ES2539530T3

ES2539530T3 - Plantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y un procedimiento de fabricación de las mismas

Info

Publication number: ES2539530T3
Application number: ES09178941.2T
Authority: ES
Inventors: Yves Hatzfeld; Ana Isabel Sanz Molinero; Amber Shirley; Lalitree Darnielle; Valerie Frankard; Steven Vandenabeele; Bryan Mckersie
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2007-05-03
Filing date: 2008-05-02
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2028-05-02
Also published as: US20150259698A1; CA2900183A1; EP2069509B1; DE112008001044T5; WO2008137108A3; EP2505652B1; ES2403281T3; CN101802202A; AU2008248189A1; EP2228386A1; AR067314A1; EP2316956B1; EP2316956A3; EP2069509A2; US20100132071A1; EP2505652A1; CA2685223A1; BRPI0823525A2; EP2316956A2; BRPI0810703A2

Abstract

Un procedimiento para aumentar el rendimiento de las semillas en plantas con respecto a las plantas de control, que comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SPL11, en el que dicho polipéptido SPL11 comprende un dominio SBP que tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 % o más con una cualquiera de SEC ID Nº: 456 a SEC ID Nº: 468 y SEC ID Nº: 478, en el que dicho rendimiento de semilla aumentado comprende preferentemente aumento del peso total de semilla, del número de semillas llenas, del número de semillas o floretes por panícula, del peso de mil granos, de la tasa de llenado de la semilla y/o del índice de cosecha, con respecto a plantas de control.

Description

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Dependiendo del uso final, la modificación de determinados rasgos de rendimiento puede estar favorecida sobre otros. Por ejemplo, para aplicaciones tales como forraje o producción de madera, o fuente de biocombustible, puede ser deseable un aumento en las partes vegetativas de una planta, y para aplicaciones tales como producción de harina, almidón o aceite, el aumento en los parámetros de semilla puede ser particularmente deseable. Incluso entre los parámetros de semilla, algunos pueden estar favorecidos sobre otros, dependiendo de la aplicación. Diversos mecanismos pueden contribuir a aumentar el rendimiento de las semillas, ya sea que esté en la forma de tamaño de semilla aumentado o número de semilla aumentado.

Una estrategia para aumentar el rendimiento (rendimiento de semillas y/o biomasa) en las plantas puede ser a través de la modificación de los mecanismos de crecimiento intrínsecos de una planta, tal como el ciclo celular o diversas rutas de señalización implicados en el crecimiento de la planta o en los mecanismos de defensa.

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que la modulación de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de la transcripción de la proteína de unión al promotor Squamosa de tipo 11 (SPL11) produce pantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento y/o mejora diversas características del crecimiento de las plantas en relación con las plantas de control.

De acuerdo con un aspecto de la solicitud, se proporciona un método para mejorar o potenciar rasgos relacionados con el rendimiento y/o mejorar diversas características del crecimiento de las plantas de una planta con relación a plantas de control, que comprende modular en una planta la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido del factor de la transcripción de la proteína de unión al promotor Squamosa de tipo 11 (SPL11).

Antecedentes

Proteína de unión al promotor Squamosa de tipo 11 (SPL11)

Los polipéptidos de factores de transcripción normalmente se definen como proteínas que muestran afinidad de unión al ADN específica de secuencias y que son capaces de activar y/o reprimir la transcripción. Los polipéptidos del factor de la transcripción de la proteína de unión al promotor Squamosa de tipo 11 (SPL, por las siglas en inglés Squamosa promoter binding protein-like) son proteínas estructuralmente diversas que comparten un dominio de unión al ADN (DBD, por sus siglas en inglés DNA binding domain) muy conservado de aproximadamente 80 restos de aminoácidos de longitud (Klein y col. (1996) Mol Gen Genet 259: 7-16; Cardon y col. (1999) Gene 237: 91-104). El sitio de unión a la secuencia consenso del ADN del factor de la transcripción de SPL en el promotor de genes diana es 5’-TNCGTACAA-3’ donde N representa cualquier base. Dentro del DBD de SPL hay diez restos de cisteína (Cys) o histidina (His) conservados (véase la Figura 28) de los cuales ocho son restos de coordinación del cinc que se unen a dos iones de cinc necesarios para la formación de la estructura terciaria del dedo de cinc específico de SPL (Yamasaki y col. (2004) J Mol Biol 337: 49-63). Una segunda característica conservada dentro del DBD de SPL es una señal de localización nuclear bipartita. Fuera del DBD, en la mayoría de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de factores de transcripción de SPL (bien en la región codificante, o en la UTR 3’) en todo el reino vegetal (Rhoades y col. (2002) Cell 110: 513-520), se encuentra un motivo diana de micro ARN (miRNA), dirigido específicamente por la familia miR156 de los miARN. Los miARN controlan la expresión de genes de SPL post-transcripcionalmente dirigiendo los ARNm que codifican la SPL para degradación o por represión traduccional.

El genoma de Arabidopsis codifica al menos 1533 reguladores transcripcionales, representando 5,9 % de su número total de genes estimado (Riechmann y col. (2000) Science 290: 2105-2109). Los autores comunican 16 polipéptidos de factores de transcripción de SPL en Arabidopsis thaliana, con escasa similitud de secuencia entre ellos (excepto las características anteriormente mencionadas), variando el tamaño del polipéptido SPL deducido de 131 a 927 aminoácidos. No obstante, los pares de polipéptidos de factores de transcripción de SPL comparten mayor homología de secuencia cuando se detectan en la familia de SPL de esta planta (Cardon y col. (1999)).

Se ha mostrado que los polipéptidos de factores de transcripción de SPL (solamente encontrados en plantas) caracterizados hasta ahora funcionan en el desarrollo de las plantas, en particular en el desarrollo de las flores. Se notificó acerca de plantas transgénicas que sobreexpresaban un polipéptido del factor de transcripción de SPL3 al inicio de la floración (Cardon y col. (1997) Plant J 12: 367-377). En la solicitud de patente Europea EP1033405, se desvelan las secuencias polipeptídicas deducidas y de ácidos nucleicos del polipéptido del factor de transcripción de SPL11.

Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que la modulación en una planta de la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SPL11 produce pantas que tienen rasgos potenciados relacionados con el rendimiento, en particular rendimiento aumentado con respecto a plantas de control.

De acuerdo con una realización, se proporciona un procedimiento para aumentar el rendimiento de las semillas en plantas con respecto a plantas de control, que comprende aumentar la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SPL11, en el que dicho SPL11 comprende un dominio SBP que tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 % o más con una cualquiera de SEC ID Nº: 456 a SEC ID Nº: 468 y SEC ID Nº: 478, en el que dicho rendimiento aumentado de las semillas comprende preferentemente un aumento del peso total de la semilla, del número de semillas llenas, del

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se lavan con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de dichos lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final: a menor concentración salina y mayor temperatura de lavado, mayor rigurosidad de lavado. Las condiciones de lavado se realizan típicamente a, o por debajo de, la rigurosidad de hibridación. Una hibridación positiva da lugar a una señal que es al menos dos veces la del fondo. Generalmente, las condiciones de rigurosidad adecuadas para los ensayos de hibridación de ácido nucleico o los procedimientos de detección de amplificación de genes son como se expusieron anteriormente. También pueden seleccionarse condiciones más o menos rigurosas. El experto en la técnica es consciente de que, durante el lavado, pueden alterarse diversos parámetros y que mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

Por ejemplo, las condiciones de hibridación típicas de alta rigurosidad para híbridos de ADN mayores de 50 nucleótidos incluyen una hibridación a 65 ºC en 1x SSC o a 42 ºC en 1x SSC y formamida al 50 %, seguido de lavado a 65 ºC en 0,3x SSC. Los ejemplos de condiciones de hibridación de rigurosidad media para híbridos de ADN más largos de 50 nucleótidos incluyen una hibridación a 50 ºC en 4x SSC o a 40 ºC en 6x SSC y formamida al 50 %, seguido de lavado a 50 ºC en 2x SSC. La longitud del híbrido es la longitud prevista para la hibridación del ácido nucleico. Cuando los ácidos nucleicos de secuencia conocida se hibridan, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias e identificando las regiones conservadas descritas en el presente documento. 1x SSC es NaCl 0,15 M y citrato sódico 15 mM, la solución de hibridación y las soluciones de lavado pueden incluir adicionalmente reactivo de Denhardt 5x, SDS al 0,5-1,0 %, 100 g/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado 100 g/ml, pirofosfato sódico al 0,5 %.

Con el fin de definir el nivel de rigurosidad, puede hacerse referencia a Sambrook y col. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 y actualizaciones anuales).

Variante de corte y empalme

La expresión “variante de corte y empalme” como se usa en el presente documento incluye variantes de una secuencia de ácido nucleico en la que los intrones y/o exones seleccionados se han escindido, reemplazado, desplazado o añadido, o en la que los intrones se han acortado o alargado. Dichas variantes serán aquellas en las que la actividad biológica de la proteína esté sustancialmente conservada; esto puede conseguirse conservando selectivamente los segmentos funcionales de la proteína. Dichas variantes de corte y empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden ser sintetizadas por el hombre. En la técnica se conocen bien procedimientos para predecir y aislar dichas variantes de corte y empalme (véase, por ejemplo, Foissac y Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).

Variante alélica

Los alelos o variantes alélicas son formas alternativas de un gen determinado, localizado en la misma posición cromosómica. Las variantes alélicas incluyen Polimorfismos Mononucleotídicos (SNP, por las siglas Single Nucleotide Polymorphisms), así como Polimorfismos Pequeños de Inserción/Deleción (INDELs, por las siglas Small Insertion/Deletion Polymorphisms). El tamaño de los INDELs es normalmente menor de 100 pb. Los SNP y los INDELs forman la serie de variantes de secuencia más grande en las cepas polimórficas de origen natural de la mayoría de los organismos.

Combinación de genes/Evolución dirigida

La combinación de genes o evolución dirigida consiste en repeticiones de combinación de ADN seguido de exploración y/o selección apropiada para generar variantes de ácidos nucleicos o partes de las mismas que codifican proteínas que tienen una actividad biológica modificada (Castle y col., (2004) Science 304(5674): 1151-4; Patentes de Estados Unidos 5.811.238 y 6.395.547).

Elemento regulador/Secuencia de control/Promotor

Las expresiones “elemento regulador”, “secuencia de control” y “promotor” se usan todas indistintamente en el presente documento y se toman en un contexto amplio para referirse a una secuencia de ácido nucleico reguladora capaz de efectuar la expresión de las secuencias a las que se unen. El término “promotor” se refiere típicamente a una secuencia de control de ácido nucleico localizada cadena arriba del inicio transcripcional de un gen y que está implicado en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo así la transcripción de un ácido nucleico unido operativamente. En los términos anteriormente mencionados se incluyen las secuencias reguladoras transcripcionales procedentes de un gen genómico eucariota clásico (incluyendo la caja TATA que es necesaria para el inicio de la transcripción adecuado, con o sin secuencia de caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras cadena arriba, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta al desarrollo y/o estímulo externo, o de una manera específica de tejido. También se incluye en el término una secuencia reguladora transcripcional de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladores transcripcionales de caja -10. La expresión “elemento regulador” también incluye una molécula de fusión sintética o un derivado que confiere, activa o potencia la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano.

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Un “promotor de planta” comprende elementos reguladores, que median la expresión de un segmento de secuencia codificante en células de plantas. Por consiguiente, un promotor de planta no tiene que ser de origen vegetal, sino que puede originarse de virus o microorganismos, por ejemplo de virus que atacan a las células de planta. El “promotor de planta” también puede originarse de una célula de planta, por ejemplo, de la planta que se transforma con la secuencia de ácido nucleico a expresar en el proceso de la invención y descrito en el presente documento. Esto también se aplica a las otras señales reguladoras de “planta”, tales como terminadores de “planta”. Los promotores cadena arriba de la secuencias de nucleótidos útiles en los procedimientos de la presente invención pueden modificarse mediante una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de nucleótido sin interferir con la funcionalidad o actividad de cualquiera de los promotores, la fase de lectura abierta (ORF, Open Reading Frame) o la región reguladora 3’ tal como terminadores u otras regiones reguladoras 3’ que se localizan fuera de la ORF. Además es posible que la actividad de los promotores aumente por la modificación de su secuencia o que se reemplacen completamente mediante más promotores activos, incluso promotores de organismos heterólogos. Para la expresión en plantas, la molécula de ácido nucleico debe, como se ha descrito anteriormente, estar unida operativamente a, o comprender, un promotor adecuado que exprese el gen de manera adecuada, en tiempo y con el patrón de expresión espacial requerido.

Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato pueden analizarse, por ejemplo, uniendo operativamente el promotor a un gen indicador y evaluando el nivel de expresión y el patrón del gen indicador en diversos tejidos de la planta. Los genes indicadores bien conocidos adecuados incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o la beta-galactosidasa. La actividad del promotor se evalúa midiendo la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La fuerza del promotor y/o el patrón de expresión pueden después compararse con la de un promotor de referencia (tal como el que se usa en los procedimientos de la presente invención). Como alternativa, la fuerza del promotor puede evaluarse cuantificando niveles de ARNm o comparando niveles de ARNm del ácido nucleico usado en los procedimientos de la presente invención, con niveles de ARNm de genes constitutivos tal como ARNr 18S, usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como transferencia de Northern con análisis densitométrico de autorradiogramas, PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (Heid y col., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Generalmente por “promotor débil” se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. Por “nivel bajo” se entiende niveles de aproximadamente 1/10.000 transcriptos a aproximadamente 1/100.000 transcriptos, a aproximadamente 1/5000000 transcriptos por célula. Por el contrario, un “promotor fuerte” dirige la expresión de una secuencia codificante a alto nivel, o a aproximadamente 1/10 transcriptos a aproximadamente 1/100 transcriptos a aproximadamente 1/1000 transcriptos por célula. Generalmente, por “promotor de fuerza media” se entiende un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel más bajo que el de un promotor fuerte, en particular a un nivel que es, en todos los casos, inferior al obtenido cuando está bajo el control de un promotor CaMV 35S.

Unido operativamente

La expresión “unido operativamente” como se usa en el presente documento se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora puede iniciar la transcripción del gen de interés.

Promotor constitutivo

Un “promotor constitutivo” se refiere a un promotor que es transcripcionalmente activo durante la mayor parte, aunque no necesariamente en todas, las fases de crecimiento y desarrollo y en la mayor parte de las condiciones ambientales, en al menos una célula, tejido u órgano. La siguiente Tabla 2a proporciona ejemplos de promotores constitutivos.

Tabla 2a: ejemplos de promotores constitutivos

Fuente del gen: Referencia

Actina: McElroy y col, Plant Cell, 2: 163-171, 1990

HMGP: WO 2004/070039

CAMV 35S: Odell y col, Nature, 313: 810-812, 1985

CaMV 19S: Nilsson y col., Physiol. Plant. 100:456-462, 1997

GOS2: de Pater y col, Plant J Nov; 2(6):837-44, 1992, WO 2004/065596

Ubiquitina: Christensen y col, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992

Ciclofilina de arroz: Buchholz y col, Plant Mol Biol. 25(5): 837-43, 1994

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Fuente del gen: Referencia

Histona H3 de maíz: Lepetit y col, Mol. Gen. Genet. 231:276-285, 1992

Histona H3 de alfalfa: Wu y col. Plant Mol. Biol. 11:641-649, 1988

Actina n 2: An y col, Plant J. 10(1); 107-121, 1996

34S FMV: Sanger y col., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443

Subunidad pequeña Rubisco: US 4,962,028

OCS: Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553

SAD1: Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

SAD2: Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

nos: Shaw y col. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831-7846

V-ATPasa: WO 01/14572

Súper promotor: WO 95/14098

Proteínas de la caja G: WO 94/12015

Promotor ubicuo

Un promotor ubicuo es activo en sustancialmente todos los tejidos o células de un organismo.

5 Promotor regulado evolutivamente

Un promotor regulado evolutivamente es activo durante determinadas etapas del desarrollo o en partes de la planta que experimentan cambios evolutivos.

Promotor inducible

Un promotor inducible ha inducido o aumentado el inicio de la transcripción en respuesta a un estímulo químico

10 (para una revisión véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89-108), ambiental o físico, o puede ser “inducible por estrés”, es decir, activado cuando una planta se expone a diversas condiciones de estrés, o un “patógeno inducible,” es decir, activado cuando una planta está expuesta a la exposición a diversos patógenos.

Promotor especifico de órgano/específico de tejido

Un promotor específico de órgano o específico de tejido es uno que es capaz de iniciar preferentemente la

15 transcripción en determinados órganos o tejidos, tales como hojas, raíces tejido de semillas, etc. Por ejemplo, un “promotor específico de raíz” es un promotor que es transcripcionalmente activo predominantemente en las raíces las de plantas, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra parte de una planta, mientras que aún permite cualquier expresión parcial en estas otras partes de la planta. En el presente documento a los promotores capaces de iniciar la transcripción solo en determinadas células se les denomina promotores “específicos de célula”.

20 En la siguiente Tabla 2b se indican ejemplos de promotores específicos de raíz:

Tabla 2b: ejemplos de promotores específicos de raíz

Fuente del gen: Referencia

RCc3: Plant Mol Biol. 1995 Jan;27(2):237-48

Arabidopsis PHT1: Kovama y col., 2005; Mudge y col. (2002, Plant J. 31: 341)

Transportador de fosfato en Medicago: Xiao y col., 2006

Arabidopsis Pyk10: Nitz y col. (2001) Plant Sci 161(2): 337-346

genes expresables en raíz: Tingey y col., EMBO J. 6: 1, 1987.

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Fuente del gen: Referencia

gen inducible por auxina en tabaco: Van der Zaal y col., Plant Mol. Biol. 16, 983, 1991.

-tubulina: Oppenheimer, y col., Gene 63: 87, 1988.

genes específicos de la raíz del tabaco: Conkling, y col., Plant Physiol. 93: 1203, 1990.

gen G1-3b de B. napus: Patente de Estados Unidos No. 5.401.836

SbPRP1: Suzuki y col., Plant Mol. Biol. 21: 109-119, 1993.

LRX1: Baumberger y col. 2001, Genes & Dev. 15:1128

BTG-26 de Brassica napus: US 20050044585

LeAMT1 (tomate): Lauter y col. (1996, PNAS 3:8139)

The LeNRT1-1 (tomate): Lauter y col. (1996, PNAS 3:8139)

gen de la patatina de clase I (patata): Liu y col., Plant Mol. Biol. 153:386-395, 1991.

KDC1 (Daucus carota): Downey y col. (2000, J. Biol. Chem. 275:39420)

gen de TobRB7: W Song (1997) PhD Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC USA

OsRAB5a (raíz): Wang y col. 2002, Plant Sci. 163:273

ALF5 (Arabidopsis): Diener y col. (2001, Plant Cell 13:1625)

NRT2;1Np (N. plumbaginifolia): Quesada y col. (1997, Plant Mol. Biol. 34:265)

Un promotor específico de semilla es transcripcionalmente activo predominantemente en tejidos de semilla, pero no necesariamente exclusivamente en tejidos de semilla (en casos de expresión parcial). El promotor específico de

5 semilla puede ser activo durante el desarrollo y/o durante la germinación de la semilla. El promotor específico de semilla puede ser específico de endospermo/aleurona/embrión. En las Tablas 2d, 2e y 2f se muestran ejemplos de promotores específicos de semilla (específicos de endospermo/aleurona/embrión). Otros ejemplos de promotores específicos de semilla se dan en Qing Qu y Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004), cuya divulgación se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad.

10 Tabla 2c: ejemplos de promotores específicos de semilla

Fuente del gen: Referencia

genes específicos de semilla: Simon y col., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;

Scofield y col., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987;

Baszczynski y col., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

albúmina de Nuez del Brasil: Pearson y col., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992.

Legumina: Ellis y col., Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988.

Glutelina (arroz): Takaiwa y col., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986;

Takaiwa y col., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987.

Zeína: Matzke y col Plant Mol Biol, 14(3):323-32 1990

napA: Stalberg y col, Planta 199: 515-519, 1996.

Gluteína-1 de BPM y APM de trigo: Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2, 1989

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Fuente del gen: Referencia

SPA de trigo: Albani y col, Plant Cell, 9: 171-184, 1997

,  y  gliadinas de trigo: EMBO J. 3:1409-15, 1984

Promotor Itr1 de cebada: Diaz y col. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8

Hordeína B1, C, D de cebada: Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996

DOF de cebada: Mena y col, The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998

blz2: EP99106056.7

promotor sintético: Vicente-Carbajosa y col., Plant J. 13: 629-640, 1998.

Prolamina NRP33 de arroz: Wu y col, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998

 globulina Glb-1 de arroz: Wu y col, Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998

OSH1 de arroz: Sato y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996

 globulina REB/OHP-1 de arroz: Nakase y col. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997

ADP-glucosa pirofosforilasa de arroz: Trans Res 6:157-68, 1997

familia del gen ESR de maíz: Plant J 12:235-46, 1997

-kafirina de sorgo: DeRose y col., Plant Mol. Biol 32:1029-35, 1996

KNOX: Postma-Haarsma y col, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999

Oleosina de arroz: Wu y col, J. Biochem. 123:386, 1998

Oleosina de girasol: Cummins y col., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992

PRO0117, supuesta proteína ribosomal 40S de arroz: WO 2004/070039

PRO0136, alanina aminotransferasa de arroz: No publicado

PRO0147, inhibidor de tripsina ITR1 (cebada): No publicado

PRO0151, WSI18 de arroz: WO 2004/070039

PRO0175, RAB21 de arroz: WO 2004/070039

PRO005: WO 2004/070039

PRO0095: WO 2004/070039

-amilasa (Amy32b): Lanahan y col, Plant Cell 4: 203-211, 1992; Skriver y col, Proc Natl Acad Sci USA 88:7266-7270, 1991

gen similar a la  catepsina: Cejudo y col, Plant Mol Biol 20: 849-856, 1992

Ltp2 de cebada: Kalla y col., Plant J. 6: 849-60, 1994

Chi26: Leah y col., Plant J. 4: 579-89, 1994

B-Perú de maíz: Selinger y col., Genetics 149; 1125-38, 1998

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Tabla 2d: ejemplos de promotores específicos de endospermo

Fuente del gen: Referencia

glutelina (arroz): Takaiwa y col. (1986) Mol Gen Genet 208:15-22; Takaiwa y col. (1987) FEBS Letts. 221:43-47

zeína: Matzke y col., (1990) Plant Mol Biol 14(3): 323-32

gluteína-1 de BPM y APM de trigo: Colot y col. (1989) Mol Gen Genet 216:81-90, Anderson y col. (1989) NAR 17:461-2

SPA de trigo: Albani y col. (1997) Plant Cell 9:171-184

gliadinas de trigo: Rafalski y col. (1984) EMBO 3:1409-15

promotor Itr1 de cebada: Diaz y col. (1995) Mol Gen Genet 248(5):592-8

hordeína B1, C, D de cebada: Cho y col. (1999) Theor Appl Genet 98:1253-62; Muller y col. (1993) Plant J 4:343-55; Sorenson y col. (1996) Mol Gen Genet 250:750-60

DOF de cebada: Mena y col, (1998) Plant J 116(1): 53-62

blz2: Onate y col. (1999) J Biol Chem 274(14):9175-82

promotor sintético: Vicente-Carbajosa y col. (1998) Plant J 13:629-640

prolamina NRP33 de arroz: Wu y col, (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885-889

globulina Glb-1 de arroz: Wu y col. (1998) Plant Cell Physiol 39(8) 885-889

globulina REB/OHP-1 de arroz: Nakase y col. (1997) Plant Molec Biol 33: 513-522

ADP-glucosa pirofosforilasa de arroz: Russell y col. (1997) Trans Res 6:157-68

familia del gen ESR de maíz: Opsahl-Ferstad y col. (1997) Plant J 12: 235-46

Kafirina de sorgo: DeRose y col. (1996) Plant Mol Biol 32: 1029-35

Tabla 2e: ejemplos de promotores específicos de embrión:

Fuente del gen: Referencia

OSH1 de arroz: Sato y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996

KNOX: Postma-Haarsma y col, Plant Mol. Biol. 39: 257-71, 1999

PRO0151: WO 2004/070039

PRO0175: WO 2004/070039

PRO005: WO 2004/070039

PRO0095: WO 2004/070039

Tabla 2f: ejemplos de promotores específicos de aleurona:

Fuente del gen: Referencia

-amilasa (Amy32b): Lanahan y col, Plant Cell 4:203-211, 1992; Skriver y col, Proc Natl Acad Sci USA 88:7266-7270, 1991

gen similar a  catepsina: Cejudo y col, Plant Mol Biol 20:849-856, 1992

Ltp2 de cebada: Kalla y col., Plant J. 6:849-60, 1994

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y homólogo de la proteína de interés. Preferentemente, el tramo de los nucleótidos sustancialmente contiguos es capaz de formar enlaces de hidrógeno con el gen diana (cadena en sentido o antisentido), más preferentemente, el tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos tiene, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 100 % con el gen diana (cadena en sentido o antisentido). Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido (funcional) no es un requisito para los diversos procedimientos analizados en el presente documento para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de gen endógeno.

Esta reducción o eliminación sustancial de la expresión puede realizarse usando herramientas y técnicas rutinarias. Un procedimiento preferido para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno es introducir y expresar en una planta una construcción genética en la que el ácido nucleico (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo y homólogo de cualquiera de las proteínas de interés) se clona como una repetición invertida (en parte o completamente), separado por un espaciador (ADN no codificante).

En dicho procedimiento preferido, la expresión del gen endógeno se reduce o elimina sustancialmente a través de silenciamiento mediado por ARN usando una repetición invertida de un ácido nucleico o una parte del mismo (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés, o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés), preferentemente capaz de formar una estructura en horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende secuencias de control. Una secuencia de ácidos nucleicos de ADN no codificante (un espaciador, por ejemplo un fragmento de la región de unión de matriz (MAR, Matrix Attachment Region Fragment), un intrón, un poliengarce, etc.) se localiza entre los dos ácidos nucleicos invertidos que forman la repetición invertida. Después de la transcripción de la repetición invertida, se forma un ARN quimérico con una estructura auto-complementaria (parcial

o completa). Esta estructura de ARN bicatenario se denomina ARN en horquilla (ARNh) El ARNh se procesa en la planta en los ARNip que se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El RISC escinde adicionalmente los transcriptos de ARNm, por lo cual se reduce sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que van a traducirse en los polipéptidos. Para detalles adicionales generales véase, por ejemplo, Grierson y col. (1998) WO 98/53083; Waterhouse y col. (1999) WO 99/53050).

La realización de los procedimientos de la invención no se basa en introducir y expresar en una planta una construcción genética en la que se clona el ácido nucleico como una repetición invertida, sino que pueden utilizarse cualquiera de uno o más de los diversos procedimientos de “silenciamiento génico” bien conocidos para conseguir los mismos efectos.

Un procedimiento de este tipo para la reducción de la expresión del gen endógeno es el silenciamiento mediado por ARN de la expresión génica (regulación negativa). En este caso, el silenciamiento se activa en una planta mediante una secuencia de ARN bicatenario (ARNbc) que es sustancialmente similar al gen endógeno diana. Este ARNbc se procesa adicionalmente por la planta de aproximadamente 20 a aproximadamente 26 nucleótidos denominado ARN de interferencia pequeño (ARNip). Los ARNip se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que escinde el transcripto de ARNm del gen endógeno diana, reduciendo por tanto sustancialmente el número de transcriptos de ARNm que se traducen en un polipéptido. Preferentemente, la secuencia de ARN bicatenario corresponde a un gen diana.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica la introducción de secuencias de ácidos nucleicos o partes de las mismas (en este caso un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos procedentes del gen de interés o de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés) en una orientación en sentido en una planta. “Orientación en sentido” se refiere a una secuencia de ADN que es homóloga a un transcripto de ARNm de la misma. Por lo tanto, en una planta se introduciría al menos una copia de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos adicional reducirá la expresión del gen endógeno, dando lugar a un fenómeno conocido como co-supresión. La reducción de la expresión del gen sería más pronunciada si en una planta se introdujesen varias copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos, cuando hay una correlación positiva entre altos niveles de transcripto y la activación de co-supresión.

Otro ejemplo de un procedimiento de silenciamiento de ARN implica el uso de secuencias de ácidos nucleicos antisentido. Una secuencia de “ácidos nucleicos “antisentido” comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos “en sentido” que codifica una proteína, es decir complementaria a la cadena que codifica una molécula de ADNc bicatenario o complementario a una secuencia de transcripto de ARNm. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido es preferentemente complementaria a gen endógeno a silenciar. La complementariedad puede localizarse en la “región codificante” y/o en la “región no codificante” de un gen. La expresión “región codificante” se refiere a una región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en restos de aminoácidos. La expresión “región no codificante” se refiere a las secuencias 5’ y 3’ que flanquean la región codificante que se transcriben pero no se traducen en aminoácidos (también denominadas regiones no traducidas 5’ y 3’).

Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido pueden diseñarse de acuerdo con las normas de emparejamiento de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácidos nucleicos antisentido puede ser complementaria a la secuencia de

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interaccionan; por lo tanto pueden proporcionarse una o más mutaciones y/o truncamientos para un polipéptido que sea aún capaz de unir las proteínas que interaccionan (tal como proteínas receptoras) pero que no pueden mostrar su función normal (tal como ligando de señalización).

Una estrategia adicional para silenciamiento génico es dirigir la secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la región reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o los potenciadores) para formar estructuras helicoidales triples que impiden la transcripción del gen en células diana. Véase Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991; Helene y col., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27-36 1992; y Maher, L. J. Bioassays 14, 807-15, 1992.

Otros procedimientos, tales como el uso de anticuerpos dirigidos contra un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la ruta de señalización en la que está implicado un polipéptido, serán muy conocidos por el experto. En particular, puede esperarse que las moléculas fabricadas por el hombre puedan ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido diana o para interferir con la ruta de señalización en la que está implicado el polipéptido diana.

Como alternativa, puede establecerse un programa de exploración para identificar en una población de plantas las variantes naturales de un gen, cuyas variantes codifican los polipéptidos con actividad reducida. Dichas variantes naturales también pueden usarse, por ejemplo, para realizar recombinación homóloga.

Pueden usarse microARN (miARN) artificiales y/o naturales para desactivar la expresión génica y/o traducción del ARNm. Los miARN endógenos son ARN pequeños monocatenarios típicamente con una longitud de 19-24 nucleótidos. Actúan principalmente regulando la expresión génica y/o la traducción de ARNm. La mayoría de los microARN (miARN) de planta tienen complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias diana. Sin embargo, hay dianas naturales con hasta cinco emparejamientos erróneos. Se procesan a partir de ARN no codificantes más largos con estructuras de plegamiento características mediante RNasas específicas bicatenarias de la familia Dicer. Después del procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, RNA-induced silencing complex) uniéndose a su componente principal, una proteína Argonauta. Los miARN sirven como componentes de especificidad del RISC, debido al emparejamiento con bases de ácidos nucleicos diana, principalmente ARNm, en el citoplasma. Los acontecimientos reguladores posteriores incluyen la escisión de ARNm diana y la destrucción y/o inhibición traduccional. Por tanto, los efectos de la sobreexpresión de miARN a menudo reflejan en niveles de ARNm disminuidos de los genes diana.

Los microARN artificiales (amiARN), que tienen típicamente 21 nucleótidos de longitud, pueden modificarse por ingeniería genética específicamente para regular negativamente la expresión génica de un solo gen o de múltiples genes de interés. En la técnica se conocen bien los determinantes de la selección diana de microARN de planta. Se han definido los parámetros empíricos para el reconocimiento diana y pueden usarse para ayudar a diseñar los amiARN específicos, (Schwab y col., Dev. Cell 8, 517-527, 2005). Herramientas convenientes para el diseño y generación de los amiARN y sus precursores también están disponibles para el público (Schwab y col., Plant Cell 18, 1121-1133, 2006).

Para un rendimiento óptimo, las técnicas de silenciamiento génico usadas para reducir la expresión en una planta de un gen endógeno requieren el uso de secuencias de ácidos nucleicos de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas. Preferentemente, una secuencia de ácidos nucleicos de cualquier especie de planta determinada se introduce dentro de esta misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requisito absoluto que la secuencia de ácidos nucleicos que se introduce se origine de la misma especie de planta como la planta en la que se introducirá. Basta con que haya una homología sustancial entre el gen diana endógeno y el ácido nucleico a introducir.

Anteriormente se han descrito ejemplos de diversos procedimientos para la reducción o eliminación sustancial de la expresión en una planta de un gen endógeno. Un experto en la técnica podrá adaptar fácilmente los procedimientos anteriormente mencionados para el silenciamiento para conseguir la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta completa o en partes de la misma usando un promotor apropiado, por ejemplo.

Marcador de selección (gen)/Gen indicador

Un “marcador de selección”, “gen marcador de selección” o “gen indicador” incluye cualquier gen que confiere un fenotipo a una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y/o selección de células que se transfectan o transforman con una construcción de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia satisfactoria de las moléculas de ácido nucleico mediante una serie de principios diferentes. Los marcadores adecuados pueden seleccionarse de marcadores que confieren resistencia a antibióticos

o a herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten selección visual. Los ejemplos de genes marcadores de selección incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como nptll que fosforila neomicina y kanamicina, o hpt, que fosforila higromicina, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), a herbicidas (por ejemplo bar que proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporciona resistencia contra glifosato, o los genes que confieren resistencia a, por ejemplo, imidazolinona, fosfinotricina o

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sulfonilurea), o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tal como manA que permite a las plantas usar manosa como única fuente de carbono o xilosa isomerasa para la utilización de xilosa, o marcadores antinutritivos tales como la resistencia a 2-desoxiglucosa). La expresión de genes marcadores visuales da como resultado la formación de color (por ejemplo -glucuronidasa, GUS o -galactosidasa con sus sustratos de color, por ejemplo X Gal), luminiscencia (tal como el sistema luciferina/luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP y derivados de los mismos). Esta lista solo representa una pequeña cantidad de marcadores posibles. El experto está familiarizado con dichos marcadores. Se prefieren diferentes marcadores dependiendo del organismo y del procedimiento de selección.

Se sabe que, después de la integración estable o transitoria de los ácidos nucleicos en células de plantas, solo una minoría de las células capta el ADN exógeno y, si se desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión usado y de la técnica de transfección usada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, normalmente se introduce un gen que codifica un marcador de selección (tal como los descritos anteriormente) en las células huésped junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden usarse, por ejemplo, en mutantes en los que estos genes no son funcionales mediante, por ejemplo, deleción por procedimientos convencionales. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador de selección pueden introducirse en una célula huésped en el mismo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o usarse en los métodos de la invención, o incluso en un vector distinto. Las células que se han transfectado de manera estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse, por ejemplo, por selección (por ejemplo, células que tienen integrado el marcador de selección sobreviven mientras que las otras mueren).

Dado que los genes marcadores, particularmente genes para resistencia a antibióticos y herbicidas, ya no se requieren o no se desean en la célula huésped transgénica una vez que se han introducido satisfactoriamente los ácidos nucleicos, el proceso de acuerdo con la invención para introducir los ácidos nucleicos emplea ventajosamente técnicas que permiten la retirada o escisión de estos genes marcadores. Un procedimiento de este tipo es lo que se conoce como co-transformación. El procedimiento de co-transformación emplea dos vectores simultáneamente para la transformación, un vector que lleva el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo que lleva el gen (o genes) marcador. Una proporción grande de transformantes recibe o, en el caso de plantas, comprende (hasta el 40 % o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de transformación con Agrobacteria, los transformantes normalmente solo reciben una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el ADN-T, que normalmente representa el casete de expresión. Posteriormente los genes marcadores pueden retirarse de la planta transformada realizando cruzamientos. En otro procedimiento, se usan genes marcadores integrados en un transposón para la transformación junto con el ácido nucleico deseado (conocido como tecnología Ac/Ds). Los transformantes pueden cruzarse con una fuente transposasa o los transformantes se transforman con una construcción de ácido nucleico que confiere expresión de una transposasa, de manera transitoria o estable. En algunos casos (aprox. 10 %), el transposón salta del genoma de la célula huésped una vez que se ha producido la transformación satisfactoriamente y se pierde. En una serie de casos adicionales, el trasposón salta a una localización diferente. En estos casos, el gen marcador debe eliminarse realizando cruzamientos. En microbiología, se desarrollan técnicas que hacen posible, o facilitan, la detección de dichos acontecimientos. Un procedimiento ventajoso adicional se basa en lo que se conoce como sistemas de recombinación; cuya ventaja es que la eliminación puede dispensarse por cruzamiento. El sistema mejor conocido de este tipo es lo que se conoce como sistema Cre/lox. Cre1 es una recombinasa que retira las secuencias localizadas entre las secuencias loxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias loxP, éste se elimina una vez se haya producido la transformación satisfactoriamente, por expresión de la recombinasa. Otros sistemas de recombinación son el sistema HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble y col., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan y col., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-566). De acuerdo con la invención, es posible una integración específica de sitio en el genoma de la planta de la secuencia de ácidos nucleicos. Naturalmente, estos procedimientos también pueden aplicarse a microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias.

Transgénico/Transgén/Recombinante

Para los fines de la invención, “transgénico”, “transgén” o “recombinante” significa con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos, un casete de expresión, una construcción génica o un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o un organismo transformado con las secuencias de ácidos nucleicos, casetes o vectores de expresión de acuerdo con la invención, todas estas construcciones realizadas por procedimientos recombinantes en los que

(a): las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas útiles en los procedimientos de la invención o

(b): la secuencia (o secuencias) de control genético que se une operativamente con la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, por ejemplo un promotor, o

(c): a) y b)

no se localizan en su ambiente genético natural o se han modificado por procedimientos recombinantes, siendo posible que se produzca la modificación de, por ejemplo, una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más restos de nucleótido. Se entiende que, ambiente genético natural, significa el locus genómico o cromosómico natural en la planta original o la presencia en una genoteca. En el caso de una genoteca, el ambiente genético natural de la secuencia de ácidos nucleicos se conserva preferentemente, al menos en parte. El ambiente

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flanquea la secuencia de ácidos nucleicos al menos en un lado y tiene una longitud de secuencia de al menos 50 pb, preferentemente al menos 500 pb, en especial preferentemente al menos 1000 pb, más preferentemente al menos 5000 pb. Un casete de expresión de origen natural -por ejemplo la combinación de origen natural del promotor natural de las secuencias de ácidos nucleicos con la secuencia de ácidos nucleicos correspondiente que codifica un polipéptido útil en los procedimientos de la presente invención, como se ha definido anteriormente -llega a ser un casete de expresión transgénica cuando esta casete de expresión se modifica mediante procedimientos sintéticos no naturales (“artificiales”) tal como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Se describen procedimientos adecuados, por ejemplo, en los documentos US 5.565.350 o WO 00/15815.

Por tanto, una planta transgénica, para los fines de la invención, se entiende que significa, como se ha indicado anteriormente, que los ácidos nucleicos usados en el procedimiento de la invención no están en su locus natural en el genoma de dicha planta, siendo posible que los ácidos nucleicos se expresen de manera homóloga o heteróloga. Sin embargo, como se ha mencionado, transgénico también significa que, aunque los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o usados en el procedimiento de la invención están en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia se ha modificado con respecto a la secuencia natural y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales se han modificado. Por transgénico se entiende preferentemente que significa la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en un locus no natural en el genoma, es decir, se produce la expresión homólogo o, preferentemente, heteróloga de los ácidos nucleicos. En el presente documento se mencionan las plantas transgénicas preferidas.

Transformación

El término “introducción” o “transformación” como se denomina en el presente documento, incluye la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del procedimiento usado para la transferencia. El tejido de planta capaz de propagación clonal posterior, mediante organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con una construcción genética de la presente invención y a partir del mismo regenerarse una planta completa. El tejido particular seleccionado variará dependiendo de los sistemas de propagación clonales disponibles para, y mejor adaptados a, la especie particular que se va a transformar. Las dianas tisulares ejemplares incluyen discos foliares, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, brotes axilares y meristemos radiculares) e inducen tejido meristemático (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo de hipocotiledón). El polinucleótido puede introducirse de manera estable o transitoria en una célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido.

Como alternativa, éste puede integrarse en el genoma huésped. La célula de la planta transformada resultante puede después usarse para regenerar una planta transformada de una manera conocida por los expertos en la técnica.

La transferencia de genes externos dentro del genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de especies plantas es actualmente una técnica muy habitual. Ventajosamente, cualquiera de los diversos procedimientos de trasformación puede usarse para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los procedimientos descritos para la transformación y regeneración de plantas de tejidos de plantas o células de plantas pueden utilizarse para la transformación transitoria o estable. Los procedimientos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, pistola de bombardeo de partículas, transformación usando virus o polen y microproyección. Pueden seleccionarse procedimientos entre, el procedimiento de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F. A. y col., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I y col. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R. D. y col. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en el material de planta (Crossway A y col., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo de partículas revestido con ADN o ARN (Klein TM y col., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrantes) y similares. Las plantas transgénicas, incluyendo plantas de cultivo transgénicas, se producen preferentemente mediante transformación mediada por Agrobacterium. Un procedimiento de transformación ventajoso es la transformación en la planta. Para esta finalidad, es posible, por ejemplo, permitir que la agrobacterias actúen en las semillas de la planta o inocular las agrobacterias en el meristemo de la planta. Se ha demostrado de un modo particularmente conveniente, de acuerdo con la invención, permitir que una suspensión de agrobacterias transformadas actúe en la planta intacta o al menos en los primordios florales. Posteriormente la planta crece hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough y Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los procedimientos para la transformación de arroz mediada por Agrobacterium incluyen procedimientos bien conocidos para la transformación de arroz, tales como los descritos en cualquiera de las siguientes referencias bibliográficas: solicitud de patente Europea EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan y col. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei y col. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad. En el caso de la transformación de maíz, el procedimiento preferido es como se describe en Ishida y col. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o en Frame y col. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002), cuyas divulgaciones se incorporan por referencia como si se expusieran en el presente documento. Dichos procedimientos se describen adicionalmente, a modo de ejemplo, en B. Jenes y col., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Los ácidos nucleicos o la

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En la Tabla G1 se proporcionan ejemplos de polipéptidos SPL11 útiles en los procedimientos de la invención. Las coordenadas de los aminoácidos del domino SBP en la proteína SPL11 representativa de la Tabla G1 se proporcionan en la Tabla G2 y la secuencia de los dominios se representa por la SEC ID Nº: 456 a la SEC ID Nº:

468. En la SEC ID Nº: 478 se proporciona una secuencia consenso de los dominios SBP presentes en los polipéptidos SPL11.

Los polipéptidos SPL11 preferidos de la invención son aquellos que tienen, en orden creciente de preferencia, una identidad de secuencia de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más con cualquiera de los polipéptidos proporcionados en la Tabla G2.

Típicamente, los polipéptidos SPL11 pueden comprender, además del domino SBP, uno o más de los siguientes motivos conservados en posiciones conservadas en la secuencia relativa al dominio SBP: (i) el Motivo 1 como se representa en la SEC ID Nº: 469, (ii) el Motivo 2, que es una región rica en serina típicamente encontrada en el extremo N terminal del dominio SBP y que puede representarse por la SEC ID Nº: 470; (iii) el Motivo 3 como se presenta en la SEC ID: 471 que está típicamente codificado por nucleótidos comprendidos en la región del polinucleótido SPL11 dirigida por miembros de la familia de microARN miR156; (iv) el Motivo 4, como se representa por la SEC ID Nº: 472. La Figura 27 muestra los motivos conservados y su posición relativa en la secuencia del polipéptido SPL11 representada por la SEC ID Nº: 428.

Por lo tanto, los polipéptidos SPL11 preferidos útiles en el procedimiento de la invención, comprenden, además del dominio SBP, uno cualquiera de uno o más de los siguientes motivos conservados:

(i): El Motivo 1 como se representa por la SEC ID Nº: 469 en el que se permite cualquier sustitución de aminoácidos conservativa y/o 1 o 2 sustituciones no conservativas,

(ii): El Motivo 2 como se representa por la SEC ID Nº: 470 en el que se permite cualquier sustitución de aminoácidos, a condición de que al menos 4 aminoácidos tengan una cadena lateral polar, preferentemente serina o treonina, y a condición de que este motivo esté localizado en el extremo N terminal del dominio SBP;

(iii) El Motivo 3 como se representa por la SEC ID: 471, en el que se permiten 1 o 2 emparejamientos erróneos;

(iv) El Motivo 4 como se representa por la SEC ID Nº: 472, en el que se permiten 1, 2 o 3 emparejamientos erróneos.

En la sección Antecedentes se proporcionan ejemplos de sustituciones de aminoácidos conservativas. Típicamente los aminoácidos comprendidos en los polipéptidos son alfa aminoácidos que tienen un grupo amina y un grupo carboxilo unidos al mismo carbono, el carbono alfa, cuyas moléculas de aminoácidos a menudo comprenden una cadena lateral unida al carbono alfa. La Tabla 3 muestra la clasificación de aminoácidos en base a las propiedades físicas y bioquímicas de la cadena lateral.

Tabla 3. Clasificación de aminoácidos de acuerdo con las propiedades de la cadena lateral.

Aminoácido: 3 Letras 1 Letra Polaridad de la cadena lateral Acidez o basicidad de la cadena lateral Índice de hidropatía

Arginina: Arg R polar básica -4,5

Asparagina: Asn N polar neutra -3,5

Ácido aspártico: Asp D polar ácida -3,5

Cisteína: Cys C polar Neutra 2,5

Ácido glutámico: Glu E polar Ácida -3,5

Glutamina: Gln Q polar Neutra -3,5

Histidina: His H polar Básica -3,2

Lisina: Lys K polar Básica -3,9

Serina: Ser S polar Neutra -0,8

Treonina: Thr T polar Neutra -0,7

Tirosina: Tyr Y polar Neutra -1,3

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Tabla G1: ejemplos de ácidos nucleicos y polipéptidos SPL11

Nombre: Alias Origen de la planta Ácido nucleico SEC ID Nº: Proteína SEC ID Nº:

Arath_SPL11a: At1g27360 Arabidopsis thaliana 427 428

Arath_SPL11aa: NM_202191 (variante de corte y empalme) Arabidopsis thaliana 429 428

Arath_SPL11aaa: NM_001084135 Arabidopsis thaliana 430 428

Arath_SPL11aaaa: SEC ID Nº:1 Variante MiR156 insensible Sintética 431 428

Arath_SPL11b: At1g27370 Arabidopsis thaliana 432 433

Arath_SPL11c: At5g43270 Arabidopsis thaliana 434 435

Orysa_SPL11a: LOC_Os02g04680 Oryza sativa 436 437

Orysa_SPL11b: LOC_Os06g49010 Oryza sativa 438 439

Popth_SPL11a: Populus SPL11a Especies de Populus 440 441

Popth SPL11_b: Populus SPL11b Especies de Populus 442 443

Popth_SPL11c: Populus SPL11c Especies de Populus 444 445

Brara_SPL11a: Br_AC189413 Brassica rapa 446 447

Zeama_SPL11a: ZM_60752693 Zea mays 448 449

Zeama_SPL11b: ZM_SPL11b Zea mays 450 451

Triae_SPL11a: Ta_SPL11a Triticum aestivum 452 453

Vitvi_SPL11a: Vv_SPL11a Vitis vinifera 454 455

Ejemplo 2: alineamiento de secuencias polipeptídicas SPL11

El alineamiento de las secuencias polipeptídicas se realizó usando el programa AlignX a partir del Vector NTI

5 (Invitrogen) que se basa en el conocido algoritmo Clustal W de alineamiento progresivo (Thompson y col. (1997) Nucleic Acids Res 25: 4876-4882; Chenna y col. (2003). Nucleic Acids Res 31: 3497-3500). Los valores predeterminados son para la penalización por apertura de hueco de 10, para la penalización de extensión de hueco de 0,1 y la matriz de peso seleccionada es Blosum 62 (si los polipéptidos se alinean). Se realizó una edición manual menor para optimizar adicionalmente el alineamiento. Se proporciona una secuencia consenso que comprende

10 aminoácidos representativos altamente conservados en cada posición; los espacios en blanco entre los aminoácidos en la secuencia consenso representan cualquier aminoácido. La conservación de alta secuencia entre los polipéptidos SPL11 se observa en su mayor parte a lo largo del dominio SBP de los polipéptidos. La posición de otros motivos de secuencia conservados fuera del dominio SBP del presente documento representados por el Motivo 1 al Motivo 4 (SEC ID Nº: 466 a SEC ID Nº: 472) se indica sobre la secuencia consenso.

15 La Figura 2 proporciona un alineamiento de polipéptidos SPL11 representativos

Ejemplo 3: cálculo del porcentaje de identidad global entre las secuencias polipeptídicas SPL11 útiles en la realización de los procedimientos de la invención

Los porcentajes de similitud e identidad globales entre las secuencias polipeptídicas de longitud completa útiles en la realización de los procedimientos de la invención se determinaron usando uno de los procedimientos disponibles en

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Tabla G5: resultados del análisis Pfam para el dominio SBP (Referencia Pfam PF03110) de polipéptidos SPL11 representativos realizado en la Versión Pfam 21.0.

Nombre de la secuencia: Coordenadas de aminoácidos del dominio SBP valor e del alineamiento

Arath_SPL11a: 174-252 1.10E-50

Arath_SPL11b: 175-253 1.61 E-47

Arath_SPL11c: 168-246 1.90E-52

Orysa_SPL11a: 181-259 5.10E-50

Orysa_SPL11b: 179-257 3.90E-47

Popth_SPL11a: 170-277 170-277

Popth_SPL11b: 180-277 1.50E-41

Popth_SPL11c: 171-249 7.80E-52

Brara_SPL11a: 180-279 5.20E-44

Zeama_SPL11a: 161-239 2.20E-51

Zeama_SPL11b: 159-237 1.10E-48

Triae_SPL11a: 184-262 2.90E-52

Vitvi_SPL11a: 171-249 7.80E-52

Ejemplo 5: clonación de la secuencia de ácidos nucleicos usada en los procedimientos de la invención

5 La secuencia de ácidos nucleicos usada en los pacientes de la invención se amplificó por PCR usando como molde una biblioteca de ADNc de plántulas de Arabidopsis thaliana hecha a medida (en pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, RU). La PCR se realizó usando la Taq ADN polimerasa Hifi en condiciones estándar, usando 200 ng de molde en una mezcla PCR de 50 pI. Se utilizó un cebador cadena arriba y cadena abajo representado por la SEC ID Nº: 473 y SEC ID Nº: 474 respectivamente, para amplificar por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) la

10 región codificante de un ácido nucleico SPL11 representado por la SEC ID Nº: 427. Los cebadores incluyen los sitios AttB para la recombinación Gateway para facilitar la clonación del fragmento de ADN amplificado por PCR en un vector de clonación Gateway.

El fragmento de PCR amplificado se purificó también usando procedimientos convencionales. Después se realizó la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual el fragmento de PCR se recombina in vivo

15 con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un “clon de entrada”, pSPL11. El plásmido pDONR201 se adquirió en Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

El clon de entrada que comprendía la SEC ID Nº: 427 se usó posteriormente en una reacción LR con un vector destinatario utilizado para transformación de Oryza sativa. Este vector contiene, como elementos funcionales dentro de los límites del ADN T: un marcador de selección de plantas; un casete de expresión marcador detectable y un

20 casete Gateway diseñado para recombinación LR in vivo con la secuencia de ácidos nucleicos de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor GOS2 de arroz (SEC ID Nº: 476) para expresión constitutiva se localizaba cadena arriba de este casete Gateway en el vector pGOS2::SPL11. La secuencia codificante de SPL11 también se clonó en un vector de expresión que comprendía un promotor WSI18 de arroz (SEC ID Nº: 477) para la expresión específica de semilla (inducible por ABA) (pWSI18::SPL11).

25 Después de la etapa de recombinación LR, los vectores de expresión resultantes pGOS2::SPL11 y pWSI18::SPL11 (Figura 5) se transformaron en la cepa LBA4044 de Agrobacterium de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica.

Ejemplo 6: transformación de plantas

Transformación de arroz

30 El Agrobacterium que contenía el vector de expresión se usó para transformar plantas de Oryza sativa. Se descascarillaron semillas secas maduras de la variedad de cultivo japónica de arroz Nipponbare. La esterilización se

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