CN103408647B - 植物滞绿相关蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物滞绿相关蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质是如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物滞绿相关的由序列1衍生的蛋白质；（c）由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（d）将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物滞绿相关的由序列4衍生的蛋白质。本发明对于植物育种具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物滞绿相关蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
正常绿色植物在衰老时细胞结构、代谢、基因表达等会发生一系列的变化，导致叶绿素降解，叶片逐渐变黄，进而光合作用能力下降，光合产物的形成量也随之降低，生物量增加变得缓慢直至完全停止。滞绿(stay green)是指植物在衰老过程中叶绿素不降解或降解不明显的现象，其最明显的特征是植株生长末期叶片保持绿色的时间较长，甚至完全不黄化。
由于滞绿突变体在衰老期叶片仍保持着一定量的光合作用，其生物产量有明显提高。研究表明，玉米滞绿型品种在子粒灌浆期比早衰品种多生产24％的干物质，同时多吸收30％的氮素。另外，功能型滞绿减缓或阻止了茎、叶中叶绿素的降解，致使滞绿型品种在成熟后茎、叶中的叶绿素含量始终保持原水平而不减少，同时也保持了光合作用，从而使其茎秆在抗逆能力，如抗干旱、抗病性、抗倒伏等方面具有很强的优势。因此，滞绿调控基因的研究对于作物高产育种研究具有重要意义，是加速高产新品种培育的重要研究内容。
大豆原产我国，已经有5000年的栽培历史，是重要的经济粮食作物。但我国大豆生产远远不能满足我国大豆消费需求。大豆滞绿调控基因的研究可在一定程度上为大豆高产育种奠定理论基础，促进形成具有国际竞争能力的转基因高产大豆产业，确保国家粮食安全。因此，D1和D2基因的克隆和功能研究对大豆生产具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供植物滞绿相关蛋白及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，获自大豆属大豆（Glycine max L.），是如下（a）或（b）或（c）或（d）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物滞绿相关的由序列1衍生的蛋白质；
（c）由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（d）将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物滞绿相关的由序列4衍生的蛋白质。
为了使（a）或（b）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1或序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6（通常为5个） | RRRRR |
| Poly-His | 2-10（通常为6个） | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述（c）或（d）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（c）或（d）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2、序列3、序列5或序列6所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因可为如下（1）或（2）或（3）或（4）或（5）或（6）的DNA分子：
（1）序列表中序列2所示的DNA分子；
（2）序列表中序列3所示的DNA分子；
（3）序列表中序列5所示的DNA分子；
（4）序列表中序列6所示的DNA分子；
（5）在严格条件下与（1）或（2）或（3）或（4）限定的DNA序列杂交且编码植物滞绿相关蛋白的DNA分子；
（6）与（1）或（2）或（3）或（4）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物滞绿相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
含有所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组载体具体可为将所述基因插入pFGC5941载体的多克隆位点得到的重组质粒。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到与所述目的植物相比具有不滞绿表型的转基因植物。所述方法中，携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述基因具体可通过所述重组载体导入所述目的植物中。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如拟南芥突变体nyc1-1。
本发明还保护所述蛋白质在调节植物滞绿表型中的应用。所述植物具体可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为拟南芥，如拟南芥突变体nyc1-1。所述双子叶植物具体可为大豆。
本发明还保护引物对甲，由序列表的序列8所示的单链DNA分子和序列表的序列9所示的单链DNA分子组成。
本发明还保护引物组合物乙，由序列表的序列10所示的单链DNA分子、序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成。
本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物对甲和所述引物组合物乙；所述试剂盒的功能为如下（Ⅰ）或（Ⅱ）：（Ⅰ）辅助鉴定待测大豆材料是否为具有滞绿表型的大豆材料；（Ⅱ）辅助筛选具有滞绿表型的大豆材料。
本发明还保护所述引物对甲和所述引物组合物乙的应用，为如下（Ⅰ）或（Ⅱ）：（Ⅰ）辅助鉴定待测大豆材料是否为具有滞绿表型的大豆材料；（Ⅱ）辅助筛选具有滞绿表型的大豆材料。
本发明对于植物育种具有重大价值。
附图说明
图1为野生型、d1突变体和d1d2突变体的表型分析的结果。
图2为实施例3中PCR扩增产物的电泳图。
图3为实施例3中表性分析中的照片。
图4为实施例4中PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
野生型即大豆属大豆（Glycine max L.）Accession#PI548384，用WT表示，d1突变体和d1d2突变体为以野生型为出发植株得到的突变体。
pFGC5941载体：参考文献：Mcginnis et al.(2005)Transgene-Induced RNAInterference as a Tool for Plant Functional Genomics.Methods in Enzymology392:1–24。
拟南芥突变体nyc1-1（在文献中被称为“nye1-1mutant”）：参考文献：Ren,G.,et al.(2007)."Identification of a novel chloroplast protein AtNYE1regulatingchlorophyll degradation during leaf senescence in Arabidopsis."Plant Physiol144(3):1429-1441.；文献中提及本生物材料的具体描述如下：To explore theregulatory mechanism of Chl degradation during leaf senescence,a nonyellowingmutant was identified from the M2population of fast-neutron mutagenizedArabidopsis(Columbia-0[Col-0]).It was subsequently backcrossed with Col-0four times and designated as nye1-1(nonyellowing).The nye1-1mutant exhibiteda stable nonyellowing phenotype during both natural and dark-inducedsenescence of leaves either attached,detached,or in planta(Figs.1,A–D,and2A).。
农杆菌菌株GV3101：Berrs et.al1992Transformation of vitis tissue bydifferent strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T-6b geneantPlant Cell Reports，11:192-195。
实施例1、野生型、d1突变体和d1d2突变体的表型分析
1、野生型、d1突变体和d1d2突变体成熟种子和黑暗处理叶片的表型比较
野生型和d1突变体的种子在成熟后变为黄色，而d1d2突变体的种子在成熟后保持绿色（见图1A）。
将植株的第三片真叶黑暗处理。野生型在处理后5天即变成黄色，d1突变体也轻微转黄，而d1d2突变体保持绿色。处理后15天叶片已经接近死亡，野生型完全变成黄色，d1突变体大部分变黄，只有极少部分保持绿色，而d1d2突变体保持绿色（见图1A）。
2、野生型、d1突变体和d1d2突变体在生长发育过程中叶绿素含量变化比较
分别在花后5天、15天和45天检测野生型、d1突变体和d1d2突变体第三片真叶的叶绿素含量。叶绿素a和叶绿素b含量在花后15天达到最高，在花后45天降低，在d1突变体和d1d2突变体中下降的程度要低于野生型（见图1B和图1C）。
3、野生型、d1突变体和d1d2突变体在生长发育过程中光合速率变化比较
分别在花后5天、15天、25天和35天检测野生型、d1突变体和d1d2突变体的光合速率。光合速率在花后逐步降低，但在d1突变体和d1d2突变体中下降的程度要低于野生型，尤其d1d2突变体下降速度最慢（见图1D）。
结果表明，D1基因和D2基因是大豆中两个不连锁的核编码基因，单独不产生滞绿表型，但是它们的双突变体会导致成熟组织的滞绿。
实施例2、蛋白及其编码基因的发现
在大量序列分析和功能验证的基础上，从野生型中发现一个蛋白质，将其命名为D1蛋白，如序列表的序列1所示，将编码D1蛋白的基因命名为D1基因，其基因组序列如序列表的序列2所示（包括4个外显子），cDNA序列如序列表的序列3所示。d1突变体与野生型相比，序列3所示的D1基因第182位核苷酸缺失，该缺失导致编码区移码并提前终止。
在大量序列分析和功能验证的基础上，从大豆属大豆（Glycine max L.）Accession#PI548384中发现一个蛋白质，将其命名为D2蛋白，如序列表的序列4所示，将编码D2蛋白的基因命名为D2基因，其基因组序列如序列表的序列5所示（包括4个外显子），cDNA序列如序列表的序列6所示。d1d2突变体与d1突变体相比，序列6所示的D2基因第301-625位核苷酸在原625位和626位核苷酸之间重复一次，引起编码区移码并提前终止。
实施例3、D1蛋白和D2蛋白的功能验证
一、重组质粒的构建
1、合成序列表的序列3所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-TTCTCGAG ATGGGTACTCTAACAACTGTTCCTG-3’；
R1：5’-GGTCTAGA TTATAGACTTTGTTGGGTCTCAATC-3’。
3、用限制性内切酶Xho I和Xba I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Xho I和Xba I双酶切pFGC5941载体，回收约9927bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒甲。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下：在pFGC5941载体的Xho I和Xba I酶切位点之间插入了序列表的序列3所示的双链DNA分子。
6、合成序列表的序列6所示的双链DNA分子。
7、以步骤6合成的双链DNA分子为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F2：5’-TTCTCGAG ATGTGTACTCTCACAACTGTTCCTG-3’；
R2：5’-GGTCTAGA TTATAGATTTTGTTGGGTCCCAATC-3’。
8、用限制性内切酶Xho I和Xba I双酶切步骤7的PCR扩增产物，回收酶切产物。
9、将步骤8的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒乙。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下：在pFGC5941载体的Xho I和Xba I酶切位点之间插入了序列表的序列6所示的双链DNA分子。
二、转基因植物甲的获得
1、将重组质粒甲导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。
2、将步骤1得到的重组农杆菌采用花浸泡法（Clough and Bent(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J16:735-743.）转化侵染拟南芥突变体nyc1-1，收获T1代种子。T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。在含15μg/LBasta的MS培养基上筛选T1代植株并进行T2代的分离比统计，对于某一T1代植株，如果其T2代植株均为筛选阳性的植株，该T1代植株及其后代为一个转基因株系。随机取两个转基因株系（#1株系和#2株系）进行后续鉴定。
三、转基因植物乙的获得
1、将重组质粒乙导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。
2、将步骤1得到的重组农杆菌采用花浸泡法（Clough and Bent(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J16:735-743.）转化侵染拟南芥突变体nyc1-1，收获T1代种子。T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。在15μg/LBasta的MS培养基上筛选T1代植株并进行T2代的分离比统计，对于某一T1代植株，如果其T2代植株均为筛选阳性的植株，该T1代植株及其后代为一个转基因株系，随机取两个转基因株系（#3株系和#4株系）进行后续鉴定。
四、转空载体植株的获得
用pFGC5941载体代替重组质粒甲，其它同步骤二，得到转空载体植株。
五、转基因植物的鉴定
1、基因的表达量鉴定
分别将哥伦比亚生态型拟南芥植株、拟南芥突变体nyc1-1植株，#1株系、#2株系、#3株系和#4株系的T3代植株进行如下鉴定：
（1）取萌发21天后的植株的叶片，提取总RNA并反转录为cDNA。
（2）以步骤（1）提取的cDNA为模板，用F3和R3组成的引物对鉴定D1基因的表达量，用F4和R4组成的引物对鉴定D2基因的表达量，用F5和R5鉴定内参基因（Actin基因的表达量）。
F3：5’-GTCACAATTCTCTTTTTCCCTACTA-3’；
R3：5’-CTTAGAAGAGTTTCTTGCTCACT-3’。
F4：5’-CCACAATTCTCTTTTTCCCTACTGT-3’；
R4：5’-GCCAACCCCTCCTCCTGGA-3’。
F5：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；
R5：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。
以所述cDNA为模板，用各个特异引物对进行PCR扩增得到的PCR扩增产物的电泳图见图2。图2中，泳道1为哥伦比亚生态型拟南芥植株、泳道2为拟南芥突变体nyc1-1植株、泳道3为#1株系、泳道4为#2株系、泳道5为#3株系、泳道6为#4株系。#2株系中D1基因的表达量高于#1株系。#4株系中D1基因的表达量高于#3株系。
2、表型分析
分别将哥伦比亚生态型拟南芥植株、拟南芥突变体nyc1-1植株、#1株系、#2株系、#3株系和#4株系的T3代植株进行如下鉴定：
取萌发21天后的植株的叶片，在黑暗环境中保湿放置4天，分别在黑暗环境放置前和黑暗环境放置后拍照，照片见图3。
图3中，1为哥伦比亚生态型拟南芥植株、2为拟南芥突变体nyc1-1植株、3为#1株系、4为#2株系、5为#3株系、6为#4株系。黑暗处理后4天后，哥伦比亚生态型拟南芥植株的叶片变成黄色，拟南芥突变体nyc1-1植株依然保持绿色，转空载体植株依然保持绿色，而#1株系、#2株系、#3株系和#4株系也开始转为黄色，#2株系的黄色程度高于#1株系，#4株系的黄色程度高于#3株系。
结果表明，D1基因的表达量与叶片的黄色程度正相关，D2基因的表达量与叶片的黄色程度正相关。
实施例4、特异引物对的设计和应用
一、特异引物对的设计
基于实施例1的发现，设计并合成用于鉴定D1基因的引物对（引物对甲）如下：
F6(序列表的序列8)：5’-GGTTTGGTTGGGAATTGG-3’；
R6(序列表的序列9)：5’-GACCATTGCCCTACTTATTAGTGT-3’。
基于实施例1的发现，设计并合成用于鉴定D2基因的引物组合物（引物组合物乙）如下：
F7(序列表的序列10)：5’-TGATACGAAACACCCACTACGA-3’；
R7-1(序列表的序列11)：5’-GACTATCTCATCTCATCTCTGAATGC-3’；
R7-2(序列表的序列12)：5’-TTGCTACTGCTATTTCGTTATTTAA-3’。
二、引物对的应用
用于本步骤的各个大豆材料见表2（来源于美国农业部的种资资源库，该资源库的种资资源面向公众开放，可用于科研相关，可以在http://www.ars-grin.gov/npgs/acc/acc_queries.html中输入PI编号查到）。
1、引物对甲的应用
将各个待测大豆材料分别进行如下鉴定：
（1）提取待测大豆的基因组DNA。
（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，用引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
（3）将步骤（2）得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收约800bp的条带并进行测序。
根据测序结果，所有待测大豆材料可以分为两组；一组大豆的PCR扩增产物为783bp,如序列表的序列2自5’末端第202至984位所示；另一组大豆的PCR扩增产物为782bp，与第一组大豆的PCR扩增产物相比，差异仅在于缺失了序列表的序列2自5’末端第277位核苷酸。
2、引物对乙的应用
将各个待测大豆材料分别进行如下鉴定：
（1）提取待测大豆的基因组DNA。
（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，用引物组合物乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
（3）将步骤（2）得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图4，泳道编号对应表2中的编号。
（4）回收电泳图上的条带并进行测序。
根据测序结果，所有待测大豆材料可以分为两组；一组大豆的PCR扩增产物为870bp、如序列表的序列7所示，另一组大豆的PCR扩增产物为1638bp、如序列表的序列5自5’末端第743-2380位核苷酸所示。
表2琼脂糖凝胶电泳和测序的结果
| 编号PI编号 | 品种名称 | 引物对甲的鉴定结果 | 引物组合物乙的鉴定结果 |
| 1PI518671 | Williams82 | 783bp | 1638bp |
| 2PI548573 | Harasoy | 783bp | 1638bp |
| 3PI548533 | Clark | 783bp | 1638bp |
| 10PI547426 | L64-2545 | 782bp | 870bp |
| 12PI547566 | L72-2832 | 782bp | 870bp |
| 13PI547614 | L74-838 | 782bp | 870bp |
| 14PI547615 | L74-851 | 782bp | 870bp |
| 15PI548160 | T41 | 782bp | 870bp |
| 16PI548167 | T104 | 782bp | 870bp |
| 17PI548170 | T122 | 782bp | 870bp |
| 18PI548177 | T144 | 782bp | 870bp |
| 19PI548317 | T38 | 782bp | 870bp |
| 20PI591495 | L93-2740 | 782bp | 870bp |
3、2012年5月上旬，将待测大豆种植于北京市昌平区中科院遗传所北七家农场，正常管理，持续观察表型。6月中旬，各个大豆材料的叶片均为绿色。8月中旬，大豆品种Williams82、大豆品种Harasoy和Clark开始变黄，即叶绿素开始降解，剩下的大豆材料的叶片仍然保持绿色。9月中旬，大豆品种Williams82、大豆品种Harasoy和Clark中的叶绿素已完全降解，但剩下的大豆材料的叶片中还有未降解的叶绿素。
以上结果表明，用本发明提供的引物对甲和引物组合物乙可以用于辅助鉴定待测大豆材料是否为具有滞绿表型的大豆材料。以待测大豆的基因组DNA为模板，分别用本发明提供的引物对甲和引物组合物乙进行PCR扩增，如果采用引物对甲时的PCR扩增产物为782bp且采用所述引物组合物乙时的PCR扩增产物为870bp、待测大豆材料为候选的具有滞绿表型的大豆材料，如果采用引物对甲时的PCR扩增产物为783bp且采用所述引物组合物乙时的PCR扩增产物为1638bp、待测大豆材料为候选的不具有滞绿表型的大豆材料。
以上结果表明，本发明提供的引物对甲和引物组合物乙可以用于辅助筛选具有滞绿表型的大豆材料。以待测大豆的基因组DNA为模板，分别用本发明提供的引物对甲和引物组合物乙进行PCR扩增，如果采用引物对甲时的PCR扩增产物为782bp且采用所述引物组合物乙时的PCR扩增产物为870bp、待测大豆材料为候选的具有滞绿表型的大豆材料，如果采用引物对甲时的PCR扩增产物为783bp且采用所述引物组合物乙时的PCR扩增产物为1638bp、待测大豆材料为候选的不具有滞绿表型的大豆材料。
Claims (4)
1.引物对甲，由序列表的序列8所示的单链DNA分子和序列表的序列9所示的单链DNA分子组成。
2.引物组合物乙，由序列表的序列10所示的单链DNA分子、序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列表的序列12所示的单链DNA分子组成。
3.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物对甲和权利要求2所述引物组合物乙；所述试剂盒的功能为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：(Ⅰ)辅助鉴定待测大豆材料是否为具有滞绿表型的大豆材料；(Ⅱ)辅助筛选具有滞绿表型的大豆材料。
4.权利要求1所述引物对甲和权利要求2所述引物组合物乙的应用，为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：(Ⅰ)辅助鉴定待测大豆材料是否为具有滞绿表型的大豆材料；(Ⅱ)辅助筛选具有滞绿表型的大豆材料。
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