CN110923253A

CN110923253A - OsPTP1在植物磷高效育种中的应用

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Publication number: CN110923253A
Application number: CN201911316262.8A
Authority: CN
Inventors: 毛传澡; 杨健; 杨支力; 徐纪明; 吴忠长
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN110923253B

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种反向遗传学途径克隆的水稻OsPTP1(Phosphate Transporter Phosphatase 1)基因，并且通过超表达技术及基因编辑技术鉴定该了基因的功能。基因OsPTP1的用途为：用于提高农作物对磷的吸收、转运或利用，从而实现磷高效育种。

Description

OsPTP1在植物磷高效育种中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及一种反向遗传学途径克隆的水稻OsPTP1(Phosphate Transporter Phosphatase 1)基因，并且通过超表达技术及基因编辑技术鉴定该了基因的功能；还涉及利用该基因产物提高水稻的磷吸收、利用效率和产量。

背景技术

磷是植物生长发育所需的重要营养元素。磷在土壤中主要以五价的磷酸盐形式存在，其通过与金属离子结合(如Fe、Ca等)，导致离子状态磷的含量小于10μm(Chiou&Lin,2011)。因此土壤中游离态磷的低含量，导致大多植物没有充足的磷可利用，从而影响植物生长发育(Wu et al.,2013)。植物通过磷酸盐转运体(Phosphate Transporter；简称PT)吸收外界的游离磷酸盐以供植物的生长发育。PT的表达受多重水平的调控，包括在转录水平和转录后水平的调控：在转录水平，PT受转录因子PHR(Phosphate Starvation ResponseRegulator)(Zhou et al.,2008)和WRKY(Su et al.,2015)的调控；在转录后水平，PT在内质网受蛋白激酶CKII(Chen et al.,2015)和转运辅助蛋白PHF1(PT TrafficFacilitator)(Chen et al.,2011)的调控、在内质网和高尔基体受泛素结合酶PHO2(PHOSPHATE2)(Huang et al.,2013；Park et al.,2014)的调控、在质膜受泛素连接酶NLA(Nitrogen Limitation Adaptation)(Lin et al.,2013；Park et al.,2014)的调控以及内吞调节蛋白ALIX的调控。

本发明涉及的参考文献如下：

Chen J,Liu Y,Ni J,Wang Y,Bai Y,Shi J,Gan J,Wu Z,Wu P.2011.OsPHF1regulates the plasma membrane localization of low-and high-affinity inorganicphosphate transporters and determines inorganic phosphate uptake andtranslocation in rice.Plant Physiology 157:269-278.(OsPHF1通过调控水稻高亲合和低亲合磷酸盐在质膜的定位以调控磷的吸收和转运，植物生理学，157：269-278)；

Chen J,Wang Y,Wang F,Yang J,Gao M,Li C,Liu Y,Yamaji N,Ma JF,Paz-AresJ,et al.2015.The Rice CK2 Kinase Regulates Trafficking of PhosphateTransporters in Response to Phosphate Levels.The Plant Cell 27:711-23.(水稻CK2调控磷酸盐转运体的膜泡运输依赖于胞内磷浓度，植物细胞，27：711-23)；

Chiou TJ,Lin SI.2011.Signaling network in sensing phosphateavailability in plants.Annual Review of Plant Biology 62:185-206.(植物感应无机磷的信号网络，植物生物学年鉴，62：185-206.)；

Huang TK,Han CL,Lin SI,Chen YJ,Tsai YC,Chen YR,Chen JW,Lin WY,ChenPM,Liu TY,et al.2013.Identification of Downstream Components of Ubiquitin-Conjugating Enzyme PHOSPHATE2 by Quantitative Membrane Proteomics inArabidopsis Roots.The Plant Cell 25:4044-60)(通过定量膜蛋白质组学鉴定了拟南芥泛素结合酶PHOSPHATE2下游组份，植物细胞，25：4044-60)；

Lin WY,Huang TK,Chiou TJ.2013.NITROGEN LIMITATION ADAPTATION,a Targetof MicroRNA827,Mediates Degradation of Plasma Membrane-Localized PhosphateTransporters to Maintain Phosphate Homeostasis in Arabidopsis.The Plant Cell25：4061-74.(拟南芥MicroRNA827的靶基因NITROGEN LIMITATION ADAPTATION介导质膜定位的磷酸盐转运体的降解以维持磷平衡，植物细，25：4061-74)；

Meina G,Wenyuan R,Changying L,Fangliang H,Ming Z,Yingyao L,Yanan Y,Xiaomeng D,Yunrong W,Zhongchang W,et al.2015.Integrative comparison of therole of the PHR1 subfamily in phosphate signaling and homeostasis inrice.Plant Physiology 168：1762-76.(PHR1亚家族基因在调控水稻磷信号和磷平衡中的功能分析，植物生理，168：1762-76)；

Park BS,Seo JS,Chua NH.2014.NITROGEN LIMITATION ADAPTATION RecruitsPHOSPHATE2 to Target the Phosphate Transporter PT2 for Degradation during theRegulation of Arabidopsis Phosphate Homeostasis.The Plant Cell 26:454-464.(拟南芥NITROGEN LIMITATION ADAPTATION通过征集PHOSPHATE2降解PT2以调控磷的稳态，植物细胞，26:454-464)；

Su T,Xu Q,Zhang FC,Chen Y,Li LQ,Wu WH,Chen YF.2015.WRKY42 modulatesphosphate homeostasis through regulating phosphate translocation andacquisition in Arabidopsis.Plant Physiology 167:1579-1591.(拟南芥WRKY42通过调控磷的吸收和转运以调控磷的稳态，植物细胞，167：1579-1591)；

Wu P,Shou H,Xu G,Lian X.2013.Improvement of phosphorus efficiency inrice on the basis of understanding phosphate signaling andhomeostasis.Current opinion in plant biology 16:205-12.(在对磷信号和稳态的理解的基础上提高磷效率，植物生物学当代进展，16：205-12)；

Zhou J,Jiao F,Wu Z,Li Y,Wang X,He X,Zhong W,Wu P.2008.OsPHR2 isinvolved in phosphate-starvation signaling and excessive phosphateaccumulation in shoots of plants.Plant Physiology 146:1673-1686.(OsPHR2在调控磷饥饿信号和地上部磷积累中的功能，植物生理，146：1673-1686)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供基因OsPTP1的用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基因OsPTP1的用途：用于提高农作物对磷的吸收；所述基因OsPTP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，以及在此序列基础上衍生的插入或缺失1个或多个核苷酸产生的突变序列。

作为本发明基因OsPTP1的用途的改进：用于提高农作物对磷的吸收、转运或利用，从而实现磷高效育种，提高产量。

作为本发明基因OsPTP1的用途的进一步改进：所述农作物为水稻。

本发明提供一种从水稻中克隆的新基因OsPTP1，具有如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；还包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。

本发明还提供了水稻具有磷酸酶活性的基因OsPTP1编码的蛋白质，具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

本发明利用含有所述基因的植物表达载体来转化水稻，从而提高磷吸收效率。

本发明提供了OsPTP1基因在作物磷平衡调控及磷高效育种中的应用。

本发明通过基因工程或杂交选育以提高效率。

虽然，前人已报道在水稻中通过超表达OsPHR3(Meina et al.,2015)、超表达OsPHF1(Wu et al.,2013)或者改变PT分子中蛋白激酶CKII磷酸化位点的氨基酸性质(Chenet al.,2015)，均表现出耐低磷和提高低磷条件下水稻的生物量和产量；可以通过调控PT的蛋白水平以提高磷吸收利用的效率。但至今没有报道过参与磷信号及磷平衡的蛋白磷酸酶(去除由CKII催化的PT的磷酸化修饰，与CKII激酶功能相反)，本发明首次报道克隆了蛋白磷酸酶OsPTP1，并明确了该蛋白的生物学功能，明确其参与磷平衡。即，本发明的OsPTP1蛋白磷酸酶能去能移除由CKII催化的PT的磷酸化修饰，与CKII激酶功能相反。

综上所述，本发明通过反向遗传学方法首次筛选到能与水稻(Oryza sativa)磷酸盐转运体OsPT8和OsPT2互作的蛋白磷酸酶OsPTP1(Phosphate Transporter Phosphatase1)。超表达OsPTP1能够显著提高水稻的磷吸收效率，而该基因突变则影响老叶和新叶间磷的转运。因此，在分子育种中存在较大的应用潜力。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为OsPTP1与磷酸盐转运体OsPT2及OsPT8互作；

A，OsPTP1由N端36个氨基酸和C端PP2C磷酸酶结构域的254个氨基酸组成；

B，酵母双杂交显示OsPTP1的全长及N端区域能够与OsPT2和OsPT8互作；

C，OsPT8的C末端用于Co-IP实验的序列；

D，Co-IP实验证明OsPTP1能够与OsPT8的C末端互作。

图2为OsPTP1在体外具有蛋白磷酸酶酶活；

A，原核表达GST、GST-PTP1及点突变PP2C酶活性位点的GST-PTP1^D240N蛋白考马斯亮蓝染色图；

B，在锰(Mn²⁺)离子存在的情况下，GST-PTP1具有PP2C酶活性；

C，在不同离子条件下，蛋白的酶活性。

图3为OsPTP1的组织特异表达检测；

A-G：OsPTP1p:OsPTP1:GUS转基因植株经GUS染色后显示其根(A和B)及主根横切(C)、叶(F和G)和花(D和E)。

图4为转基因超表达OsPTP1能够显著提高水稻磷的吸收；

A，正常磷浓度条件下培养35天的野生型(NIP)和3个OsPTP1超表达株系的表型；

B，3个OsPTP1超表达株系的OsPTP1基因的表达量分析；

C，正常磷浓度条件下培养35天的野生型(NIP)和3个OsPTP1超表达株系的地上部和根中总磷含量测定；

D，正常磷浓度条件下培养35天的野生型(NIP)和3个OsPTP1超表达株系的地上部和根的生物量分析(鲜重)。不同的字母代表单因素Duncan多重比较结果(P<0.05,n＝3)。

图5为OsPTP1突变不影响水稻生长但影响磷在不同叶片间的分布；

A，野生型(NIP)和两个ptp1突变体株系的表型；在高磷(200μM)或低磷(10μM)条件下生长30天后的整株苗表型；Bar＝10厘米；

B，野生型和两个ptp1突变体株系地上部分和根的鲜重(FW)。误差线表示SD(n＝9)；

C和D，在高磷或低磷条件下生长30天的野生型和ptp1突变体株系的地上部分和根中(C)或不同叶片中(D)的有效磷浓度；

误差线表示SD(n＝3)，星号表示与野生型对照的显著差异(*P<0.05，**P<0.05和***P<0.001；Student’s t test)。

图6.用于研究的载体结构示意图；A和B为用于酵母双杂交的载体示意图；C为用于组织定位所用载体示意图；D为转基因超表达所用载体示意图；E为原核表达载体示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实现本发明的具体技术步骤如下：

一、OsPTP1能够与低亲和磷酸盐转运体OsPT2及高亲和磷酸盐转运体OsPT8互作。

本发明以OsPT8作为诱饵蛋白，通过酵母双杂交筛选到能够与其互作的蛋白磷酸酶OsPTP1。进一步分析发现OsPTP1也能够与OsPT2互作。进一步通过Co-IP发现，OsPTP1能够与OsPT8的C末端互作。

二、OsPTP1在体外具有蛋白磷酸酶酶活：

通过原核表达GST-OsPTP1及点突变PP2C酶活性位点的GST-PTP1^D240N明确OsPTP1在体位具有蛋白磷酸酶活性，并且其活性依赖于辅酶Mn²⁺。

三、OsPTP1的组织特异表达检测。

本发明构建了OsPTP1pro:OsPTP1:GUS载体，通过转化野生型水稻获得一系列转基因苗。通过组织化学染色分析发现，OsPTP1在根、叶、花均表达，其中根伸长区的外皮层、厚壁组织和木质部及叶脉维管束中较强：

四、转基因超表达OsPTP1能够显著提高水稻磷的吸收：

本发明构建了OsPTP1超表达载体，通过转化野生型水稻获得一系列转基因超表达株系；挑选了其中3个株系进行表型、磷含量及生物量分析，发现超表达OsPTP1能够显著提高水稻对磷的吸收。

五、转基因超表达OsPTP1的元素分析：

本发明对3个转基因超表达株系进行了各种元素分析；发现所有被检测的元素在OsPTP1超表达植株地上部与野生型之间均没有显著差异，包括Fe、B、K、Na、Ca、Cu、Mg、Mn、Zn等元素。而在根中，OsPTP1超表达株系中Mg和Zn含量均有显著提升，分别为野生型的1.3倍和1.2倍。这些结果说明OsPTP1对调控植株对磷的吸收具有特异性的同时，也能够提高植物对Mg和Zn的吸收：

六、OsPTP1突变不影响水稻生长但影响磷在不同叶片间的分布

本发明利用CRISPR-Cas9系统构建了OsPTP1突变载体，通过转化野生型水稻获得一系列转基因OsPTP1突变体株系；从中挑选了其中2个株系进行表型、磷含量及生物量分析，发现OsPTP1的突变不影响水稻生长但影响磷在不同叶片间的分布。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1、OsPTP1与OsPT2和OsPT8的互作研究：

首先通过酵母双杂交筛选到能够与OsPT8互作的蛋白磷酸酶OsPTP1，其基因组序列为3892bp(SEQ ID No.1)，并编码一个290个氨基酸的蛋白(SEQ ID No.2)。

然后进一步设计证实除OsPT8外，OsPT2也能够与OsPTP1互作。通过对OsPTP1的蛋白结构进行分析发现，其由N端36个氨基酸和C端PP2C磷酸酶结构域的254个氨基酸组成(图1A)。为明确其与OsPT2和OsPT8互作的亚结构域，对OsPTP1的两个亚结构域进行截短，并通过酵母双杂交实验证实OsPTP1是通过其N端36个氨基酸与OsPT2和OsPT8互作的(图1B)。随后通过体内Co-IP实验进一步明确了OsPTP1与OsPT8的互作关系(图1C和1D)。

实施例2、OsPTP1在体外验证其具有蛋白磷酸酶酶活：

为明确OsPTP1具有蛋白磷酸酶活性，对其进行了原核表达并纯化。以野生型cDNA为模版，用OsPTP1特异的引物扩增出OsPTP1全长编码序列，目的片段大小为873bp。将扩增出的目的片段进行BamH I和Sal I双酶切，并连接进入经相同酶切的pGEX4T-1载体。为验证OsPTP1具有PP2C磷酸酶酶活，对野生型OsPTP1蛋白的其中一个Mg²⁺/Mn²⁺离子结合位点突变(具体为OsPTP1蛋白第240个氨基酸位点上的天冬氨酸突变为天冬酰胺)。经相同的连接方法构入pGEX4T-1载体。所用引物如下：

OsPTP1全长引物：

上游引物为：CGGGATCCATGGCTGGCAAGGAAATCTACC

下游引物为：GCGTCGACGCAGAGGAATTTTACAACGATGC

OsPTP1^D240N点突变引物：

上游引物为：ATTTTCTAATTCTTGCAAGTaATGGATTATGGAAGGTGAT

下游引物为：ATCACCTTCCATAATCCATtACTTGCAAGAATTAGAAAAT

将构建完成的载体转入BL21菌株，并在20℃，120rpm条件下经1μM IPTG诱导蛋白原核表达，随后使用GST亲和纯化出GST、GST-PTP1和GST-PTP1^D240N蛋白(图2A)。在0.3μg蛋白，75mM Tris,pH 7.6,10mM MnCl₂,100mM NaCl,0.5mM EDTA和5mM pNPP的条件下，检测405nm处吸光度，并根据碱性磷酸酶活性单位的定义(37℃条件下每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位)计算酶活性。结果表明，OsPTP1具有PP2C家族典型的依赖于Mn²⁺的蛋白磷酸酶酶活性(图2B和2C)。

实施例3、OsPTP1-GUS融合基因载体的构建及GUS染色

OsPTP1p:OsPTP1:GUS载体构建：以野生型日本晴基因组为模版扩增OsPTP1启动子、5’UTR和全基因组序列(不包括终止子，6408bp)，利用Sal I和BamH I进行酶切，并连接进入经相同酶切的pBI-GUS-PLUS载体；得OsPTP1p:OsPTP1:GUS载体。

引物信息如下：

上游引物：GCGTCGACTAAACGACGGTAAAAATCCCTAAT

下游引物：CGGGATCCTGCAGAGGAATTTTACAACGATGC

经测序验证后，通过农杆菌侵染整合进野生型日本晴基因组中。

GUS染色及显微观察

将T1代转基因苗的根、根茎结合部、茎、叶和花等器官浸泡在GUS染液内(配方如下表1)，常温抽真空10min，然后37℃温浴，待样品出现蓝色之后，转入FAA固定液中(甲醛溶液：冰乙酸：70％乙醇＝1:1:18)，抽真空1min，终止反应。之后将叶片等绿色材料转入70％乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料(野生型SX63的叶片)呈白色为止。在LEICA MZ95体视镜下观察，用LEICA DC100摄像头拍照，样品中的蓝色位点即为GUS表达位点。

根据上述观察结果，可得知：OsPTP1在根、叶、花中均有表达(图3)。且OsPTP1表达于根伸长区的外皮层、厚壁组织和木质部(图3A，3B和3C)；叶中主要表达于维管束(图3F和3G)；在花中，颖壳外表面有比较强的表达，内部子房表达较弱，花药也微弱(图3D和3E)。

表1

实施例4、OsPTP1超表达载体构建

为明确OsPTP1在调控磷吸收利用的功能，构建了OsPTP1超表达载体。以野生型cDNA为模版，用OsPTP1特异的引物扩增出OsPTP1全长编码序列，目的片段大小为873bp。将扩增出的目的片段进行BamH I和Sma I双酶切，并连接进入经相同酶切的pF3PYPZ122载体。经测序验证后，通过农杆菌侵染整合进野生型日本晴基因组中；从而获得OsPTP1超表达株系(图3A,3B和3D)。

引物信息如下：

上游引物：CGGGATCCATGGCTGGCAAGGAAATCTACC

下游引物：TCCCCCGGGGCAGAGGAATTTTACAACGATGC。

从上述超表达株系中挑选3个株系进行表型、磷含量及生物量分析，发现超表达OsPTP1能够显著提高水稻对磷的吸收(图3C)。随后通过对3个转基因超表达株系进行了各种元素分析；发现所有被检测的元素在OsPTP1超表达植株地上部与野生型之间均没有显著差异，包括Fe、B、K、Na、Ca、Cu、Mg、Mn、Zn等元素。而在根中，OsPTP1超表达株系中Mg和Zn含量均有显著提升，分别为野生型的1.3倍和1.2倍。这些结果说明OsPTP1对调控植株对磷的吸收具有特异性的同时，也能够提高植物对Mg和Zn的吸收。

实施例5、OsPTP1突变体载体构建

为明确OsPTP1在调控磷吸收利用的功能，利用CRISPR/Cas9系统构建了OsPTP1突变载体。CRISPR/Cas9系统是由CRISPR位点(Clusters of Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，CRISPR)及CRISPR相关基因(CRISPR-associated，Cas9)组成的。CRISPR/Cas9系统目前广泛用于特异编辑动植物基因。OsPTP1突变体株系由CRISPR/Cas9载体转基因获得。具体方法如下：

1)靶点的选择：在目标区找到NGG上游第20碱基是A或G的序列(A，G分别为U3和U6启动子的转录起始碱基)，优先选为靶序列，如果不是，可手动改为A或G。依照这种方法，OsPTP1的靶点选择为第二个外显子区域，序列为：5’-AAGAAGGAGAGCATGATCTG-3’；

2)合成接头引物：按照pYL-U3-gRNA载体合成接头引物，引物信息如下：

OsPTP1-接头引物-F：GGCAAGAAGGAGAGCATGATCTG

OsPTP1-接头引物-R：AAACCAGATCATGCTCTCCTTCT

3)将两条合成的接头引物溶解成100μM母液，各取1μl加入到98μl水中混合稀释到1μM。90℃变性1min后，移至室温下冷却退火。

4)gRNA表达盒连接：取1μl退火产物，与BbsI酶切过的pYL-U3-gRNA载体室温下连接1h。

5)gRNA表达盒扩增：第一轮扩增：取1μl连接产物为模板，使用U-F接头反向引物和接头正向引物gRNA-R利用KOD高保真酶PCR扩增第一轮产物(95℃10s，60℃15s，68℃20s。28个循环)。第二轮扩增：取1μl用水稀释10倍的第一轮PCR反应产物，用特定位置gRNA表达盒引物B1’和BL进行PCR扩增(95℃10s，58℃15s，68℃20s。25个循环)。

6)割胶回收上述产物片段，取回收的产物约20-70ng，加入约60-80ng未切割的pYLCRISPR/Cas9-MH(B)质粒，在15μl反应(1x Bsa I-内切酶Buffer)用10U BsaI 37℃酶切10min后加入终浓度至0.5～1.0mM的ATP和35U T4 DNA连接酶。用变温循环酶切连接约10-15循环:37℃2min；10℃3min，20℃5min；最后37℃2min。

7)将上述连接产物通过热激法转化至大肠杆菌DH5α中。涂板后37℃培养12h。

8)挑取单克隆，于卡那抗生素培养基中培养3h左右进行PCR鉴定，引物为M13测序引物(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)及一条合成的接头引物(OsPTP1-接头引物-R)，阳性克隆提取质粒DNA并送测序，测序鉴定无误后(即接头序列信息已正确连入载体中)将制备好的质粒-20℃保存并用于转基因实验以构建OsPTP1突变体株系。

实施例6、水稻转基因

农杆菌(EHA105)介导的水稻遗传转化体系具体过程如下：

水稻成熟胚愈伤组织的准备：

水稻成熟种子脱壳后，挑选饱满光洁无菌斑的种子放入烧杯中，用70％酒精消毒2min；

倒去酒精，加入25％(v/v)NaClO溶液消毒30min；

倒去NaClO溶液，用无菌水清洗5遍，最后1遍在无菌水中浸泡30min；

倒去无菌水，将种子放在无菌滤纸上吸干，种子平放于粳稻成熟胚诱导培养基中，28℃暗下培养10天；

在超净工作台上打开培养皿，用镊子将芽和胚乳去掉，留下胚性愈伤组织(淡黄色，致密不规则)，移入粳稻继代培养基中，28℃暗下培养5-10天。

农杆菌的培养：

挑取农杆菌单克隆或吸取所保农杆菌菌液100μl于5ml YEP(含50mg/L Kan和50mg/L Str)培养液中，28℃，250rpm振荡培养12-36h至菌液OD600饱和；

从上述饱和的菌液中吸取500μl于30ml YEP含50mg/L Kan和50mg/L Str培养液中，28℃，250rpm振荡培养12-16h至菌液OD600＝0.8-1.5。

共培养及抗性愈伤的筛选：

取培养好的菌液15ml于50ml离心管中，4℃，4000rmp，离心10min，去上清；

用含200μmol/L As的30ml AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.4-0.7；

将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，切割成粒状，放入农杆菌悬浮液，振荡培养30min；

将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30min；

然后将愈伤组织置于放有一层滤纸的共培养基上；

25℃暗下培养2.5天后，将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次，其间需不停的振荡；

再用含250mg/L羧苄青霉素钠的无菌水清洗1-2遍；

最后置于无菌滤纸上沥干2h；

将晾干的愈伤转入含250mg/L羧苄青霉素钠和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，暗下培养14天；

将长大的初始愈伤转到含250mg/L羧苄青霉素钠和50mg/L潮霉素选择培养基上进行第二轮选择，28℃，暗下培养14天，此时抗性愈伤组织长出。

抗性愈伤的分化及成苗：

挑取来源相同的抗性愈伤2-3颗置于分化培养基上，25℃光照培养(16h/8h光周期，光强为2000lx)；

分化培养30天左右愈伤组织会分化出小苗，当小苗长至3-5cm左右，转入生根培养基中，25℃光照培养(16h/8h光周期，光强为2000lx)。

转基因苗的锻炼和移栽：

生根14天后，将转基因苗生长状态较好的试管挑出，打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水，在培养室中培养2-3天；

洗去琼脂，转入水稻营养液中培养2周，将获得的转基因阳性苗移入大田或盆栽，收种转基因苗的鉴定

T₀代阳性转基因苗的筛选：

T0代转基因苗在正常条件下(温度：白天30℃，晚上22℃；湿度>60％；光照度30000lx，16h/8h光周期)溶液培养1周之后，取1cm长的叶片提取基因组DNA，利用抗性筛选标记基因对转基因苗进行鉴定，筛选成功的转化株系。

基因组DNA的提取(TPS法)：

1.取2cm叶片置于2ml离心管中，加入200μl TPS抽提液(100mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH 8.0)，1M KCl)，加入一枚钢珠，盖紧离心管盖，在组织捣碎仪TissueLyser Ⅱ(QIAGEN，U.S.A)震荡1.5min。

2.将捣碎的组织匀浆转移至新的1.5ml离心管中，70℃温浴30min。

3. 12000rpm离心10min，取上清于另一新的1.5ml离心管中。

4.加等体积异丙醇，上下颠倒混匀之后，12000rpm离心10min，弃上清。

5.加600μl 70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心5min。

6.弃去乙醇，晾干DNA，之后用30μl ddH2O溶解。

阳性转基因苗的RT-PCR鉴定：

对超表达转基因株系提取RNA，做反转录，用qRT-PCR方法检测OsPTP1的相对表达量。具体过程如下：

RNA提取：

采用天根公司的植物RNA提取试剂盒提取总RNA，方法如下：1.将研钵研杵于180℃烘烤2h以除去RNase；2.取50-100mg植物样品速冻于液氮之中；3.在冷冻状态下将样品充分研磨粉碎；4.加入提取液使细胞充分裂解；5.过滤除去组织碎片；6.纯化层析柱中的RNA(去蛋白、去DNA和脱盐)；7.RNase-free H₂O洗脱获取RNA。具体操作过程参照试剂盒附带说明书。

反转录:

cDNA的合成采用Invitrogen公司的SuperScript II RT试剂盒完成，反转录体系中总RNA的用量为1μg，具体过程参照试剂盒附带说明书。

qRT-PCR：

(1)按照实验需要，计算Master、模板、引物和水的用量，每个样本做3个技术重复。

(2)将2×Master和cDNA模板混合液加入定量PCR孔壁上。并将定量PCR板离心使得的样品沉到孔底。

(3)将水、引物和探针混合液加入定量PCR孔壁，并离心，条件同上。

(4)开启LightCycle480软件，放入定量PCR板进行程序运行。

(5)待PCR程序结束，进入“Analysis”界面，点击“Abs Quant/2nd DerivativeMax”分析样品C_T值；若是SYBR GreenⅠ，点击“Tm Calling”分析样品溶解曲线。

(6)取出定量PCR板，保存数据，退出程序，关电脑，再关定量PCR仪。

元素含量测定：

野生型和3个OsPTP1超表达株系分别高磷(200μM Pi)和低磷(10μM Pi)培养5周(每周换一次营养液)后称取新鲜根叶组织样品，放入65℃烘箱烘干3天，称取烘干的组织样品0.1g左右，用HNO₃：H₂O₂(30:1，v/v)消解，消解后排酸到1ml，定容到50ml，通过ICP-MS测定所有元素(氮除外)。

所得结果如下表2及表3；

表2、正常磷浓度培养条件下，各株系叶片中元素分析

在正常磷浓度(200μM)条件下培养5周的野生型Nip及3个OsPTP1转基因超表达株系叶片中的元素测定。数据为3次生物学重复的平均值±方差，每行中不同的小写字母代表存在显著差异(Duncan多重比较，P<0.05)。

表3、正常磷浓度培养条件下，各株系根中元素含量分析

在正常磷浓度(200μM)条件下培养5周的野生型Nip及3个OsPTP1转基因超表达株系根中的元素测定。数据为3次生物学重复的平均值±方差，每行中不同的小写字母代表存在显著差异(Duncan多重比较，P<0.05)。

因此，可得知：在正常磷培养条件下，所有被检测的元素在OsPTP1超表达植株地上部与野生型之间均没有显著差异，包括Fe、B、K、Na、Ca、Cu、Mg、Mn、Zn等元素。而在根中，OsPTP1超表达株系中Mg和Zn含量均有显著提升，分别为野生型的1.3倍和1.2倍。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> OsPTP1在植物磷高效育种中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3892

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atggctggca aggaaatcta ccacaagatg aaggacaagg tactgagtaa tggaggactg 60

gaggatgggg attcttgttt gttcttcctt tggcctccat ttccctttca tgtttattgt 120

ttttttttat ttttttgcta ttcctgtgct atttttgggg taatatttag gtgcaccgtt 180

gtgtcgaatc ttttcctttt catattagct tgaggggatc ttgaaatggc gaaggctaga 240

agtctgaaca tgtcttaaaa atcttggaat gatgctaggc tatggtgtct atttatttat 300

tttgggccaa atctgttgct taattacgac aatccaatgg tttgtggttc tataaacata 360

atgagtcccg atgccatgaa actccgtgtt gacgttagat tcttggagtt atcatgtttc 420

tcgttcctac tagcagaagc aggaaacatg tatcagtgga gaaaataact actgaggaaa 480

caaaacataa ctcgtctaga ccagtagaga gacaagcatt tcaatatgtt ggttatggga 540

atctggtcca tttcaccata aaacttcaag aacacgatct ccggcttttg ccggttaagc 600

atgaatttta ttttatgctt agattttttt ggatattctt ttttatgaaa gcttttggaa 660

ctcaagaact cgtttgattg acgttgttcc ttgggagttt tagagtttgc agcctggaaa 720

ctagaagtta tcttgaaatg ttatactcta ctcaatgtag aatacacaca tcactaaatc 780

cagactaaat tcattttggt agactacctt atgcaccttc tttgtgttta ttcttgctgt 840

gatgcaacca atgtcaaaaa agcgaaaact gtttttttgc tccattgtgc tggatgtttt 900

ccgcaagctt atatatttgc tttgcttagt gttgtactat tagcaactta acatgcttga 960

cgaacgatta tgttttgttt aacaggtgaa agatgctttt agttcgtcag gaccagaaac 1020

agggaaagga aaaacaaaat tgtcaggcaa gcgtgtcaag catggttacc atcttgtgaa 1080

gggaaaatca aatcatccga tggaggacta tctagtggca gagtacaggc aagaaggaga 1140

gcatgatctg gggctgtttg caatatttga tgggcatttg ggccacactg ttccagactt 1200

cctgcgctca catctctttg ataatatctt aaagcaggta atatttcaaa ttcaatgtcc 1260

tgttaatagg cttagcctca atacttgctg cattgcctac atgctcagat agtaagattg 1320

ttttgtcatc atgcgtcaat tgttccaata ttgtattttt actagctaca tgtcctttga 1380

tttactatgg ataaaaatga accatccaag ttctaatgct gttcacaata aatagttgtg 1440

tcattcattt tttttgtcgt tttaaggagc atctgacagt gtctgtactt acagtaaaaa 1500

taacccattc gctatgtact tttatgtgtt aaattctgag tttagaaggt ttaaaaaaat 1560

ggaattagaa tatatggaat gaagattgca taatattaaa gaaatgtagg aagcattttg 1620

agaaaagaaa aacaaggcgg agttagtggg gtggcgattt accaccagca tcactactct 1680

ttttctttta ggtattatac ttatcctcaa aaacacagaa agagcaagtc aatctataat 1740

gcatatggta aactataaac agggtaagaa gagttgtact tctgttacgc ttacaagtgt 1800

tatctgtgct tgttctacaa tctacttgca agaaccatgc taggaataac tatggagtga 1860

cctaaatata tagataatgt ctatgcaatt gaagatagtc aactgaattc acaactgtgc 1920

tgattattta ttgactcctt caacctcagc cagaattctt gagcaaccca caagctgcaa 1980

ttcgaaatgc atatcaactt acggatgcaa aaatattgga aagcgcagct gagttgggca 2040

gaggaggctc cactgctgtt actgccatat taataagcag tgaaaattct gtgaacctag 2100

tagttgcaaa tgttggagat tcacgagcag ttattagcaa gagtggtgta gcaaaacagc 2160

tttcggttga tcatgaacca aacaaggagc ggcattcaat cgagaaaaaa ggtggctttg 2220

tttcaaactt accaggtaaa tgaccatttc ttgtcaactc tttttccttt tttttttttt 2280

ttgggggggg gtttagtcat tgtaattaac agtttaaagt tatagatgtt ttttactgag 2340

gtttttttgt ttgctaatct agtgtatcta atgtttagtt ccacactgct ttcttatttg 2400

gatttatgtc cttgtatgac tatatactag ccatgtggcc ctcaatactg cccatctatt 2460

tgagcccgtt tcattggttg acattgcatc agatcctagg tccaggatac accctaacac 2520

taagcatacc tatgccaata ttgcattagt aattaccagc agtggcgtac acagacccta 2580

ctcttaactg cttctatgct gttactgtca caacatatga gatgcaatct atcgagcttc 2640

aattccaaaa attttttact tgcaggagat gtaccgcgtg ttgatggtca gcttgcggtt 2700

gcaagggcat ttggagaccg gagcctaaag aagcacctca gctcagagcc agatgtggtg 2760

gaggaaccta tagacgagaa tactgatttt ctaattcttg caagtgatgg attatggaag 2820

gtgatgccta taaagctcat accaaccatc catgatagat tacacctaaa tttattgttt 2880

tgcattctat atgcatacct aacctaagct caacaaactg gagaccatgt cctaccttat 2940

ttaattctat atacacacca aatctcagaa tatgcataca tgcatgcact acattattta 3000

attttgaaca tgaggtactg gaggttgagt tttgtctaac aggtgaaagt gcttattcct 3060

acatttcagc tacttcctcc gtcccaaaat ataagcattt ttagatatct acacggtctt 3120

cgagatgcta ctttgaccaa caatgtctat aaaagtaata tgttttaaat aaaaagagtt 3180

gcatattatg atagtttgtt taatgataaa tctagcaata tcaaatttac atgattgatc 3240

tttttcatta ttttgctatt aatagtcaac atttaaaaag tttgatttgg cactattcta 3300

aaaatgctta tattttggga tgaatgaagt atgtaatttg gcatgcataa gcacatcctg 3360

actcatgagt tgcgaacctt gatttttcta ttttcttaag ctgcatctat gactattgca 3420

tgattgtttt tttttttgtt ttagttgagt tctttactct ttttatgcta gttttcccaa 3480

ctcacctcgc tcgttttcca cgtgcatgct tttcaaactg ctaaacggtg tgtttttttg 3540

taaaaaattt ctatacgaaa gttgttttaa aaaattatat taatccattt ttcaaaaaaa 3600

aagttaatac ataattaatt gtgcaatagt acgtgctccg ttttgcgtgc cggggaggag 3660

gggttcccag ccttaatgag ctgctaagtt gcattagcga cgttctttta tcatatgcaa 3720

cgattataat ttcaagatca tacatatcca ggtgatgtcc aaccaagagg cggtggatga 3780

aatcaaggac ttcaaggatg ctcaggcagc tgcgaagcat ctgacggagc aggccgtgaa 3840

ccggaaaagc aaagacgaca tctcctgcat cgttgtaaaa ttcctctgct ag 3892

<210> 2

<211> 290

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

Met Ala Gly Lys Glu Ile Tyr His Lys Met Lys Asp Lys Val Lys Asp

1 5 10 15

Ala Phe Ser Ser Ser Gly Pro Glu Thr Gly Lys Gly Lys Thr Lys Leu

20 25 30

Ser Gly Lys Arg Val Lys His Gly Tyr His Leu Val Lys Gly Lys Ser

35 40 45

Asn His Pro Met Glu Asp Tyr Leu Val Ala Glu Tyr Arg Gln Glu Gly

50 55 60

Glu His Asp Leu Gly Leu Phe Ala Ile Phe Asp Gly His Leu Gly His

65 70 75 80

Thr Val Pro Asp Phe Leu Arg Ser His Leu Phe Asp Asn Ile Leu Lys

85 90 95

Gln Pro Glu Phe Leu Ser Asn Pro Gln Ala Ala Ile Arg Asn Ala Tyr

100 105 110

Gln Leu Thr Asp Ala Lys Ile Leu Glu Ser Ala Ala Glu Leu Gly Arg

115 120 125

Gly Gly Ser Thr Ala Val Thr Ala Ile Leu Ile Ser Ser Glu Asn Ser

130 135 140

Val Asn Leu Val Val Ala Asn Val Gly Asp Ser Arg Ala Val Ile Ser

145 150 155 160

Lys Ser Gly Val Ala Lys Gln Leu Ser Val Asp His Glu Pro Asn Lys

165 170 175

Glu Arg His Ser Ile Glu Lys Lys Gly Gly Phe Val Ser Asn Leu Pro

180 185 190

Gly Asp Val Pro Arg Val Asp Gly Gln Leu Ala Val Ala Arg Ala Phe

195 200 205

Gly Asp Arg Ser Leu Lys Lys His Leu Ser Ser Glu Pro Asp Val Val

210 215 220

Glu Glu Pro Ile Asp Glu Asn Thr Asp Phe Leu Ile Leu Ala Ser Asp

225 230 235 240

Gly Leu Trp Lys Val Met Ser Asn Gln Glu Ala Val Asp Glu Ile Lys

245 250 255

Asp Phe Lys Asp Ala Gln Ala Ala Ala Lys His Leu Thr Glu Gln Ala

260 265 270

Val Asn Arg Lys Ser Lys Asp Asp Ile Ser Cys Ile Val Val Lys Phe

275 280 285

Leu Cys

290

Claims

1.基因OsPTP1的用途，其特征在于：用于提高农作物对磷的吸收；所述基因OsPTP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，或者在此序列基础上衍生的插入或缺失1个或多个核苷酸产生的突变序列。

2.根据权利要求1所述的基因OsPTP1的用途，其特征在于：用于提高农作物对磷的吸收、转运或利用，从而实现磷高效育种。

3.根据权利要求1或2所述的基因OsPTP1的用途，其特征在于：所述农作物为水稻。