CN103172714B - 水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用 - Google Patents
水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103172714B CN103172714B CN201110432233.5A CN201110432233A CN103172714B CN 103172714 B CN103172714 B CN 103172714B CN 201110432233 A CN201110432233 A CN 201110432233A CN 103172714 B CN103172714 B CN 103172714B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- plant
- gene
- osmyb103l
- rice
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 87
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 56
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 23
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title claims description 51
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 73
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 6
- 230000008676 import Effects 0.000 claims description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 4
- 230000035558 fertility Effects 0.000 abstract description 3
- 241000209094 Oryza Species 0.000 abstract 5
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 10
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 5
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 102100030053 Secreted frizzled-related protein 3 Human genes 0.000 description 4
- 108010020277 WD repeat containing planar cell polarity effector Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 3
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 2
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010028230 Trp-Ser- His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 2
- MKPCNMXYTMQZBE-UHFFFAOYSA-N 7h-purin-6-amine;sulfuric acid;dihydrate Chemical compound O.O.OS(O)(=O)=O.NC1=NC=NC2=C1NC=N2.NC1=NC=NC2=C1NC=N2 MKPCNMXYTMQZBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 101001000261 Arabidopsis thaliana Transcription factor MYB80 Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101100285000 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241001417524 Pomacanthidae Species 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 108700021654 myb Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物叶片卷曲性状相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明中的水稻叶片卷曲相关基因过量表达引起水稻叶片发生内卷，但对转基因水稻的育性等性状没有显著影响，也没有观察到其他不良的农艺性状，对进一步提高水稻产量具有重要的潜在作用。本发明公开的基因及其编码的蛋白质对培育叶片适度卷曲的植物品种、改良株型具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，提高产量一直是水稻育种的主要目的。株型是水稻高产的一个重要影响因素，而叶片又是植物株型构成的重要组成部分，在水稻高产育种及株型改良过程中，叶片性状一直是育种家们关注的重点，叶片形态的改良也一直是株型育种的重要目标之一。
目前认为叶片的适度卷曲是水稻理想株型的一个重要因素，而且这一性状已被直接或间接的应用于水稻的株型改良和杂交水稻的育种。叶片的适度卷曲有利于使叶片保持挺直，同时减少叶倾角，改善植物的受光姿态，特别是在密植情况下可改善群体内部通风透光状况，提高光能利用效率，增进物质生产，从而增加水稻的产量。
水稻中可遗传的卷叶种质资源相对比较丰富，深入了解各种卷叶材料的遗传特性，具有重要的理论意义和应用价值。但目前的研究多关注叶片的生理机能，而对遗传控制及分子水平的机制研究相对较少。已有许多可能控制水稻卷叶的基因被报道，但大多数仅被初步定位在水稻染色体的某个区段中。在水稻经典遗传图谱上标定的控制卷叶性状的6个基因(r11-r16)，分别被定位在经典遗传图的1、4、12、1、3和7号染色体上。随着分子标记技术和水稻突变体遗传学的快速发展，近年来又有更多的基因[如：r17、r18、r19、r110、r111(t)和r112(t)等]和QTL也被定位到水稻的染色体上。
仍有大量控制叶形的基因有待于被发现和研究，水稻叶形及株型的遗传改良也迫切需要丰富的基因资源。
发明内容
本发明的目的是提供一种水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用。
本发明提供的蛋白质(OsMYB103L蛋白)，来自粳稻品种日本晴(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.Nipponbare)，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物叶片卷曲性状相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白的基因(OsMYB103L基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因是具体可为如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
1)序列表的序列2所示的DNA分子；
2)序列表的序列3所示的DNA分子；
3)序列表的序列4所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码植物叶片卷曲性状相关蛋白的DNA分子；
5)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物叶片卷曲性状相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接根据表型筛选目的植物。
所述重组表达载体具体可为将所述基因插入载体pTCK303的多克隆位点得到的重组质粒。
扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到叶片卷曲程度高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为水稻，如籼稻品种Kasalath。
本发明还保护所述蛋白质作为转录因子的应用。
本发明的水稻叶片卷曲相关基因在过量表达的条件下可引起水稻叶片发生内卷，因此，通过基因工程的方法能利用该基因有效地调节和控制水稻叶片的卷曲程度，进而改良水稻的株型。本发明中的水稻叶片卷曲相关基因过量表达对转基因水稻的育性等性状没有显著影响，也没有观察到其他不良的农艺性状，对进一步提高水稻产量具有重要的潜在作用。本发明公开的基因及其编码的蛋白质对培育叶片适度卷曲的植物品种、改良株型具有重要意义。
附图说明
图1为OsMYB103L蛋白在洋葱表皮细胞里的亚细胞定位。
图2为OsMYB103L蛋白转录激活活性分析。
图3为水稻OsMYB103L基因的组织表达分析(水稻的Actin1基因作为内参)；1：根；2：茎；3：叶片；4：幼穗；5：成熟穗。
图4为重组质粒ProUbi::OsMYB103L的结构示意图。
图5为野生型植株和转基因植株(也可称过表达植株)的表型比较(T0代)。
图6为野生型植株和转基因植株(也可称过表达植株)的表型比较(T1代)。
图7为OsMYB103L基因在野生型植株和转基因植株(也可称过表达植株)中的表达分析。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
粳稻品种日本晴：参考文献：International Rice Genome Sequencing Project(2005).The map-based sequence of the rice genome.Nature 436，793-800.。
籼稻品种Kasalath：参考文献：Nishimura，A.，Ashikari，M.，Lin，S.，Takashi，T.，Angeles，E.R.，Yamamoto，T.，and Matsuoka，M.(2005).Isolation of a riceregeneration quantitative trait loci gene and its application totransformation systems.Proc Natl Acad Sci U S A 102，11940-11944.。
载体pTCK303：参考文献：Wang et al.，2004，Plant Mol Biol Reporter 22：409-417。
实施例1、水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因的发现
对多个从粳稻品种日本晴(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.Nipponbare)预筛选得到的水稻MYB基因进行系统地反向遗传学研究，主要研究策略是对目标基因进行过量表达和(或)RNAi分析。在对转基因水稻群体进行表型分析时发现一个新蛋白及其编码基因。
将序列表的序列1所示蛋白质命名为OsMYB103L蛋白(由359个氨基酸残基组成)。将OsMYB103L蛋白在蛋白保守结构域分析网站上进行结构域分析，结果显示在其N端有两个串联的MYB DNA结合结构域(R2和R3)。将OsMYB103L蛋白与拟南芥(Arabidopsis thalina L.)的相关R2R3MYB蛋白进行系统进化，发现与AtMYB103(At1g63910)同源性最高，二者在预测的R2和R3MYB DNA结合区高度保守。
将编码OsMYB103L蛋白的基因命名为OsMYB103L基因，其cDNA的开放阅读框如序列表的序列2所示，基因组DNA如序列表的序列3所示(由3个外显子和2个内含子组成)。OsMYB103L基因位于水稻第8号染色体。过量表达OsMYB103L基因获得的转基因水稻叶片发生向近轴面的卷曲(内卷)，并且该表型能稳定遗传。
实施例2、OsMYB103L蛋白作为转录因子的功能验证
一、OsMYB103L蛋白在植物细胞中的定位
转录因子一般在细胞核内行使其生物学功能。为分析OsMYB103L蛋白在细胞中的定位情况，将OsMYB103L基因的全长ORF(序列表的序列2所示DNA去除终止密码子)的3’末端与双元载体pEZR(K)-LN(Brown et al，PNAS，2005，102：18225-18230)中的绿色荧光蛋白基因eGFP融合，并置于CaMV 35S启动子的控制之下，从而构建成35S::OsMYB103L-eGFP表达载体。利用基因枪介导的方法将该重组载体及对照空载体分别导入洋葱内表皮，培养24小时后，在激光共聚焦显微镜下观察eGFP荧光信号。OsMYB103L-eGFP融合蛋白产生的绿色荧光信号主要分布在细胞核中，而作为对照空载体(35S::eGFP)的荧光信号在细胞质和细胞核中都被检测到(见图1)。说明OsMYB103L蛋白可定位在植物细胞核中，这与推测其作为转录因子的功能是一致的。
二、OsMYB103L蛋白的体外转录活性
用GAL4酵母双杂交噬菌粒载体试剂盒系统(Stratagene)对OsMYB103L的转录激活进行分析。GAL4酵母双杂交噬菌粒载体试剂盒系统包括如下组件：含酵母转录因子GAL4的DNA结合结构域的载体pBD-GAL4Cam(简称载体pBD-GAL4Cam)、pGAL4质粒(阳性对照)和酿酒酵母YRG-2菌株(含有His3报告基因和LacZ报告基因)。
1、提取粳稻品种日本晴的总RNA，并反转录为cDNA。
2、以步骤1的cDNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5’-CTCGAGGAATGGGGCATCACTCTTG-3’；
R1：5’-CTCGAGTTAATCATGGTCATTTGGTCCC-3’。
3、用限制性内切酶Xho I单酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶Xho I单酶切载体pBD-GAL4 Cam，得到载体骨架(约6500bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pBD-OsMYB103L。根据测序结果，对重组质粒pBD-OsMYB103L进行结构描述如下：在载体pBD-GAL4 Cam的Xho I酶切位点正向插入了序列表的序列2所示的DNA片段。
6、将步骤5的重组质粒pBD-OsMYB103L，载体pBD-GAL4 Cam(阴性对照)和pGAL4质粒(阳性对照)分别转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YRG-2菌株的感受态细胞，得到重组酵母菌。
7、重组酵母菌先在YPAD培养基(酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，腺嘌呤硫酸盐0.04g/L，琼脂20g/L)进行培养。转化重组质粒pBD-OsMYB103L的重组酵母菌、转化阴性对照的重组酵母菌和转化阳性对照的重组酵母菌均可正常生长(见图2)。
8、分别挑单克隆在SD-His培养基[minimal SD Base 26.7g/L(购自Clontech公司)，-His Do supplement 0.69g/L(购自Clontech公司)，琼脂20g/L]上划线使其生长。结果表明，转化重组质粒pBD-OsMYB103L的重组酵母菌和转化阳性对照的重组酵母菌能生长，而转化阴性对照的重组酵母菌不能生长(见图2)。
9、将YPAD培养基上的菌落进行X-gal显色，X-gal显色结果见图2，转化重组质粒pBD-OsMYB103L的重组酵母菌和转化阳性对照的重组酵母菌均可使lacZ基因表达，其表达产物β-半乳糖苷酶降解X-Gal形成蓝色克隆。
实施例3、OsMYB103L基因的表达分析
为了研究OsMYB103L基因的表达模式，首先通过定量RT-PCR分析它在籼稻品种Kasalath(Oryza sativa L.subsp.indica cv.Kasalath)的根、茎、叶片、幼穗(长度小于5mm)和成熟的穗等组织中的表达。将OsMYB103L基因的荧光信号(以Ct值表示)与Actin1基因(内参基因)的荧光信号(以Ct值表示)根据公式(相对表达量＝2-ΔCt，其中ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因)计算出的值作为OsMYB103L基因的相对表达量，结果见图3。结果表明，OsMYB103L基因在根、茎、叶和成熟穗中都有表达，在茎中的表达量最高，在根、叶片和成熟穗子中的表达量相对较低，而在幼穗中基本上没有检测到它的表达。
实施例4、过表达OsMYB103L基因的转基因水稻的获得和表型分析
一、重组质粒的制备
1、提取粳稻品种日本晴的总RNA，并反转录为cDNA。
2、以步骤2的cDNA为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F2：5’-GGATCCTGCTAGCAGCTAGATCAAG-3’；
R2：5’-ACTAGTGTCATCCTCCTGTGTTTATT-3’。
3、用限制性内切酶BamH I和Spe I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BamH I和Spe I双酶切载体pTCK303，得到载体骨架(约14100bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒ProUbi::OsMYB103L。根据测序结果，对重组质粒ProUbi::OsMYB103L进行结构描述如下：在载体pTCK303的BamH I和Spe I酶切位点之间正向插入了序列表的序列4所示的DNA片段(自5’末端第139-1218位核苷酸为开放阅读框)。重组质粒ProUbi::OsMYB103L的结构示意图见图4。重组质粒ProUbi::OsMYB103L中，OsMYB103L基因由玉米Ubi启动子启动表达。
二、转基因水稻的获得
1、将步骤一构建的重组质粒ProUbi::OsMYB103L转化农杆菌(Agrobactericumtumefaciens)菌株LBA4404(购自Invitrogen公司)得到重组农杆菌。
2、将步骤1得到的重组农杆菌转化籼稻品种Kasalath(野生型，WT)，得到51株单株(T0代)。农杆菌介导的水稻转化方法参见文献：Hiei Y，Ohta S，Komari T，Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal6：271-282.。
3、将步骤2的单株分别进行PCR鉴定，48株为转基因植株(OE)，阳性率为94％以上。转基因植株最明显的表型变化是叶片发生内卷，自叶缘两侧沿中脉向近轴面卷曲，呈半圆筒状(见图5)。
4、将载体pTCK303代替重组质粒ProUbi::OsMYB103L进行步骤1和步骤2，获得转空载体植株，转空载体植株的表型与野生株一致，不发生叶片内卷。
三、T1代植株的获得和鉴定
1、将转基因植株进行自交，收获种子(T1代)。
2、将步骤1收获的种子培育为植株，卷叶植株和正常植株的比例接近3∶1，呈现显著的性状分离现象。卷叶植株叶片卷曲的性状在水稻幼苗期就出现并在整个植株生长过程中一直保持为卷叶状态(见图6，a为植株表型图，b为叶片横截面)。
3、随机挑选了三个株系的T1代卷叶植株(每个株系30株)进行叶片卷曲度分析，对这两株系的旗叶、倒二叶和倒三叶的统计分析表明：旗叶的卷曲度在50％-60％之间，倒二叶和倒三叶较旗叶稍低，但也在50％左右。
4、从步骤2的卷叶植株中，随机选取6个株系(OE1、OE3、OE4、OE6、OE8和OE11)的植株(以籼稻品种Kasalath为对照)，分别提取总RNA，进行定量RT-PCR鉴定。
用于鉴定OsMYB103L基因的引物对为F3和R3组成的引物对，靶序列约239bp。
F3：5’-CTTAGAAGATGGCCAAACAGCC-3’；
R3：5’-TGGCCTCCAAGTTGGATGAT-3’。
用于鉴定Actin1基因的引物对为F4和R4组成的引物对，靶序列约435bp。
F4：5’-AGCAACTGGGATGATATGGA-3’；
R4：5’-CAGGGCGATGTAGGAAAGC-3’。
将OsMYB103L基因的荧光信号(以Ct值表示)与Actin1基因(内参基因)的荧光信号(以Ct值表示)根据公式(相对表达量＝2，其中ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因)计算出的值作为OsMYB103L基因的相对表达量，结果见图7。
结果表明，卷叶植株叶片中OsMYB103L基因的表达量都有明显增强。由此可以认为，转基因水稻叶片向内卷曲表型是由强启动子驱动下OsMYB103L的过量表达造成的。
转基因水稻的育性等性状也野生型相比没有显著差异，也没有观察到其他不良的农艺性状。
Claims (3)
1.一种培育转基因植物的方法，是将编码序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因导入目的植物中，得到叶片卷曲程度高于所述目的植物的转基因植物；所述目的植物为水稻。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述编码序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因是如下1）至3）中任一所述的DNA分子：
1）序列表的序列2所示的DNA分子；
2）序列表的序列3所示的DNA分子；
3）序列表的序列4所示的DNA分子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述编码序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因通过重组表达载体导入所述目的植物中；所述重组表达载体为将所述编码序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因插入载体pTCK303的多克隆位点得到的重组质粒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110432233.5A CN103172714B (zh) | 2011-12-21 | 2011-12-21 | 水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110432233.5A CN103172714B (zh) | 2011-12-21 | 2011-12-21 | 水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103172714A CN103172714A (zh) | 2013-06-26 |
| CN103172714B true CN103172714B (zh) | 2014-07-30 |
Family
ID=48632961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110432233.5A Expired - Fee Related CN103172714B (zh) | 2011-12-21 | 2011-12-21 | 水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103172714B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015081787A1 (zh) * | 2013-12-06 | 2015-06-11 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 调控稻类株型的基因及其应用 |
| CN105175519B (zh) * | 2015-08-04 | 2018-07-13 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 蛋白srl2在培育叶卷曲水稻中的应用 |
| CN111118032B (zh) * | 2020-02-20 | 2021-01-12 | 南京林业大学 | 杂交鹅掌楸LhWOX1基因的用途 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1923850A (zh) * | 2006-08-09 | 2007-03-07 | 中国水稻研究所 | 水稻叶形控制基因sll1及其应用 |
| CN101177683A (zh) * | 2007-11-20 | 2008-05-14 | 中国水稻研究所 | 水稻叶形态建成调控基因rlal1及其应用 |
| CN101857633A (zh) * | 2008-12-18 | 2010-10-13 | 中国水稻研究所 | 一种水稻叶形控制基因srnl1及其应用 |
| CN101979580A (zh) * | 2010-11-12 | 2011-02-23 | 扬州大学 | 一个水稻卷叶基因及其应用方法 |
-
2011
- 2011-12-21 CN CN201110432233.5A patent/CN103172714B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1923850A (zh) * | 2006-08-09 | 2007-03-07 | 中国水稻研究所 | 水稻叶形控制基因sll1及其应用 |
| CN101177683A (zh) * | 2007-11-20 | 2008-05-14 | 中国水稻研究所 | 水稻叶形态建成调控基因rlal1及其应用 |
| CN101857633A (zh) * | 2008-12-18 | 2010-10-13 | 中国水稻研究所 | 一种水稻叶形控制基因srnl1及其应用 |
| CN101979580A (zh) * | 2010-11-12 | 2011-02-23 | 扬州大学 | 一个水稻卷叶基因及其应用方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Os08g0151300 [Oryza sativa Japonica Group];Tanaka,T等;《GENBANK》;20100608;蛋白质序列 * |
| Tanaka,T等.Os08g0151300 [Oryza sativa Japonica Group].《GENBANK》.2010, |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103172714A (zh) | 2013-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109355293B (zh) | 雄性核不育基因及其突变体在杂交育种上的应用 | |
| US11472852B2 (en) | Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking | |
| US20230242931A1 (en) | Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking | |
| US20090031444A1 (en) | Homologous recombination in plants | |
| JP2013531502A (ja) | グルコシノレート輸送タンパク質及びその使用 | |
| CN108368518A (zh) | 制备单倍体和随后的双单倍体植物的方法 | |
| CN108642065A (zh) | 一种水稻胚乳粉质相关基因OsSecY2及其编码蛋白质和应用 | |
| WO2019129145A1 (en) | Flowering time-regulating gene cmp1 and related constructs and applications thereof | |
| CN103172714B (zh) | 水稻叶片卷曲相关蛋白OsMYB103L及其编码基因与应用 | |
| WO2015007241A1 (en) | Molecular marker | |
| CN101798342A (zh) | 水稻颖壳发育相关蛋白tri1及其编码基因和应用 | |
| US11702670B2 (en) | Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking | |
| CN105713079A (zh) | 蛋白质及其相关生物材料在提高植物产量中的应用 | |
| US20210238619A1 (en) | Guayule with increased rubber production and yield | |
| CN108660139A (zh) | 植物育性调控基因np2及其编码蛋白和应用 | |
| CN103408647B (zh) | 植物滞绿相关蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN105886516B (zh) | 一个育性调控基因OsRPLP0及其应用 | |
| US20220298527A1 (en) | Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking | |
| US20220307042A1 (en) | Compositions and methods for improving crop yields through trait stacking | |
| CN101280008A (zh) | 一种与植物耐冷性相关的蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN111394500A (zh) | 一种用于鉴定待测植物样品是否来源于SbSNAC1-382事件或其后代的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140730 Termination date: 20161221 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |