CN102409062B - 一种改变植物中叶绿素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改变植物中叶绿素含量的方法。该方法包括如下步骤：使出发植物中的FHY3蛋白的编码基因功能丧失，得到目的植物；所述目的植物的叶绿素含量低于所述出发植物和/或所述目的植物的光系统II光化学效率低于所述出发植物。本发明通过RNAi抑制FHY3基因，获得转基因植株。转基因植株表现为叶片叶绿素含量下降，造成叶色变淡，光合作用的光化学效率降低。本发明方法在植物的遗传育种领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种改变植物中叶绿素含量的方法。
背景技术
光合作用是地球上最大规模利用太阳能的过程，它为几乎所有的生命活动提供有机物、能量和氧气。每年地球上通过光合作用合成的有机物约为2200亿吨，相当于人类每年所需能耗的10倍。植物干物质的90％-95％来自光合作用的产物，光合作用是作物产量形成的物质基础。光合作用主要在植物叶片的叶绿体中进行，需要一系列的色素和蛋白复合体的参与。叶绿素是吸收光能的主要色素，叶绿素的减少或缺失将使叶片颜色变浅，直接影响光合作用的效率和功能。随着植物分子生物学和生物化学的发展，人们分离克隆了催化叶绿素合成的各种酶及其基因。然而，叶绿素的合成受到体内和环境因子的调节，这种调节作用又是受核基因和(或)质体基因的控制，因此，叶绿素的合成和降解存在复杂的调控网络。分离和克隆关键或重要的调控因子，对揭示叶绿素的代谢，通过人工改造提高光能利用效率具有重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种降低植物中叶绿素含量的方法。
本发明所提供的降低植物中叶绿素含量的方法，包括如下步骤：使出发植物中的FHY3蛋白的编码基因功能丧失，得到目的植物；所述目的植物的叶绿素含量低于所述出发植物和/或所述目的植物的光系统II光化学效率低于所述出发植物。
上述方法中，所述FHY3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
上述方法中，所述FHY3蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)所示：
1)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述FHY3蛋白的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述FHY3蛋白的DNA分子。
上述方法中，所述使出发植物中的FHY3蛋白的编码基因功能丧失是通过向所述出发植物中导入干扰载体实现的；所述干扰载体为向载体pART27的NotI和NotI酶切位点间插入如下DNA片段得到的：由CaMV35S启动子、FHY3正向片段、内含子、FHY3反向片段和OCS终止子依次连接而成的DNA片段；
所述FHY3正向片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述FHY3反向片段的核苷酸序列是所述FHY3正向片段的反向互补序列；所述内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
所述CaMV35S启动子的核苷酸序列为GenBank AJ311873所示的核苷酸序列中第3104-4449位核苷酸所示；所述OCS终止子的核苷酸序列为GenBank AJ311873所示的核苷酸序列中第4493-5234位核苷酸所示。
上述方法中，所述干扰载体按照包括如下步骤的方法制备得到：
以拟南芥的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增片段；
用BamHI和ClaI酶切所述PCR扩增片段，回收酶切产物，记作产物I；用BamHI和ClaI酶切载体pKANNIBAL，回收载体大片段，记作产物II；将产物I和产物II进行连接，得到重组载体，记作中间重组载体I；
用XhoI和KpnI酶切所述PCR扩增片段，回收酶切产物，记作产物III；用XhoI和KpnI所述中间重组载体I，回收载体大片段，记作产物IV；将产物III和产物IV进行连接，得到重组载体，记作中间重组载体II；
用NotI酶切所述中间重组载体II，回收小片段，记作产物V；用NotI酶切载体pART27，回收载体大片段，记作产物VI；将产物V和产物VI进行连接，得到重组载体，即为所述干扰载体。
上述方法中，所述叶绿素含量为叶片中的叶绿素含量；所述光系统II光化学效率为叶片的光系统II光化学效率；
上述方法中，所述叶绿素为叶绿素a和/或叶绿素b；
上述方法中，所述出发植物为拟南芥。
本发明的另一个目的是提供一种蛋白。
本发明所提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：
a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与叶绿素合成相关的由a)衍生的蛋白质。
上述任一所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示：
1)其核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围；所述引物对中的一条引物序列如SEQ ID NO：3所示，所述引物对中的另一条引物序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明通过RNAi抑制FHY3基因，获得转基因植株。转基因植株表现为叶片叶绿素含量下降，造成叶色变淡，光合作用的光化学效率降低。本发明方法在植物的遗传育种领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为干扰植物和野生型植物的表型。
图2为干扰植株的鉴定。
图3为干扰载体的鉴定。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
拟南芥中FHY3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。其编码的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例1、改变植物中叶绿素含量的方法
一、干扰载体的构建及验证
载体pKANNIBAL在文献(Chris Helliwell and Peter Waterhouse，Methods，2003，30：289-295)中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。
双元载体pART27在文献(Andrew P Gleave，Plant Molecular Biology，1992，20：1203-1207)中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。
农杆菌GV3101菌株在文献(Steven J Clough and Andrew F Bent，Plant Journal，1998，16：735-743)中公开过，公众可从中国科学院植物研究所获得。
植物反义抑制载体构建过程中PCR扩增片段也可按照如下方法得到：人工合成SEQ ID NO：5所示DNA片段，作为模板，用引物P1(5’-CTAGGATCCCTCGAGATGGATATAGATCTTCGACTAC-3’)(SEQ ID NO：3)和P2(5’-GTAGGTACCATCGATACCAGCCATATTCTCTGGATC-3’)(SEQ ID NO：4)进行PCR扩增，得到PCR扩增片段。
植物反义抑制载体构建：在FHY3基因的开放读码框区设计引物P1(5’-CTAGGATCCCTCGAGATGGATATAGATCTTCGACTAC-3’)(SEQ ID NO：3)和P2(5’-GTAGGTACCATCGATACCAGCCATATTCTCTGGATC-3’)(SEQ ID NO：4)，引物上包含了用于克隆的酶切位点。通过PCR从野生型拟南芥(NO生态型)DNA扩增目的片段，PCR反应程序为：94℃3分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃1分钟，30个循环；最后72℃延伸10分钟。克隆分3步进行：第一步，PCR产物分离纯化后，用BamHI和ClaI酶切，载体pKANNIBAL也用BamHI和ClaI酶切，回收纯化后连接并转化大肠杆菌DH5α菌株，用LB+Kan培养基筛选阳性克隆，并通过PCR和酶切鉴定，得到中间载体A。第二步，PCR扩增产物用XhoI和KpnI酶切，中间载体A用XhoI和KpnI酶切，两者回收纯化后连接并转化DH5α，用LB+Kan培养基筛选阳性克隆，并通过PCR和酶切鉴定，得到中间载体B。第三步，中间载体B和双元载体pART27均用NotI酶切，回收纯化后连接并转化DH5α，用LB+Spec培养基筛选阳性克隆，得到最后目的载体pFHY3-RNAi。将pFHY3-RNAi进行PCR鉴定和酶切鉴定，PCR鉴定所用的引物为P1和P2，结果如图3A所示，获得目的片段；酶切鉴定结果如图3B所示，大片段为载体，小片段为插入的序列。(图3A中，泳道1为marker，泳道2为PCR扩增产物；图3B中，泳道1为marker，泳道2为空载体对照酶切；泳道3为目的载体酶切)。
双元载体pART27中的NotI和NotI酶切位点间插入了如下序列：CaMV35S启动子-FHY3(1-444bp)正向序列-内含子(742bp)-FHY3(1-444bp)反向序列-OCS终止子。FHY3(1-444bp)正向序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，内含子(742bp)的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；FHY3(1-444bp)反向序列是FHY3(1-444bp)正向序列的反向互补序列。
CaMV35S启动子的核苷酸序列是GenBank AJ311873所示的核苷酸序列中第3104-4449位核苷酸；OCS终止子的核苷酸序列是GenBank AJ311873所示的核苷酸序列中第4493-5234位核苷酸。
二、干扰植物的构建及验证
植物转化：将植物双元载体pFHY3-RNAi用电击法转入农杆菌GV3101菌株，在LB+Spec+Gent抗性培养基上筛选阳性克隆。用花浸泡法转化拟南芥NO野生型植株。
转基因植物的筛选与鉴定：农杆菌转化后获得T1代种子，在MS+卡那霉素50mg/L培养基上生长7至10天，筛选抗性植株，并转到培养土中生长。经自交结实后收T2代种子，种子在卡那霉素50mg/L培养基上萌发，观察抗性和敏感植株的比例，符合3：1比例，表明外源基因以单拷贝整合到基因组中。再经自交结实获得T3代种子，获得T3代种子，在MS+卡那霉素50mg/L培养基上筛选100％抗性植株，表明纯合体。
纯合体和野生对照在光下生长7天，提取总RNA，并反转录成cDNA，再用引物P1和P2PCR扩增，经凝胶电泳比较目的带的亮度。以看家基因Actin作为对照。RT-PCR实验表明与野生型相比，该纯合体中没有检测到内源FHY3基因表达，说明FHY3基因被反义抑制，纯合体中的内源FHY3基因不表达(图2，WT表示野生型，RNAi表示干扰植株)，表明外源RNAi使内源FHY3基因发生了沉默，抑制其表达。
以未经任何处理的野生型拟南芥为野生型对照。
三、干扰植物的功能
下述实验中均以野生型拟南芥(NO生态型)为野生型对照。
(一)叶片颜色
将T3代纯合体在长日照(16小时光照/8小时黑暗)条件下生长4周，观察植株的叶片颜色。转基因植株的叶片颜色明显比野生型对照浅(图1，A表示野生型，B表示干扰植株)。
(二)叶绿素含量检测
用80％丙酮提取法提取叶片叶绿素，在波长663nm和645nm测定吸收，计算叶绿素含量。
叶绿素a含量计算公式为12.7×A663-2.69×A645。
叶绿素b含量计算公式为22.9×A645-4.48×A663。
实验设3次重复，结果取平均值±标准差。
结果：干扰植株中，叶绿素a含量为252.7±36.2(ng/mg FW)，叶绿素b含量为107.6±8.7(ng/mg FW)；野生型对照中，叶绿素a含量为425.5±62.4(ng/mg FW)，叶绿素b含量为168.5±16.1(ng/mg FW)。干扰植株的叶绿素a和叶绿素b含量均比野生型对照低，说明干扰基因FHY3的表达，降低了叶绿素a和叶绿素b含量。
(三)用PAM-2000(德国Walz公司)测定叶片的光系统II光化学效率Fv/Fm比值。
实验设3次重复，结果取平均值±标准差。
结果：干扰植株中，Fv/Fm比值为0.62±0.06；野生型对照中，Fv/Fm比值为0.81±0.04。干扰植株中Fv/Fm比值比野生型对照中低，说明基因FHY3被干扰后，植株光化学效率下降。
Claims (6)
1.一种降低植物中叶绿素含量的方法，包括如下步骤：使出发植物中的FHY3蛋白的编码基因功能丧失，得到目的植物；所述目的植物的叶绿素含量低于所述出发植物和/或所述目的植物的光系统II光化学效率低于所述出发植物；
所述叶绿素含量为叶片中的叶绿素含量；所述出发植物为拟南芥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述FHY3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述FHY3蛋白的编码基因为核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示DNA分子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述使出发植物中的FHY3蛋白的编码基因功能丧失是通过向所述出发植物中导入干扰载体实现的；所述干扰载体为向载体pART27的NotI和NotI酶切位点间插入如下DNA片段得到的：由CaMV35S启动子、FHY3正向片段、内含子、FHY3反向片段和OCS终止子依次连接而成的DNA片段；
所述FHY3正向片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述FHY3反向片段的核苷酸序列是所述FHY3正向片段的反向互补序列；所述内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述CaMV35S启动子的核苷酸序列为GenBank AJ311873所示的核苷酸序列中第3104-4449位核苷酸所示；所述OCS终止子的核苷酸序列为GenBank AJ311873所示的核苷酸序列中第4493-5234位核苷酸所示。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述干扰载体按照包括如下步骤的方法制备得到：
以拟南芥的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增片段；
用BamHI和ClaI酶切所述PCR扩增片段，回收酶切产物，记作产物I；用BamHI和ClaI酶切载体pKANNIBAL，回收载体大片段，记作产物II；将产物I和产物II进行连接，得到重组载体，记作中间重组载体I；
用XhoI和KpnI酶切所述PCR扩增片段，回收酶切产物，记作产物III；用XhoI和KpnI所述中间重组载体I，回收载体大片段，记作产物IV；将产物III和产物IV进行连接，得到重组载体，记作中间重组载体II；
用NotI酶切所述中间重组载体II，回收小片段，记作产物V；用NotI酶切载体pART27，回收载体大片段，记作产物VI；将产物V和产物VI进行连接，得到重组载体，即为所述干扰载体。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述光系统II光化学效率为叶片的光系统II光化学效率；所述叶绿素为叶绿素a和/或叶绿素b。
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