CN109608531B - Fpa和fpal在调控植物叶绿体发育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了FPA和FPAL在调控植物叶绿体发育中的应用。本发明提供了如下1)‑3)中任一种物质在如下a‑c中至少一种中的应用：1)蛋白FPA和/或FPAL；2)编码蛋白FPA和/或FPAL的DNA分子；3)含有编码蛋白FPA和/或FPAL的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；a)调控植物叶绿体发育；b)使植物白化苗变为绿色苗；c)调控植物叶绿体基因的表达。本发明从模式植物拟南芥中鉴定到了FPA和FPAL基因，通过研究该基因突变后导致的植物表型及其翻译后蛋白的生物学功能，详细描述了FPA和FPAL两个蛋白在植物叶绿体发育过程中的作用及其调控叶绿体编码基因的方式，为外源蛋白在叶绿体中高表达提供了可操作的技术手段。

Description

FPA和FPAL在调控植物叶绿体发育中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及FPA和FPAL在调控植物叶绿体发育中的应用。

背景技术

叶绿体是植物进行光合作用的重要场所，目前广泛被接受的理论是叶绿体来源于古老的蓝细菌被真核生物内吞后的共生作用。在长期的进化过程中，蓝细菌

基因组中的大部分基因被整合到宿主基因组中，生成叶绿体。叶绿体基因组包含大约100个基因，这些基因编码的蛋白是光合复合体的重要亚基和质体基因表达调控蛋白。

叶绿体中参与光合作用的复合体由核编码和叶绿体编码的蛋白共同组成。叶绿体编码基因与核编码基因之间的协同作用对叶绿体的正常发育及行使功能具有重要的意义。质体编码的RNA聚合酶PEP主要负责叶绿体自身编码基因的转录。PEP复合物的活性调节对植物叶绿体的发育至关重要。植物体内包含两种RNA聚合酶：核编码的质体RNA聚合酶(NEP)和质体编码的RNA聚合酶(PEP)(Liere et al,2011；Yagi&Shiina,2012)。NEP是T3/T7噬菌体型的RNA聚合酶，主要负责植物看家基因的转录，例如PEP的核心亚基和核糖体蛋白等(Puthiyaveetil et al,2010)。然而PEP是细菌型的RNA聚合酶，起源于蓝细菌，主要负责光合相关基因的转录。NEP和PEP聚合酶在叶绿体基因转录过程中行使不同的功能，以应答植物发育过程和外界各种环境条件的变化(Emanuel et al,2004；Zoschke et al,2007)。根据PEP和NEP所负责的不同叶绿体基因转录，可以把叶绿体基因分成三大类：第一类，主要由PEP负责转录的光合相关基因(psaA,psbA，psbD)；第二类，PEP和NEP共同负责转录的看家基因(clpP,rrn,operon)；第三类，NEP负责转录的accD和rpoB等基因(Allison et al,1996；

et al,2015)。

PEP复合物定位于质体的类核区，以可溶和不溶的两种状态存在，不溶状态的复合物被命名为TAC(insoluble transcriptional active chromosome)(Pfalz et al,2006)。蛋白质组学分析PEP复合体鉴定出50多个PEP复合物亚基，其中18个是不溶的TAC组分(Pfalz et al,2006；reviewed in Yu et al,2014)。TAC蛋白是被子植物和苔藓植物所特有。之前的很多研究表明，PEP复合物亚基缺失后导致PEP复合物活性降低，叶绿体翻译下降，最终导致植物出现白化表型，这些现象表明TAC亚基蛋白参与PEP依赖的转录。对于植物来说，PEP复合物活性直接影响了叶绿体的发育，其对叶绿体调节的机制研究就显得尤其重要。虽然大部分的PEP复合体已经被鉴定，但是PEP复合体的调控机制仍然不清楚。

发明内容

本发明的一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。

本发明提供的如下1)-3)中任一种物质在如下a-c中至少一种中的应用：

1)蛋白FPA和/或FPAL；

2)编码蛋白FPA和/或FPAL的DNA分子；

3)含有编码蛋白FPA和/或FPAL的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述蛋白FPA为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列3或序列3第61-333位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列3或序列3第61-333位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质；

所述蛋白FPAL为如下(3)或(4)：

(3)由序列表中序列6或序列6第49-302位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(4)将序列表中序列6或序列6第49-302位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质；

a)调控植物叶绿体发育；

b)使植物白化苗变为绿色苗；

c)调控植物叶绿体基因的表达。

上述应用中，所述编码蛋白FPA的DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)编码区为序列表中序列2或序列2第181-1002位所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

所述编码蛋白FPAL的DNA分子是如下1)-4)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列4所示的DNA分子；

2)编码区为序列表中序列5或序列5第145-909位所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

上述应用中，所述调控植物叶绿体发育为促进植物叶绿体发育；

或所述调控植物叶绿体基因的表达为提高植物PEP依赖型基因的表达或降低NEP依赖型基因或降低NEP与PEP共同负责转录的基因。

上述应用中，所述促进植物叶绿体发育为使植物叶绿体类囊体膜形成跺叠结构、使植物叶绿体类囊体膜结构完整和/或使植物叶绿体类囊体膜结构连续。

上述1)-3)中任一种物质在改善植物叶绿体发育中的应用也是本发明保护的范围。

上述1)-3)中任一种物质在培育植物PEP依赖基因的高表达的植物中的应用也是本发明保护的范围；

上述1)-3)中任一种物质在培育由白化苗恢复为绿色苗植物中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种获得由白化苗恢复为绿色苗的转基因植物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：提高白化苗目的植物中蛋白FPA或FPAL的含量和/或活性，得到恢复为绿色苗的转基因植物；

所述蛋白FPA为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列3或序列3第61-333位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列3或序列3第61-333位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质；

所述蛋白FPAL为如下(3)或(4)：

(3)由序列表中序列6或序列6第49-302位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(4)将序列表中序列6或序列6第49-302位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

本发明第3个目的是提供一种获得由白化苗恢复为绿色苗的转基因植物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：提高白化苗目的植物中蛋白FPA或FPAL编码基因的表达量和/或活性，得到恢复为绿色苗的转基因植物；

所述蛋白FPA为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列3或序列3第61-333位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列3或序列3第61-333位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质；

所述蛋白FPAL为如下(3)或(4)：

(3)由序列表中序列6或序列6第49-302位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(4)将序列表中序列6或序列6第49-302位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

上述中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

本发明从模式植物拟南芥中鉴定到了FPA(Factors essential for PEP-dependent Activity)和FPAL(FPA-like protein)基因，通过研究该基因突变后导致的植物表型及其翻译后蛋白的生物学功能，详细描述了FPA和FPAL两个蛋白在植物叶绿体发育过程中的作用及其调控叶绿体编码基因的方式，为外源蛋白在叶绿体中高表达提供了可操作的技术手段。

附图说明

图1为fpa和fpal突变体表型；

(A)FPA和FPAL基因结构，黑色的标尺代表100bp；黑色方框代表基因的外显子，细线代表内含子，空三角框代表T-DNA/Ds的插入位点；

(B)培养基上生长10天的fpa和fpal突变体苗生长表型；标尺：5mm；

(C)叶绿体光合蛋白复合体代表亚基的免疫分析。

图2为拟南芥野生型和突变体质体的亚显微结构。

图3为野生型和突变体植株中质体编码基因的转录分析。

图4为FPA蛋白和FPAL蛋白定位在叶绿体类核区。

图5为FPA蛋白和FPAL蛋白互作。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、FPA基因和FPAL基因在调控植物叶绿体发育中的应用

一、FPA基因突变的突变体和FPAL基因突变的突变体的表型

FPA基因的基因组核苷酸序列为序列1，cDNA核苷酸序列为序列2，其编码的蛋白FPA的氨基酸序列为序列3；

序列3中，第1-60位为信号肽，第61-333位为FPA成熟蛋白；

序列2中，第1-180位为信号肽编码区，第181-1002位为FPA成熟蛋白的编码区。

FPAL基因的基因组核苷酸序列为序列4，cDNA核苷酸序列为序列5，其编码的蛋白FPAL的氨基酸序列为序列6；

序列6中，第1-48位为信号肽，第49-302位为FPAL成熟蛋白；

序列5中，第1-144位为信号肽编码区，第145-909位为FPAL成熟蛋白的编码区。

拟南芥突变体fpa(SALK_012162C)是T-DNA插入产生突变体(图1A)，fpa的基因组与野生型拟南芥(col-0；从拟南芥SALK突变体库(the SALK collection，网址为：http://signal.salk.edu)基因组相比，仅FPA基因突变，其余基因不变。

拟南芥突变体fpal(pst16985)是Ds转座子插入的突变体(图1A)，fpa的基因组与野生型拟南芥基因组相比，仅FPAL基因突变，其余基因不变。

fpa和fpal突变体在MS培养基上生长10天，观察表型，以野生型拟南芥(col-0)为对照。

结果如图1B所示，可以看出，与野生型拟南芥相比，fpa和fpal突变体呈现白化苗表型，在土壤中不能存活。

二、FPA基因和FPAL基因在使拟南芥白化苗变为绿色苗中的应用

如图1所示，fpa是T-DNA插入产生突变体，fpal是Ds转座子插入的突变体(图1A)。fpa和fpal突变体在MS培养皿上呈现白化苗表型，在土壤中不能存活。

1、重组载体的构建

重组载体pCambia1300-3x FLAG-FPA为将FPA基因的CDS(序列2)替换pCAMBIA1300-flag载体的salI和kpnI酶切位点间的片段，得到的载体。

pCAMBIA1300-flag载体记载在如下文献中，该载体在文献中的相应名称为“amodified pCAMBIA1300containing either the Myc or Flag coding sequence”：ZhaoY,Xie S,Li X,Wang C,Chen Z,Lai J,Gong Z.。REPRESSOR OF SILENCING5Encodes aMember of the Small Heat Shock Protein Family and Is Required for DNADemethylation in Arabidopsis.Plant Cell.2014Jun；26(6):2660-2675.

重组载体pCambia1300-3x FLAG-FPAL为将FPAL基因的CDS(序列5)替换pCAMBIA1300-flag载体的salI和kpnI酶切位点间的片段，得到的载体。

2、重组菌的制备

重组菌GV3101/pCambia1300-FPA为将重组载体pCambia1300-3x FLAG-FPA转入GV3101农杆菌，得到重组菌GV3101/pCambia1300-FPA。

重组菌GV3101/pCambia1300-FPAL为将重组载体pCambia1300-3x FLAG-FPAL转入GV3101农杆菌，得到重组菌GV3101/pCambia1300-FPAL。

3、回补株系的获得

将上述重组菌GV3101/pCambia1300-FPA采用蘸花法转入突变体fpa中，得到T0代转FPA拟南芥回补苗种子。

将上述重组菌GV3101/pCambia1300-FPAL采用蘸花法转入突变体fpal中，得到T0代转FPAL拟南芥回补苗种子。

T0代种子长成的植株即为T1代植株，T1代植株自交获得T1代种子，T1代种子长成的植株即为T2代植株，T2代植株自交获得T2代种子，T2代种子长成的植株即为T3代植株。

4、回补苗的鉴定

1)PCR扩增

提取T1代转FPA拟南芥回补苗和突变体fpa叶片的基因组DNA，用fpa-LP、fpa-RPLBb1.3(引物序列如表1所示)进行如下不同组合PCR扩增：

若fpa-LP和fpa-RP扩增无条带，且LB和RP扩增得到约500bp条带，且superPro-seq-F+p1300FLAG-seq R扩增得到1500bp左右条带，则转基因植株是正确的回补苗。

结果，T1代转FPA拟南芥回补苗满足上述不同组合PCR扩增结果，表明FPA基因回补到突变体fpa中。

提取T1代转FPAL拟南芥回补苗和突变体fpal叶片的基因组DNA，用fpal-PrimerA、fpal-Primer B和3-1a(引物序列如表1所示)进行如下不同组合PCR扩增：

若fpal-Primer A和fpal-Primer B扩增无条带，且fpal-primer B+3-1a扩增有约500bp条带，且superPro-seq-F+p1300FLAG-seq R扩增有1500bp条带，则转基因植株是正确的回补苗。

结果，T1代转FPAL拟南芥回补苗满足上述不同组合PCR扩增结果，表明FPA基因回补到突变体fpal中。

表1为PCR扩增所用引物

2)蛋白检测

分别提取T1代转FPA拟南芥回补苗和T1代转FPAL拟南芥回补苗总蛋白，用WesternBlot检测蛋白，FLAG为抗体。以野生型拟南芥、突变体fpa和突变体fpal为对照。

结果如图1C所示，可以看出，与野生型相比，突变体fpa、fpal中光合主要复合体的亚基全部都缺失了；T1代转FPA拟南芥回补苗和T1代转FPAL拟南芥回补苗在光合主要复合体的亚基全部都存在。

上述结果均表明，回补成功，T1代转FPA拟南芥回补苗为FPA基因回补到突变体fpa中得到的回补苗，T1代转FPAL拟南芥回补苗为FPAL基因回补到突变体fpal中得到的回补苗。

5、回补苗的表型观察

将T3代转FPA拟南芥回补苗和T3代转FPAL拟南芥回补苗在添加蔗糖的MS培养基上培养10天，观察表型。以野生型拟南芥、突变体fpa和突变体fpal为对照。

结果如图1B所示，可以看出，突变体fpa和突变体fpal为白化苗，T3代转FPA拟南芥回补苗和T3代转FPAL拟南芥回补苗均又恢复为野生型绿色苗表型。

上述结果表明，FPA基因和FPAL基因均具有使由于FPA基因或FPAL基因表达量降低或沉默导致的白化苗恢复为绿色苗的功能。也就证明FPA基因和FPAL基因均与叶绿体发育相关。

三、fpa突变体、fpal突变体和野生型拟南芥的叶绿体结构检测

MS培养基上生长10天的fpa突变体、fpal突变体和野生型拟南芥(WT)幼苗叶片作为材料，固定在2％戊二醛和4％多聚甲醛，50mM二甲胂酸钠溶液pH7中，在4℃中过夜固定，洗2小时。然后在1％OsO4(锇酸)4℃固定2小时，固定样品0.1M PBS Ph7.0漂洗2次，水洗1次。乙醇系列脱水，丙酮置换乙醇，渗透(丙酮：树脂＝3:1)，包埋，烘干，透射电镜观察。

结果如图2所示，可以看出，野生型拟南芥的叶绿体的形状和内部结构都是完整的，类囊体膜结构也很完整和连续，形成有功能的跺叠；但是在fpa突变体、fpal突变体中叶绿体内部的结构是不完整的，类囊体膜不形成跺叠结构，分散且不连续，质体尺寸相比野生型小很多。

上述结果表明，FPA基因和FPAL基因参与了叶绿体发育的调节。

四、fpa突变体、fpal突变体和野生型拟南芥叶绿体编码基因表达分析

提取MS培养皿上生长六周的fpa突变体、fpal突变体和野生型拟南芥(WT)植株的RNA，随机引物反转录生成cDNA作为模板，用如下引物检测叶绿体编码基因的表达。根据其转录模式，可以将叶绿体编码的基因分为三大类：PEP(质体编码的RNA聚合酶)依赖型、NEP(核编码的RNA聚合酶，属于噬菌体型)依赖型和PEP&NEP共同作用型。依赖质体编码的RNA聚合酶转录的叶绿体基因在叶绿体早期发育起着很重要的作用。通过实时定量PCR，来确定突变体中不同类型的叶绿体编码基因的表达变化。

表2为实时定量PCR的引物

结果如图3所示，可以看出，突变体中PEP依赖的叶绿体编码的基因表达大幅下降，而NEP、NEP与PEP共同负责转录的基因则大部分上调表达，这种表型与其它此类影响叶绿体编码基因转录的突变体分子表型是一致的。这些结果表明FPA和FPAL蛋白参与了叶绿体发育相关基因的表达调控。

五、FPA和FPAL蛋白在植物体中的亚细胞定位

1、重组载体的构建

pBI221-FPA-GFP为将FPA基因的CDS(序列2)插入载体pBI221-GFP(Zhong etal.2013)的xbaI和BamHI酶切位点间，得到的载体，成熟蛋白FPA的C端融合GFP。

pBI221-FPAL-GFP为将FPAL基因的CDS(序列5)插入载体pBI221-GFP的xbaI和BamHI酶切位点间，得到的载体，成熟蛋白FPAL的C端融合GFP。

2、转化

将重组载体pBI221-FPA-GFP和pBI221-FPAL-GFP转入野生型拟南芥的原生质体(Walter M.,Chaban C.,Schutze K.,Batistic O.,Weckermann K.,Nake C.,BlazevicD.,Grefen C.,Schumacher K.,Oecking C.,Harter K.&Kudla J.(2004)

Visualization of protein interactions in living plant cells usingbimolecular fluorescence complementation.Plant J 40,428-38)中，首先将适龄叶片用刀切成1毫米宽度碎条，浸入酶解液在黑暗中消化4个小时，离心弃上清，沉淀即为原生质体，用适量MMG将原生质体悬起，PEG方法转化目的质粒，转化后的原生质体在弱光下培养16小时后通过显微共聚焦，观察蛋白的定位，标识不同亚细胞部位的marker蛋白也转入原生质体，用来显示线粒体(FRO1-GFP)，叶绿体(RbcS-GFP)以及细胞核(Fbr1-GFP)的位置。pTAC5-RFP和pBI221-FPA-GFP/pBI221-FPAL-GFP共同转化入原生质体，进行共定位观察。已有文献报道pTAC5定位在叶绿体的类核区(Zhong L.,Zhou W.,Wang H.,Ding S.,Lu Q.,Wen X.,Peng L.,Zhang L.&Lu C.(2013)Chloroplast small heat shock proteinHSP21interacts with plastid nucleoid protein pTAC5and is essential forchloroplast development in Arabidopsis under heat stress.Plant Cell 25,2925-43.)。

结果如图4所示，A为FPA和FPAL蛋白定位于叶绿体，B为FPA和FPAL蛋白共定位于叶绿体的类核区；pTAC5-RFP定位于叶绿体类核区，FPA-GFP/FPAL-GFP分别与pTAC5-RFP共转入原生质体，通过FPA/FPAL与pTAC5的共定位，确定FPA和FPAL蛋白均定位于叶绿体的类核区。

六、FPA和FPAL蛋白互作

1、FPA和FPAL蛋白免疫共沉淀质谱鉴定

分别提取拟南芥FPA-FLAG和FPAL-FLAG转基因回补苗的叶绿体蛋白，免疫沉淀按照FLAG MicroBeads kit(Miltenyi Biotec)检测。

结果如图5A所示，可以看出，FPA和FPAL蛋白可以分别从FPAL-FLAG和FPA-FLAG转基因样品中鉴定到，说明FPA和FPAL蛋白在体内是存在于相同的复合体内。

2、酵母双杂交

pGBKT7载体为诱饵表达载体(BD)。pGADT7为猎物表达载体(AD)。

重组质粒BD-FPA为将将编码FPA成熟蛋白的CDS(序列2第181-1002)插入pGBKT7载体，得到重组质粒BD-FPA。

重组质粒AD-FPAL为将将编码FPAL成熟蛋白的CDS(序列5第145-909位)插入pGADT7载体，得到重组质粒AD-FPAL。

重组质粒BD-FPAL为将编码FPAL成熟蛋白的CDS(序列5第145-909位)插入pGBKT7载体，得到重组质粒BD-FPAL。

重组质粒AD-FPA为将编码FPA成熟蛋白的CDS(序列2第181-1002)插入pGADT7载体，得到重组质粒AD-FPA。

将上述质粒分别按照图5B的组合方式导入酵母Gold菌株中，如果在DDO培养基上生长，则说明诱饵和猎物的质粒都转入酵母菌中，转化成功的酵母菌如果能在TDO/x-a-gal培养基上生长，则说明诱饵和猎物的目的蛋白相互作用。

结果如图5B所示，可以看出，FPA和FPAL蛋白彼此互作，同时FPA和FPAL蛋白也能与自身蛋白互作。

3、双分子荧光互补实验

pUC-SPYNE中具有N-YFP蛋白的编码序列，pUC-SPYCE中具有C-YFP蛋白的编码序列。N-YFP蛋白和C-YFP蛋白组成完成的YFP蛋白，产生YFP荧光。

将编码FPA成熟蛋白的CDS(序列2第181-1002)插入pUC-SPYNE，得到重组质粒E。重组质粒E表达FPA成熟蛋白与N-YFP蛋白的融合蛋白(N-YFP蛋白位于C端)，用FPA-YFP^N表示。

将编码FPA成熟蛋白的CDS(序列2第181-1002)插入pUC-SPYCE，得到重组质粒F。重组质粒F表达FPA蛋白与C-YFP蛋白的融合蛋白(C-YFP蛋白位于C端)，用FPA-YFP^C表示。

将编码FPAL成熟蛋白的CDS(序列5第145-909位)插入pUC-SPYNE，得到重组质粒G。重组质粒G表达FPAL蛋白与N-YFP蛋白的融合蛋白(N-YFP蛋白位于C端)，用FPAL-YFP^N表示。

将编码FPAL成熟蛋白的CDS(序列5第145-909位)插入pUC-SPYCE，得到重组质粒H。重组质粒H表达FPAL成熟蛋白与C-YFP蛋白的融合蛋白(C-YFP蛋白位于C端)，用FPAL-YFP^C表示。

将重组质粒E和重组质粒H共同导入哥伦比亚生态型拟南芥原生质体，16小时后采用激光共聚焦扫描显微镜(LSM 510 490meta；Zeiss)捕获YFP荧光。将重组质粒F和重组质粒G共同导入哥伦比亚生态型拟南芥原生质体，16小时后采用激光共聚焦扫描显微镜(LSM510 490meta；Zeiss)捕获YFP荧光。

瞬时转化FPA-YFP^N/YFP^C,FPAL-YFP^N/YFP^C空载体作为阴性对照。

结果如图5C所示，YFP荧光在FPA-FPAL中可以观察到，说明FPA蛋白和FPAL蛋白互作。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院植物研究所

<120> FPA和FPAL在调控植物叶绿体发育中的应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2482

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acagtaacga gatcgacaag gaaaaaaaat gtacgaaaat aatctcttaa cgctctcttc 60

atgcaccatg aatctcaatt tcgctttctc cccattcctt gtctctcaga gacaaccatt 120

ctcttcccac aagcgtaatc ttcacactct cgttgctgtt tctgctaatt ccgacaacct 180

cgccggtgaa gataacggcg gaatttcggc ggcaaataaa ggttctggga ctacagcgag 240

aggaaggaga ttactcaagg ttagagaaga gaagcgaaaa cgcgactacg atcgtcttca 300

cgattaccca tcttgggcca agtacttgtt tctttccttt tcttttgcac tccaggtgtt 360

tgtgtttttg cctaagtcac gagaaagtgt gaaccttttt ttggtgaatg ataaatgcag 420

ggtactggaa agtgcgtgta aagatgatga agagcttcga gctgttcttg gtgatagcat 480

aggaaatcct gagctcatga gaaagaaggt aatcgttggg tcgaattcac taaaaagaat 540

tctcgtctct gttatagttt ctttggtagt gactatttgg catgcgctgg ggcatttata 600

tgtgttgttt ctatcgattg tgaagtttgg acatgtgtat gtttactaat tattcaggtt 660

gaagaaagag ttaggaagaa gggaaaagat ttccagaaac agaagactgg ttctgtgctt 720

tctttcaaag ttaacttcag agagtgagaa actttttttc catcttgtcc attaattcac 780

tttggtttct gcattccgca acataatata agactactag aataatatcc cattccataa 840

attactaacc aagtactctt attttgatga ctgcagtttc aatcctgtag attccttcat 900

atggtttgag ctctatggaa cgccttcaga tcgagatgtt gatctcattg gaagtgtaag 960

aaattgatat tcttcttgct attgcaaaac gtcgagtctt actgcgatga ttcaatgatt 1020

cttccaattc tttcttttga ccacgagttt tgttaacagg ttatacaggc atggtatgtt 1080

atggggcgat tgggcgcttt caatacatcc aacttgcagg tttgttcatc atcccttctg 1140

tttcctagtt gctaatcatg tttttcttcc catttccatg gtcatcttca ttctcgtctt 1200

aacggtatca tctaaactat gattgcagct agcaaacaca tccctagaat atgatcctct 1260

ctatgacgca gagaagggct tcaaagtgat gccttcatcg tttcatgaca ttagcgatgt 1320

cgaatttcaa gacaactggg gtcgtgtgtg gtaaacaact gttctgacat ctttatgatg 1380

caaactattt ccttcaaaat cttgtaatta gtctgaactt cacttgcact gtttcttgta 1440

gggttgatct tggtacttcc gatatcttcg cccttgatgt gcttctcaac tgtttgacag 1500

ttatgagttc agagtaagta acacaagaga acttgtagtt cccttttatc ctctttgatt 1560

gattgcttct ttgttgcaga aaactttaat ttttgtttat ataaaatttc aggtacttgg 1620

gcattcaaca agtagtattt ggtggtaaac gaatgggaga ttgggaagag ggaatgacaa 1680

atcctgattt tgggtataag tacttcaaga tctgaatctt ctacaaaaca gttttgttaa 1740

atataggctt cttttttgtg ctcttaagaa caaatagcta aacagtgtgg aagaaatgat 1800

aacctagatc aatacaacaa ccgaaatggc tctttacaca ccaagttagc ttgaaacgag 1860

agacagtacc gtatccatac gcaaggcaaa ggttacggac ccgagcagtg gccatacgca 1920

atacgcgagg gttagttagt cttccataga ctctattggt tagcttggta gagttaggct 1980

ttagtactgt taaactccac attggaacca aatccacatc caaaaagtat cacgatgaaa 2040

cttcttgaaa tgttaagttg agttcatgga gagtcttggc caccaaattt cctcttctac 2100

atatccataa agagatatat atatatatat aagacataag ataatagact tcaaaaaaag 2160

agagaagata accatctaac tcttcattgt ccagtagatg aaatttaccc accttgctaa 2220

agagggaagg caagccttga ttttctcgaa ctcgacaaag caacaactgt accgctccat 2280

cctgaatagc aaaaatcata tttgacttgc caaagagagt aaattgcaat cgaaaacgac 2340

aatgaatggt gagattgaag ctcggaccaa cctttgctca gcctcaatat ctacaccaac 2400

agatgaggga gcggaaagcg acgagtaaat ttgtgaccca tacattctta ccagcttaag 2460

cagcaaatca aggcagacac tc 2482

<210> 2

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtacgaaa ataatctctt aacgctctct tcatgcacca tgaatctcaa tttcgctttc 60

tccccattcc ttgtctctca gagacaacca ttctcttccc acaagcgtaa tcttcacact 120

ctcgttgctg tttctgctaa ttccgacaac ctcgccggtg aagataacgg cggaatttcg 180

gcggcaaata aaggttctgg gactacagcg agaggaagga gattactcaa ggttagagaa 240

gagaagcgaa aacgcgacta cgatcgtctt cacgattacc catcttgggc caagtacttg 300

tttctttcct tttcttttgc actccaggtg tttgtgtttt tgcctaagtc acgagaaagt 360

gtgaaccttt ttttggtgaa tgataaatgc agggtactgg aaagtgcgtg taaagatgat 420

gaagagcttc gagctgttct tggtgatagc ataggaaatc ctgagctcat gagaaagaag 480

gttgaagaaa gagttaggaa gaagggaaaa gatttccaga aacagaagac tggttctgtg 540

ctttctttca aagttaactt cagagatttc aatcctgtag attccttcat atggtttgag 600

ctctatggaa cgccttcaga tcgagatgtt gatctcattg gaagtgttat acaggcatgg 660

tatgttatgg ggcgattggg cgctttcaat acatccaact tgcagctagc aaacacatcc 720

ctagaatatg atcctctcta tgacgcagag aagggcttca aagtgatgcc ttcatcgttt 780

catgacatta gcgatgtcga atttcaagac aactggggtc gtgtgtgggt tgatcttggt 840

acttccgata tcttcgccct tgatgtgctt ctcaactgtt tgacagttat gagttcagag 900

tacttgggca ttcaacaagt agtatttggt ggtaaacgaa tgggagattg ggaagaggga 960

atgacaaatc ctgattttgg gtataagtac ttcaagatct ga 1002

<210> 3

<211> 333

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Tyr Glu Asn Asn Leu Leu Thr Leu Ser Ser Cys Thr Met Asn Leu

1 5 10 15

Asn Phe Ala Phe Ser Pro Phe Leu Val Ser Gln Arg Gln Pro Phe Ser

20 25 30

Ser His Lys Arg Asn Leu His Thr Leu Val Ala Val Ser Ala Asn Ser

35 40 45

Asp Asn Leu Ala Gly Glu Asp Asn Gly Gly Ile Ser Ala Ala Asn Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Thr Ala Arg Gly Arg Arg Leu Leu Lys Val Arg Glu

65 70 75 80

Glu Lys Arg Lys Arg Asp Tyr Asp Arg Leu His Asp Tyr Pro Ser Trp

85 90 95

Ala Lys Tyr Leu Phe Leu Ser Phe Ser Phe Ala Leu Gln Val Phe Val

100 105 110

Phe Leu Pro Lys Ser Arg Glu Ser Val Asn Leu Phe Leu Val Asn Asp

115 120 125

Lys Cys Arg Val Leu Glu Ser Ala Cys Lys Asp Asp Glu Glu Leu Arg

130 135 140

Ala Val Leu Gly Asp Ser Ile Gly Asn Pro Glu Leu Met Arg Lys Lys

145 150 155 160

Val Glu Glu Arg Val Arg Lys Lys Gly Lys Asp Phe Gln Lys Gln Lys

165 170 175

Thr Gly Ser Val Leu Ser Phe Lys Val Asn Phe Arg Asp Phe Asn Pro

180 185 190

Val Asp Ser Phe Ile Trp Phe Glu Leu Tyr Gly Thr Pro Ser Asp Arg

195 200 205

Asp Val Asp Leu Ile Gly Ser Val Ile Gln Ala Trp Tyr Val Met Gly

210 215 220

Arg Leu Gly Ala Phe Asn Thr Ser Asn Leu Gln Leu Ala Asn Thr Ser

225 230 235 240

Leu Glu Tyr Asp Pro Leu Tyr Asp Ala Glu Lys Gly Phe Lys Val Met

245 250 255

Pro Ser Ser Phe His Asp Ile Ser Asp Val Glu Phe Gln Asp Asn Trp

260 265 270

Gly Arg Val Trp Val Asp Leu Gly Thr Ser Asp Ile Phe Ala Leu Asp

275 280 285

Val Leu Leu Asn Cys Leu Thr Val Met Ser Ser Glu Tyr Leu Gly Ile

290 295 300

Gln Gln Val Val Phe Gly Gly Lys Arg Met Gly Asp Trp Glu Glu Gly

305 310 315 320

Met Thr Asn Pro Asp Phe Gly Tyr Lys Tyr Phe Lys Ile

325 330

<210> 4

<211> 2001

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caaaaaccca ttagcttctt cagtcttctc taaaatactt gcaagcaaca gagtcagagg 60

ttaagtaaga agaagaaaaa ataatgctaa ggtttcaatg ttttcttcac cttcttcagc 120

cttctatggc gaagaacaac agcaaccact cgaatatttg tttacacaat ttggcgccgt 180

ttcgggtcac cgacacgatt cctgtacaga agatccagga gttacgtgcg aatcggtcga 240

gggagagtgg aaagttgcga gtaaatggaa taggtagaga aatggaagaa ggtgtggaag 300

aattcgaaga agtagatgat ggagatgatg atgaggtaga agatgagttc tcggcgaaga 360

agagaggcgt ttacagagcg aagaaagaga agattgatta cgataaagac cctgagtttg 420

cggatattct tggagattgt ttagataacc cagataaagc tcaaaagaag gtgaagtttt 480

aaactttgat ctttggatct taccatttcg atcgagaagc tgttgttgag ctgatgtatt 540

gacaaagtaa cgtttattga gctgaaattt ttgagtagct tttgattttg attgttattt 600

tgaaatgggt tgtttatcaa tgaactcttt ttagatggaa gagagattga ggaagaagag 660

gaacaaaatt cttcatacta agactggttc tgcaacttcg atgccagtga cgtttaacaa 720

gtgagtgatc ctatgttgct tttgaagtta tatgtgattc tcttggttga ttttgcttgc 780

tcatttgatc tgcttgttca gtagttgttg atgttcagtg ccttgttctt ctcattgttt 840

attaaactct tggttttgtt gttctgtaag atttgagtat tcgaattcat acatgtggtt 900

ggagttttac aacacaccgc tggacaaaga catagccttg atctctgatg tgagtcctca 960

aactgaatct ttgcattcct atactaatct gaggagatag ggaaaatctt aacaaatcac 1020

tcactgtttt gttttgatgg ctaaaatctt gcagacaatc cggtcctggc atatccttgg 1080

acgacttggt ggatacaact ccatgaatat gcaagtatgt ctatgattga gaaagtgaaa 1140

gcatttatct attcggtttc cttttgtttt ctcgcattat aagcattaag ctgttttttt 1200

atcttttgct cgtatggtgc agttatcaca agcaccactg gataagaggc caaactatga 1260

tgccatactt ggagctaatg tcgagcccac cacgttttat aacatcgggg atcttgaggt 1320

tcaagacaat gtcgctcgaa tatggtgata actctcacta caccctaaaa acattttttg 1380

caagtcttgt tgttactcat cacataaatg atggttttga caggctcgat attgggacct 1440

cggagccgtt gattctcgat gttctgataa acgcattgac acaaatcagc tcagagtgag 1500

ttcaattctc tccttctctc tgtatgttta ttaactgaat taagcttttg agatggacat 1560

gtttgaaatg tgtgtaagct ctaacgtggt atttgttttg gttgtttcta gttatgtcgg 1620

gataaagaaa gttgtgtttg gtggatctga gttcgagagc tggaaggaga atatgacatc 1680

cgaggaatct ggtttcagag tccacaagat ttaacatctt atacacacac ccattagatt 1740

acagctgttt cagaggccac aagagttcac atatgtgttt atttagattt gcactgtgat 1800

atattatgga aaattagaat cacatcttca tgttcaatta catctttgta gcactagcgc 1860

aattacaagt attgagaaat cagagcagag tgatattatg ggaaattaga atcatatttt 1920

ctcgttcagt taatctttgt agcacttgcg caatgacaag tattgagaag tgagagcagg 1980

cagccaagaa tagatctttt t 2001

<210> 5

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgctaaggt ttcaatgttt tcttcacctt cttcagcctt ctatggcgaa gaacaacagc 60

aaccactcga atatttgttt acacaatttg gcgccgtttc gggtcaccga cacgattcct 120

gtacagaaga tccaggagtt acgtgcgaat cggtcgaggg agagtggaaa gttgcgagta 180

aatggaatag gtagagaaat ggaagaaggt gtggaagaat tcgaagaagt agatgatgga 240

gatgatgatg aggtagaaga tgagttctcg gcgaagaaga gaggcgttta cagagcgaag 300

aaagagaaga ttgattacga taaagaccct gagtttgcgg atattcttgg agattgttta 360

gataacccag ataaagctca aaagaagatg gaagagagat tgaggaagaa gaggaacaaa 420

attcttcata ctaagactgg ttctgcaact tcgatgccag tgacgtttaa caaatttgag 480

tattcgaatt catacatgtg gttggagttt tacaacacac cgctggacaa agacatagcc 540

ttgatctctg atacaatccg gtcctggcat atccttggac gacttggtgg atacaactcc 600

atgaatatgc aattatcaca agcaccactg gataagaggc caaactatga tgccatactt 660

ggagctaatg tcgagcccac cacgttttat aacatcgggg atcttgaggt tcaagacaat 720

gtcgctcgaa tatggctcga tattgggacc tcggagccgt tgattctcga tgttctgata 780

aacgcattga cacaaatcag ctcagattat gtcgggataa agaaagttgt gtttggtgga 840

tctgagttcg agagctggaa ggagaatatg acatccgagg aatctggttt cagagtccac 900

aagatttaa 909

<210> 6

<211> 302

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Leu Arg Phe Gln Cys Phe Leu His Leu Leu Gln Pro Ser Met Ala

1 5 10 15

Lys Asn Asn Ser Asn His Ser Asn Ile Cys Leu His Asn Leu Ala Pro

20 25 30

Phe Arg Val Thr Asp Thr Ile Pro Val Gln Lys Ile Gln Glu Leu Arg

35 40 45

Ala Asn Arg Ser Arg Glu Ser Gly Lys Leu Arg Val Asn Gly Ile Gly

50 55 60

Arg Glu Met Glu Glu Gly Val Glu Glu Phe Glu Glu Val Asp Asp Gly

65 70 75 80

Asp Asp Asp Glu Val Glu Asp Glu Phe Ser Ala Lys Lys Arg Gly Val

85 90 95

Tyr Arg Ala Lys Lys Glu Lys Ile Asp Tyr Asp Lys Asp Pro Glu Phe

100 105 110

Ala Asp Ile Leu Gly Asp Cys Leu Asp Asn Pro Asp Lys Ala Gln Lys

115 120 125

Lys Met Glu Glu Arg Leu Arg Lys Lys Arg Asn Lys Ile Leu His Thr

130 135 140

Lys Thr Gly Ser Ala Thr Ser Met Pro Val Thr Phe Asn Lys Phe Glu

145 150 155 160

Tyr Ser Asn Ser Tyr Met Trp Leu Glu Phe Tyr Asn Thr Pro Leu Asp

165 170 175

Lys Asp Ile Ala Leu Ile Ser Asp Thr Ile Arg Ser Trp His Ile Leu

180 185 190

Gly Arg Leu Gly Gly Tyr Asn Ser Met Asn Met Gln Leu Ser Gln Ala

195 200 205

Pro Leu Asp Lys Arg Pro Asn Tyr Asp Ala Ile Leu Gly Ala Asn Val

210 215 220

Glu Pro Thr Thr Phe Tyr Asn Ile Gly Asp Leu Glu Val Gln Asp Asn

225 230 235 240

Val Ala Arg Ile Trp Leu Asp Ile Gly Thr Ser Glu Pro Leu Ile Leu

245 250 255

Asp Val Leu Ile Asn Ala Leu Thr Gln Ile Ser Ser Asp Tyr Val Gly

260 265 270

Ile Lys Lys Val Val Phe Gly Gly Ser Glu Phe Glu Ser Trp Lys Glu

275 280 285

Asn Met Thr Ser Glu Glu Ser Gly Phe Arg Val His Lys Ile

290 295 300

Claims (11)

1.如下1)-3)中任一种物质在如下a-c中至少一种中的应用：

1)蛋白FPA和/或FPAL；

2)编码蛋白FPA和/或FPAL的DNA分子；

3)含有编码蛋白FPA和/或FPAL的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述蛋白FPA为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述蛋白FPAL为由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

a)调控植物叶绿体发育；

b)使植物白化苗变为绿色苗；

c)调控植物叶绿体基因的表达。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述编码蛋白FPA的DNA分子是如下1)或2)的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；

所述编码蛋白FPAL的DNA分子是如下3)或4)的DNA分子：

3)编码区为序列表中序列4所示的DNA分子；

4)编码区为序列表中序列5所示的DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述调控植物叶绿体发育为促进植物叶绿体发育；

或所述调控植物叶绿体基因的表达为提高植物PEP依赖型基因的表达或降低NEP依赖型基因或降低NEP与PEP共同负责转录的基因。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述促进植物叶绿体发育为使植物叶绿体类囊体膜形成跺叠结构、使植物叶绿体类囊体膜结构完整和/或使植物叶绿体类囊体膜结构连续。

5.权利要求1-4任一项中的如下1)-3)中任一种物质在改善植物叶绿体发育中的应用。

6.权利要求1-4任一项中的如下1)-3)中任一种物质在培育植物PEP依赖基因的高表达的植物中的应用。

7.权利要求1-4任一项中的如下1)-3)中任一种物质在培育由白化苗恢复为绿色苗植物中的应用。

8.根据权利要求5-7任一所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

9.一种获得由白化苗恢复为绿色苗的转基因植物的方法，包括如下步骤：提高白化苗目的植物中蛋白FPA或FPAL的含量和/或活性，得到恢复为绿色苗的转基因植物；

所述蛋白FPA为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述蛋白FPAL为由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

10.一种获得由白化苗恢复为绿色苗的转基因植物的方法，包括如下步骤：提高白化苗目的植物中蛋白FPA或FPAL编码基因的表达量和/或活性，得到恢复为绿色苗的转基因植物；

所述蛋白FPA为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述蛋白FPAL为由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

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