CN112375777B - OsbHLH6在提高作物磷吸收能力及作物耐低磷育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种OsbHLH6在提高作物磷吸收能力中的应用，用于作物耐低磷育种，即，用于作物耐低磷能力的遗传改良。本发明还同时提供了一种对水稻植株进行改造的方法：包括用OsbHLH6基因转化水稻细胞；和将转化的水稻细胞培育成植株；所述植株提高了磷吸收能力，具有耐低磷性能。

Description

OsbHLH6在提高作物磷吸收能力及作物耐低磷育种中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种反向遗传学途径克隆的水稻OsbHLH6(basic Helix–Loop–Helix 6)基因，并通过增强表达技术在不同磷浓度培养条件下鉴定了该基因的功能；还涉及利用该基因产物提高水稻体内的有效磷含量，提高作物耐低磷能力。

背景技术

磷是植物必需的大量营养元素之一，对于植物的生长发育是必不可少的。植物主要以无机磷的形式吸收磷。上的农作物产量全世界有30％的可耕地土壤缺磷；施加磷肥是提高在低磷土壤中作物产量的有效的途径。然而磷肥的利用效率很低，通常作物只吸收了所施用的磷的10％–25％(Johnston et al.,2014)。且过量施用磷肥会造成土壤加速退化、水体富营养化等一系列环境问题(Conley et al.,2009)。因此，迫切需要提高作物的磷利用效率(Raghothama,1999；Heuer et al.,2017)。随着人口的增长，对粮食的需求增大，开发耐低磷的作物品种对于粮食的可持续生产越来越重要(Wu et al.,2013；He et al.,2019)。

自然选择过程中植物已经进化出复杂的分子机制和调控网络来适应环境中的低磷胁迫；例如，通过改变根系结构提高从土壤中获取磷的能力，以及提高磷转运蛋白的表达及转运能力等，来维持磷稳态(Nussaume et al.,2011；Gu et al.,2015)。

SPXs蛋白(SPX-domain-containing proteins,SPX)在真核生物磷的感知、信号转导和转运过程中起着重要的作用。SPXs蛋白可以感知无机磷酸盐状态，因为SPX结构域的表面可以与无机磷酸盐(Pi)低亲和力地结合，并且与肌醇焦磷酸盐(IPs)高亲和力地结合(Wild et al.,2016)。高浓度无机磷酸盐或低浓度肌醇焦磷酸盐的存在可以稳定SPXs与众多蛋白的相互作用，从而调节Pi的转运和信号转导(Lv et al.,2014；Wild et al.,2016)。

在植物中，已知SPXs根据细胞磷状态，负调控磷中心调节因子——OsPHR2/AtPHR1的活性(Lv et al.,2014；Puga et al.,2014；Wang et al.,2014；Zhong et al.,2018)。例如，拟南芥细胞核中，SPX1和SPX2与AtPHR1相互作用，从而阻止AtPHR1与磷饥饿诱导基因的启动子结合(Puga et al.,2014)，从而确保磷充足条件下，磷饥饿诱导基因只保持本底表达水平。水稻中，OsSPXs过表达可以抵消OsPHR2过表达引起的磷中毒表型和磷饥饿诱导基因上调。相比之下，OsSPXs敲除株系则表现为叶尖磷中毒表型，茎中磷积累明显增多。以OsSPX4蛋白为例，在磷充足条件下，OsSPX4与细胞质中的OsPHR2相互作用，抑制OsPHR2定位至细胞核，从而影响OsPHR2与下游的磷饥饿诱导基因启动子的结合(Lv et al.,2014)。在磷缺乏的条件下，OsSPX4被E3泛素连接酶SDEL1和SDEL2降解(Ruan et al.,2019)，OsPHR2进入细胞核，启动下游磷饥饿诱导基因的表达。最近的研究表明，硝酸盐感受器NRT1.1B可以与SPX4发生相互作用，通过招募E3泛素连接酶NBIP1，介导硝酸盐触发的SPX4降解，从而激活磷酸盐和硝酸盐响应基因，实现氮和磷的协同利用(Hu et al.,2019)。综上所述，SPX蛋白主要通过调控下游的转录因子功能来提高植物磷的吸收利用效率。

在植物对低磷环境的响应和适应过程中，已知有许多转录因子，包括MYB和WRKY家族成员，正向或负向调节磷信号和体内磷平衡。拟南芥中bHLH转录因子AtbHLH32是一系列磷饥饿诱导响应的负调节因子。与野生型相比，bhlh32突变体有效磷含量和根毛形成均显著增加(Chen et al.,2007)。AtWRKY42通过调控PHO1和PHT1；1的表达来影响磷的吸收和转运以调节拟南芥体内的磷稳态。WRKY42过表达增强了拟南芥根中有效磷含量(Su et al.,2015)。水稻中bHLH家族转录因子OsPTF1过表达株系通过增强根系结构提高了转基因水稻对Pi饥饿的耐受性(Yi et al.,2005)。WRKY结构域转录因子OsWRKY74通过激活酸性磷酸酶(即OsPAP10a)的活性，促进磷的吸收，来增加植物耐低磷能力(Dai et al.,2016)。磷饥饿诱导的R2R3型MYB转录因子OsMYB1和OsMYB2P-1通过调节主根的伸长，影响对外界磷的吸收(Dai et al.,2012；Gu et al.,2017)。在磷充足条件下，OsMYB2P-1过表达植株比野生型植株主根短，而在磷缺乏条件下，过表达植株比野生型植株的主根和不定根长。OsMYB4P和OsMYB5P受缺磷诱导，并且参与根长调控；OsMYB4P过表达的植株与野生型植株相比，根系较长，茎和根中有效磷含量积累增加(Yang et al.,2014)。OsMYB5P直接与水稻OsPT5启动子上的MYB结合基序结合并诱导其表达。OsMYB5P过表达株系增加了根和茎中的磷含量，无论在磷充足还是磷缺乏的条件下都比野生型植株表现出更好的生长性能和更高的生物量(Yang et al.,2018)。

上文中涉及的参考文献如下：

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发明内容

本发明要解决的技术问题是提供从水稻中克隆的OsbHLH6基因在提高植物磷吸收能力及耐低磷能力中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供OsbHLH6在提高作物磷吸收能力中的应用：OsbHLH6基因的核苷酸序列如Seq ID NO:1所述，其编码的蛋白质(bHLH结构域蛋白质)的氨基酸序列如Seq ID NO:2所述，以及将SEQ ID No：1所示的核苷酸经过一个或几个的取代/插入或缺失产生的核酸序列或Seq ID NO:2所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加衍生的蛋白质。

作为本发明应用的改进：还用于作物耐低磷育种，即，用于作物耐低磷能力的遗传改良。

本发明还同时提供了一种对水稻植株进行改造的方法：包括用OsbHLH6基因转化水稻细胞；和将转化的水稻细胞培育成植株；所述植株提高了磷吸收能力，具有耐低磷性能。

本发明中的蛋白属于bHLH转录因子超家族；本发明提供了bHLH结构域蛋白质在调节植物磷吸收及体内磷平衡上的应用。

本发明的蛋白质，所述氨基酸序列还包括在Seq ID NO:2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。

本发明的基因，所述核苷酸序列还包括在Seq ID NO:1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

本发明首次发现bHLH家族基因OsbHLH6具有提高水稻磷吸收的功能。bHLH6与OsPTF1属于不同亚类的Bhlh基因。OsbHLH6不仅能促进根毛伸长，还可以调节下游磷饥饿响应基因的表达。由于磷养分高效吸收对维持低磷土壤中的植物生长发育以及高产稳产是必不可少的，因此在分子育种中存在较大的应用潜力。

本发明的具体技术步骤如下：

一、bHLH6的组织特异表达检测：

构建了bHLH6pro::GUS载体，通过转化野生型NIP水稻愈伤组织获得bHLH6pro::GUS转基因阳性苗。通过组织化学染色分析发现，bHLH6在根、叶以及小穗均表达(图1b和1c)，其中根伸长区的外皮层、根尖(图1f和1g)以及叶片的叶肉细胞(图1d和1e)表达最为明显。b中标尺为5cm；c为0.2cm；d和f为100μm，e和g为50μm。xm，木质部；xp，木质部薄壁细胞；mc，叶肉细胞；pp，韧皮部薄壁细胞；ms，维管束输导组织鞘细胞；ep，表皮；ex，外皮层；sc，厚壁组织；co，皮层；st，中柱。

二、bHLH6是磷饥饿响应基因：

利用定量RT-PCR分析不同缺磷处理时间后bHLH6在茎、根和叶片中的表达水平(图2)。磷充足条件下生长7d的幼苗，转入磷饥饿(-P,无P)处理不同时间(-P 1d--P 7d)，或-P7d转入磷充足条件1d(-P 7d+P 1d)后取样，提取RNA，通过定量RT-PCR分析bHLH6的表达。

三、bHLH6作为转录激活因子行使功能：

利用水稻悬浮细胞制备的原生质体转化瞬时表达分析bHLH6的亚细胞定位，结果表明bHLH6-GFP主要定位于细胞核中(图3a)。将不同截短的bHLH6连接到含有GAL4结合域的pGBKT7载体上，构建GAL4-BD融合表达菌株。转化AH109酵母感受态，涂至色氨酸缺陷培养基(-Trp)上进行培养观察。结果表明，N端(1-95aa)、N端+bHLH结构域(1-144aa)和bHLH6全长蛋白可以在-His培养基上正常生长(图3b)，表明bHLH6具有转录激活活性，并且转录激活域位于N端。

四、超表达OsbHLH6能够显著提高水稻磷的吸收。

本发明构建了OsbHLH6超表达载体，通过实施例5中的方法转化野生型日本晴(NIP)水稻愈伤组织获得一系列超表达转基因株系。本发明挑选了其中2个代表性的独立株系(bHLH6 OV-3和bHLH6 OV-5)在不同磷浓度培养条件下进行表型及磷含量分析，发现在高磷条件下，超表达OsbHLH6能显著提高根对磷的吸收；并且发现无论是在高磷还是低磷条件下，bHLH6超表达株系叶片中的磷含量都显著高于野生型NIP(图4d)。

本发明的研究表明bHLH6超表达能够促进下游的磷饥饿诱导基因的表达(图5a)；bHLH6超表达株系根毛的长度和密度相比野生型都显著增加(图5b和图5c)，酸性磷酸酶的活性也显著增强(图5d)。此外，本发明对bHLH6超表达和bhlh6突变体转基因株系进行了各种元素分析。本发明发现bHLH6超表达株系中P元素的含量相比野生型显著提升，而其他被检测的元素无论是地上部还是地下部在bHLH6超表达植株与野生型之间均没有显著差异，包括Fe、B、K、Na、Ca、Cu、Mg、Mn、Zn等元素(如表1所示)。这些结果说明bHLH6特异地调控植株对磷的吸收。

表1：正常磷浓度培养条件下，各植株叶片和根中元素含量分析

Table l.Contents of nutrient elements in shoot and root of bHLH6overexpression lines and bhlh6 mutants measured using ICP

Notc：：Data are mcans±SD.*Significant difference with WT(*，P＜0.01；**，P＜0.001；Student’s t test).

在正常磷浓度(200μM)条件下培养4周的野生型NIP、2个bHLH6超表达株系和bhlh6突变体株系叶片和根中各元素的测定。数据为3次生物学重复的平均值±方差，星号代表与野生型之间的显著性差异(*P＜0.05和**P＜0.01；Student’s t测验)。

上述结果表明，本发明克隆的水稻OsbHLH6基因具有潜在的应用价值，可以利用该基因对作物进行遗传改良，提高农作物磷吸收利用能力。

本发明通过酵母双杂交文库筛选到一个与水稻(Oryza sativa)SPX4蛋白互作的bHLH (basic Helix-Loop-Helix)结构域蛋白OsbHLH6。从水稻基因组中克隆了该基因并进行了功能分析。OsbHLH6是一个磷饥饿诱导基因。OsbHLH6过表达株系(bHLH6 OV)无论在高磷还是低磷营养条件下，都能显著提高水稻叶片中有效磷的含量。OsbHLH6过表达株系中磷饥饿诱导基因的表达上调，根毛长度和密度增加，酸性磷酸酶活性增强。说明，该基因正向调控植物体内的磷饥饿响应，可提高作物的磷吸收能力，在作物耐低磷能力的遗传改良方面具有潜在应用价值。

本发明首次发现新的磷饥饿响应转录因子OsbHLH6通过调节下游的磷饥饿响应基因，增强根系结构和酸性磷酸酶活性来提高磷吸收。OsbHLH6过表达株系(bHLH6 OV)无论在高磷还是低磷生长条件下，都能显著提高水稻体内磷的含量。因此，该基因可用于改良作物磷吸收能力，提高作物耐低磷能力。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为bHLH6的组织特异表达检测；

(a)bHLH6在不同组织的表达量；(b)～(g)bHLH6pro::GUS植株经GUS染色后显示；(b)：整株苗；(c)：小穗；(d)和(e)：不同放大比例的叶；(f)主根纵切；(g)：主根横切；

图2为bHLH6是磷饥饿响应基因。

(a)和(b)：bHLH6基因地上部的表达受到缺磷强烈诱导，地下部表达缺磷响应变化不大；(c)bHLH6在老叶中的表达高于幼叶，在磷饥饿条件下，所有叶片中bHLH6的表达均显著上调。

图3为bHLH6作为转录激活因子行使功能。

(a)bHLH6蛋白的亚细胞定位；GFP代表绿色荧光蛋白，Bright代表明场，Merge代表绿色荧光蛋白和明场的重叠；

(b)酵母激活活性分析证明bHLH6具有转录激活活性，并且转录激活域在N端。

即，图(a)表明bHLH6主要在细胞核中定位，而(b)表明bHLH6的N端具有转录激活活性。

图4是超表达bHLH6能够显著提高水稻磷的吸收。

(a)在磷充足(200μM)条件下培养的野生型和过表达株系中bHLH6的相对表达量。

(b)野生型(NIP)和两个过表达系(bHLH6 OV-3和bHLH6 OV-5)的表型。在磷充足条件下生长7天的幼苗移入磷充足(HP,200μM)或Pi缺乏(LP,10μM)条件下培养21天。Bar＝10cm。

(c)在(b)中不同株系的茎和根干重的统计。误差线代表SD(n≥6)。

(d)在(b)中不同株系的茎和根的可溶磷含量。

误差线代表SD(n≥4)。星号代表与野生型之间的显著性差异(*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001；Student’s t测验)。

图5为在磷充足条件下，过表达bHLH6可促进植物体内的磷饥饿响应。

(a)磷饥饿诱导基因的相对表达；野生型，bHLH6 OV转基因植物(bHLH6 OV-3和bHLH6OV-5)和bhlh6突变体(bhlh6-1和bhlh6-2)在磷充足(200μM)条件下生长21天取样进行定量RT-PCR分析。(b,c)5天苗龄bHLH6过表达株系和bhlh6突变株系主根基部1-1.5cm的根毛表型(剪头)(b)及根毛长度,bar＝2mm。误差线表示SD(n≥6)，*指与野生型(NIP)有显著差异(***P<0.001，Student's t检验))。(d)磷充足条件下，NIP、bHLH6 OV和bhlh6突变体中的酸性磷酸酶(APase)活性测定。*表示与野生型有显著差异(**P<0.01；Student’s t检验)。

图6为本发明用到的载体结构示意图；

(a)用于酵母双杂交的载体示意图；左为酵母AD载体，右为酵母BD载体。

(b)为用于组织定位的载体示意图；

(c)为表达GFP蛋白的载体示意图；

(d)为转基因超表达所用载体示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、bHLH6启动子融合GUS报告载体的构建

为研究bHLH6基因(OsbHLH6)在不同器官中的表达模式，通过PCR克隆了bHLH6启动子序列(基因组ATG前3089bp)。所用的启动子PCR引物序列如下，上下游引物末端分别加上Sal I和Kpn I的识别位点(下划线标记)，目的启动子片段大小为3089bp。

上游引物：5’ACGCGTCGACGAAATGCGTGCTAGCGATTGGCCGT 3’

下游引物：5’CGGGGTACCGGCGCTTGCTCTGCTTCGCGTTTGC 3’

利用野生型水稻NIP的基因组DNA作模板，用上述引物扩增得到bHLH6启动子。

将扩增得到的启动子用Sal I/Kpn I双酶切，获得的启动子片段(SEQ ID NO:3)连入实验室改造后的载体pBIl0l.3-GUS plus(图6b)获得bHLH6Pro::GUS载体。

载体pBIl0l.3-GUS plus在已经发表的论文(Yang et al.,Plant Cell.2020.32(3):740-757)中有明确告知，构建方法可参考该文。

随后通过实施例5中的转基因方法，转化野生型NIP成熟胚诱导的愈伤组织，获得一系列转基因苗。

GUS染色及显微观察

将T₁代转基因整株苗、剪成合适大小的根和叶及小穗浸泡在GUS染液内(配方如下)，常温抽真空30min后37℃烘箱静置6h。然后将GUS染液换成75％的酒精终止GUS反应，并对叶片进行脱色，直至叶片未染色部分变白，期间不断更换75％的酒精；选取代表性苗的根和脱色后的叶片用4％琼脂糖包埋，用震动切片机(Leica VT1000S)切成25μM的薄片，并使用体视显微镜(Leica MZ95，Germany)进行观察与拍照。小穗则直接进行拍照观察。GUS染色和切片的结果表明，bHLH6在根、叶以及小穗均表达(图1b和1c)，其中根伸长区的外皮层、根尖(图1f和1g)以及叶片的叶肉细胞(图1d和1e)表达最为明显。

根据图1，可得知：(图1a，b和c)表明bHLH6在根、叶片、茎、根茎结合部以及小穗中均有表达；(图1d,e,f和g)表明bHLH6主要在叶片的叶肉细胞，根尖以及根表皮细胞中表达。

GUS染液配方：

(1)200mmol/L磷酸钠缓冲液(PH＝7.0)

制备方法：A液：称取NaH₂PO₄·2H₂O，15.6g溶于蒸馏水，定容至500mL。

B液：称取Na₂HPO₄·12H₂O，35.85g溶于蒸馏水，定容至500mL。

取500mL B液与200mL A液混合(混合后PH值约7.03)，用NaH₂PO₄·2H₂O调至7.0。

(2)GUS染色液：

实施例2、bHLH6是磷饥饿响应基因

为明确bHLH6是磷饥饿响应基因，进行了不同培养条件下的表达分析。正常磷浓度(磷浓度为200μm)条件下生长7天的幼苗，按照指定的时间(即，正常浓度生长7天后的第1、3、5和7天)转入磷饥饿(-P,no Pi)条件下处理(-P 1d-P 7d)，或转入磷充足(磷浓度为200μm)条件下处理1d(正常浓度生长7天后，磷饥饿处理7天再回复供磷1天)(图2a和2b)；正常磷浓度(200μm)下生长7天的野生型幼苗在高磷(HP，200μM)或低磷(LP，10μM)处理14天(图2c)。

上述处理后的幼苗取样通过实时荧光定量PCR来检测基因的表达情况。

OsbHLH6定量表达分析引物：

上游引物：5’CTCATGCACACCCTCTTCG 3’

下游引物：5’CACAAGCTGGGAGAGAGCA 3’

结果为：

发现bHLH6的表达在地上部受缺磷显著诱导，地下部变化不明显(图2a和2b)；bHLH6在老叶(最先长出来的叶片，Leaf4)中的表达高于幼叶(后面长出来的叶片，Leaf1)，在磷饥饿条件下，所有叶片中bHLH6的表达均显著上调(图2c)。

根据图2，可得知：bHLH6基因地上部的表达随着缺磷时间的增加不断受到显著诱导(图2a)，地下部表达受缺磷响应不明显(图2b)；正常磷条件下，bHLH6的表达在老叶中比幼叶中增加，并且在所有叶片中bHLH6的表达均受到缺磷诱导(图2c)。

实施例3、bHLH6作为转录激活因子行使功能

利用水稻悬浮细胞制备的原生质体瞬时表达，研究bHLH6的亚细胞定位，结果表明bHLH6-GFP信号主要定位于细胞核中(载体见图6c，Lv et al.,Plant Cell.2014.26(4):1586-1597)。为明确bHLH6具有转录激活活性，本发明对其进行了酵母激活活性分析。

将不同截短和全长的bHLH6连接到含有GAL4结合域的pGBKT7载体(图6a)上，构建GAL4-BD融合表达菌株。转化AH109酵母感受态细胞，然后转移至色氨酸缺陷培养基(SD/-Trp培养基)上，长势正常后移到组氨酸缺陷培养基(SD/-His培养基)上进行培养观察。

不同截短的bHLH6具体为：1-95aa、96-144aa、145-310aa、1-144aa、96-310aa，其分别为按照如下方法获得：1-95aa为SEQ ID NO:1的1-285bp，96-144aa为SEQ ID NO:1的286-432aa，145-310aa为SEQ ID NO:1的433-933、1-144aa为SEQ ID NO:1的1-432aa、96-310aa为SEQ ID NO:1的286-933aa。

所用引物如下：

用于扩增1-310aa：

bHLH-AD/BD-F 5’GGAATTCCATATGATGGACGCCGAGATGGCC 3’

bHLH-AD/BD-R 5’CCGGAATTCCTAATAGCTCATGGAGCTCAACGGAC 3’

用于扩增1-95aa：

bHLH-AD/BD-N-F 5’GGAATTCCATATGATGGACGCCGAGATGGCC 3’

bHLH-AD/BD-N-R 5’CCGGAATTCCTAGATGTTCTTGTTCGCGCCACC 3’

用于扩增96-144aa：

bHLH-AD/BD-HLH-F 5’GGAATTCCATATGATGCTCATGGAGCGCGACCG 3’

bHLH-AD/BD-HLH-R(432bp)5’CCGGAATTCCTACTGCTGCTCCTCCGCCTGC 3’

用于扩增96-310aa：

bHLH-AD/BD-C-F(433bp)5’GGAATTCCATATGATGCTCCGGGAGGTCGCC 3’

bHLH-AD/BD-C-R(933bp)5’CCGGAATTCCTAATAGCTCATGGAGCTCAACGGAC 3’

结果表明，N端(1-95aa)、N端+HLH结构域(1-144aa)和bHLH6全长蛋白可以在组氨酸缺陷培养基上正常生长，表明bHLH6具有转录激活活性，并且转录激活域位于N端(图3)。

实施例4、bHLH6超表达和突变体载体构建

bHLH6超表达载体构建：以野生型水稻NIP的cDNA为模板进行扩增，程序为：95℃变性5min；(95℃，30s；58℃，30s；68℃，1min)，32个循环；最后68℃延伸5min。将全长的SEQ IDNO:1用下述引物进行PCR扩增，片段用BamH I和Xba I内切酶酶切后与实验室改造的pCAMBIA-1300改载体(见ZL201510903118.X)(图6d)连接，形成35S启动子-OsbHLH6超表达载体。随后通过实施例5中的转基因方法，转化野生型NIP成熟胚诱导的愈伤组织，获得一系列转基因苗。

所用引物如下：

bHLH-CDS.1-F ATGGACGCCGAGATGGCC

bHLH-CDS.2-R CAGGCGCTGGATGTA

鉴定并挑选了其中2个代表性株系进行表型及磷含量分析；

具体如下：此2个株系(bHLH6 OV3、bHLH6 OV5)中bHLH6具有不同的超表达水平，因此，选择其作为实验对象。实验内容(高磷/低磷)具体培养条件为高磷(HP)为磷浓度200μm，低磷(LP)为磷浓度10μm。

利用CRISPR/Cas9技术构建bhlh6突变体材料(方法见Shao et al.,PlantCell.2019,31(6):1257-1275)。

靶点如下：

bHLH-U3-F:ggcACAGCATGTACCTGCCGACGC

bHLH-U3-R:aaaCGCGTCGGCAGGTACATGCTG

bHLH-U6a-F:gccGCAGCGCTACCTTGAGTCCG

bHLH-U6a-R:aaaCCGGACTCAAGGTAGCGCTG

结果发现：在高磷条件下，超表达OsbHLH6能显著提高根对磷的吸收；并且无论是在高磷还是低磷条件下，OsbHLH6超表达株系叶片中的有效磷含量都显著高于野生型NIP水稻，而突变体材料与野生型相比没有显著差异(图4d)。

实施例5、水稻转基因及阳性株系的鉴定

水稻愈伤的诱导与农杆菌(EHA105)介导的水稻转基因，具体过程如下：

水稻愈伤组织的诱导

1、挑选饱满光洁无虫斑的野生型NIP成熟种子，人工脱皮，按以下步骤进行消毒；

将种子放入50ml无菌离心管中，倒入75％酒精消毒2min；

倒去酒精，加入30ml 30％次氯酸钠(NaClO)溶液，消毒30min；

倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗5遍，最后一遍在无菌水中浸泡30min。

2、诱导与继代培养：

将种子用无菌镊子夹到无菌滤纸上吸干，置入成熟胚诱导培养基中，每皿12颗；

操作完毕用封口膜封好培养皿，在28℃光照培养箱，培养3周；

在超净工作台上打开培养皿，用无菌镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织(淡黄色，致密呈球状)，置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养5-10天。

农杆菌培养

挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液50μL于20ml YEP(含50mg/L Kan和50mg/L Str)培养液中，28℃，250rpm振荡培养12-24h至菌液OD₆₀₀为0.6-0.8。

愈伤组织与农杆菌共培养和抗性愈伤组织的筛选

1、感菌与共培养：

取培养好的菌液，4000rmp，离心10min，去上清；

用含200μmol/L As的40ml AAM感菌液制成悬浮液，摇菌30min，使菌液OD₆₀₀的终浓度为0.01；

将长到一定大小的水稻愈伤组织用消毒的镊子挑出(约100颗)，放入农杆菌悬浮液浸染10min；

用勺子将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40min，开盖在超净工作台吹干，约20-30min；

将愈伤组织置于含有无菌滤纸的共培养基上，25℃暗培养2.5-3天。

2、选择：

将共培养的愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡。再用终浓度为300mg/L羧苄青霉素钠Carb的无菌水清洗1～2遍，摇床摇30min。最后置于无菌滤纸上沥干1.5h；将晾干的愈伤转入含300mg/L羧苄青霉素钠Carb和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，每皿25-30颗(一颗初始愈伤作为一个株系，将共培养的愈伤全部挑进去)，28℃，光照培养14天；

将长大的初始愈伤转到含30mg/L羧苄青霉素钠Carb和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第二轮选择，每皿12-14颗，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。

抗性愈伤组织的诱导分化和转基因苗的锻炼和移栽

挑取从相同愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤3颗，移入装有分化培养基的分化罐中(1罐可放3个株系)，放入25℃恒温培养室中(一周后出现绿色，分化初步成功)，等待分化成苗(35天左右)，待苗长至顶到分化罐盖子。

7天后，将幼苗的根部和茎叶分化得较完好的分化罐挑出(苗长至分化罐顶部，就要及时开盖)，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水(防止长菌)，炼苗3天左右，至幼苗挺立，然后洗去琼脂，移栽至水稻营养液中培养1-2周，鉴定。

转基因植株的鉴定

T₀代转基因苗的鉴定：

T₀代转基因苗在正常条件下(温度：白天32℃，晚上22℃；湿度≥60％；光照密度值：250-300μmol m^-2s^-1；白天晚上时间分别为12小时)培养一周之后，取1cm长的叶片使用TPS缓冲液提取基因组DNA，对转基因苗进行抗性筛选标记基因的鉴定，筛选阳性的转化株系。

TPS提取基因组DNA：

1.取1cm叶片置于2ml离心管中，加入200μL TPS抽提液(100mM Tris-HCl，PH 8.0，10mM EDTA，1M KCl)，加入一枚氧化锆珠，盖紧离心管盖，在打样仪TissueLyserⅡ(QIAGEN，USA)震荡1.5min。频率为25次/秒。

2.将捣碎的组织匀浆置于70℃水浴30min。然后小心倒掉打样珠，防止样品被大量倒出。

3.12000rpm离心10min，取上清于另一新的1.5ml离心管中。

4.加等体积异丙醇，上下颠倒混匀之后，12000rpm离心10min，弃上清。

5.加600μL 70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min。

6.弃去乙醇，晾干DNA，之后用30μL ddH₂O溶解。

潮霉素抗性基因检测：

潮霉素抗性基因引物序列为：

上游引物：5’CGAGTACTTCTACACAGCCATC 3’

下游引物：5’TAGCGAGAGCCTGACCTATT 3’

PCR条件是95℃变性5min，然后进入循环反应：95℃30s，59℃30s，72℃1min，循环数为32，最后延伸5min结束。取10μL PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳检测,然后用GelDoc^TM XR+(BIO-RAD，USA)成像系统记录实验结果。

转基因阳性苗的RT-qPCR鉴定：

提取超表达转基因株系的RNA，进行逆转录，用RT-qPCR方法检测OsbHLH6的相对表达量。具体过程如下：

RNA的提取：

采用MACHEREY-NAGEL公司的植物NucleoSpin RNA Plant提取试剂盒提取总RNA，方法如下：1.将研钵研杵于180℃烘烤2h以除去RNase；2.取50-100mg植物样品速冻于液氮之中；3.在冷冻状态下将样品充分研磨粉碎；4.加入裂解液使细胞充分裂解；5.过滤除去组织碎片；6.纯化层析柱中的RNA(去蛋白、去DNA和脱盐)；7.RNase-free H₂O洗脱获取RNA。具体操作过程参照试剂盒附带说明书。

反转录:

取2μg总RNA，用DEPC水补至10μl，70℃变性10min，简单旋转，冰上放置，然后加入下表中已混合好的体系：

体系(μl)：

反转录程序为：42℃50min；95℃5min；4℃10min，分装，-20℃保存，若短时间内使用可放在4℃保存，防止反复冻融。

RT-qPCR：

(1)根据引物对数和模板数目，计算Master(含探针)、模板、引物和水的用量，每个样本做3个技术重复。所用RT-PCR引物如下，上游引物：5’CTCATGCACACCCTCTTCG 3’；下游引物：5’CACAAGCTGGGAGAGAGCA 3’。

(2)将2×Master和cDNA模板混合液加入定量PCR孔壁上。并将定量PCR板室温低速离心3min，使得到的样品沉到孔底。

(3)将水和引物混合液加入定量PCR孔壁，并离心，条件同上。

(4)开启LightCycle480定量仪，打开电脑qPCR软件，放入定量PCR板进行程序运行。

(5)待PCR程序结束，进入“Analysis”界面，点击“Abs Quant/2nd DerivativeMax”分析样品C_T值；若是SYBR GreenⅠ，点击“Tm Calling”分析样品溶解曲线。

(6)取出定量PCR板，保存数据，退出程序，关电脑，再关定量PCR仪。

水稻有效磷和总磷含量的测定

有效磷测定：水稻组织破碎后，用5M硫酸提取无机磷，在酸性条件下，磷酸根与钼酸铵形成锑磷钼混合杂多酸，在酒石酸锑钾的催化下，被抗坏血酸还原成钼蓝，在800nm比色测定吸光度，利用钼蓝质量浓度与吸光度呈正比定量测定。

具体操作如下：取水稻叶片(大约6cm)或根(擦干水分)并剪碎，放入已称量的2ml国产离心管中，并称量(样品质量以30-80mg为宜)，离心管中加入氧化锆珠子和0.5ml 5M的H₂SO₄，使用打样机打成匀浆，用5ml去离子水稀释到15ml离心管中，使用9mm定性分析滤纸过滤到进样管中，用0.5ml 5M的H2SO4和5ml去离子水混匀过滤做空白对照，使用荷兰SKALAR分析仪器SAN++三通道连续流动分析仪进行无机磷浓度测定。

总磷测定：野生型、2个bHLH6超表达株系和bhlh6突变体株系分别高磷(200μM Pi)和低磷(10μM Pi)培养4周(每周换一次营养液)后称取新鲜根叶组织样品，放入70℃烘箱烘干3天，称取烘干的组织样品0.1g左右，用HNO₃：H₂O₂(30:1，v/v)消解，消解后排酸到1ml，定容到50ml，通过ICP-MS测定所有元素(氮除外)。

最终所得结果如图5所述。

根据该图5，可获得以下总结性结论：

在磷充足的条件下，bHLH6过表达株系叶片和根中的无机磷含量明显高于(约2.0倍叶片和1.2倍根)野生型植株(图4d)。

本发明分析了野生型、bHLH6过表达株系和bhlh6突变体株系根中的磷饥饿诱导基因的表达，结果发现分析的磷饥饿诱导基因的表达水平在bHLH6过表达株系中受到显著上调。并且bHLH6过表达株系根毛的长度显著增加，酸性磷酸酶活性显著增强，而在bhlh6突变体中变化不明显。表明bHLH6是正向调控磷信号和磷平衡，并且通过调控下游的磷饥饿响应基因的表达和根毛的伸长促进磷饥饿响应。说明可通过调控bHLH6的表达水平调控植物对磷的吸收。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> OsbHLH6在提高作物磷吸收能力及作物耐低磷育种中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 933

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggacgccg agatggccat gggcgagagc ttcgcctact actgggagac gcagcgctac 60

cttgagtccg aggagctcga cagcatgtac ctgccgacgc aggatgactc caactacgag 120

tcgagctcgc cggacgggtc gcactcgtcg tcggcgccgg cgccggcggc cgtgggcggg 180

gacgcagccg ccgcggtggc gggtagcggt ggcgggatga cgacgatgat gatgggcggc 240

ggcggcggcg gtggcgacga cgccggtggc gcgaacaaga acatcctcat ggagcgcgac 300

cgccgccgca agctcaacga gaagctctac gcgctccgca gtgtcgtgcc caacatcacc 360

aagatggaca aggcgtcgat catcaaggac gcgatcgagt acatccagcg cctgcaggcg 420

gaggagcagc agatgctccg ggaggtcgcc gcgctcgagt ccgccgccgc ggcgagcgcc 480

gccccggccg cggcgaaccc gttcgccggc ctcggcgccg acgaggaaca cgagtacggc 540

caccaccacc cctcgtcgtc gtcggagcgg acgaagaagg tgaagcgggc gctgtccgtg 600

tcgtccatca gcgacgccct gctcgccgcg gcggcgccgg cgccgccggt ggagatccag 660

gagctgcgcg tgtcggaggt gggcgacagg gtgctggtgg tgagcgtgac gtgcagcaag 720

cgccgcgacg ccatggcccg ggtgtgccgc gccctcgagg agctccgcct ccgcgtcatc 780

accgccaaca tcacctccgt cgccggctgc ctcatgcaca ccctcttcgt cgaggtagat 840

cacatggata gtgtccaaat gaagcagatg gtggaggctg ctctctccca gcttgtggcg 900

accggcagtc cgttgagctc catgagctat tag 933

<210> 2

<211> 310

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Asp Ala Glu Met Ala Met Gly Glu Ser Phe Ala Tyr Tyr Trp Glu

1 5 10 15

Thr Gln Arg Tyr Leu Glu Ser Glu Glu Leu Asp Ser Met Tyr Leu Pro

20 25 30

Thr Gln Asp Asp Ser Asn Tyr Glu Ser Ser Ser Pro Asp Gly Ser His

35 40 45

Ser Ser Ser Ala Pro Ala Pro Ala Ala Val Gly Gly Asp Ala Ala Ala

50 55 60

Ala Val Ala Gly Ser Gly Gly Gly Met Thr Thr Met Met Met Gly Gly

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gly Gly Asp Asp Ala Gly Gly Ala Asn Lys Asn Ile Leu

85 90 95

Met Glu Arg Asp Arg Arg Arg Lys Leu Asn Glu Lys Leu Tyr Ala Leu

100 105 110

Arg Ser Val Val Pro Asn Ile Thr Lys Met Asp Lys Ala Ser Ile Ile

115 120 125

Lys Asp Ala Ile Glu Tyr Ile Gln Arg Leu Gln Ala Glu Glu Gln Gln

130 135 140

Met Leu Arg Glu Val Ala Ala Leu Glu Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ala

145 150 155 160

Ala Pro Ala Ala Ala Asn Pro Phe Ala Gly Leu Gly Ala Asp Glu Glu

165 170 175

His Glu Tyr Gly His His His Pro Ser Ser Ser Ser Glu Arg Thr Lys

180 185 190

Lys Val Lys Arg Ala Leu Ser Val Ser Ser Ile Ser Asp Ala Leu Leu

195 200 205

Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Pro Val Glu Ile Gln Glu Leu Arg Val

210 215 220

Ser Glu Val Gly Asp Arg Val Leu Val Val Ser Val Thr Cys Ser Lys

225 230 235 240

Arg Arg Asp Ala Met Ala Arg Val Cys Arg Ala Leu Glu Glu Leu Arg

245 250 255

Leu Arg Val Ile Thr Ala Asn Ile Thr Ser Val Ala Gly Cys Leu Met

260 265 270

His Thr Leu Phe Val Glu Val Asp His Met Asp Ser Val Gln Met Lys

275 280 285

Gln Met Val Glu Ala Ala Leu Ser Gln Leu Val Ala Thr Gly Ser Pro

290 295 300

Leu Ser Ser Met Ser Tyr

305 310

<210> 3

<211> 3078

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

gaaatgcgtg ctagcgattg gccgtagcat tcagacatca cagatgcata tactagcaaa 60

gtagggattc cttttctaga cccgcaaatc taggctgaag acatcatttg ttgagtagtt 120

aatcacacag ccattgtcat caaccctttc ttctttagat ccagttagta gttaaggtct 180

tattttatgt gtttgaagct tgatttagaa atcaaccaac taatcagatg acactacatg 240

aggttatatg gcttggattt ttctctaatc cctgttggca aattggagag aaaaaaaaag 300

gaaatccata tttgacttta caagctatgg ctaggtgaag aattaatatc ttaattgggt 360

gtaaacctca tcagagacca tgccttctgg cacatgactg ccagatcggg tagcagcaat 420

gccaattaaa caaacaaaaa ttatcagtgc attgtgcttg ggaacaggtg tcctgcagag 480

agaagaagat gccaatagat tatttatttg tttgggtttt gatgccataa ctgtaatctc 540

acactagata tggcaactag ttgatctaat cttgtttaat gcatcaattt gacaagttgg 600

gcaaagggtt ggtataaaaa agaaatcttt ttttttaatg ttggggaggg gagttgtctc 660

atctgaactg aaatgttaaa tattcatagg ttttggcaaa tatatatatg caaaaagaaa 720

gaaagttagg tcgttaattt ctaaagaaaa attgcatgtt ctgctggtta atagctgtgg 780

ttgatgtgta cgggtaatga gacttgtttt tgttcagtga tagatccaga acatttttaa 840

atattagcaa tttttgctac aagttttatt tactgcgaaa ttctatcttc aatactttca 900

agaagacaga gatttcatgg agattttgcc aataacctcg aatggtcggg tgcccaggcg 960

atgaatatcc gccaatacat gtgtgatgtc tttatgatag gaagagataa ctaacaatga 1020

taaatgagta gaatctactc tctctctctc tctctctaca ttttatctcg atagcgaaac 1080

caaagacagc aattgctgga cggcgaagtg taaagggtga cgaaaccagg gatgacgtaa 1140

tttcagtttt caaatggtcc gtcgtgccac attcgcaatt aattccaagt gtcccctcct 1200

ccaaaaacaa acaaaataaa aatctctatc tgaatactgg accaaaagga acaaaaaata 1260

aaggcattaa aaaaaaggag atgagaaatt attcatcacc aaaatgggga caggcacatg 1320

gtgcgagcca aaccccatcc acagcgtcgt ttactcggat cagactcgct ttctccacgt 1380

ccacacgcgt acaccatcaa tgcccaacac aaggacagcg acatcgcttc ccgtactgtc 1440

atttgtaatt aacacgcgat taattagcat aaccaaagtc attacgagag tgcttactga 1500

gtaggagtaa tccataaagg ctgggttcgt tcctagggtt cccaactact ccctccgtcc 1560

cataaaaaaa caaatctaga accggatgta acatattcta atactgtgaa tctggacgaa 1620

tatatgtcta gattcattgt aataggatat gttacatcca gtattagctt gttttttaat 1680

aggatggagg aagtactctg cagtgcatgt gaaacgaaac tatcaattaa cgcatgatta 1740

attaagtatt agctaacttt tttaaaaaat aaatcaatat aattttttaa aacaattttt 1800

gtattttttt tttacaaata acgcatcgtt aagtaattta aaaagcttac gcgcggaaaa 1860

taaaagagat tagttggaaa aacagagtaa caaactcaac cacttatggt ggaatcagaa 1920

ttaagtcata accatcatat atgtattctt tctacccatc aacagcagta agacgtttct 1980

tataacctca tcaatttcaa gatatatcgc tttaatattt tgtagattgc ttattagaac 2040

agacgcacat ttatatgaat tagtgtacgc gtttgtggtg tgtttgacga aaaggttact 2100

aagggggtgt ttagatccag gatgtaaagg tttggtatgt cacatcagat attatatagg 2160

gtgtcgtata gagtgtttgg cactaataat aaaactaatt acagaatccg tcagtaaacc 2220

acaagaagaa tttattaagc ctaattaatt tatcattagt aaatgtttac tgtagcacga 2280

tgttatcaaa tcatggagca attaggctca aaagatccgt ttcgcaaatt agtcgcaatc 2340

cgtgcaatta tttttttaaa actatattta atactttatg caagtgttta gacgtttgat 2400

gtgacatgat gtaaaatttt taggtgggat ttaactgcct catcgtttgg cctttttcgt 2460

aataagccaa aacggcttat tagagaataa aaataaattt gtaggtaaaa cttttatata 2520

tgtgttatcg gtgacttaaa tgtcaatgct gaaaaagaaa ctacgttgaa aatatctcaa 2580

aatcaatatt aaaattaagt ttgaaaattt aaattttggt tttttctttt agctgaatag 2640

gccatccgat gggtgcctaa actaaggcct agcagatcaa atacacaaca gaagtagtag 2700

cgtgcgtagc agtaattaac atgtgatcgc cacattaaaa aaacgaagcg ataataatca 2760

gtggtggccg gaggcatcaa tcggccgggc tcgcgcacgc gcacgttgtc ctcgcgtgcc 2820

tggctcggcg ggcccacccg cggttgaatt cccgcacgtt ttccgcctgg tcgccacgcg 2880

gtcccggaga ccagacgcgt ccgtgtccag gtgtgggtgt gcgcgtcccc ccccgtgggc 2940

cccacctgcc agcctcaccc ctctcccagt atatattggc tcggcgactc ggagagagac 3000

aagtgagctc ggagtcggag agagacacaa gccaacctcg aactcgaagc agagcaaacg 3060

cgaagcagag caagcgcc 3078

Claims (3)

1.OsbHLH6基因在提高作物磷吸收能力中的应用，其特征在于：

OsbHLH6基因的核苷酸序列如Seq ID NO:1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SeqID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：还用于作物耐低磷育种，即，用于作物耐低磷能力的遗传改良。

3.一种对水稻植株进行改造的方法，其特征在于：包括用OsbHLH6基因转化水稻细胞；和将转化的水稻细胞培育成植株；所述植株提高了磷吸收能力，具有耐低磷性能；OsbHLH6基因的核苷酸序列如Seq ID NO:1所示。

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