), sind nachstehend dargestellt. Eine Erhöhung von mindestens 3% wurde für das Samengewicht (Gesamt-Samengewicht), die Anzahl gefüllter Samen und die Pflanzenhöhe beobachtet (Tabelle D1). Tabelle D1: Ergebnis der Auswertung der Leistung transgener Pflanzen (T2-Pflanzen), die mit pGOS2::SEQ ID NR: 1 transformiert waren.
    ertragsbezogene Eigenschaft % Erhöhung in der transgenen Pflanze (mit pGOS2::Orysa_PATL_1 transformierte Pflanzen) im Vergleich zur nullizygoten Kontrollpflanze
    Gesamt-Samengewicht 8
    Ernte-Index 5
    Pflanzenhöhe 3
    Zahl an gefüllten Samen 7
  • Die Ergebnisse der Auswertung von, eine AtPRP38_1 (SEQ ID NR: 76) Nukleinsäure exprimierenden transgenen Reispflanzen, welche in einem Gewächshaus unter Nicht-Stress-Bedingungen wachsen gelassen wurden (Example 7), sind nachstehend dargestellt. Eine Erhöhung von mindestens 5% wurde für oberirdische Biomasse (AreaMax), Emergenz-Wuchskraft (Früh-Wuchskraft), Gesamtsamenertrag, Anzahl gefüllter Samen, Füllrate, Ernteindex und die Anzahl an Samen pro Pflanze beobachtet (Tabelle D2). Tabelle D2: Ergebnis der Auswertung der Leistung transgener Pflanzen, die mit pGOS2::PRP38 transformiert waren.
    ertragsbezogene Eigenschaft % Erhöhung in der transgenen Pflanze im Vergleich zur nullizygoten Kontrollpflanze
    Oberirdische Fläche 10
    Emergenz-Wuchskraft 38
    Gesamt-Samengewicht 18
    Zahl gefüllter Samen 18
    Samen-Füllrate 7
    Ernte-Index 8
    Gesamtzahl an Samen 11
  • Die Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche die durch SEQ ID NR: 128 repräsentierte GATA-like-Nukleinsäure unter Nicht-Stress-Bedingungen exprimieren, zeigte eine Erhöhung des Tausendkerngewichts (alle sechs Ereignisse, insgesamte Erhöhung von 9,1%, p-Wert: 0,00001). Es wurden keine signifikanten Änderungen für andere Ertragsparameter beobachtet.
  • Die Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche die durch SEQ ID NR: 177 repräsentierte GATA-like-Nukleinsäure unter Nicht-Stress-Bedingungen exprimieren, zeigte eine Erhöhung des Gesamtgewichts von Samen (vier von sechs Linien, insgesamte Erhöhung von 16,9%, p-Wert: 0,00001) und der Anzahl gefüllter Samen (vier von sechs Linien, insgesamte Erhöhung von 16,0%, p-Wert: 0,00001). Es wurden keine signifikanten Änderungen für andere Ertragsparameter beobachtet.
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche die Nukleinsäure Arath_ADA2_1 (SEQ ID NR: 181) entweder vom pHMG- oder vom pEXP-Promotor aus exprimieren und in einem Gewächshaus unter Nicht-Stress-Bedingungen (Beispiel 7) wachsen gelassen wurden, sind nachstehend wiedergegeben. Eine Erhöhung von mindestens 3% wurde für das Samengewicht (Gesamtsamengewicht), die Anzahl gefüllter Samen, die Samenfüllung (Füllrate), die Anzahl an Blüten pro Rispe und den Ernteindex beobachtet (Tabelle D4). Tabelle D4: Ergebnis der Auswertung der Leistung transgener Pflanzen (T1-Pflanzen), die mit pHMG::SEQ ID NR: 181 und mit pEXP::SEQ ID NR: 181 transformiert waren.
    ertragsbezogene Eigenschaft % Erhöhung in der transgenen Pflanze im Vergleich zur nullizygoten Kontrollpflanze (mit pHMG::Arath_ADA2_1 transformierte Pflanzen) % Erhöhung in der transgenen Pflanze im Vergleich zur nullizygoten Kontrollpflanze (mit pEXP::Arath_ADA2_1 transformierte Pflanzen)
    Gesamt-Samengewicht 21 9
    Zahl gefüllter Samen 21 8
    Samen-Füllrate 12 10
    Anz. an Blüten pro Rispe 4 3
    Ernte-Index 23 8
  • Beispiel 9: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Reispflanzen, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein WDR23-like-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 216, unter der Steuerung eines konstitutiven Promoters exprimieren
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen der T1- und T2-Generation, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein WDR23-like-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 216, unter der Steuerung eines GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimieren, sind nachstehend angegeben.
  • Es bestand eine signifikante Erhöhung beim Gesamtsamenertrag pro Pflanze, bei der Samenfüllrate, bei der Anzahl gefüllter Samen, beim Ernteindex, und beim Tausendkerngewicht (TKW) der transgenen Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie gezeigt in Tabelle D5, in der phänotypischen Analyse sowohl der T1- als auch der T2-Generation. Tabelle D5: Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen der T1- und T2-Generation, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein WDR23-like-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 216, unter der Steuerung eines GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimieren.
    Eigenschaft Gesamtdurchschnitt-% in T1-Generation Gesamtdurchschnitt-% in T2-Generation
    Gesamt-Samenertrag pro Pflanze 84 16
    Samen-Füllrate 73 11
    Zahl gefüllter Samen 95 7
    Ernte-Index 93 13
    TKW 8 4
  • Beispiel 10: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Reispflanzen, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein WDR23-like-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 216, unter der Steuerung eines meristemspezifischen Promoters exprimieren
  • Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen der T1- und T2-Generation, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein WDR23-like-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 216, unter der Steuerung eines Metallothionein-MT-Promotors für meristemspezifische Expression exprimieren, sind nachstehend angegeben.
  • Es bestand eine signifikante Erhöhung beim Gesamtsamenertrag pro Pflanze, bei der Samenfüllrate, bei der Anzahl gefüllter Samen, beim Ernteindex, und beim Tausendkerngewicht (TKW) der transgenen Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie gezeigt in Tabelle E, in der phänotypischen Analyse sowohl der T1- als auch der T2-Generation. Tabelle E: Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen der Ti- und T2-Generation, welche die Nukleinsäuresequenz, codierend ein WDR23-like-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 216, unter der Steuerung eines MT-Promotors für meristemspezifische Expression exprimieren.
    Eigenschaft Gesamtdurchschnitt% in T1-Generation Gesamtdurchschnitt% in T2-Generation
    Gesamt-Samenertrag pro Pflanze 18 7
    Samen-Füllrate 17 6
    Zahl gefüllter Samen 10 5
    Ernte-Index 15 8
    TKW 2 0
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (20)

  1. Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, codierend a) ein PATELLIN-Polypeptid, und gegebenenfalls Selektieren von Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, oder b) ein PRP38-Polypeptid oder c) ein ADA2-Polypeptid, und gegebenenfalls Selektieren von Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, oder d) ein GATA-ähnliches bzw. GATA-like Polypeptid, wobei das GATA-ähnliche Polypeptid der Subfamilie II der GATA-Transkriptionsfaktoren angehört und eine GATA-Domäne umfasst, oder e) ein WDR23-ähnliches Polypeptid, wobei das WDR23-ähnliche Polypeptid eine Domäne mit mindestens 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer ”Conserved Domain” (CD), wie durch SEQ ID NR: 271 repräsentiert, umfasst, und gegebenenfalls Selektieren von Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das PATELLIN-Polypeptid mindestens eine der folgenden Domänen umfasst: (i) eine SEC14-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 71 repräsentiert: lpeldsvvfyrgadreghpvcynvygefqdkdlyekafgdeekrerflkwriqllergilsqldfspsgicsmvqvtdlknsppmlgkhravtrqavallqdnypefiakkvfinvpwwylaankmmspfltqrtkskfifaspaksaetlfryiapeqvpvqfgglfk, oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 71 repräsentierten Domäne oder zu einer beliebigen SEC14-Domäne, wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden; (ii) eine GOLD-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 72 repräsentiert: sdavteltikpssketveipvtenstigwelrvlgwevsygaeftpdaeggytvivqktrkvpaneepimkgsfkvgepgkivltinnpaskkkkllyrskv, oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97% oder mehr Sequenzidentität zu der durch SEQ ID NR: 72 repräsentierten Domäne oder zu einer beliebigen GOLD-Domäne wie in einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A vorhanden.
  3. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die modulierte Expression bewirkt wird durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von a) einer Nukleinsäure, die ein PATELLIN-Polypeptid codiert, oder b) einer Nukleinsäure, die ein PRP38-Polypeptid codiert, oder c) einer Nukleinsäure, die ein GATA-ähnliches Polypeptid codiert, oder d) einer Nukleinsäure, die ein ADA2-Polypeptid codiert, oder e) einer Nukleinsäure, die ein WDR23-ähnliches Polypeptid codiert.
  4. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die ein PATELLIN-, PRP38-, ADA2-, GATA-ähnliches oder ein WDR23-ähnliches Polypeptid codierene Nukleinsäure ein beliebiges der in Tabelle A aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer derartigen Nukleinsäure ist oder eine Nukleinsäure ist, die zum Hybridisieren mit einer derartigen Nukleinsäure in der Lage ist.
  5. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A angegebenen Proteine codiert.
  6. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, erhöhtes Tausendkerngewicht, vorzugsweise erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
  7. Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei die gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen von Stickstoffmangel erhalten werden.
  8. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die ein Polypeptid codierende Nukleinsäure von pflanzlichem Ursprung ist.
  9. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die Pflanze oder der Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein PATELLIN-, PRP38-, ADA2-, GATA-ähnliches oder ein WDR23-ähnliches Polypeptid codiert.
  10. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein beliebiges der folgenden Merkmale umfasst: (i) eine Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 9; SEQ ID NR: 11; SEQ ID NR: 13; SEQ ID NR: 15; SEQ ID NR: 17; SEQ ID NR: 19; SEQ ID NR: 21; SEQ ID NR: 23; SEQ ID NR: 25 und SEQ ID NR: 27; (ii) ein Nukleinsäurefragment, das zu einer beliebigen der in (i) angegebenen SEQ ID NRn komplementär ist; (iii) eine Nukleinsäure, codierend ein PATELLIN-Polypeptid, mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, angegeben in SEQ ID NR: 10; SEQ ID NR: 12; SEQ ID NR: 14; SEQ ID NR: 16; SEQ ID NR: 18; SEQ ID NR: 20; SEQ ID NR: 22; SEQ ID NR: 24; SEQ ID NR: 26 und SEQ ID NR: 28; (iv) eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen zum Hybridisieren an eine beliebige der in (i), (ii) oder (iii) obenstehend angegebenen Nukleinsäuren befähigt ist.
  11. Isoliertes Polypeptid, umfassend: (i) eine Aminosäuresequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, angegeben in SEQ ID NR: 10; SEQ ID NR: 12; SEQ ID NR: 14; SEQ ID NR: 16; SEQ ID NR: 18; SEQ ID NR: 20; SEQ ID NR: 22; SEQ ID NR: 24; SEQ ID NR: 26 und SEQ ID NR: 28; (ii) Derivate von einer beliebigen der Aminosäuresequenzen, die in (i) angegeben sind.
  12. Konstrukt, umfassend (i) Nukleinsäure, codierend ein PATELLIN-, PRP38-, ADA2-, GATA-ähnliches oder ein WDR23-ähnliches Polypeptid, wie definiert in den Ansprüchen 1, 2 oder 11, oder eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 11; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
  13. Verwendung eines Konstrukts gemäß Anspruch 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
  14. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 12 oder 13 transformiert ist.
  15. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, vorzugsweise erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäure, codierend ein PATELLIN-, PRP38-, ADA2-, GATA-ähnliches oder ein WDR23-ähnliches Polypeptid, wie definiert in den Ansprüchen 1, 2 oder 12, oder eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 11; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern; und gegebenenfalls (iii) Selektieren von Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften.
  16. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, resultierend aus der modulierten Expression einer Nukleinsäure, codierend ein PATELLIN-, PRP38-, ADA2-, GATA-ähnliches oder ein WDR23-ähnliches Polypeptid, wie definiert in Anspruch 1 oder 2, oder eine aus der transgenen Pflanze abgeleitete transgene Pflanzenzelle.
  17. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 11, 14 oder 16, oder eine daraus abgeleitete transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer ist.
  18. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Anspruch 17, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Spross-Biomasse und/oder Samen sind.
  19. Produkte, die aus einer Pflanze gemäß Anspruch 17 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 18 abgeleitet sind.
  20. Verwendung einer Nukleinsäure, die ein PATELLIN-, PRP38-, ADA2-, GATA-ähnliches oder ein WDR23-ähnliches Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Spross-Biomasse in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
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