ES2553652T3

ES2553652T3 - Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y un procedimiento de producción de las mismas

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Publication number: ES2553652T3
Application number: ES12195082.8T
Authority: ES
Inventors: Ana Isabel Sanz Molinero; Valerie Frankard; Christophe Reuzeau; Ramon Serrano Salom; José Miguel Mulet Salort
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2007-11-26
Filing date: 2008-11-26
Publication date: 2015-12-10
Anticipated expiration: 2028-11-26
Also published as: AU2008328794B2; US20100313299A1; US8697948B2; CN103951741A; EP2220111A1; AR071545A1; MX2010005697A; US20140237687A1; WO2009068564A8; EP2570426A1; DE112008003225T5; EP2581385A1; EP2574622A1; EP2574621A1; CA2706602A1; WO2009068564A1; EP2570426B1; AU2008328794A1; CN101883783A

Abstract

Un procedimiento para potenciar rasgos relacionados con el rendimiento en plantas con respecto a plantas de control, que comprende modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido PRP38, para lo cual el polipéptido PRP38 tiene al menos el 70 % o más de identidad de secuencia con la SEC ID N.º: 77 entera y en el que dicha expresión modulada se efectúa mediante la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido PRP38, en el que dichos rasgos relacionados con el rendimiento son uno o más de los siguientes rasgos: (i) biomasa de la parte aérea, (ii) vigor de emergencia, (iii) rendimiento de semilla total, (iv) número de semillas llenas, (v) tasa de llenado, (vi) índice de cosecha, y (vii) número de semillas por planta.

Description

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a o para otro catión monovalente, pero solo exacto en el intervalo de 0,01-0,4 M. b solo exacto para % GC en el intervalo de 30 % a 75 %. c L = longitud del dúplex en los pares de bases. d oligo, oligonucleótido; In, = longitud eficaz del cebador = 2x(n.º de G/C)+(n.º de A/T).

La unión no específica puede controlarse usando una cualquiera de las numerosas técnicas conocidas, tales como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen la proteína, adiciones del ARN heterólogo, ADN y SDS al tampón de hibridación y tratamiento con Rnasa. Para sondas no homólogas, puede realizarse una serie de hibridaciones al variar uno de (i) disminuir progresivamente la temperatura de hibridación (por ejemplo de 68 ºC a 42 ºC) o (ii) disminuir progresivamente la concentración de formamida (por ejemplo del 50 % al 0 %). El experto en la técnica es consciente de que durante la hibridación pueden alterarse diversos parámetros y que se mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Además de las condiciones de hibridación, la especificidad de hibridación también depende típicamente de la función de los lavados post-hibridación. Para retirar el fondo resultante de la hibridación no específica, las muestras se lavan con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de dichos lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final: a menor concentración salina y mayor temperatura de lavado, mayor rigurosidad de lavado. Las condiciones de lavado se realizan típicamente a, o por debajo de, la rigurosidad de hibridación. Una hibridación positiva da lugar a una señal que es al menos dos veces la del fondo. Generalmente, las condiciones de rigurosidad adecuadas para los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos o los procedimientos de detección de amplificación de genes son como se expusieron anteriormente. También pueden seleccionarse condiciones más o menos rigurosas. El experto en la técnica es consciente de que, durante el lavado, pueden alterarse diversos parámetros y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Por ejemplo, las condiciones de hibridación típicas de alta rigurosidad para híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos incluyen una hibridación a 65 ºC en 1x SSC o a 42 ºC en 1x SSC y formamida al 50 %, seguido de lavado a 65 ºC en 0,3x SSC. Los ejemplos de condiciones de hibridación de rigurosidad media para híbridos de ADN más largos de 50 nucleótidos incluyen una hibridación a 50 ºC en 4x SSC o a 40 ºC en 6x SSC y formamida al 50 %, seguido de lavado a 50 ºC en 2x SSC. La longitud del híbrido es la longitud prevista para la hibridación del ácido nucleico. Cuando los ácidos nucleicos de secuencia conocida se hibridan, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias e identificando las regiones conservadas descritas en el presente documento. 1x SSC es NaCl 0,15 M y citrato sódico 15 mM, la solución de hibridación y las soluciones de lavado pueden incluir adicionalmente reactivo de Denhardt 5x, SDS al 0,5-1,0 %, 100 g/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado 100 g/ml, pirofosfato sódico al 0,5 %.

Con el fin de definir el nivel de rigurosidad, puede hacerse referencia a Sambrook y col. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 y actualizaciones anuales).

Variante de corte y empalme

La expresión “variante de corte y empalme” como se usa en el presente documento incluye variantes de una secuencia de ácidos nucleicos en la que los intrones y/o exones seleccionados se han escindido, reemplazado, desplazado o añadido, o en la que los intrones se han acortado o alargado. Dichas variantes serán aquellas en las que la actividad biológica de la proteína esté sustancialmente conservada; esto puede conseguirse conservando selectivamente los segmentos funcionales de la proteína. Dichas variantes de corte y empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden ser sintetizadas por el hombre. En la técnica se conocen bien procedimientos para predecir y aislar dichas variantes de corte y empalme (véase, por ejemplo, Foissac y Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).

Variante alélica

Los alelos o variantes alélicas son formas alternativas de un gen determinado, localizado en la misma posición cromosómica. Las variantes alélicas incluyen Polimorfismos Mononucleotídicos (SNP, por las siglas Single Nucleotide Polymorphisms), así como Polimorfismos Pequeños de Inserción/Deleción (INDELs, por las siglas Small Insertion/Deletion Polymorphisms). El tamaño de los INDELs es normalmente menor de 100 pb. Los SNP y los INDELs forman la serie de variantes de secuencia más grande en las cepas polimórficas de origen natural de la mayoría de los organismos.

Combinación de genes/Evolución dirigida

La combinación de genes o evolución dirigida consiste en repeticiones de combinación de ADN seguido de exploración y/o selección apropiada para generar variantes de ácidos nucleicos o partes de las mismas que codifican proteínas que tienen una actividad biológica modificada (Castle y col., (2004) Science 304(5674): 1151-4; Patentes de Estados Unidos 5.811.238 y 6.395.547).

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Tabla 2: Ejemplos de promotores constitutivos

Fuente del gen: Referencia

Actina: McElroy y col, Plant Cell, 2: 163-171, 1990

HMGP: WO 2004/070039

CAMV 35S: Odell y col, Nature, 313: 810-812, 1985

CaMV 19S: Nilsson y col., Physiol. Plant. 100:456-462, 1997

GOS2: de Pater y col, Plant J Nov; 2(6):837-44, 1992, WO 2004/065596

Ubiquitina: Christensen y col, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992

Ciclofilina de arroz: Buchholz y col, Plant Mol Biol. 25(5): 837-43, 1994

Histona H3 de maíz: Lepetit y col, Mol. Gen. Genet. 231:276-285, 1992

Histona H3 de alfalfa: Wu y col. Plant Mol. Biol. 11:641-649, 1988

Actina n 2: An y col, Plant J. 10(1); 107-121, 1996

34S FMV: Sanger y col., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443

Subunidad pequeña Rubisco: US 4,962,028

OCS: Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553

SAD1: Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

SAD2: Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

nos: Shaw y col. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831-7846

V-ATPasa: WO 01/14572

Súper promotor: WO 95/14098

Proteínas de la caja G: WO 94/12015

Promotor ubicuo

Un promotor ubicuo es activo en sustancialmente todos los tejidos o células de un organismo.

5 Promotor regulado evolutivamente

Un promotor regulado evolutivamente es activo durante determinadas etapas del desarrollo o en partes de la planta que experimentan cambios evolutivos.

Promotor inducible

Un promotor inducible ha inducido o aumentado el inicio de la transcripción en respuesta a un estímulo químico

10 (para una revisión véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108), ambiental o físico, o puede ser “inducible por estrés”, es decir, activado cuando una planta se expone a diversas condiciones de estrés, o un “patógeno inducible,” es decir, activado cuando una planta está expuesta a la exposición a diversos patógenos.

Promotor especifico de órgano/específico de tejido

Un promotor específico de órgano o específico de tejido es uno que es capaz de iniciar preferentemente la

15 transcripción en determinados órganos o tejidos, tales como hojas, raíces tejido de semillas, etc. Por ejemplo, un “promotor específico de raíz” es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en las raíces las de plantas, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta. En el presente documento a los promotores capaces de iniciar la transcripción solo en determinadas células se les denomina promotores “específicos de célula”.

20 En la siguiente Tabla i se indican ejemplos de promotores específicos de raíz:

Tabla i: ejemplos de promotores específicos de raíz

Fuente del gen: Referencia

RCc3 de arroz: Xu y col. (1995) Plant Mol Biol 27(2): 237-48

Transportador de fosfato en Arabidopsis PHT1: Kovama y col., 2005

Transportador de fosfato de Medicago: Xiao y col., 2006

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(continuación)

Fuente del gen: Referencia

Pyk10 de Arabidopsis: Nitz y col. (2001) Plant Sci 161(2): 337-346

Genes específicos de la raíz del tabaco RB7, RD2, RD5, RH12: Conkling y col. (1990) Plant Phys 93(3): 1203-1211

Lectina específica de raiz de cebada: Lerner & Raikhel (1989) Plant Phys 91: 124-129

Proteína rica en hidroxiprolina específica de raiz: Keller & Lamb (1989) Genes & Dev 3:1639-1646

CDC27/hobbit de Arabidopsis: Blilou et al. (2002) Genes & Dev 16:2566-2575

Un promotor específico de semilla es transcripcionalmente activo predominantemente en tejidos de semilla, pero no necesariamente exclusivamente en tejidos de semilla (en casos de expresión parcial). El promotor específico de semilla puede ser activo durante el desarrollo y/o durante la germinación de la semilla. Se proporcionan ejemplos de promotores específicos de semilla en Qing Qu y Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004) y en la Tabla ii a continuación

Tabla ii: Ejemplos de promotores específicos de semilla

Fuente del gen: Referencia

genes específicos de semilla: Simon y col., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;

Scofield y col., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;

Baszczynski y col., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

albúmina de Nuez del Brasil: Pearson y col., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992.

Legumina: Ellis y col., Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988.

Glutelina (arroz): Takaiwa y col., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986;

Takaiwa y col., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987.

Zeína: Matzke y col Plant Mol Biol, 14(3):323-32 1990

NapA: Stalberg y col, Planta 199: 515-519, 1996.

Gluteína-1 de BPM y APM de trigo: Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2, 1989

SPA de trigo: Albani y col, Plant Cell, 9: 171-184, 1997

,  y  gliadinas de trigo: EMBO J. 3:1409-15, 1984

Promotor Itr1 de cebada: Diaz y col. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8

Hordeína B1, C, D de cebada: Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996

DOF de cebada: Mena y col, The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998

blz2: EP99106056.7

promotor sintético: Vicente-Carbajosa y col., Plant J. 13: 629-640, 1998.

Prolamina NRP33 de arroz: Wu y col, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998

 globulina Glb-1 de arroz: Wu y col, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998

OSH1 de arroz: Sato y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996

 globulina REB/OHP-1 de arroz: Nakase y col. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997

ADP-glucosa pirofosforilasa de arroz: Trans Res 6:157-68, 1997

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(continuación)

Fuente del gen: Referencia

familia del gen ESR de maíz: Plant J 12:235-46, 1997

-kafirina de sorgo: DeRose y col., Plant Mol. Biol 32:1029-35, 1996

KNOX: Postma-Haarsma y col, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999

Oleosina de arroz: Wu y col, J. Biochem. 123:386, 1998

Oleosina de girasol: Cummins y col., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992

PRO0117, supuesta proteína ribosomal 40S de arroz: WO 2004/070039

PRO0136, alanina aminotransferasa de arroz: No publicado

PRO0147, inhibidor de tripsina ITR1 (cebada): No publicado

PRO0151, WSI18 de arroz: WO 2004/070039

PRO0175, RAB21 de arroz: WO 2004/070039

PRO005: WO 2004/070039

PRO0095: WO 2004/070039

-amilasa (Amy32b): Lanahan y col, Plant Cell 4: 203-211, 1992; Skriver y col, Proc Natl Acad Sci USA 88:7266-7270, 1991

gen similar a la  catepsina: Cejudo y col, Plant Mol Biol 20: 849-856, 1992

Ltp2 de cebada: Kalla y col., Plant J. 6: 849-60, 1994

Chi26: Leah y col., Plant J. 4: 579-89, 1994

B-Perú de maíz: Selinger y col., Genetics 149; 1125-38, 1998

Un promotor específico de tejido verde como se define en el presente documento es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido verde, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta. Los ejemplos de promotores específicos de tejido verde que pueden usarse para realizar los procedimientos de la invención se muestran a continuación en la Tabla iii.

Tabla iii: ejemplo de promotores específicos de tejido verde

Gen: Expresión Referencia

Ortofosfato diquinasa de maíz: Específica de hoja Fukavama y col., 2001

Fosfoenolpiruvato carboxilasa de maíz: Específica de hoja Kausch y col., 2001

Fosfoenolpiruvato carboxilasa de arroz: Específica de hoja Liu y col., 2003

Pequeña subunidad de Rubisco de arroz: Específica de hoja Nomura y col., 2000

Beta expansina EXBP9 de arroz: Específica de brote WO 2004/070039

Pequeña subunidad de Rubisco de frijol de palo: Específica de hoja Panguluri y col., 2005

RBCS3A de guisante: Específica de hoja

Otro ejemplo de un promotor específico de tejido es un promotor específico de meristemo, que es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido meristemático, sustancialmente con la exclusión de 10 cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta. Los ejemplos de promotores específicos de meristemo que pueden usarse para realizar los procedimientos

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de la invención se muestran en la siguiente Tabla iv. Tabla iv: ejemplos de promotores específicos de meristemo

Fuente del gen: Patrón de expresión Referencia

OSH1 de arroz: Meristemo apical de brote, desde la fase globular embrionaria a la fase de plántula Sato y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122

Metalotioneína de arroz: Específico de meristemo BAD87835.1

WAK1 y WAK 2: Meristemos apicales de brote y raíz y en hojas y sépalos en expansión Wagner y Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303-318

Terminador

El término “terminador” incluye una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que señaliza el procesamiento y la poliadenilación en dirección 3’ de un transcripto primario y la terminación de la transcripción. El terminador puede proceder del gen natural, de una variedad de otros genes de planta, o de ADN T. El terminador a añadir puede proceder, por ejemplo, de genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o como alternativa, de otro gen de planta, o menos preferentemente, de cualquier otro gen eucariota.

Modulación

El término “modulación” significa en relación a la expresión o expresión de un gen, un proceso en el que en el nivel de expresión se cambia mediante dicho gen de expresión en comparación con la planta de control, el nivel de expresión puede aumentarse o disminuirse. La expresión original, no modulada, puede ser de cualquier tipo de expresión de un ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con traducción posterior. La expresión “modulación de la actividad” significará cualquier cambio de la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención o proteínas codificadas, que conduce a un rendimiento aumentado y/o a un crecimiento aumentado de las plantas.

Expresión

El término “expresión” o “expresión génica” significa la transcripción de un gen específico o genes específicos o construcción genética específica. El término “expresión” o “expresión génica” significa en particular la transcripción de un gen o genes o construcción genética en ARN estructural (ARNr, ARNt) o ARNm con o sin traducción posterior del último en una proteína. El proceso incluye la transcripción de ADN y el procesamiento del producto de ARNm resultante.

Expresión aumentada/sobreexpresión

La frase “expresión aumentada” o “sobreexpresión” como se usa en el presente documento, significa cualquier forma de expresión que es adicional al nivel de expresión original de tipo silvestre.

En la técnica se documentan bien procedimientos para aumentar la expresión de genes o productos génicos e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión conducida por promotores apropiados, el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de la traducción. Los ácidos nucleicos aislados que sirven como promotores o elementos potenciadores pueden introducirse en una posición apropiada (típicamente cadena arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido para regular positivamente la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, pueden alterarse promotores endógenos in vivo por mutación, deleción y/o sustitución (véase, Kmiec, US 5.565.350; Zarling y col., WO9322443) o pueden introducirse promotores aislados en una célula de planta en la orientación y distancia apropiada de un gen de la presente invención para controlar la expresión del gen.

Si se desea la expresión del polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3’ de una región codificante polinucleotídica. La región de poliadenilación puede proceder del gen natural, de una diversidad de otros genes de planta, o de ADN T. La secuencia de extremo 3’ a añadir pude proceder, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o como alternativa de otro gen de planta, o menos preferentemente de cualquier otro gen eucariota.

También puede añadirse una secuencia intrónica a la región no traducida (UTR, untranslated region) 5’ ola secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. Se ha observado que la inclusión de un intrón de corte y empalme en la unidad de transcripción en construcciones de expresión tanto de plantas como de animales aumenta la expresión génica tanto a nivel de proteína como de ARNm hasta 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395-4405; Callis y col. (1987) Genes Dev 1: 1183-1200). Dicha potenciación intrónica de la expresión génica es típicamente mayor cuando se pone cerca del extremo 5’ de la unidad de transcripción. En la técnica se conoce el uso de los intrones de maíz, el intrón Adh1-S, 1, 2 y 6, el intrón Bronze-1. Para una información general véase: The Maize Handbook,

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expresión usado y de la técnica de transfección usada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, normalmente se introduce un gen que codifica un marcador de selección (tal como los descritos anteriormente) en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden usarse, por ejemplo, en mutantes en los que estos genes no son funcionales mediante, por ejemplo, deleción por procedimientos convencionales. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador de selección pueden introducirse en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o usarse en los procedimientos de la invención, o incluso en un vector distinto. Las células que se han transfectado de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse, por ejemplo, por selección (por ejemplo, células que tienen integrado el marcador de selección sobreviven mientras que las otras mueren). Se conocen en la técnica técnicas para la eliminación de genes marcadores, se describen anteriormente técnicas útiles en la sección de definiciones.

Dado que los genes marcadores, particularmente genes para resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no se requieren o no se desean en la célula huésped transgénica una vez que se han introducido satisfactoriamente los ácidos nucleicos, el proceso de acuerdo con la invención para introducir los ácidos nucleicos emplea ventajosamente técnicas que permiten la retirada o escisión de estos genes marcadores. Un procedimiento de este tipo es lo que se conoce como co-transformación. El procedimiento de co-transformación emplea dos vectores simultáneamente para la transformación, un vector que lleva el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo que lleva el gen (o genes) marcador. Una proporción grande de transformantes recibe o, en el caso de plantas, comprende (hasta el 40 % o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de transformación con Agrobacteria, los transformantes normalmente solo reciben una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el ADN-T, que normalmente representa el casete de expresión. Posteriormente los genes marcadores pueden retirarse de la planta transformada realizando cruzamientos. En otro procedimiento, se usan genes marcadores integrados en un transposón para la transformación junto con el ácido nucleico deseado (conocido como tecnología Ac/Ds). Los transformantes pueden cruzarse con una fuente transposasa o los transformantes se transforman con una construcción de ácido nucleico que confiere expresión de una transposasa, de manera transitoria o estable. En algunos casos (aprox. 10 %), el transposón salta del genoma de la célula huésped una vez que se ha producido la transformación satisfactoriamente y se pierde. En una serie de casos adicionales, el transposón salta a una localización diferente. En estos casos, el gen marcador debe eliminarse realizando cruzamientos. En microbiología, se desarrollan técnicas que hacen posible, o facilitan, la detección de dichos acontecimientos. Un procedimiento ventajoso adicional se basa en lo que se conoce como sistemas de recombinación; cuya ventaja es que la eliminación puede dispensarse por cruzamiento. El sistema mejor conocido de este tipo es lo que se conoce como sistema Cre/lox. Cre1 es una recombinasa que retira las secuencias localizadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias loxP, éste se elimina una vez se haya producido la transformación satisfactoriamente, por expresión de la recombinasa. Otros sistemas de recombinación son el sistema HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble y col., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan y col., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). De acuerdo con la invención, es posible una integración específica de sitio en el genoma de la planta de la secuencia de ácidos nucleicos. Naturalmente, estos procedimientos también pueden aplicarse a microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias.

Transgénico/Transgén/Recombinante

Para los fines de la invención, “transgénico”, “transgén” o “recombinante” significa con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos, un casete de expresión, una construcción génica o un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o un organismo transformado con las secuencias de ácidos nucleicos, casetes o vectores de expresión de acuerdo con la invención, todas estas construcciones realizadas por procedimientos recombinantes en los que

(a): las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas útiles en los procedimientos de la invención o

(b): la secuencia (o secuencias) de control genético que se une operativamente con la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, por ejemplo un promotor, o

(c): a) y b)

no se localizan en su ambiente genético natural o se han modificado por procedimientos recombinantes, siendo posible que se produzca la modificación de, por ejemplo, una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más restos de nucleótido. Se entiende que, ambiente genético natural, significa el locus genómico o cromosómico natural en la planta original o la presencia en una genoteca. En el caso de una genoteca, el ambiente genético natural de la secuencia de ácidos nucleicos se conserva preferentemente, al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácidos nucleicos al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, preferentemente al menos 500 pb, en especial preferentemente al menos 1000 pb, más preferentemente al menos 5000 pb. Un casete de expresión de origen natural -por ejemplo la combinación de origen natural del promotor natural de las secuencias de ácidos nucleicos con la secuencia de ácidos nucleicos correspondiente que codifica un polipéptido útil en los procedimientos de la presente invención, como se ha definido anteriormente -llega a ser un casete de expresión transgénica cuando esta casete de expresión se modifica mediante procedimientos sintéticos no naturales (“artificiales”) tal como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Se describen procedimientos adecuados, por ejemplo, en los documentos US 5.565.350 o WO 00/15815.

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gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a plantas transgénicas. Por tanto, por ejemplo, semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacterias y se obtienen semillas del desarrollo de plantas de las que se transforma una determinada proporción y por tanto transgénicas [Feldman, KA y Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208: 274-289; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua y J Shell, eds, Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapore, pág. 274-289]. Los procedimientos alternativos se basan en la retirada repetida de las inflorescencias e incubación del sitio de escisión en el centro de la roseta con agrobacterias transformadas, por lo que las semillas transformadas pueden obtenerse de modo similar en un punto de tiempo final (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un procedimiento especialmente eficaz es el procedimiento de infiltración por vacío con sus modificaciones tal como el procedimiento de “inmersión floral”. En el caso de la infiltración por vacío de Arabidopsis, las plantas intactas bajo presión reducida se tratan con una suspensión agrobacteriana [Bechthold, N (1993). C R Acad Sci Paris Life Sci,

316: 1194-1199], mientras que en el caso del procedimiento de “inmersión floral” el tejido floral en desarrollo se incuba brevemente con una suspensión agrobacteriana tratada con tensioactivo [Clough, SJ y Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743]. En ambos casos se recoge una determinada proporción de semillas transgénicas y estas semillas pueden diferenciarse de semillas no transgénicas al cultivar bajo las condiciones selectivas descritas anteriormente. Además, la transformación estable de los plástidos es ventajosa ya que estos se heredan por vía materna en la mayor parte de los cultivos reduciendo o eliminando el riesgo de flujo transgénico a través del polen. La transformación del genoma del cloroplasto generalmente se realiza mediante un proceso que han presentado esquemáticamente Klaus y col., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225-229]. En resumen, las secuencias a transforman se clonan junto con un gen marcador de selección entre las secuencias flanqueantes homólogas al genoma del cloroplasto. Estas secuencias flanqueantes homólogas dirigen la integración específica de sitio en el plastoma. La transformación plastidial se ha descrito para muchas especies de plantas diferentes y se ofrece una revisión en Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):425-38 o Maliga, P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21, 20-28. Recientemente se han descrito progresos biotecnológicos adicionales, en forma de transformantes plastidiales sin marcador, que pueden producirse mediante un gen marcador co-integrado transitorio (Klaus y col., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

El etiquetado en activación de ADN T

El etiquetado en activación de ADN T (Hayashi y col. Science (1992) 1350-1353), implica la inserción de ADN T, que normalmente contiene un promotor (también puede ser un potenciador de traducción o un intrón), en la región genómica del gen de interés o 10 kb cadena arriba o cadena abajo de la región codificante de un gen en una configuración de tal manera que el promotor dirige la expresión del gen diana. Típicamente, la regulación de la expresión del gen diana mediante su promotor natural se interrumpe y el gen cae bajo el control del promotor nuevamente introducido. El promotor se incorpora típicamente en un ADN T. Este ADN T se inserta al azar el genoma de la planta, por ejemplo, a través de infección por Agrobacterium y conduce a expresión modificada de genes cerca al ADN T insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debidos a la expresión modificada de los genes cerca al promotor introducido.

TILLING

El término “TILLING” es la abreviatura de “Targeted Induced Local Lesions In Genomes” (Inducción Dirigida de Lesiones Locales en el Genoma) y se refiere a una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas con expresión y/o actividad modificada. El TILLING también permite la selección de plantas que llevan dichas variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden presentar expresión modificada, en fuerza o en localización o en tiempo (si las mutaciones afectan, por ejemplo, al promotor). Estas variantes mutantes pueden presentar mayor actividad que la mostrada por el gen en su forma natural. El TILLING combina mutagénesis de alta densidad con procedimientos de detección de alto rendimiento. Las etapas seguidas típicamente en el TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei GP y Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds. Singapore, World Scientific Publishing Co, páginas 16-82; Feldmann y col., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, páginas 137-172; Lightner J y Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, páginas 91-104); (b) preparación y agrupamiento de ADN en individuos; (c) amplificación por PCR de una región de interés; (d) desnaturalización e hibridación para permitir la formación de heteroduplex; (e) DHPLC, donde la presencia de un heteroduplex en un grupo se detecta como un pico extra en el cromatograma; (f) identificación del mutante individual; y (g) secuenciación del producto PCR mutante. Los procedimientos de TILLING son bien conocidos en la técnica (McCallum y col., (2000) Nat Biotechnol 18: 455457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

Recombinación homóloga

La recombinación homóloga permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición definida seleccionada. La recombinación homóloga es una tecnología convencional utilizada rutinariamente en ciencias biológicas para organismos inferiores tales como levaduras o el musgo Physcomitrella. Se han descrito procedimientos para realizar recombinación homóloga en plantas no solo para el modelo de plantas (Offringa y col. (1990) EMBO J 9(10): 3077-84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo, arroz (Terada y col. (2002) Nat

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Biotech 20(10): 1030-4; lida y Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2): 132-8), y existen estrategias que son generalmente aplicables independientemente del organismo diana (Miller y col, Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007).

Rendimiento

El término “rendimiento” en general significa un producto medible de valor económico, típicamente relacionado con un cultivo, un área y un periodo de tiempo específicos. Las partes de planta individuales contribuyen directamente al rendimiento en base a su número, tamaño y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por metro cuadrado de un cultivo y año, que se determina dividiendo la producción total (incluyendo la producción tanto cosechada como valorada) por metro cuadrado plantado. El término “rendimiento” de una planta puede estar relacionado con biomasa vegetativa (biomasa de raíz y/o brote), con órganos reproductores y/o con propágulos (tal como semillas) de esta planta.

Vigor temprano

“Vigor temprano” se refiere a un crecimiento bien equilibrado saludable activo especialmente durante las etapas tempranas del crecimiento de la planta, y puede ser el resultado del aumento de la eficacia biológica de la planta debido a, por ejemplo, plantas que están mejor adaptadas a su ambiente (es decir, optimizando el uso de fuentes de energía y repartiendo entre brotes y raíces). Las plantas que tienen vigor temprano también muestran supervivencia aumentada de plántula y un mejor establecimiento del cultivo, que a menudo produce campos muy uniformes (creciendo el cultivo de una manera uniforme, es decir, alcanzando la mayoría de las plantas las diversas etapas de desarrollo a sustancialmente el mismo tiempo) y a menudo mejor y mayor rendimiento. Por lo tanto, el vigor temprano puede determinarse midiendo diversos factores, tales como, peso de mil granos, porcentaje de germinación, porcentaje de emergencia, crecimiento de plántula, altura de plántula, longitud de raíz, biomasa de brote y raíz y muchos más.

Aumento/Mejora/Potenciación

Los términos “aumento”, “mejora” o “potenciación” son intercambiables y significan en el sentido de la solicitud al menos 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % o 10 %, preferentemente al menos 15 % o 20 %, más preferentemente 25 %, 30 %, 35 % o 40 % más rendimiento y/o crecimiento en comparación con plantas de control como se define en el presente documento.

Rendimiento de semilla

El rendimiento de semilla aumentado puede manifestarse por sí mismo como uno o más de los siguientes: a) un aumento en biomasa de semilla (peso total de semilla) que puede establecerse sobre una semilla individual y/o por planta y/o por metro cuadrado; b) número de flores por planta aumentado; c) número de semillas (llenas) aumentado; d) tasa de llenado de semilla aumentado (que se expresa como la proporción entre el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas); e) índice de cosecha aumentado, que se expresa como una proporción del rendimiento de partes cosechables, tales como semillas, dividido entre la biomasa total, y f) peso de mil granos (PMG) aumentado y g) número aumentado de panículas primarias, que se extrapola a partir del número de semillas llenas contadas y su peso total. Un PMG aumentado puede ser el resultado de un tamaño y/o peso de semilla aumentado y también puede ser el resultado de un aumento en el tamaño del embrión y/o endospermo.

También puede manifestarse un aumento en el rendimiento de la semilla como un aumento del tamaño de la semilla y/o volumen de la semilla. Además, también puede manifestarse un aumento en el rendimiento de la semilla en sí mismo como un aumento en el área de semilla y/o longitud de semilla y/o anchura de semilla y/o un perímetro de semilla. El rendimiento de semilla aumentado puede ser también el resultado de arquitectura modificada, o puede ocurrir debido a la arquitectura modificada.

Índice de verdor

El “índice de verdor” como se usa en el presente documento se calcula a partir de imágenes digitales de plantas. Para cada píxel que pertenece al objeto de la planta sobre la imagen, se calcula la proporción del valor verde frente al valor rojo (en el modelo RGB por el que se codifica el color). El índice de verdor se expresa como el porcentaje de píxeles por el que la proporción con verde con respecto a rojo supera un umbral determinado. En condiciones de crecimiento normales, en condiciones de crecimiento de estrés salino y en condiciones de crecimiento de disponibilidad de nutrientes reducido, el índice de verdor de las plantas se mide en la última imagen antes de la floración. Por otro lado, en condiciones de crecimiento de estrés por sequía, el índice de verdor de las plantas se mide en la primera imagen después de la sequía.

Planta

El término “planta” como se usa en el presente documento incluye plantas completas, antecesores y progenie de las plantas y partes de las plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos), flores y

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significado estadístico de los emparejamientos. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucleico usado en la presente invención se usó para el algoritmo TBLASTN, con configuraciones predeterminadas y el filtro para ignorar la activación de secuencias de baja complejidad. El resultado de los análisis se observó por comparación por pares, y se clasificó de acuerdo con la puntuación de probabilidad (valor E), en el que la puntuación refleja la 5 probabilidad de que se produzca un alineamiento particular por casualidad (cuanto menor sea el valor E más significativo es el acierto). Además de los valores E, las comparaciones también se puntuaron por porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o de polipéptidos) comparadas sobre una longitud particular.

La Tabla A proporciona un listado de secuencias de ácidos nucleicos relacionados con la secuencia de 10 ácidos nucleicos usados en los procedimientos de la presente invención.

Tabla A: Ejemplos de ácidos nucleicos y polipéptidos PRP38:

Nombre: Especie de origen SEC ID N.º: de ácido nucleico SEC ID N.º: de polipéptido

Arath_PRP38_1: Arabidopsis thaliana SEC ID N.º: 76 SEC ID N.º: 77

Arath_PRP38_2: Arabidopsis thaliana SEC ID N.º: 78 SEC ID N.º: 79

Arath_PRP38_3: Arabidopsis thaliana SEC ID N.º: 80 SEC ID N.º: 81

Arath_PRP38_4: Arabidopsis thaliana SEC ID N.º: 82 SEC ID N.º: 83

Arath_PRP38_5: Arabidopsis thaliana SEC ID N.º: 84 SEC ID N.º: 85

brasy_PRP38_1: Brachypodium sylvaticum SEC ID N.º: 86 SEC ID N.º: 87

brasv_PRP38_2: Brachypodium sylvaticum SEC ID N.º: 88 SEC ID N.º: 89

Chlre_PRP38_1: Chlamydomonas reinhardtii SEC ID N.º: 90 SEC ID N.º: 91

Horvu_PRP38_1: Hordeum vulgare SEC ID N.º: 92 SEC ID N.º: 93

Lvces_PRP38_1: Lycopersicum esculentum SEC ID N.º: 94 SEC ID N.º: 95

Medtr_PRP38_1: Medicago truncatula SEC ID N.º: 96 SEC ID N.º: 97

Orvsa_PRP38_1: Oryza sativa SEC ID N.º: 98 SEC ID N.º: 99

Orvsa_PRP38_2: Oryza sativa SEC ID N.º: 100 SEC ID N.º: 101

Ostta_PRP38_1: Ostreococcus tauri SEC ID N.º: 102 SEC ID N.º: 103

Ostta_PRP38_2: Ostreococcus tauri SEC ID N.º: 104 SEC ID N.º: 105

Poptr_PRP38_1: Populus trichocarpa SEC ID N.º: 106 SEC ID N.º: 107

Poptr_PRP38_2: Populus trichocarpa SEC ID N.º: 108 SEC ID N.º: 109

Sacof_PRP38_1: Saccharum officiarum SEC ID N.º: 110 SEC ID N.º: 111

Sacof_PRP38_3: Saccharum officiarum SEC ID N.º: 112 SEC ID N.º: 113

Schce_PRP38_1: Saccharomyces cerevisie SEC ID N.º: 114 SEC ID N.º: 115

Triae_PRP38_1: Triticum aestivum SEC ID N.º: 116 SEC ID N.º: 117

Vitvi_PRP38_1: Vitis vinifera SEC ID N.º: 118 SEC ID N.º: 119

Ejemplo 2: Alineamiento de las secuencias del polipéptido PRP38

El alineamiento de las secuencias de polipéptidos se realizó utilizando el programa AlignX del vector NTI (Invitrogen) que es a base del popular algoritmo de alineamiento progresivo Clustal W (Thompson y col. (1997) Nucleic Acids

15 Res 25:4876-4882; Chenna y col. (2003). Nucleic Acids Res 31:3497-3500). Los valores predeterminados fueron: para la penalización de apertura de hueco de 10, para la penalización de la extensión de hueco de 0,1 y la matriz de peso seleccionada fue Blosum 62 (si se alinean polipéptidos).

La conservación de secuencia entre polipéptidos PRP38 fue esencialmente en el dominio N-terminal de PRP38 de los polipéptidos, siendo de forma habitual el dominio N-terminal más variable en longitud y composición de

20 secuencia, estaba enriquecido en aminoácidos acídicos. Los polipéptidos PRP38 están alineados en la Figura 2. Se construyó un árbol filogenético de polipéptidos PRP38 (Figura 3) utilizando un algoritmo de agrupamiento de unión de vecindad como se proporciona en el programa AlignX del vector NTI (Invitrogen).

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Tabla C: Resultados de exploración Pfam (números de registro principales) de la secuencia de polipéptidos de la Tabla A. Se proporcionan las coordenadas de aminoácidos que delimitan el dominio (Nombre de Dominio) en el polipéptido explorado (Polipéptido de Búsqueda). Se proporciona el valor e del alineamiento del Polipéptido de búsqueda para el acierto en la entrada de Pfam.

Polipéptido de Búsqueda: Nombre de Dominio Coordenadas de aminoácidos: Inicio Coordenadas de aminoácidos: Fin Valor e

Arath_PRP38_1: PRP38 1 170 2,4e-31

Arath_PRP38_1: DUF1777 255 389 0,026

Arath_PRP38_4: DUF1777 87 221 0,026

Arath_PRP38_5: PRP38 1 177 9,3e-65

Arath_PRP38_5: DUF1777 208 355 0,15

Brasy_PRP38_1: PRP38 1 169 1,5e-24

Brasy_PRP38_1: DUF1777 251 392 0,14

Brasy_PRP38_2: PRP38 1 162 1E-15

Chlre_PRP38_1: PRP38 1 169 1,9e-22

Chlre_PRP38_1: DUF1777 289 354 0,77

Horvu_PRP38_1: PRP38 1 169 2,1e-29

Lyces_PRP38_1: PRP38 1 170 3,5e-26

Lyces_PRP38_1: DUF1777 266 428 0,024

Medtr_PRP38_1: PRP38 1 177 5E-71

Orysa_PRP38_1: PRP38 1 169 2,9e-29

Orysa_PRP38_1: DUF1777 270 434 0,1

Orysa_PRP38_2: PRP38 1 177 5,5e-75

Orysa_PRP38_2: DUF1777 235 392 0,071

Ostta_PRP38_1: PRP38 1 146 6,5e-41

Ostta_PRP38_2: PRP38 16 191 7,1e-10

Poptr_PRP38_1: PRP38 1 169 5,8e-29

Poptr_PRP38_1: DUF1777 263 414 0,0074

Poptr_PRP38_2: PRP38 1 169 3,7e-26

Poptr_PRP38_2: DUF1777 258 414 0,23

Sacof_PRP38_1: PRP38 1 169 8,6e-27

Sacof_PRP38_3: PRP38 1 169 3,3e-27

Sacof_PRP38_3: DUF1777 263 375 0,067

Schce_PRP38_1: PRP38 6 221 2,8e-150

Triae_PRP38_1: PRP38 1 177 4,6e-71

Triae_PRP38_1: DUF1777 220 371 0,17

Vitvi_PRP38_1: PRP38 1 177 4,6e-71

Vitvi_PRP38_1: DUF1777 220 371 0,17

Ejemplo 5: Clonado de la secuencia de ácidos nucleicos utilizada en los procedimientos de la invención

La secuencia de ácidos nucleicos usada en los procedimientos de la invención se amplificó mediante PCR usando como molde una biblioteca de ADNc de plántulas de Arabidopsis thaliana hecha por el cliente (en pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, RU). La PCR se realizó utilizando la polimerasa de ADN Hifi Taq en condiciones estándar,

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