JP2013531502A - グルコシノレート輸送タンパク質及びその使用 - Google Patents

グルコシノレート輸送タンパク質及びその使用 Download PDF

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Abstract

植物又はその部分におけるグルコシノレート輸送タンパク質（ＧＴＲ）活性を改変することによって、植物、特に特定の植物部分におけるグルコシノレート（ＧＳＬ）含量を変化させる方法及び手段が、本明細書において記載される。特に、Brassicales植物の植物種子及びそのミールのＧＳＬ含量を減少させる方法、及び、Brassicales植物の緑色植物組織におけるＧＳＬ含量を増加させる方法が提供される。

Description

本発明は、改変されたグルコシノレート含量を有する農産物、特に作物植物及びその部分の分野に関する。植物又はその部分におけるグルコシノレート輸送タンパク質（ＧＴＲ）活性を改変することによって、植物、特に特定の植物部分におけるグルコシノレート（ＧＳＬ）含量を変化させる方法が提供される。ＧＴＲ活性のこのような改変は、ＧＴＲ遺伝子発現若しくはＧＴＲタンパク質活性のダウンレギュレーション又はアップレギュレーションによって、達成され得る。特に、植物種子及びそのミールのＧＳＬ含量を減少させる方法、並びに、ブラシカ目（Brassicales）植物、特にブラシカ科（Brassicaceae）植物、例えば油糧種子の形態のブラシカ（Brassica）属（例えば、ブラシカ・ナパス（B. napus）、ブラシカ・ジュンセア（B. juncea）及びブラシカ・カリナタ（B. carinata）を含む）、ブラシカ・オレラセア（B. oleracea）、ブラシカ・ラパ（B. rapa）、アブラナ科のサラダ（例えば、エルカ・サティヴァ（Eruca sativa）及びディプロタキス・テヌイフォリア（Diplotaxis tenuifolia）を含む）及びラファヌス（Raphanus）（例えば、ラファヌス・サティヴァ（Raphanus sativa）を含む）の緑色植物組織におけるＧＳＬ含量を増加させる方法が提供される。
Brassicaceae科若しくはCruciferae科を含むBrassicales目又はCapparales目の植物は、香辛料、野菜、飼料作物、並びに、経済的に重要な作物の菜種（Brassica napus及びブランカ・カンペストリス（Brassica campestris）又はrapa）及びマスタード（Brassica juncea）の原料を人類に提供した多くの品種を含む。
これらの植物の顕著かつ特徴的な化学的特性は、その高含量のグルコシノレート（すなわち、チオグルコース及びスルホン化オキシムを含むアミノ酸由来天然植物産物）である。これらの硫黄含有二次代謝産物は、それ自体は非毒性であると考えられるが、植物損傷の際に加水分解酵素ミロシナーゼ（チオグルコシドグルコヒドロラーゼ；ＥＣ３．２．３．１）によって切断されると、ニトリル、エピチオニトリル、オキサゾリジン−２−チオン、チオシアン酸塩及びイソチオシアン酸塩などの多数の生理活性産物がそれらから生じるので、重要である（Halkier and Gershenzon, 2006, Annual Review of Plant Biology 57: 303-333）。
植物にとっては、グルコシノレート／ミロシナーゼ系は、草食動物の攻撃から身を守り、特定の捕食者によるホスト−植物認識に関与している。ヒトにとっては、グルコシノレート（又は、むしろそれらの加水分解産物）は、ガン予防剤、香味化合物及びバイオ農薬候補として注目が高まっている。
グルコシノレートは、植物のすべての部分に存在する。グルコシノレートのレベルは、異なる発生段階の異なる組織で変化し（Fieldsend and Milford, 1994, Ann. Appl. Biol. 124: 531-542; Porter et al., 1991, Ann. Appl. Biol. 118: 461-467）、生育条件（Zhao et al., 1993, J. Sci. Food Agric. 63: 29-37; Zhao et al., 1994, J. Sci. Food Agric. 64, 295-304）、創傷（Bodnaryk, 1992, Phytochemistry 31: 2671-2677）、真菌感染（Doughty et al., 1991, Ann. Appl. Biol. 118: 469-477）、実質的及び模擬的な虫害（Bodnaryk, 1992, Phytochemistry 31: 2671-2677; Koritsas et al., 1991, Ann. Appl. Biol. 118: 209-221）、及び、他の種類のストレス（Mithen, 1992, Euphytica 63: 71-83）などの外部要因によって影響を受ける。植物防御における卓越した機能に対応して、最高グルコシノレート濃度は、生殖器官（種子、長角果、花、及び、発生中の花序を含む）、続いて若葉、根系、及び、完全に広がった葉において見られる。
グルコシノレートは、植物において、母体組織から師部を介して葉及び長角果に由来するいくつかのアポプラストバリアを越えて、胚に輸送され、高レベルに蓄積することが公知である（Nour-Eldin and Halkier, 2009, Phytochem Rev 8: 53-67において概説される）。この輸送の分子機構は、不明である。輸送機構の同定は、例えば、種子及びその種子ミールで得られるレベルをより低くするのにつながり得るので、植物内のグルコシノレートの輸送特性は、関心対象である。
植物トランスポーターを発見する方法は、相同性及び酵母機能的相補性に基づいて記載されている。しかしながら、これらの方法は、公知のホモログを有しないトランスポーターを同定する場合、又は栄養要求性酵母株が設計できない場合に限界を示す。Nour-Eldin (Ph. D. thesis, University of Copenhagen, Faculty of Life Sciences, Department of Plant Biology, Plant Biochemistry Laboratory, 2007, 72 p.)は、機能的ゲノミクスアプローチに基づいて、植物トランスポーターを発見する方法を記載している。Arabidopsis二次代謝産物トランスポーターの標準化されたライブラリーを構築し、Xenopus卵母細胞においてハイスループット形式でスクリーニングした。脂肪族グルコシノレート４−メチルチオブチル（４−ＭＴＢ）グルコシノレートの取り込みに関して、トランスポーターライブラリーをスクリーニングした。３個のArabidopsisグルコシノレートトランスポーター遺伝子を同定した。それらの２個（Ａｔ３ｇ４７９６０及びＡｔ１ｇ１８８８０；以下、ＡｔＧＴＲ１及び３と称する）は、硝酸塩／ペプチドトランスポーターファミリーに属するのに対して、３個目の遺伝子（Ａｔ１ｇ７１８８０；ＡｔＳＵＣ１として公知）は、スクローストランスポーターファミリーに属する。Arabidopsisスクローストランスポーターファミリーは、９個の遺伝子を含み（Williams et al., 2000, Trends Plant Sci 5: 283-290）、これらは、特異性が広く、様々なβ−グルコシドを輸送することが示されている（Chandran et al., 2003, J Biol Chem 278: 44320-44325）。ＡｔＳＵＣ１、２、５、８及び９は、Xenopus卵母細胞において、様々な効率で４−ＭＴＢを輸送することが示された（Nour-Eldin, 2007、前掲）。ＡｔＳＵＣ９Ｔ−ＤＮＡノックアウト系統の種子は、４種類のグルコシノレートの有意な減少を示したのに対して、ＡｔＳＵＣ１ノックアウト系統は、種子グルコシノレート含量の差を示さなかった（Andersen et al., 2nd Conference on Glucosinolates, May 24-27, 2009）。相同性に基づいて、２個のさらなるＡｔＧＴＲ遺伝子（Ａｔ５ｇ６２６８０及びＡｔ１ｇ６９８７０；以下、ＡｔＧＴＲ２及びＡｔＧＴＲ５と称する）が同定され、続いて、４−ＭＴＢをXenopus卵母細胞に輸送することも示された（Nour-Eldin, 2007、前掲）。
世界市場を現在独占している油糧種子作物の中で、菜種は、２つの重要な理由で傑出している；ヒトにとって優れた栄養特性を持つ油が高レベルであること、及び、タンパク質が豊富なシードケーキミールが動物飼料に理想的であること。種子におけるグルコシノレートのレベルを減少させることへの関心は、苦味があり毒性の甲状腺腫誘発分解産物（これは、菜種ミールを非反芻動物の動物飼料に組み込むのを制限する）が存在することに起因する（Thomson and Hughes, 1986, In Oilseed rape. Edited by Scarisbrick and Daniels. Collins, London, U.K. pp. 32-82）。
今までに、生合成経路を遮断することによって、種子におけるグルコシノレートレベルを減少させるアプローチがなされている。しかしながら、このアプローチは、例えば、生物的又は非生物的ストレスに対する感受性の増加により、植物の適応度に対する悪影響を伴うことが多い。
１９７０年代に、伝統的な品種改良により、植物のすべての部分（種子を含む）において減少されたグルコシノレート含量を有する複数ローカス依存性B. napus品種が作製された。その後、この「００」（「ダブルロー」）品種及びその子孫は、北半球を通して最も広く栽培された菜種品種になった。しかしながら、この単一のソースによって引き起こされる長期の選択ボトルネックは、将来のB. napus育種プログラムに対して、限定された遺伝的多様性を作り出し、種間交雑を制限している。これは、生産量及び耐病性を改善し、さらには、種間交雑によって新規な形質（例えば、乾燥耐性）を導入しようとするB. napus育種家に深刻な問題をもたらす。
「００」品種のさらなる問題は、種子が、少ないものの、グルコシノレートを含むことである。油を抽出した後の「００」品種から得られるプレスシードケーキは、典型的には、（１グラムあたり１２０〜１５０μmoleの総ＧＳＬを含む伝統的な菜種ミールと比較して）乾燥重量１グラムあたり１８〜２４μmole未満の総グルコシノレート（ＧＳＬ）を含む。配合飼料における使用に関して、反芻動物に対する嗜好性を、乾燥重量１グラムあたり１０〜１５μmole未満の許容総ＧＳＬレベルに設定すると、これは、シードケーキが当該低レベルのＧＳＬ含量にある場合に、動物飼料が、理論上は、ほとんどすべての「００」プレスシードケーキと配合され得ることを意味する。しかしながら、最近、家禽及びブタは両方とも、反芻動物よりもＧＳＬレベルに対して非常に感受性であり、乾燥重量１グラムあたり２〜４μmole超の飼料中のＧＳＬは、これらの動物において繁殖効率に深刻な影響を与え得ることが見出された。真の「ゼロＧＳＬ」品種は、配合飼料に含めることができるシードケーキの量を増加させ、製品におけるＧＳＬレベルの継続的なモニタリングの必要性を取り除くことによって、動物飼料配合者、プレスシードケーキの製造者及び栽培者にとって重要な商業利点になるであろう。
以下、異なる実施態様、実施例及び特許請求の範囲において記載されるように、これらの及び他の問題が解決される。
本発明は、改変された総グルコシノレート（ＧＳＬ）含量を有する植物及び植物部分（例えば、種子、種子ミール、緑色植物組織及び根の組織）に関する。機能性グルコシノレート輸送タンパク質（ＧＴＲ）活性の改変によって、改変された総ＧＳＬ含量を有する植物及び植物部分を製造する方法が提供される。特に、機能性ＧＴＲ活性の減少によって、総ＧＳＬ含量が減少した種子を製造する方法、及び、総ＧＳＬ含量が増加した緑色植物組織（例えば、葉組織）を製造する方法が提供される。さらに、植物及び植物部分において改変されたＧＳＬ含量を得るための、ＧＴＲをコードする核酸分子の使用、及び、例えば、ガン予防、害虫管理又は動物飼育における改変された機能性ＧＴＲ活性を有する植物及び植物部分の使用が提供される。
本発明の第１の態様では、機能性ＧＴＲ活性の減少は、ＧＴＲ遺伝子発現のダウンレギュレーションによって達成され得る。本発明の一実施態様では、ＧＴＲ遺伝子発現をダウンレギュレーションできるＲＮＡ分子の導入によって（例えば、発現するとこのようなＲＮＡ分子を生じるヌクレオチド領域を含むキメラ核酸構築物の導入によって）、植物及び植物部分の総ＧＳＬ含量を改変する方法が提供される。
一実施態様では、ＧＴＲ遺伝子発現は、ＧＴＲをコードするヌクレオチド配列若しくは相同配列の一部を含むＲＮＡ分子を導入することによって、又は、このようなＲＮＡ分子をコードするキメラＤＮＡを導入することによって、ダウンレギュレーションされる。別の実施態様では、ＧＴＲ遺伝子発現は、ＧＴＲをコードするヌクレオチド若しくは相同配列の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスＲＮＡ分子を導入することによって、又は、このようなＲＮＡ分子をコードするキメラＤＮＡを導入することによって、ダウンレギュレーションされる。さらに別の実施態様では、ＧＴＲ遺伝子発現は、ＧＴＲ遺伝子配列の少なくとも一部に対応し、かつ、それぞれ相補的なセンス及びアンチセンスＲＮＡ領域であって、二本鎖ＲＮＡ領域を互いに形成できるセンス及びアンチセンスＲＮＡ領域を含む二本鎖ＲＮＡ分子を導入することによって、ダウンレギュレーションされる。別の実施態様では、ＧＴＲ遺伝子発現は、ＧＴＲ ｍＲＮＡの切断を誘導できるマイクロＲＮＡ分子（これは、マイクロＲＮＡ前駆体分子からプロセシングされ得る）の導入によって、ダウンレギュレーションされ得る。さらに、マイクロＲＮＡ分子は、このようなｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体又は一次ｍｉＲＮＡ転写産物をコードするキメラＤＮＡ分子からの発現によって、植物細胞に便利に導入され得る。
本発明の別の実施態様では、内因性ＧＴＲ遺伝子のヌクレオチド配列の変化（例えば、プロモーター配列、イントロンプロセシングシグナル、非翻訳リーダー及びトレーラー配列又はポリアデニル化シグナル配列を含む調節シグナルの変化など）によるＧＴＲ遺伝子発現のダウンレギュレーションによって、植物又は植物部分の総ＧＳＬ含量を改変する方法が提供される。
本発明の第２の態様では、機能性ＧＴＲ活性の減少は、ＧＴＲ活性のレベルで起こり得る。本発明の一実施態様では、ＧＴＲタンパク質活性をダウンレギュレーションできるタンパク質をコードするキメラ核酸構築物の導入によって、植物及び植物部分の総ＧＳＬ含量を改変する方法が提供される。一実施態様では、ＧＴＲタンパク質活性は、ドミナントネガティブＧＴＲ遺伝子の発現によって、ダウンレギュレーションされ得る。本発明の別の実施態様では、ＧＴＲタンパク質活性は、ＧＴＲを不活性化する抗体の発現によって、ダウンレギュレーションされ得る。機能性ＧＴＲ活性は、ＧＴＲタンパク質のリン酸化／脱リン酸化状態を変化させることによっても、モデュレーションされ得る。これは、ＧＴＲをコードする遺伝子の変異体アレルを使用することによって達成され得、それにより、リン酸化部位は、後述のように改変される。
本発明の別の実施態様では、内因性ＧＴＲ遺伝子のヌクレオチド配列の変化による（例えば、アミノ酸の挿入、欠失若しくは置換を導入するコード領域の変化、コードされるタンパク質のトランケーション又はスプライス部位突然変異による）ＧＴＲタンパク質活性のダウンレギュレーションによって、植物又は植物部分の総ＧＳＬ含量を改変する方法が提供される。
Arabidopsis ＮＲＴ１／ＰＴＲファミリーにおけるタンパク質配列のルーツ化されていない系統樹。ARAMEMNON植物膜タンパク質データベース（Schwacke et al., Plant Physiol. 131: 16-26）から、タンパク質配列を検索した。Ａｔ３ｇ４７９６０（ＡｔＧＴＲ１）タンパク質サブクレードは、括弧でマークする。モノクロ階調の円は、Xenopus卵母細胞における相対的なｉｎ ｖｉｔｒｏ ＧＳＬ取り込み活性を反映しており、白色は取り込みゼロを示し、黒色は観察された最大の取り込みを示す。マークされていない遺伝子は、試験しなかった。近隣結合法（Saitou and Nei, 1987, Mol Biol Evol. 4(4):406-25）を使用して、系統発生関係を推測した。Poisson補正法（Zuckerkandl and Pauling, 1965, In Bryson V, Vogel HJ (eds), Academic Press, New York, pp 97-166）を使用して、系統発生関係を計算した。ギャップ及び欠測データを含むすべての位置を、データセットから削除した（完全削除オプション）。最終的なデータセットには、合計３００個の位置があった。系統発生解析をMEGA4（Tamura et al., 2007, Mol Biol Evol 24: 1596-1599）で実行した。 Arabidopsis ＧＴＲアミノ酸配列のアライメント。ＰＯＴ１−６＿ＡＴ．．ｐ：ＡｔＧＴＲ１〜６（配列番号２、４、６、８、１０及び１２） ＧＴＲ１における３０アミノ酸のＮ末端延長を含むArabidopsis ＧＴＲアミノ酸配列１〜６（配列番号１４２、４、６、８、１０及び１２）のアライメント。 配列番号６６の１２６位（ＧｌｙからＡｒｇ）、１４５位（ＧｌｙからＡｒｇ）、１９２位（ＧｌｕからＬｙｓ）、２２９位（Ｔｒｐから終止）及び３５９位（ＳｅｒからＰｈｅ）のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を有するＢｒＧＴＲ２−Ａ２タンパク質並びに野生型ＢｒＧＴＲ２−Ａ２タンパク質を発現するXenopus卵母細胞における４−ＭＴＢ取り込み。アッセイ条件：０．５mM ４−ＭＴＢ、１時間。各バーは４回反復の平均であり、誤差は標準偏差である。 Xenopus卵母細胞においてＡｔＧＴＲ１及び２媒介性ＧＳＬ輸送の生化学的アッセイ。Ａ及びＢ、ＡｔＧＴＲ媒介性ＧＳＬ輸送のｐＨ依存性。Ａ、卵母細胞抽出物のＬＣ−ＭＳ分析によって測定したＡｔＧＴＲ２媒介性４−ＭＴＢ取り込み、ｎ＝卵母細胞３個。Ｂ、ｐＨ５（●）、ｐＨ６（◆）及びｐＨ７（▲）の異なる膜電位において、１mM ４−ＭＴＢによって誘導したＡｔＧＴＲ１電流を測定した。ｐＨ５、−６０mVで誘導した電流に対して、電流を標準化した。エラーバーはＳＤであり、ｎ＝卵母細胞４個。Ｃ及びＤ、ＡｔＧＴＲ媒介性グルコシノレート輸送の動態分析。−６０mVの膜電位における標準化したグルコシノレート依存性電流を、４−ＭＴＢの濃度に対してプロットし、線は、データに対するMichaelis-Menten式の適合を示す；エラーバーはＳＤである。ＡｔＧＴＲ１（ｎ＝卵母細胞６個）；ＡｔＧＴＲ２（ｎ＝卵母細胞５個）。１００μM ４−ＭＴＢで誘導した電流に対して、各卵母細胞データセットを標準化した。Ｅ及びＦ、ＡｔＧＴＲの基質特異性。Ｅ、２mM ４−ＭＴＢ、２mM ＮＯ３ −、２mMグルコース＋２mM ＳＯ４ −−又は２mM Ａｌａ−Ｈｉｓ＋２mM Ａｓｐ−Ａｌａ＋２mM Ｇｌｙ−Ｌｅｕ＋２mM Ａｌａ−Ｐｈｅ＋２mM Ｇｌｙ−Ｇｌｕ＋２mM Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ溶液の存在下における０，０４mMＣ−１４ラベル化ｐＯＨＢＧ（ｐＨ５）のＡｔＧＴＲ１及びＡｔＧＴＲ２取り込み、エラーバーはＳＤであり、ｎ＝卵母細胞８個。Ｆ、内因性及び外因性グルコシノレート、正、負及び中性の各ジペプチド並びに２個のトリペプチドによって誘導したＡｔＧＴＲ１電流。−６０mVに固定して１００μM ４−ＭＴＢ（ｐＨ５）により誘導した電流に対して、電流を標準化した。エラーバーはＳＤであり、ｎ＝卵母細胞４個。 Arabidopsis野生型及びＧＴＲノックアウト植物に由来する種子におけるグルコシノレート含量。Ａ〜Ｄ、野生型、ａｔｇｔｒ１、ａｔｇｔｒ２及びａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物にそれぞれ由来する各長角果のすべての種子におけるＧＳＬ含量を示すＨＰＬＣトレース。Ａ、野生型植物に由来する５４個の種子。Ｂ、ａｔｇｔｒ２に由来する５１個の種子。Ｃ、ａｔｇｔｒ１に由来する５３個の種子。Ｄ、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物に由来する３９個の種子。Ｅ、ネイティブなＡｔＧＴＲ２相補構築物でトランスフォーメーションしたａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物に由来する２０個の種子。略語は、検出したグルコシノレートの接頭辞を意味する。４ｏｈｂ：４−ヒドロキシブチル−ＧＳＬ、４ｍｓｂ：４−メチルスルフィニルブチル−ＧＳＬ、５ｍｓｐ：５−メチルスルフィニルペンチル−ＧＳＬ、６ｍｓｈ：６メチルスルフィニルヘキシル−ＧＳＬ、７ｍｓｈ：７−メチルスルフィニルヘプチル−ＧＳＬ、４ｍｔｂ：４−メチルチオブチル−ＧＳＬ、８ｍｓｏ：８−メチルスルフィニル−ＧＳＬ、ｉ３ｍ：インドール−３−イル−メチル−ＧＳＬ、５ｍｔｐ：５−メチルチオブチル−ＧＳＬ、３ｂｚｏｐ：３−ベンゾイルプロピル−ＧＳＬ、４ｂｚｏｂ：４−ベンゾイルブチル−ＧＳＬ、７ｍｔｈ：７−メチルチオヘプチル−ＧＳＬ、８−メチルチオオクチル−ＧＳＬ．２−プロペニル−ＧＳＬ：精製中の減少を標準化する内部標準ＧＳＬ。 発生の間の土壌栽培Arabidopsis植物に由来する異なる植物部分における総脂肪族グルコシノレート（Ｙ軸で「ｇｌｓ」と略される）含量。採取時点：抽だい前：３週齢植物、抽だい（及び長角果発生の開始）後：５週齢植物、老化（及び種子成熟）：８週齢。「抽だい後」及び「老化」の時点に関しては、同じ植物から組織を採取する。Ａ、種子。Ｂ、ロゼット。Ｃ、茎（花を含む）、すべての茎生葉、すべてのインタクトな長角果（発生中及び成熟種子を含む）。Ｄ、単一の長角果壁。バーは平均±ＳＤを表す。（総脂肪族ＧＳＬは、ベンゾイルオキシＧＳＬを含むメチオニンに由来するＧＳＬすべてを含む） 発生の間の水耕栽培Arabidopsis植物に由来する異なる植物部分における総脂肪族グルコシノレート（Ｙ軸で「ｇｌｓ」と略される）含量。採取時点は、土壌栽培植物に関して図２に記載した通りである。Ａ、根。Ｂ、ロゼット抽だい。Ｃ、植物１mgあたりの脂肪族グルコシノレート濃度。 Arabidopsis ＧＴＲアミノ酸配列の一部のアライメントの詳細：ＡｔＧＴＲ２：配列番号４のアミノ酸位置４５４〜アミノ酸位置４９３；ＢｒＧＴＲ２：配列番号２６のアミノ酸位置４５０〜アミノ酸位置４８９；ＡｔＧＴＲ１：配列番号２のアミノ酸位置４４０〜アミノ酸位置４７９（又は配列番号１４２のアミノ酸位置４７０〜５０９）；ＡｔＧＴＲ３：配列番号６のアミノ酸位置４３８〜アミノ酸位置４６７；ＡｔＧＴＲ５：配列番号１０のアミノ酸位置４６３〜アミノ酸位置４９５；ＡｔＧＴＲ６：配列番号１２のアミノ酸位置４２３〜アミノ酸位置４４９；及びＡｔＧＴＲ４：配列番号８のアミノ酸位置４２５〜アミノ酸位置４５１。 突然変異ＢｒＧＴＲ２タンパク質における突然変異を相対的に表示した、ＧＴＲ２タンパク質の予測タンパク質構造。破線矢印は、ＧＴＲ１、ＧＴＲ２及びＧＴＲ３タンパク質に特徴的なループを示す（図７における枠で囲まれた配列によっても示される）。 B. rapa種子における３−ブテニル含量。Ｘ軸は、種子のＢｒＧＴＲ２遺伝子型を示す；暗い柱は、ホモ接合性突然変異体に由来する種子を示すのに対して、明るい柱は、各突然変異体に関する野生型分離個体（ＷＴＳ）に由来する種子を示す。ＷＴは、突然変異していない参照野生型種子を表す。Ｙ軸は、３−ブテニル濃度（nmol/mg単位）を示す。パネルＡ）各植物に由来する種子のグルコシノレート濃度；ｎ＝種子３個から標準偏差を計算する。パネルＢ）すべての「Ｗ２２９Ｘ−」（終止コドン）突然変異体の平均グルコシノレート濃度、ｎ＝種子２７個、ｎ＝種子１２個及びｎ＝種子３個から標準偏差をそれぞれ計算した。 突然変異及び参照B. napus種子における総グルコシノレート含量。Ｙ軸は、種子の遺伝子型を示す。参照は、突然変異していない同系野生型種子である。 野生型ＡｔＧＴＲ１及びＧＴＲ２と比較した、リン酸化／脱リン酸化模倣構築物の４−ＭＴＢ取り込み；Ｘ軸は、異なる構築物の遺伝子型を表す。 Brassica rapaの様々な組織におけるグルコシノレートの濃度。Ｘ軸は分析した植物部分を示し、Ｙ軸はnmolグルコシノレート／mg生重量を示す。この分析は、Ｂｒｇｔｒ２植物全体におけるグルコシノレート濃度がＷＴよりも高いこと、及び、この濃度増加は、茎及び根ではなく葉及び長角果におけるグルコシノレートレベルが原因であることを示している。ｎ＝５から標準偏差を計算する。 様々な組織の生重量。Ｘ軸は重量を量った植物部分を示し、Ｙ軸はmg生重量を示す。この分析は、Ｂｒｇｔｒ２植物がＷＴよりも大きいこと、及び、この増加は、葉及び茎の重量が主な原因であることを示している。ＢｒＧＴＲ２ ＷＴ長角果の低重量は、真のＷＴ及びＢｒｇｔｒ２長角果（データは示さず）と比較して、これらにおける種子の量が少ないことが部分的な原因であることに注意すべきである。ｎ＝５から標準偏差を計算する。
一般的な定義
本明細書において使用される「グルコシノレート」（本明細書において「ＧＳＬ」又は「ＧＬＳ」と略される）という用語は、スルホン化アルドキシム部分を含むアミノ酸由来チオグルコシド有機アニオンを指す。親アミノ酸及びさらなる側鎖改変に依存する可変側鎖は、異なる化学的及び生物学的特性をＧＳＬにもたらす。約１２０個の異なるＧＳＬが文献に記載されており、それらはすべて、わずか８個の異なるアミノ酸に由来する。親アミノ酸は、分類基準として便利に使用される。Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＭｅｔに由来するＧＳＬは「脂肪族ＧＳＬ」と称され、Ｔｙｒ及びＰｈｅに由来するＧＳＬは「芳香族ＧＳＬ」と称され、Ｔｒｐに由来するＧＳＬは「インドールＧＳＬ」と称される。ＧＳＬの種類の大きな多様性は、親アミノ酸の側鎖の多数の改変によって引き起こされる。特に、メチオニンは、広範なトランスフォーメーションを受ける。Brassicaceaeにおける主な脂肪族ＧＳＬは、鎖伸長型のＭｅｔに由来する側鎖を有し、例えば、脂肪族チオ−ＧＳＬ ３−メチルチオプロピル（３−ＭＴＰ）−、４−メチルチオブチル（４−ＭＴＢ）−、５−メチルチオペンチル（５−ＭＴＰ）−、６−メチルチオヘキシル（６−ＭＴＨ）−、７−メチルチオヘプチル（７−ＭＴＨ）−及び８−メチルチオオクチル（８−ＭＴＯ）−ＧＳＬ；脂肪族スルフィニル−ＧＳＬ ３−メチルスルフィニルプロピル（３−ＭＳＰ）−、４−メチルスルフィニルブチル（４−ＭＳＢ）−、５−メチルスルフィニルペンチル（５−ＭＳＰ）−、６−メチルスルフィニルヘキシル（６−ＭＳＨ）−、７−メチルスルフィニルヘプチル（７−ＭＳＨ）−及び８−メチルスルフィニルオクチル（８−ＭＳＯ）−ＧＳＬ；脂肪族ヒドロキシ−ＧＳＬ ３−ヒドロキシプロピル（３−ＯＨＰ）−及び４−ヒドロキシブチル（４−ＯＨＢ）−ＧＳＬ；脂肪族ベンゾイルオキシ−ＧＳＬ ３−ベンゾイルオキシプロピル（３−ＢＺＯＰ）−及び４−ベンゾイルオキシブチル（４−ＢＺＯＢ）−ＧＳＬ並びに脂肪族アルケニル−ＧＳＬ ２−プロペニル（２−Ｐ）−及び３−ブテニル（３−Ｂ）−ＧＳＬである。Brassicaceaeにおける主な芳香族ＧＳＬは、Ｐｈｅに由来する側鎖を有し、例えば、芳香族ＧＳＬ ２−フェニルエチル（２−ＰＥ）−ＧＳＬである。Ｔｒｐに由来するインドール側鎖を有するＧＳＬも少し存在し、例えば、インドール−ＧＳＬ インドール−３−イルメチル（ｉ３Ｍ）−ＧＳＬである。ＧＳＬは、植物中で、ＧＳＬ特異的チオグルコシダーゼミロシナーゼと同時に存在している。この酵素は、植物中で、ＧＳＬから物理的に分離されているが、組織が破壊されると、その基質と接触する。その結果として生じる加水分解産物は、ＧＳＬ分子１個あたり１個の遊離グルコース分子と１個のアグリコン分子とからなる。アグリコンは不安定であり、イソチオシアネート、ニトリル、チオシアネート及び多少は毒性の他の化合物へと容易に再構成する。親アミノ酸の側鎖に応じて、これらの加水分解産物は、ＧＳＬの実際の生物学的活性に寄与するのに対して、インタクトなＧＳＬは、不活性な貯蔵型であると考えられている。
本明細書において使用される植物又は植物部分の「グルコシノレート含量」という用語は、ＧＳＬの種類に関係なく、脂肪族、芳香族及びインドールＧＳＬを含むＧＳＬの総量を指す。従って、植物若しくは植物部分の「総ＧＳＬ含量」又は「ＧＳＬ含量」は、その植物又は植物部分の総ＧＳＬの含量を意味し、ＧＳＬは、それらの側鎖のサイズに応じて有意に異なる分子量を有するので、（重量（mg/kg）基準よりもむしろ）分子（nmol/g又はμmol/g）基準で表される。ＧＳＬの蓄積は、組織及び発生段階によって異なる。若葉及び生殖組織（例えば、長角果及び種子）は最高濃度のＧＳＬを含むのに対して、老化葉は最低濃度のＧＳＬを含む。中間濃度は、根、葉及び茎などの「大きな」器官全体で見られる。加えて、ＧＳＬプロファイルの組成は、器官によって著しく変化する。根及び栄養組織では、ＧＳＬ含量は、インドール及び脂肪族ＧＳＬから構成されるのに対して、芳香族は存在しない。長角果及び種子では、少量の芳香族及びインドールＧＳＬが見られるのに対して、残りのＧＳＬ含量は、脂肪族ＧＳＬからすべて構成されている。
「キャノーラ」、「００（ｄｏｕｂｌｅ−ｚｅｒｏ）菜種」又は「ダブルロー（ｄｏｕｂｌｅ−ｌｏｗ）菜種」は、標準植物育種技術によって交配されて、油部分における低レベルのエルカ酸（２％未満）、及び、ミール部分における低レベルのＧＳＬ（３０μmol/g未満）を有する菜種（Brassica napus及びBrassica campestris又はrapa）の子孫である。（００）菜種の「種子」は、小さくて、円形であり、直径１〜２mmである。それは、食用植物油として使用するために抽出される約４２〜４３％の油を含む。残りの「種子ミール」は、動物飼料に広く使用されているタンパク質源である。菜種中のＧＳＬは、毒性であり、ほとんどの動物にとって嫌なものなので、減らされており、このため、動物飼料における菜種ミールの含有レベルを非常に低いレベルに制限している。キャノーラ及び菜種ミールは、世界中で動物飼料によく使用されており、マッシュとしてバルク形態で又はペレットで販売されている。
本発明の方法による植物若しくは植物部分の「総ＧＳＬ含量の減少」又は「総ＧＳＬ含量の増加」は、類似の遺伝的背景を有する参照植物又は植物部分の総ＧＳＬ含量と比較して測定される。総ＧＳＬ含量は、任意の適切な方法によって測定され得る。植物材料の総ＧＳＬ含量を定量化する方法、及び、植物材料のＧＳＬ組成を決定する方法は、当技術分野において周知であり、例えばHansen et al. (2007, Plant J. 50 (5): 902-910)によって記載される、sephadex陰イオン交換カラムから脱硫酸化及び溶出したメタノール抽出物のＨＰＬＣ分析を含むＨＰＬＣ−ＵＶ脱硫酸化法；例えばBotting et al. (2002, J. Agric. Food Chem. 50 (5): 983-988)によって記載される、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によるインタクトなＧＳＬの分析；例えばFont et al. (2005, J. Agric. Sci. 143: 65-73)によって記載される近赤外反射スペクトル；例えばClarke (2010, Anal. Methods 2: 310-325)によって要約される、活性分解産物を分光光度的に生じさせる方法；例えばRochfort et al. (2008, Phytochemistry 69: 1671)によって記載される、インタクトなグルコシノレートのＨＰＬＣ質量分析を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「生物燻蒸」は、いくつかの土壌病原体及び疾患をコントロールするために、Brassicaceae（例えば、キャベツ、カリフラワー、ケール及びマスタード）、Capparidaceae（例えば、クレオメ）及びMoringaceae（例えば、西洋ワサビ）種などのＧＳＬ含有植物を、生物学的に活性な輪作緑肥作物として使用することを指す。
「作物植物」は、Brassica napus、（ＡＡＣＣ、２ｎ＝３８）、Brassica juncea（ＡＡＢＢ、２ｎ＝３６）、Brassica carinata（ＢＢＣＣ、２ｎ＝３４）、Brassica rapa（ｓｙｎ．B. campestris）（ＡＡ、２ｎ＝２０）、Brassica oleracea（ＣＣ、２ｎ＝１８）、又はBrassica nigra（ＢＢ、２ｎ＝１６）などの作物として栽培される植物種を指す。この定義は、Arabidopsis thalianaなどの雑草を包含しない。
「核酸」又は「核酸分子」という用語は、一本又は二本鎖形態のＤＮＡ又はＲＮＡ分子、特に本発明のタンパク質又はタンパク質フラグメントをコードするＤＮＡを指す。「内因性核酸」は、植物細胞内の核酸（例えば、Brassica細胞の核ゲノム内に存在するＧＴＲ遺伝子の内因性アレル）を指す。「単離された核酸」は、もはやその自然環境中、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ又はリコンビナント細菌若しくは植物のホスト細胞中にない核酸を指すのに使用される。
「遺伝子」という用語は、細胞においてＲＮＡ分子に転写され（例えば、イントロン配列を含むｍＲＮＡ前駆体に転写され、次いで成熟ｍＲＮＡにスプライシングされるか、又は、イントロン配列を含まないｍＲＮＡに直接的にスプライシングされるか、又は、ｍｉＲＮＡ前駆体にスプライシングされ）、調節領域（例えば、プロモーター）に機能的に連結されたＤＮＡ領域（転写領域）を含むＤＮＡフラグメントを意味する。従って、遺伝子は、いくつかの機能的に連結されたＤＮＡフラグメント（例えば、プロモーター、例えば翻訳開始に関与する配列を含む５’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、及び例えば転写終結部位を含む３’非翻訳配列）を含み得る。「内因性遺伝子」は、「外来遺伝子」、「トランスジーン」、又は「キメラ遺伝子」から区別するのに使用され、特定の植物属、種、又は品種の植物に由来する遺伝子を指し、それはトランスフォーメーションによりその植物中に導入されていない（すなわち、それは「トランスジーン」ではない）が、それは通常、その属、種、又は品種の植物中に存在するか、又は、別の植物の属、種、又は品種の植物からその植物に導入され、それにおいては通常、通常の育種技術により又は体細胞交雑により（例えば、プロトプラスト融合により）存在する。同様に、遺伝子の「内因性アレル」は、植物のトランスフォーメーションにより植物又は植物組織に導入されないが、例えば、植物の突然変異誘発及び／又は選択により生成されるか、又は、植物の自然集団をスクリーニングすることにより得られる。
本明細書において使用される「キメラ核酸構築物」は、植物種において通常は見られない核酸構築物を指す。キメラ核酸構築物は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。「キメラＤＮＡ構築物」及び「キメラ遺伝子」は、互換的に使用され、植物種において通常は見られない遺伝子を意味するか、又は、遺伝子のプロモーター又は１つ以上の他の調節領域が、転写ＤＮＡ領域の一部又は全部に本来は結合していない任意の遺伝子を指す。
「遺伝子の発現」又は「遺伝子発現」は、適切な調節領域、特にプロモーターに機能的に連結されたＤＮＡ領域がＲＮＡ分子に転写されるプロセスを指す。次いで、ＲＮＡ分子は、細胞内で、（転写後プロセスにより）例えばＲＮＡスプライシングによりさらにプロセシングされ、翻訳が開始され、アミノ酸鎖（ポリペプチド）に翻訳され、翻訳終止コドンにより翻訳が終結する。「機能的に発現される」という用語は、本明細書において、機能タンパク質が産生されることを示すのに使用される；「非機能的に発現される」という用語は、有意に減少した機能性（生物学的活性）を有するか、又は機能性（生物学的活性）を有しないタンパク質が産生されること、又は、タンパク質が産生されないことを示すのに使用される（さらに以下を参照のこと）。ＲＮＡ分子は、それが別の核酸又はタンパク質と相互作用できるか、又は生物学的に活性なポリペプチド又はタンパク質に翻訳され得る場合に、生物学的に活性である。遺伝子は、遺伝子発現の最終産物が、生物学的に活性なＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム又はｍｉＲＮＡなど）である場合に、ＲＮＡをコードすると言われる。遺伝子は、遺伝子発現の最終産物が、タンパク質又はポリペプチドである場合に、タンパク質をコードすると言われる。遺伝子は、遺伝子発現の最終産物が、ＧＴＲ機能活性をダウンレギュレーションできる（すなわち、ＧＴＲ遺伝子発現及び／又はＧＴＲタンパク質活性をダウンレギュレーションできる）場合に、ＧＴＲ阻害ＲＮＡをコードすると言われる。
本発明の目的のために、「植物機能プロモーター」及び「植物発現プロモーター」という用語は、植物、植物組織、植物器官、植物部分又は植物細胞において転写を開始できるプロモーターを意味する。これは、任意の植物起源プロモーターを含むが、植物細胞において転写を指令できる任意の非植物起源プロモーターも含む。
この点において使用され得るプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写産物のプロモーター（Harpster et al., 1988, Mol. Gen. Genet. 212: 182-190）、ＣａＭＶ １９Ｓプロモーター（US 5,352,605; WO 84/02913; Benfey et al., 1989, EMBO J. 8:2195-2202）、地下クローバーウイルスプロモーターＮｏ４又はＮｏ７（WO 96/06932）、ルビスコ小サブユニットプロモーター（US 4,962,028）、ユビキチンプロモーター（Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29:637-649）、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子プロモーター（例えば、Agrobacteriumに由来するオクトピン合成（ＯＣＳ）及びノパリン合成（ＮＯＳ）プロモーター）、及び、植物において構成的に発現することが当業者に公知である遺伝子のさらなるプロモーターなどの構成的プロモーターである。
この点において使用され得るさらなるプロモーターは、２Ｓアルブミンプロモーター（Joseffson et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:12196-12201）、ファセオリンプロモーター（US5,504,200; Bustos et al., 1989, Plant Cell 1.(9):839-53）、レグミンプロモーター（Shirsat et al., 1989, Mol. Gen. Genet. 215(2):326-331）、「未知の種子タンパク質」（ＵＳＰ）プロモーター（Baumlein et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 225(3):459-67）、ナピンプロモーター（US5,608,152; Stalberg et al., 1996, Planta 199:515-519）、Arabidopsisオレオシンプロモーター（WO 98/45461）、Brassica Ｂｃｅ４プロモーター（WO 91/13980）、及び、植物において種子特異的に発現することが当業者に公知である遺伝子のさらなるプロモーターなどの組織特異的又は器官特異的プロモーター、好ましくは種子特異的プロモーターである。
使用され得る他のプロモーターは、器官原基特異的プロモーター（An et al., 1996, Plant Cell 8: 15-30）、茎特異的プロモーター（Keller et al., 1988, EMBO J. 7(12): 3625-3633）、葉特異的プロモーター（Hudspeth et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12: 579-589）、葉肉特異的プロモーター（例えば、光誘導性ルビスコプロモーター）、根特異的プロモーター（Keller et al., 1989, Genes Dev. 3: 1639-1646）、塊茎特異的プロモーター（Keil et al., 1989, EMBO J. 8(5): 1323-1330）、維管束組織特異的プロモーター（Peleman et al., 1989, Gene 84: 359-369）、雄しべ選択的プロモーター（WO 89/10396, WO 92/13956）、裂開帯特異的プロモーター（WO 97/13865）などの組織特異的又は器官特異的プロモーターである。
本発明によるキメラＲＮＡ構築物は、WO90/12107、WO03/052108又はWO2005/098004に記載されているような手段及び方法を使用して、植物細胞に送達され得る。
「タンパク質」又は「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用され、特定の作用機序、サイズ、３次元構造、又は由来に関係なく、アミノ酸の鎖からなる分子を指す。従って、ＧＴＲタンパク質の「フラグメント」又は「部分」は、依然として「タンパク質」と称され得る。「単離されたタンパク質」は、もはやその自然環境中、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ又はリコンビナント細菌若しくは植物のホスト細胞中にないタンパク質を指すのに使用される。
「輸送タンパク質」という用語は、特定の物質又は特定のクラスの密接に関連する物質が、膜を通過するのを助ける膜貫通タンパク質を指すのに使用される。「グルコシノレート輸送タンパク質」（本明細書において「ＧＴＲ」と略される）は、グルコシノレートの輸送に関与するプロトン依存性オリゴペプチド輸送（ＰＯＴ）タンパク質である。
「ＧＴＲ遺伝子」という用語は、本明細書において、グルコシノレート輸送（ＧＴＲ）タンパク質をコードする核酸配列を指すのに使用される。
本明細書において使用される「アレル」という用語は、特定のローカスにある遺伝子の１つ以上の別の形態のいずれかを意味する。生物の二倍体（又は複二倍体）細胞において、所定の遺伝子のアレルは、染色体上の特定の位置又はローカス（ローサイ（複数形））に位置する。１つのアレルは、相同染色体の対の各染色体上に存在する。
本明細書において使用される「相同染色体」という用語は、同じ生物学的特性の情報を含み、かつ、同じローカスにある同じ遺伝子だがその遺伝子のおそらく異なるアレルを含む染色体を意味する。相同染色体は、減数分裂中に対を形成する染色体である。「非相同染色体」は、生物のすべての生物学的特性を表わし、セットを形成し、細胞中のセットの数は倍数性と称される。二倍体生物は、２セットの非相同染色体を含み、各相同染色体は、異なる親から遺伝される。複二倍体の種において、本質的に２セットの二倍体ゲノムが存在し、それにより２つのゲノムの染色体は、「類似相同（ホメオロガス）染色体」と称される（そして同様に、２つのゲノムのローカス又は遺伝子は、類似相同ローカス又は遺伝子と称される）。二倍体、又は複二倍体の植物種は、特定のローカスに多数の異なるアレルを含み得る。
本明細書において使用される「ヘテロ接合性」という用語は、２つの異なるアレルが特定のローカスに存在するが、細胞中の相同染色体の対応する対に個別に位置する場合に存在する遺伝的条件を意味する。反対に、本明細書において使用される「ホモ接合性」という用語は、２つの同一のアレルが特定のローカスに存在するが、細胞中の相同染色体の対応する対に個別に位置する場合に存在する遺伝的条件を意味する。
本明細書において使用される「ローカス」（ローサイ（複数形））は、例えば遺伝子又は遺伝子マーカーが見出される染色体上の特定の場所（単数）若しくは場所（複数）又は部位を意味する。例えば、「ＧＴＲ−Ａ１ローカス」は、ＧＴＲ−Ａ１遺伝子（及び２つのＧＴＲ−Ａ１アレル）が見出され得るＡゲノムの染色体上の位置を指すのに対して、「ＧＴＲ−Ｃ１ローカス」は、ＧＴＲ−Ｃ１遺伝子（及び２つのＧＴＲ−Ｃ１アレル）が見出され得るＣゲノムの染色体上の位置を指す。
本発明の「植物（単数）」又は「植物（複数）」を参照する場合はいつでも、植物部分、親の識別特徴（特に、特定の植物部分におけるグルコシノレート含量）を保持する植物の後代（例えば、自家受粉又は交雑により得られる種子、例えば雑種種子（２つの自殖の親系統を交雑することにより得られる）、雑種植物、及びそれらに由来する植物部分も、特に示さない限り、本明細書に包含されることが理解される。
本明細書において使用される「植物部分」は、植物細胞、植物組織、植物器官、長角果又は種子鞘、種子、切断部分（例えば、根、葉、花、花粉など）を含む植物の任意の部分を指す。
「分子アッセイ」（又は試験）は、本明細書において、１つ又は両方のＧＴＲローカスでの（例えば、ＧＴＲ−Ａ１又はＧＴＲ−Ｃ１ローカスの１つ又は両方での）１つ以上の特定のＧＴＲアレルの存在又は非存在を（直接的又は間接的に）示すアッセイを指す。一実施態様では、それによって、特定の（野生型又は突然変異）アレルが、任意の植物個体におけるローカスでホモ接合性又はヘテロ接合性であるか否かを決定することが可能になる。
本明細書において使用される「野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）」（「ｗｉｌｄｔｙｐｅ」又は「ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ」とも記載される）は、それが自然界で最も多く存在する植物又は遺伝子の典型的な形態を指す。「野生型植物」は、自然集団におけるこのような植物の最も多い表現型を有する植物を指す。「野生型アレル」は、野生型表現型を作るために必要とされる遺伝子のアレルを指す。対照的に、「突然変異植物」は、自然集団におけるこのような植物の異なる稀な表現型を有する植物、又は、ヒトの介入により（例えば、突然変異誘発により）作られる植物を指し、「突然変異アレル」は、突然変異表現型を作るために必要とされる遺伝子のアレルを指す。
本明細書において使用される「野生型ＧＴＲ」（例えば、野生型ＧＴＲ−Ａ１又はＧＴＲ−Ｃ１）という用語は、植物、特にBrassicaceae植物、特にArabidopsis及びBrassica植物内で見出される自然発生ＧＴＲアレルを意味し、機能性ＧＴＲタンパク質（例えば、それぞれ機能性ＧＴＲ−Ａ１又はＧＴＲ−Ｃ１）をコードする。対照的に、本明細書において使用される「突然変異ＧＴＲ」（例えば、突然変異ＧＴＲ−Ａ１又はＧＴＲ−Ｃ１）という用語は、機能性ＧＴＲタンパク質をコードしないＧＴＲアレルすなわち、非機能性ＧＴＲタンパク質（例えば、それぞれ非機能性ＧＴＲ−Ａ１又はＧＴＲ−Ｃ１）をコードするＧＴＲアレルを指し、これは、本明細書において使用される場合、生物学的活性を有しないか、又は対応する野生型の機能性ＧＴＲタンパク質と比較して有意に減少した生物学的活性を有するＧＴＲタンパク質、又は、ＧＴＲタンパク質を全くコードしないＧＴＲタンパク質を指す。このような「突然変異ＧＴＲアレル」（「完全ノックアウト」又は「ヌル」アレルとも称される）は、野生型ＧＴＲアレルであり、１つ以上の突然変異であって、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞における機能性ＧＴＲタンパク質の（絶対又は相対）量の有意な減少をもたらす突然変異をその核酸配列中に含む。ＧＴＲタンパク質をコードする核酸配列の突然変異アレルは、本明細書において、「ｇｔｒ」（例えば、それぞれｇｔｒ−ａ１又はｇｔｒ−ｃ１）と称される。突然変異アレルは、「自然突然変異」アレル（これは、自然界で見出される（例えば、ヒトによる突然変異原の適用なしに自発的に産生される）突然変異アレルである）又は「誘発突然変異」アレル（これは、ヒトの介入により（例えば、突然変異誘発により）誘発される）のいずれかであり得る。
「有意に減少した量の機能性ＧＴＲタンパク質」（例えば、機能性ＧＴＲ−Ａ１又はＧＴＲ−Ｃ１タンパク質）は、突然変異ＧＴＲアレルを含まない細胞により産生される機能性ＧＴＲタンパク質の量と比較して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％（すなわち、機能性ＧＴＲタンパク質が細胞により産生されない）の、突然変異ＧＴＲアレルを含む細胞により産生される機能性ＧＴＲタンパク質の量の減少を指す。この定義は、ｉｎ ｖｉｖｏでＧＳＬ輸送活性を有しない「非機能性」ＧＴＲタンパク質（例えば、トランケーションされたＧＴＲタンパク質）の産生、機能性ＧＴＲタンパク質の絶対量の減少（例えば、ＧＴＲ遺伝子における突然変異のために、機能性ＧＴＲタンパク質が作られないこと）、及び／又は、機能性野生型ＧＴＲタンパク質の活性と比較して、有意に減少したＧＳＬ輸送活性を有するＧＴＲタンパク質の産生を包含する（このようなＧＴＲタンパク質では、コードされるＧＴＲタンパク質のＧＳＬ輸送活性に重要な１つ以上のアミノ酸残基が、以下に例示する通り、別のアミノ酸残基に置換されている）。本明細書において使用される「突然変異ＧＴＲタンパク質」という用語は、突然変異ＧＴＲ核酸配列（「ｇｔｒ」アレル）によりコードされるＧＴＲタンパク質であって、突然変異が、非突然変異の野生型ＧＴＲ配列（「ＧＴＲアレル」）によりコードされるＧＴＲタンパク質の活性と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＧＴＲ活性の有意な減少及び／又は消失をもたらす、ＧＴＲタンパク質を指す。
本明細書において使用される「突然変異誘発」は、植物細胞（例えば、複数のBrassica種子又は他の部分、例えば花粉など）を、細胞のＤＮＡにおいて突然変異を誘発する技術（例えば、変異原性薬剤、例えば化学物質（例えば、エチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）など）との接触、又は、電離放射線（中性子（例えば、高速中性子突然変異誘発など）、アルファ線、ガンマ線（例えば、コバルト６０供給源により供給されるもの）、Ｘ線、ＵＶ照射など、又は、これらの２つ以上の組み合わせ）に供するプロセスを指す。従って、１つ以上のＧＴＲアレルの所望の突然変異誘発は、化学的手段の使用により（例えば、１つ以上の植物組織とエチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）などとの接触により）、物理的手段（例えば、ｘ線など）の使用により、又はガンマ照射（例えば、コバルト６０供給源により供給されるもの）により達成され得る。放射線照射により引き起こされる突然変異は、大きな欠失又は他の甚だしい損傷（例えば、転座又は複雑な再配列）であることが多いのに対して、化学的突然変異原により引き起こされる突然変異は、より個別な損傷（例えば、点突然変異）であることが多い。例えば、ＥＭＳは、グアニン塩基をアルキル化し、それは塩基の誤対合をもたらす：アルキル化されたグアニンは、チミン塩基と対合し、主にＧ／ＣからＡ／Ｔ転位をもたらす。
本明細書において使用される「非自然発生」という用語は、植物に関して使用される場合、人間により改変されているゲノムを有する植物を意味する。トランスジェニック植物は、例えば、外因性の核酸分子（例えば、転写された場合に、内因性遺伝子（例えば、本発明のＧＴＲ遺伝子）の発現を減少させることができる生物学的に活性なＲＮＡ分子を生じる転写領域を含むキメラ遺伝子）を含み、従って、人間により遺伝子改変されている非自然発生植物である。加えて、変異原性薬剤への曝露の結果としての内因性遺伝子における突然変異（例えば、内因性ＧＴＲ遺伝子（例えば、調節エレメント又はコード配列）における突然変異）を含む植物も、人間により遺伝的に改変されているので、非自然植物と見なす。さらに、例えば、同じ又は別の種（例えば、Brassica juncea又はrapa）の植物を用いる方向性を持った育種プロセス（例えば、マーカー利用育種及び選択又は遺伝子移入）の結果としての、内因性遺伝子における突然変異（例えば、内因性ＧＴＲ遺伝子における突然変異（これは、自然界ではその特定の植物種において存在しない））を含む特定の種（例えば、Brassica napus）の植物も、非自然発生植物と見なされる。対照的に、自発的な又は自然発生の突然変異だけ含む植物（すなわち、人間により遺伝的に改変されていない植物）は、本明細書において定義される「非自然発生植物」ではなく、従って、本発明内に包含されない。当業者は、非自然発生植物が、典型的には、自然発生植物と比較して変化したヌクレオチド配列を有し、非自然発生植物も、そのヌクレオチド配列を変えることなく、例えば、そのメチル化パターンを改変することにより人間により遺伝的に改変され得ることを理解する。
遺伝子又はタンパク質の「オルソログ」という用語は、本明細書において、別の種において見出される相同遺伝子又はタンパク質を指し、それは、その遺伝子又はタンパク質と同じ機能を有するが、その遺伝子を持つ種が分岐した（すなわち、遺伝子が共通の祖先から種分化により進化した）時点から配列において（通常は）分岐している。従って、例えば、Brassica napusＧＴＲ遺伝子のオルソログは、他の植物種（例えば、Brassica junceaなど）において、両配列の比較（例えば、配列全体にわたる又は特定のドメインにわたるパーセンテージ配列同一性に基づき）及び／又は機能解析に基づき同定され得る。
「品種」は、本明細書において、ＵＰＯＶ条約に準拠して使用され、単一植物分類群の公知の最下位階級内で植物をグループ化することを指し、そのグループ化は、所定の遺伝子型又は遺伝子型の組み合わせに起因する特徴の発現により定義され得、前記特徴の少なくとも１つの発現により任意の他の植物グループ化から識別され得、変化せずに繁殖する（安定である）ためのその適合性に関する単位と見なされる。
「含む」という用語は、記載した部分、工程、又は構成要素の存在を特定すると解釈すべきであるが、１つ以上のさらなる部分、工程、又は構成要素の存在を除外しない。従って、特定の形質を含む植物は、さらなる形質を含み得る。ヌクレオチド又はアミノ酸の配列を含む核酸又はタンパク質は、実際に引用されたものよりも多くのヌクレオチド又はアミノ酸を含み得る（すなわち、より大きな核酸又はタンパク質に組み込まれ得る）。機能的又は構造的に定義されるＤＮＡ領域を含むキメラ遺伝子は、さらなるＤＮＡ領域などを含み得る。
単数形の単語（例えば、植物（ｐｌａｎｔ）又は根（ｒｏｏｔ））を指す場合、複数形（例えば、複数の植物（ａ ｐｌｕｒａｌｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ）、複数の根（ａ ｐｌｕｒａｌｉｔｙ ｏｆ ｒｏｏｔｓ））も本明細書において含まれると理解される。従って、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素の参照は、文脈が明らかに１つ又は１つだけの要素が存在することを必要としない限り、１を超える要素が存在する可能性を除外しない。従って、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常は、「少なくとも１つ」を意味する。
本発明の目的のために、２つの関連するヌクレオチド又はアミノ酸配列の「配列同一性」は、パーセンテージで表わし、比較される位置の数により割った同一の残基（×１００）を有する２つの最適にアライメントした配列における位置の数を指す。ギャップ（すなわち、残基が一方の配列において存在するが、他方においては存在しないアラインメント中の位置）は、非同一残基を有する位置と見なされる。２つの配列の「最適なアラインメント」は、The European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277；例えば、http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.htmlを参照のこと）におけるNeedleman及びWunschのグローバルアラインメントアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3): 443-53）に従って、デフォルト設定（ギャップ開始ペナルティ＝１０（ヌクレオチドに関して）／１０（タンパク質に関して）及びギャップ伸長ペナルティ＝０．５（ヌクレオチドに関して）／０．５（タンパク質に関して））を使用して、２つの配列を全長にわたりアラインメントすることにより見出される。ヌクレオチドに関して、使用するデフォルトスコアリングマトリックスは、ＥＤＮＡＦＵＬＬであり、タンパク質に関して、デフォルトスコアリングマトリックスは、ＥＢＬＯＳＵＭ６２である。
ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列が、対応するＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を参照して定義される場合はいつでも、ヌクレオチド配列中のチミン（Ｔ）は、ウラシル（Ｕ）で置換されるべきであることは明らかである。参照するのがＲＮＡ又はＤＮＡ分子であるかは、本出願の文脈から明らかである。
本明細書において使用される「実質的に同一の」又は「本質的に類似の」は、上記に定義されるように最適にアラインメントされた場合に、少なくとも一定の最小パーセンテージの配列同一性（以下でさらに定義される）を共有する配列を指す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、所定のヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を同定するのに使用され得る。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況では異なるであろう。一般的には、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで特定の配列に関して熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、ターゲット配列の５０％が、パーフェクトマッチプローブとハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨ下）である。典型的には、塩濃度がｐＨ７で０．０２モルであり、温度が少なくとも６０℃であるストリンジェントな条件が選択される。塩濃度を減少させること及び／又は温度を増加させることによって、ストリンジェンシーが増加する。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば、１００ｎｔのプローブを使用するノーザンブロット）のためのストリンジェントな条件は、例えば、０．２×ＳＳＣ、６３℃における２０分間の洗浄を少なくとも１回含むものであるか、又は同等の条件である。
「高ストリンジェンシーな条件」は、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、３．０Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍ Ｎａクエン酸（ｐＨ７．０））、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ（１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓは、２％Ｆｉｃｏｌｌ、２％ポリビニル・ピロリドン、２％ウシ血清アルブミン）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウ（ＳＤＳ）、及び非特異的コンペティターとしての２０μg/ml変性キャリアＤＮＡ（一本鎖魚精子ＤＮＡ、平均長１２０〜３０００ヌクレオチド）を含む水溶液における６５℃でのハイブリダイゼーションにより提供され得る。ハイブリダイゼーションに続き、高ストリンジェンシーな洗浄が、いくつかの工程において、０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション温度での最終洗浄（約３０分）で行われ得る。
「中ストリンジェンシーな条件」は、上記溶液におけるハイブリダイゼーションと同等であるが、約６０〜６２℃の条件を指す。中ストリンジェンシーな洗浄は、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション温度で行われ得る。
「低ストリンジェンシー」は、上記溶液におけるハイブリダイゼーションと同等で、約５０〜５２℃の条件を指す。低ストリンジェンシーな洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション温度で行われ得る。Sambrook et al.(1989)及びSambrook and Russell(2001)も参照のこと。
発明の詳細な説明
本発明は、モデル植物Arabidopsis thaliana（Nour-Eldin, 2007、前掲）におけるＧＳＬ輸送（ＧＴＲ）タンパク質及び対応するＧＴＲ遺伝子の同定に基づく。本発明者らは、ArabidopsisのＧＴＲ遺伝子が、ＧＴＲ１〜６と名付けられた６個のホモログ（図１ａ）で小さいサブクレードを形成することを見出した。本発明者らは、ＧＴＲ１又はＧＴＲ２トランスポーターのいずれかをノックアウトしたArabidopsis植物の種子は、野生型植物と比較して、総脂肪族ＧＳＬ濃度がそれぞれ有意に減少しなかったか又は約５０％減少したこと、及び、ＧＴＲ１及びＧＴＲ２トランスポーターの両方をノックアウトしたArabidopsis植物の種子は、ゼロＧＳＬ種子表現型であったことをさらに見出した。驚くべきことに、ｇｔｒノックアウト植物に由来する老化葉のＧＳＬレベルは高かったのに対して、野生型植物では、老化すると葉はＧＳＬが激減していた。本発明者らは、Brassica rapa（ゲノムＡＡ、２ｎ＝２０）及びBrassica oleracea（ゲノムＣＣ、２ｎ＝１８）がそれぞれ、３個のＧＴＲ１遺伝子及び３個のＧＴＲ２遺伝子をそれらのゲノム中に含むのに対して、Brassica napus（ゲノムＡＡＣＣ、２ｎ＝４ｘ＝３８）（これは、その起源が二倍体祖先に由来するため、本質的には、２個の二倍体ゲノム（Ａ及びＣゲノム）を含む異質四倍体（複二倍体）種である）は、６個のＧＴＲ１遺伝子及び６個のＧＴＲ２遺伝子（６個のＧＴＲ１及びＧＴＲ２遺伝子の３個はＡゲノム上に位置し、３個はＣゲノム上に位置する）をそのゲノム中に含むことをさらに見出した。Brassica juncea（ゲノムＡＡＢＢ、２ｎ＝４ｘ＝３６）（これは、本質的には、２個の二倍体ゲノム（Ａ及びＢゲノム）を含む別の異質四倍体種である）も、６個のＧＴＲ２遺伝子（６個のＧＴＲ２の３個はＡゲノム上に位置し、３個はＢゲノム上に位置する）をそのゲノム中に含む。Ａゲノム上に位置するＧＴＲ１及びＧＴＲ２遺伝子は、本明細書において「ＧＴＲｘ−Ａｙ」（ｘは１又は２であり、ｙは１、２又は３である）と称され、Ｃゲノム上に位置するＧＴＲ１及びＧＴＲ２遺伝子は、本明細書において「ＧＴＲｘ−Ｃｙ」（ｘは１又は２であり、ｙは１、２又は３である）と称される。Ｂゲノム上に位置するＧＴＲ１及びＧＴＲ２遺伝子は、本明細書において「ＧＴＲｘ−Ｂｙ」（ｘは１又は２であり、ｙは１、２又は３である）と称される。B. napusに由来するＧＴＲｘ−Ａｙ遺伝子は、B. napusに由来する対応するＧＴＲｘ−Ｃｙ遺伝子と「類似相同」であると言われる。すなわち、「Ａ遺伝子」は、Ａゲノム上に見られ、二倍体祖先B. rapa（ＡＡ）に由来するのに対して、「Ｃ遺伝子」は、B. napusのＣゲノム上に見られ、二倍体祖先B. oleracea（ＣＣ）に由来する。同様に、B. junceaに由来するＧＴＲｘ−Ａｙ遺伝子は、B. junceaに由来する対応するＧＴＲｘ−Ｂｙ遺伝子と「類似相同」であると言われる。すなわち、「Ａ遺伝子」は、Ａゲノム上に見られ、二倍体祖先B. rapa（ＡＡ）に由来するのに対して、「Ｂ遺伝子」は、B. napusのＢゲノム上に見られ、二倍体祖先B. nigra（ＢＢ）に由来する。
任意の二倍体ゲノムにおけるように、２つの「アレル」が、ゲノム中の各ＧＴＲローカスにおける各ＧＴＲ遺伝子に関して、ｉｎ ｖｉｖｏで存在し得る（一方のアレルが一方の染色体上で見出される遺伝子配列であり、他方が相同染色体上で見出される遺伝子配列である）。各ＧＴＲ遺伝子に関して存在する異なるアレル候補の数は、種集団において、全体として２よりもずっと大きくなり得るが、これらの２つのアレルのヌクレオチド配列は、任意の所定の植物において、同一であり得るか（ホモ接合性植物）、又は異なり得る（ヘテロ接合性植物）。
本明細書において、Brassicaceae種に由来する野生型及び突然変異ＧＴＲ遺伝子／アレルの核酸配列、並びに野生型及び突然変異ＧＴＲタンパク質が提供される。また、Brassicaceae植物、並びに、それらのゲノム中に野生型及び突然変異ＧＴＲアレルの特定の組み合わせを含むBrassicaceae植物及び植物部分において、突然変異及び野生型ＧＴＲアレルを生成及び組み合わせ、それによりＧＳＬ含量がこれらの植物の特定の部分において改変される方法が提供される。突然変異ＧＴＲアレルを他の植物に移すためのこれらの植物の使用も、本発明の実施態様であり、記載される植物のいずれかの植物産物も同様である。加えて、ＧＴＲ遺伝子及び／又はアレルを組み合わせるか、又は検出するためのマーカー利用選択（ＭＡＳ）のためのキット及び方法が提供される。本発明の異なる実施態様は、本明細書において以下に詳細に記載される。
本発明の核酸配列
Brassicaceae、特にBrassica種、特にBrassica napus、Brassica juncea、Brassica rapa又はBrassica oleracea、しかしさらに他のBrassica作物種に由来するＧＴＲ遺伝子の、機能性ＧＴＲタンパク質をコードする野生型ＧＴＲ核酸配列、及び、突然変異ｇｔｒ核酸配列（１つ以上の突然変異、好ましくはコードされるＧＴＲタンパク質のＧＳＬ輸送活性の消失又は有意な減少をもたらすか、又は、ＧＴＲタンパク質の無産生をもたらす突然変異を含む）の両方が提供される。例えば、Ａ及び／又はＣゲノムを含むBrassica種は、ＧＴＲ−Ａ又はＧＴＲ−Ｃ遺伝子の異なるアレル（これは、本発明の単一の植物において同定され、組み合わせられ得る）を含み得る。さらに、突然変異誘発方法は、野生型ＧＴＲアレルにおいて突然変異を生成し、それにより本発明の使用のための突然変異ｇｔｒアレルを作製するのに使用され得る。特定のＧＴＲアレルは、好ましくは、植物において交雑及び選択により組み合わせられるため、一実施態様では、植物（例えば、Brassica植物、好ましくはBrassica napus、Brassica juncea、Brassica rapa又はBrassica oleraceaと交雑され得るか、又は「合成」Brassica napus植物を作るために使用され得るBrassica植物）内の（すなわち、内因性の）ＧＴＲ及び／又はｇｔｒの核酸配列が提供される。異なるBrassica種の間でのハイブリダイゼーションが、当技術分野において記載されている（例えば、Snowdon(2007, Chromosome research 15:85-95)を参照のこと）。種間ハイブリダイゼーションは、例えば、遺伝子を、例えば、B. napus（ＡＡＣＣ）中のＣゲノムからB. carinata（ＢＢＣＣ）中のＣゲノムへ、あるいは、例えば、B. napus（ＡＡＣＣ）中のＣゲノムからB. juncea（ＡＡＢＢ）中のＢゲノムへ（それらのＣゲノムとＢゲノムの間の非正統的組換えの散発性事象により）移すのに使用され得る。「再合成」又は「合成」Brassica napus系統は、元の祖先、B. oleracea（ＣＣ）及びＢ．ｒａｐａ（ＡＡ）を交雑することにより作製され得る。種間、及びさらには属間の不適合性バリアは、Brassica作物種とそれらの近縁種の間での交雑において、例えば、胚救出技術又はプロトプラスト融合により上手く克服され得る（例えば、Snowdon、上記を参照のこと）。
しかしながら、単離されたＧＴＲ及びｇｔｒ核酸配列（例えば、植物からクローニングにより単離されたか、又はＤＮＡ合成により合成的に作られた）、並びにその変異体及びこれらのいずれかのフラグメントも、本明細書において提供される。というのも、これらは、機能性及び突然変異アレルの所望の組み合わせを有する植物を作製するために、いずれの配列が植物又は植物部分において内因的に存在し、その配列が機能性若しくは非機能性タンパク質をコードするのか又はタンパク質をコードしないのか（例えば、下に記載するリコンビナントホスト細胞における発現による）を判断するために、及び、ある植物に由来する特定のアレルを選択して別の植物へ移すために使用され得るからである。
本発明の「ＧＴＲ核酸配列」又は「ＧＴＲ変異体核酸配列」は、配列番号２と少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、又は、配列番号１又と少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列である。これらの核酸配列は、また、配列表において提供されるＧＴＲ配列と「本質的に類似する」又は「本質的に同一である」とも称され得る。
配列表に図示されるＧＴＲ１〜６の核酸配列は、Arabidopsisから単離され、ＧＴＲｘ−Ａｙの核酸配列は、B. rapa、B. juncea及びB. napusから単離され、ＧＴＲｘ−Ｂｙの核酸配列は、B. junceaから単離され、ＧＴＲｘ−Ｃｙの核酸配列は、B. oleracea及びB. napusから単離された。野生型ＧＴＲの配列は図示されるのに対して、これらの配列及びこれらに本質的に類似する配列の突然変異ｇｔｒ配列は、野生型ＧＴＲの配列を参照して、本明細書において以下及び実施例に記載される。ＧＴＲタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ及び対応するｍＲＮＡ前駆体は、３個のイントロン（５’末端からイントロン１〜３と番号付けされる）によって分断される４個のエクソン（５’末端からエクソン１〜４と番号付けされる）を含む。配列表に図示されるように、ｃＤＮＡ及び対応するプロセシングされたｍＲＮＡ（すなわち、スプライスされたＲＮＡ）において、イントロンは除去されており、エクソンは結合している。エクソン配列は、イントロン配列よりも進化的に保存されているため、あまり変化しない。
本発明の「ＧＴＲ１、２、３、４、５又は６核酸配列」又は「ＧＴＲ１、２、３、４、５又は６変異体核酸配列」は、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０若しくは１２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であるか、又は配列番号１、３、５、７、９若しくは１１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列である。これらの核酸配列は、配列表において提供されるＧＴＲ配列と「本質的に類似」又は「本質的に同一」であるとも称され得る。
従って、本発明は、野生型の機能性ＧＴＲ１、２、３、４、５又は６タンパク質（その変異体及びフラグメント（以下でさらに定義される）を含む）をコードする核酸配列、並びに、これらのいずれかの突然変異核酸配列であって、核酸配列における突然変異が、好ましくは、野生型ＧＴＲタンパク質と比較して、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換をもたらす、突然変異核酸配列の両方を提供する。好ましくは、核酸配列における突然変異は、１つ以上のアミノ酸変化（すなわち、野生型アミノ酸配列との関連で、１つ以上のアミノ酸が挿入、欠失、及び／又は置換される）をもたらし、それによりＧＴＲタンパク質のＧＳＬ輸送活性が有意に減少するか、又は完全に消失する。ＧＴＲタンパク質のＧＳＬ輸送活性の有意な減少又は完全な消失は、本明細書において、ＧＳＬ含量が、突然変異ＧＴＲタンパク質を発現する植物の特定の部分において、対応する野生型ＧＴＲタンパク質を発現する植物と比較して改変されるような、ＧＴＲタンパク質のＧＳＬ輸送活性の減少又は消失を指す。
特異的ＧＴＲ核酸又はタンパク質の機能性を決定するために、これらは、Nour-Eldin et al. (2006, Plant Methods 2: 17)及び以下の実施例に記載されるように、例えば、Xenopus卵母細胞において機能的にスクリーニングされ得る。
植物、特にBrassicaceae植物における特異的ＧＴＲアレル又はタンパク質の機能性を決定するために、ＧＳＬ含量は、例えばHansen et al. (2007, Plant J. 50 (5): 902-910)によって記載されるように、又は、以下の実施例に記載されるように、例えばｓｅｐｈａｄｅｘ陰イオン交換カラムから脱硫酸化及び溶出されたメタノール抽出物のＨＰＬＣ−ＵＶ分析を実施することによって、例えば、異なる型の特異的ＧＴＲアレル又はタンパク質（例えば、突然変異型及び野生型の特異的ＧＴＲアレル又はタンパク質）を含む植物の特異的部分の間で比較され得る。
内因性の核酸配列及び単離された核酸配列の両方が、本明細書において提供される。また、本発明の別の態様によれば、プライマー又はプローブとして及びキットの構成要素としての使用のための、上記に定義されるＧＴＲ配列及びＧＴＲ変異体核酸配列のフラグメントが提供される（以下をさらに参照のこと）。ＧＴＲ核酸配列若しくはｇｔｒ核酸配列又はその変異体（定義される通り）の「フラグメント」は、様々な長さ、例えば、ＧＴＲ配列又はｇｔｒ配列（又は変異体配列）の少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、５０、１００、２００、５００、６００の連続ヌクレオチドであり得る。
機能性ＧＴＲタンパク質をコードする核酸配列
配列表に記載される核酸配列は、Arabidopsis、B. rapa、B. oleracea、B. juncea及びB. napusに由来する野生型の機能性ＧＴＲタンパク質をコードする。従って、これらの配列は、それらが単離された植物に対して内因性である。Brassica作物種、品種、育種系統、又は野生型アクセッションを含む他のBrassicaceae植物は、同じＧＴＲタンパク質又はその変異体をコードする他のＧＴＲアレルに関してスクリーニングされ得る。例えば、核酸ハイブリダイゼーション技術（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用する、例えばサザンブロット解析）又はＰＣＲベースの技術は、他のBrassicaceae植物、例えば様々なBrassica napus、oleracea及びrapaの品種、系統、又はアクセッションに対して内因性であるＧＴＲアレルを同定するのに使用され得、しかしさらにはBrassica juncea（特に、Ａゲノム上のＧＴＲアレル）及びBrassica carinata（特に、Ｃゲノム上のＧＴＲアレル）植物、器官及び組織が、他の野生型ＧＴＲアレルに関してスクリーニングされ得る。このような植物、植物器官又は組織をＧＴＲアレルの存在に関してスクリーニングするために、配列表に提供されるＧＴＲ核酸配列、又はこれらのいずれかの変異体若しくはフラグメントが使用され得る。例えば、配列全体又はフラグメントが、プローブ又はプライマーとして使用され得る。例えば、特異的プライマー又は縮重プライマーは、植物、植物器官又は組織のゲノムＤＮＡから、ＧＴＲタンパク質をコードする核酸配列を増幅するのに使用され得る。これらのＧＴＲ核酸配列は、単離され、標準的な分子生物学的技術を使用して配列決定され得る。次いで、バイオインフォマティクス解析は、アレルを特性決定するのに、例えば、いずれのＧＴＲアレルに配列が対応するか、及び、いずれのＧＴＲタンパク質又はタンパク質変異体が配列によりコードされるかを決定するために、使用され得る。
当技術分野において公知のリコンビナントＤＮＡ技術（例えば、Arabidopsis植物（これは、１つ以上の完全ノックアウトｇｔｒ突然変異アレルに関してホモ接合性である）又はBrassica植物（これは、１つ以上の完全ノックアウトｇｔｒ突然変異アレルに関してホモ接合性である）を使用する遺伝子相補試験）によって、又は、Nour-Eldin et al. (2006, Plant Methods 2, 17)によって記載されているように、Xenopus卵母細胞においてＧＴＲタンパク質を機能的スクリーニングすることによって、核酸配列が機能性ＧＴＲタンパク質をコードするか否かが分析され得る。
加えて、ＧＴＲ核酸配列及びその変異体（又はこれらのいずれかのフラグメント）は、本質的に類似の配列に関して核酸データベースをスクリーニングすることにより、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで同定され得ると理解される。同様に、核酸配列は、化学的に合成され得る。以下にさらに記載される本発明の核酸分子のフラグメントも提供される。フラグメントは、後述される特定の保存された機能ドメインだけをコードする核酸配列を含む。
突然変異ＧＴＲタンパク質をコードする核酸配列
野生型核酸配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換を含む核酸配列は、本発明の別の実施態様であり、このような突然変異核酸分子のフラグメントも同様である。このような突然変異核酸配列（ｇｔｒ配列と称される）は、以下でさらに記載される様々な公知の方法を使用して作製及び／又は同定され得る。この場合でも、このような核酸分子は、内因性形態及び単離された形態の両方で提供される。一実施態様では、突然変異は、コードされるＧＴＲタンパク質のアミノ酸配列において１つ以上の変化（欠失、挿入、及び／又は置換）をもたらす（すなわち、それは「サイレント突然変異」ではない）。別の実施態様では、核酸配列における突然変異は、野生型タンパク質と比較して、コードされるＧＴＲタンパク質のＧＳＬ輸送活性の有意な減少又は完全な消失をもたらす。
従って、核酸分子は、例えば、１つ以上の以下の突然変異を含み得る：（ａ）「ミスセンス突然変異」又は「置換突然変異」（これは、アミノ酸の別のアミノ酸への置換をもたらす核酸配列の変化である）；（ｂ）「ナンセンス突然変異」又は「終止コドン突然変異」（これは、未成熟終止コドンの導入及びそれによる翻訳の終結をもたらす（トランケーションされたタンパク質をもたらす）核酸配列の変化である）；植物遺伝子は、翻訳終止コドン「ＴＧＡ」（ＲＮＡ中のＵＧＡ）、「ＴＡＡ」（ＲＮＡ中のＵＡＡ）、及び「ＴＡＧ」（ＲＮＡ中のＵＡＧ）を含む；従って、（リーディングフレーム中の）翻訳される成熟ｍＲＮＡ中にあるはずのこれらのコドンの１つに起こる任意のヌクレオチドの置換、挿入、欠失は、翻訳を終結させる；（ｃ）１つ以上のアミノ酸の「挿入突然変異」（これは、１つ以上のコドンが、核酸のコード配列において加えられたことが原因である）；（ｄ）１つ以上のアミノ酸の「欠失突然変異」（これは、１つ以上のコドンが、核酸のコード配列において欠失されたことが原因である）；（ｅ）「フレームシフト突然変異」（これは、突然変異の下流において異なるフレームで翻訳される核酸配列をもたらす）。フレームシフト突然変異は、様々な原因（これは、例えば、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は重複であるが、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングに影響を与えて（スプライス部位突然変異）、フレームシフトをもたらし得る突然変異でもある）を有し得る。（ｆ）「スプライス部位突然変異」（ｍＲＮＡ前駆体配列の正しいスプライシングを変化させるか、又は無効にして、野生型と異なるアミノ酸配列のタンパク質をもたらす）。例えば、ＲＮＡスプライシング中に１つ以上のエクソンが省略されて、省略されたエクソンによってコードされるアミノ酸を欠くタンパク質が生じ得る。又は、リーディングフレームが誤ったスプライシングによって変更され得るか、又は１つ以上のイントロンが残り得るか、又は別のスプライスドナー若しくはアクセプターが生成され得るか、又はスプライシングが別の位置で（例えば、イントロン内で）開始され得るか、又は別のポリアデニル化シグナルが発生され得る。正しいｍＲＮＡ前駆体スプライシングは、ＧＴＲをコードする遺伝子のヌクレオチド配列における様々な突然変異によって影響され得る複合プロセスである。植物などの高等真核生物では、主なスプライセオソームは、５’スプライス部位（ドナー部位）にＧＵ及び３’スプライス部位（アクセプター部位）にＡＧを含むイントロンをスプライシングする。このＧＵ−ＡＧルール（又はＧＴ−ＡＧルール；Lewin, Genes VI, Oxford University Press 1998, pp885-920, ISBN 0198577788を参照のこと）は、真核性核遺伝子のスプライス部位の約９９％に受け継がれているのに対して、５’及び３’スプライス部位に他のジヌクレオチド（例えば、ＧＣ−ＡＧ及びＡＵ−ＡＣ）を含むイントロンはそれぞれ、わずか約１％及び０．１％を占めるにすぎない。５’スプライス部位（ドナー部位）にＧＵ及び３’スプライス部位（アクセプター部位）にＡＧを含むイントロンの例は、配列表に示される。
既に述べたように、核酸配列における突然変異は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏで有意に減少したＧＳＬ輸送活性を含むか、若しくはＧＳＬ輸送活性を含まない突然変異タンパク質をもたらすか、又はタンパク質の無産生をもたらすことが望ましい。野生型タンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含むタンパク質をもたらす任意の突然変異は、ＧＳＬ輸送活性の有意な減少又は消失を引き起こし得る。しかしながら、タンパク質の特定の部分における突然変異は、突然変異ＧＴＲタンパク質の機能の減少をもたらす可能性がより高い（例えば、トランケーションされたタンパク質をもたらす突然変異により、保存されたドメイン又は機能ドメインの重要な部分が欠如している）と理解される。
Arabidopsis ＧＴＲ１、２、３、４、５及び６タンパク質の保存された機能ドメインは、ＡｔＧＴＲ１（配列番号２）がＡｔ３ｇ４７９６０であり、ＡｔＧＴＲ２（配列番号４）がＡｔ５ｇ６２６８０であり、ＡｔＧＴＲ３（配列番号６）がＡｔ１ｇ１８８８０であり、ＡｔＧＴＲ４（配列番号８）がＡｔ１ｇ６９８６０であり、ＡｔＧＴＲ５（配列番号１０）がＡｔ１ｇ６９８７０であり、ＡｔＧＴＲ６（配列番号１２）がＡｔ１ｇ２７０８０であるArabidopsis Information Resource（TAIR）データベース（http://www.arabidopsis.org/）で発見され得るか、並びに／又は、Arabidopsis ＧＴＲ１、２、３、４、５及び６タンパク質配列を最適にアライメントして、アミノ酸配列Ｆ／ＶＡＬＴＫＰＴＬＧＭ／ＬＡＰＲＫＧＥ／ＡＩＳＳ（配列番号２の４４８〜４６６位のアミノ酸又は配列番号１４２のアミノ酸位置４７８〜４９６）及びそれと本質的に類似する配列（例えば、配列番号４の４６２〜４８０位のアミノ酸及び配列番号６の４３６〜４５４位のアミノ酸）；アミノ酸配列Ｌ／ＩＮｘｘｘＬＤｘＹ／ＦＹ／ＦｘｘｘｘｘｘｘｘｘＮｘｘＹ／Ｆ（配列番号２の５４５〜５６７位のアミノ酸又は配列番号１４２の５７５〜５９７位）及びそれと本質的に類似する配列などの保存されたドメイン（図１を参照のこと）を決定することによって発見され得る。
Brassica ＧＴＲタンパク質の対応する保存された機能ドメインは、Brassica及びArabidopsis ＧＴＲタンパク質を最適にアライメントして、ＴＡＩＲデータベースのアノテーション情報に基づいて、決定され得る。
Arabidopsis ＧＴＲ１、２及びＧＴＲ３は上記配列Ｆ／ＶＡＬＴＫＰＴＬＧＭ／ＬＡＰＲＫＧＥ／ＡＩＳＳを含むのに対して、Arabidopsis ＧＴＲ４、５及びＧＴＲ６はその配列を含まないことが見出された（図７のアライメントを参照のこと）。以下の実施例に詳述されるように、ＧＴＲ１、ＧＴＲ２及びＧＴＲ３は、Xenopus卵母細胞試験において、グルコシノレートの最大取り込み活性を示した。予測したように、ＧＴＲ２タンパク質のタンパク質構造は、１２個の膜貫通ドメインを含む（図８）。図８の破線矢印によって示されるように、この保存された配列は、タンパク質のカルボキシ末端付近でＧＴＲ１／２／３特異的ループを形成する。
ＢｎＧＴＲ１−Ａ１（配列番号１４アミノ酸位置４５６〜４７４）；ＢｎＧＴＲ１−Ａ２（配列番号１６アミノ酸位置４５９〜４７７）；ＢｎＧＴＲ１−Ａ３（配列番号１８アミノ酸位置４５７〜４７５）；ＢｎＧＴＲ１−Ｃ１（配列番号２０アミノ酸位置４５６〜４７４）；ＢｎＧＴＲ１−Ｃ２（配列番号２２アミノ酸位置４５９〜４７７）；ＢｎＧＴＲ１−Ｃ３（配列番号２４アミノ酸位置４５７〜４７５）；ＢｎＧＴＲ２−Ａ１（配列番号２６アミノ酸位置４５８〜４７６）；ＢｎＧＴＲ２−Ａ２（配列番号２８アミノ酸位置４５８〜４７６）；ＢｎＧＴＲ２−Ａ３（配列番号３０アミノ酸位置４５８〜４７６）；ＢｎＧＴＲ２−Ｃ１（配列番号３２アミノ酸位置４５８〜４７６）；ＢｎＧＴＲ２−Ｃ２（配列番号３４アミノ酸位置４０１〜４１９）；ＢｎＧＴＲ２−Ｃ３（配列番号３６アミノ酸位置４５７〜４７５）；ＢｒＧＴＲ１−Ａ１（配列番号３８アミノ酸位置４５６〜４７４）；ＢｒＧＴＲ１−Ａ２（配列番号４０アミノ酸位置４５９〜４７７）；ＢｒＧＴＲ１−Ａ３（配列番号４２アミノ酸位置４５７〜４７５）；ＢｒＧＴＲ２−Ａ１（配列番号４４アミノ酸位置４５８〜４７６）；ＢｒＧＴＲ２−Ａ２（配列番号４６アミノ酸位置４５８〜４７６）；ＢｒＧＴＲ２−Ａ３（配列番号４８アミノ酸位置４５８〜４７６）；ＢｏＧＴＲ１−Ｃ１（配列番号５０アミノ酸位置４５６〜４７４）；ＢｏＧＴＲ１−Ｃ２（配列番号５２アミノ酸位置４５９〜４７７）；ＢｏＧＴＲ１−Ｃ３（配列番号５４アミノ酸位置４５７〜４７５）；ＢｏＧＴＲ２−Ｃ１（配列番号５６アミノ酸位置４５８〜４７６）；ＢｏＧＴＲ２−Ｃ２（配列番号５８アミノ酸位置４５８〜４７６）；ＢｏＧＴＲ２−Ｃ３（配列番号６０アミノ酸位置４５８〜４７６）；ＢｊＧＴＲ２−Ａ１（配列番号１２０アミノ酸位置４５８〜４７６）；ＢｊＧＴＲ２−Ａ２（配列番号１２２アミノ酸位置４５８〜４７６）；ＢｊＧＴＲ２−Ａ３（配列番号１２４アミノ酸位置４５８〜４７６）；ＢｊＧＴＲ２−Ｂ１（配列番号１２６アミノ酸位置４０５〜４２３）；ＢｊＧＴＲ２−Ｂ２（配列番号１２８アミノ酸位置４５８〜４７６）及びＢｊＧＴＲ２−Ｂ３（配列番号１３０アミノ酸位置４５２〜４７０）を含む類似ドメインが、Brassica種のＧＴＲ１及びＧＴＲ２タンパク質において見られ得る。
最近、Arabidopsis thalianaのＧＴＲ１タンパク質は、配列番号２に表されるＧＴＲ１タンパク質と比較した場合に、３０アミノ酸の長さを有するアミノ末端延長ペプチドを含み得ることも見出され、プロテオミクスデータによって裏付けられた。Ｎ末端延長を有する変異体は、配列番号１４２において提供され、このようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４１において提供される。類似のＮ末端延長ペプチドは、B. rapa ＧＴＲ１＿Ａ１、ＧＴＲ１＿Ａ２、ＧＴＲ１＿Ａ３、B. napus ＧＴＲ１＿Ａ１、ＧＴＲ１＿Ａ２、ＧＴＲ１＿Ａ３、B. oleracea ＧＴＲ＿Ｃ１、ＧＴ１＿Ｃ２、ＧＴＲ１＿Ｃ３及びB. napus ＧＴＲ＿Ｃ１、ＧＴ１＿Ｃ２、ＧＴＲ１＿Ｃ３（配列番号１４３〜１５０）において見られ得る。類似の延長は、例えば、B. junceaに存在するＧＴＲ１＿Ｂ１、ＧＴＲ１＿Ｂ２及びＧＴＲ１＿Ｂ３において見られ得ることが予測され得る。この３０／２３アミノ酸配列を変化させる突然変異は、突然変異ＧＴＲ１タンパク質をもたらし得、これは、植物細胞中の異なる細胞内部位に局在するため、機能が減少したか、又は活性ではないＧＴＲ１タンパク質である。また、アミノ末端ペプチドは、タンパク質と相互作用して、一定の条件下（例えば、異なる種類のストレス）で、ＧＴＲ１活性に影響を与える調節機構を提供し得、この領域における突然変異は、この方法で機能性にも影響を与え得る。
従って、一実施態様では、上記突然変異の種類のいずれかの１つ以上を含む核酸配列が提供される。別の実施態様では、１つ以上の終止コドン（ナンセンス）突然変異、１つ以上の置換（ミスセンス）突然変異、及び／又は１つ以上のスプライス部位（フレームシフト）突然変異を含むｇｔｒ配列が提供される。上記突然変異核酸配列のいずれかは、それ自体で（単離形態で）提供され、このような配列を内因的に含む植物及び植物部分も同様である。本明細書における以下の表において、最も好ましいｇｔｒアレルが記載される。
本明細書において使用されるＧＴＲアレルにおけるナンセンス突然変異は、ＧＴＲアレルにおける突然変異であり、それにより１つ以上の翻訳終止コドンが、対応する野生型ＧＴＲアレルのコードＤＮＡ及び対応するｍＲＮＡ配列に導入される。翻訳終止コドンは、ＴＧＡ（ｍＲＮＡ中のＵＧＡ）、ＴＡＡ（ＵＡＡ）、及びＴＡＧ（ＵＡＧ）である。従って、コード配列においてインフレーム終止コドンの生成を引き起こす任意の突然変異（欠失、挿入、又は置換）は、翻訳の終結及びアミノ酸鎖のトランケーションをもたらす。一実施態様では、ナンセンス突然変異を含む突然変異ＧＴＲアレルは、単一ヌクレオチド置換（例えば、ＣＡＧからＴＡＧ、ＴＧＧからＴＡＧ又はＴＧＡ、ＣＧＡからＴＧＡ、ＣＡＡからＴＡＡなどの突然変異）により、インフレーム終止コドンがＧＴＲコドン配列中に導入されているＧＴＲアレルである（以下の表を参照のこと）。一態様では、ナンセンス突然変異を含む突然変異ＧＴＲアレルは、配列番号６６における２２９位のアミノ酸のコドンに対応する位置に、終止コドンを含むＧＴＲアレル（例えば、以下の実施例３の表７に示されるＧＴＲアレル）である。別の実施態様では、ナンセンス突然変異を含む突然変異ＧＴＲアレルは、二重ヌクレオチド置換（例えば、ＣＡＧからＴＡＡ、ＴＧＧからＴＡＡ、ＣＧＡからＴＡＡなどの突然変異）により、インフレーム終止コドンがＧＴＲコドン配列中に導入されているＧＴＲアレルである（以下の表を参照のこと）。さらに別の実施態様では、ナンセンス突然変異を含む突然変異ＧＴＲアレルは、三重ヌクレオチド置換（例えば、ＣＧＧからＴＡＡなどの突然変異）により、インフレーム終止コドンがＧＴＲコドン配列中に導入されているＧＴＲアレルである（以下の表を参照のこと）。トランケーションされたタンパク質は、突然変異の下流のコードＤＮＡによりコードされるアミノ酸（すなわち、ＧＴＲタンパク質のＣ末端部分）を欠き、突然変異の上流のコードＤＮＡによりコードされるアミノ酸（すなわち、ＧＴＲタンパク質のＮ末端部分）を保持する。突然変異ＧＴＲタンパク質が、野生型ＧＴＲタンパク質と比較してよりトランケーションされるほど、トランケーションは、ＧＴＲタンパク質の活性の有意な減少又は消失をよりもたらし得る。
本明細書における以下の表は、本明細書において提供されるArabidopsis及びBrassica ＧＴＲ配列における可能なナンセンス突然変異の範囲を記載する：

ＡｔＧＴＲ１に関して、この数は、３０ＡＡのＮ末端延長を考慮した位置に関して言及するために、９０ｎｔ又は３０ＡＡにより増加され得る。
配列番号１３７のＢｎＧＴＲ１−Ｃ２に関して、終止コドンは、ＥＭＳ変異誘発によって、以下の各位置で誘発され得る：１０３〜１０５、１２７〜１２９、１２２７〜１２２９、１２３９〜１２４１、１２５７〜１２５９、１３４４〜１３４６、１３９８〜１４００、１４２５〜１４２７、１４５８〜１４６０、１４７３〜１４７５、１６４１〜１６４３、１６４７〜１６４９、１７１０〜１７１２、１８６８〜１８７０、１８８６〜１８８８、１９３１〜１９３３、１９７０〜１９７２、１９９１〜１９９３、２０００〜２００２、２１６２〜２１６４、２２５２〜２２５４、２２７６〜２２７８、２３０９〜２３１１、２３２１〜２３２３、２３６６〜２３６８、２３８７〜２３８９、２５１６〜２５１８、２６１８〜２６２０、２６８７〜２６８９、２６９０〜２６９２。
当然ながら、突然変異は、上記表において示されるものに限定されず、配列表に図示され、上記表において言及されるもの以外にも、類似の終止コドン突然変異がｇｔｒアレルにおいて存在し得ると理解される。
本明細書において使用されるＧＴＲアレルにおけるミスセンス突然変異は、ＧＴＲアレルにおける任意の突然変異（欠失、挿入、又は置換）であり、それにより１つ以上のコドンが、対応する野生型ＧＴＲアレルのコードＤＮＡ及び対応するｍＲＮＡ配列に変化して、野生型ＧＴＲタンパク質中の１つ以上のアミノ酸の、突然変異ＧＴＲタンパク質中の１つ以上のアミノ酸への置換が起こる。一実施態様では、ミスセンス突然変異を含む突然変異ＧＴＲアレルは、１つ以上の上記保存されたアミノ酸が置換されているＧＴＲアレルである。一態様では、ミスセンス突然変異を含む突然変異ＧＴＲアレルは、配列番号６６の１２６、１４５、１９２又は３５９位に対応する位置のアミノ酸が置換されているＧＴＲタンパク質をコードするＧＴＲアレル（例えば、以下の実施例３の表７に示されるもの）である。
本明細書において使用されるＧＴＲアレルにおけるフレームシフト突然変異は、突然変異の下流において異なるフレームで翻訳される核酸配列をもたらすＧＴＲアレルにおける突然変異（欠失、挿入、重複など）である。上記のように、スプライス部位突然変異は、フレームシフトをもたらし得る。本明細書において提供されるArabidopsis及びBrassica ＧＴＲ配列における可能なＥＭＳ誘発性スプライス部位突然変異は、配列表に示される５’スプライス部位のＧＵドナー部位又は３’スプライス部位のＡＧアクセプター部位で突然変異をもたらす（例えば、これらの部位でＧ／ＣからＡ／Ｔの変化をもたらす）ものである。
本発明のアミノ酸配列
Brassicaceae、特にBrassica種、特にBrassica napus、しかしさらには他のBrassica作物種に由来する野生型（機能性）ＧＴＲアミノ酸配列及び突然変異ＧＴＲアミノ酸配列（１つ以上の突然変異、好ましくはＧＴＲタンパク質のＧＳＬ輸送活性の有意な減少又は消失をもたらす突然変異を含む）の両方が提供される。例えば、Ａ及び／又はＣ若しくはＢゲノムを含むBrassica種は、異なるＧＴＲ−Ａ、ＧＴＲ−Ｂ又はＧＴＲ−Ｃアミノ酸をコードし得る。加えて、突然変異誘発方法は、野生型ＧＴＲアレルにおいて突然変異を生成し、それによりさらなる突然変異ＧＴＲタンパク質をコードし得る突然変異アレルを作製するのに使用され得る。一実施態様では、Brassica植物内の（すなわち、内因性の）野生型及び／又は突然変異ＧＴＲアミノ酸配列が提供される。しかしながら、単離されたＧＴＲアミノ酸配列（例えば、植物から単離されたか、又は合成的に作られた）、並びにその変異体及びこれらのいずれかのフラグメントも、本明細書において提供される。
本発明の「ＧＴＲアミノ酸配列」又は「ＧＴＲ変異体アミノ酸配列」は、配列番号２と少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、配列表において提供されるＧＴＲ配列と「本質的に類似する」又は「本質的に同一である」とも称され得る。
配列表に図示されるＧＴＲ１〜６タンパク質のアミノ酸配列は、Arabidopsisから単離され、ＧＴＲｘ−Ａｙタンパク質のアミノ酸配列は、B. rapa、B. juncea及びB. napusから単離され、ＧＴＲｘ−Ｃｙタンパク質のアミノ酸配列は、B. oleracea及びB. napusから単離され、ＧＴＲｘ−Ｂｙタンパク質のアミノ酸配列は、B. junceaから単離された。野生型ＧＴＲのアミノ酸配列は図示されるのに対して、これらの配列及びこれらに本質的に類似する配列の突然変異配列は、野生型ＧＴＲのアミノ酸配列を参照して、本明細書において以下及び実施例に記載される。
本発明の「ＧＴＲ１、２、３、４、５又は６アミノ酸配列」又は「ＧＴＲ１、２、３、４、５又は６変異体アミノ酸配列」は、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０若しくは１２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、配列表において提供されるＧＴＲ配列と「本質的に類似する」又は「本質的に同一である」とも称され得る。
従って、本発明は、野生型の機能性ＧＴＲ１、２、３、４、５又は６タンパク質（その変異体及びフラグメント（以下でさらに定義される）を含む）のアミノ酸配列、並びに、これらのいずれかの突然変異アミノ酸配列であって、アミノ酸配列における突然変異が、好ましくは、対応する野生型ＧＴＲタンパク質のＧＳＬ輸送活性と比較して、ＧＴＲタンパク質のＧＳＬ輸送活性の有意な減少又は完全な消失をもたらす、突然変異アミノ酸配列の両方を提供する。ＧＴＲタンパク質のＧＳＬ輸送活性の有意な減少又は完全な消失は、本明細書において、ＧＳＬ含量が、突然変異ＧＴＲタンパク質を発現する植物の特定の部分において、対応する野生型ＧＴＲタンパク質を発現する植物と比較して改変されるような、ＧＴＲタンパク質のＧＳＬ輸送活性の減少又は消失を指す。
内因性のアミノ酸配列及び単離されたアミノ酸配列の両方が、本明細書において提供される。また、上記に定義されるＧＴＲアミノ酸配列及びＧＴＲ変異体アミノ酸配列のフラグメントが提供される。ＧＴＲアミノ酸配列又はその変異体（定義される通り）の「フラグメント」は、様々な長さ、例えば、ＧＴＲ配列（又は変異体配列）の少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、５０、１００、１５０、１７５、１８０の連続アミノ酸であり得る。
機能性ＧＴＲタンパク質のアミノ酸配列
配列表に図示されるアミノ酸配列は、Arabidopsis、B. rapa、B. oleracea、B. juncea及びB. napusに由来する野生型の機能性ＧＴＲタンパク質をコードする。従って、これらの配列は、それらが単離された植物に対して内因性である。上記のように、Brassica作物種、品種、育種系統、又は野生型アクセッションを含む他のBrassicaceae植物は、同じアミノ酸配列又はその変異体を有する他の機能性ＧＴＲタンパク質に関してスクリーニングされ得る。
加えて、ＧＴＲアミノ酸配列及びその変異体（又はこれらのいずれかのフラグメント）は、本質的に類似の配列に関してアミノ酸データベースをスクリーニングすることにより、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで同定され得ると理解される。本発明のアミノ酸分子のフラグメントも提供される。フラグメントは、上記の保存された機能ドメインのアミノ酸配列を含む。
突然変異ＧＴＲタンパク質のアミノ酸配列
野生型アミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換を含むアミノ酸配列は、本発明の別の実施態様であり、このような突然変異アミノ酸分子のフラグメントも同様である。このような突然変異アミノ酸配列は、上記の様々な公知の方法を使用して作製及び／又は同定され得る。この場合でも、このようなアミノ酸分子は、内因性形態及び単離形態の両方で提供される。
一実施態様では、アミノ酸配列における突然変異は、野生型タンパク質と比較して、ＧＴＲタンパク質のＧＳＬ輸送活性の有意な減少又は完全な消失をもたらす。上記のように、基本的には、野生型タンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含むタンパク質をもたらす任意の突然変異は、ＧＳＬ輸送活性の有意な減少又は消失を引き起こし得る。しかしながら、タンパク質の特定の部分における突然変異は、突然変異ＧＴＲタンパク質の機能の減少をもたらす可能性がより高い（例えば、トランケーションされたタンパク質をもたらす突然変異により、機能ドメインの有意な部分、例えば膜貫通ドメイン若しくは基質結合ドメインが欠如しているか、又は置換されている）と理解される。一態様では、膜貫通ドメインにおいてミスセンス突然変異を含む突然変異ＧＴＲタンパク質は、配列番号６６の１２６位又は３５９位に対応する位置のアミノ酸が置換されているＧＴＲタンパク質（例えば、以下の実施例３の表７に示される突然変異ＧＴＲタンパク質）である。
従って、一実施態様では、１つ以上の欠失又は挿入突然変異を含む突然変異ＧＴＲタンパク質であって、欠失又は挿入が、ｉｎ ｖｉｖｏで有意に減少した活性を有するか、又は活性を有しない突然変異タンパク質をもたらす、突然変異ＧＴＲタンパク質が提供される。このような突然変異ＧＴＲタンパク質は、少なくとも１、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、１００、１５０、１７５、１８０又はそれ以上のアミノ酸が、野生型ＧＴＲタンパク質と比較して欠失又は挿入されているＧＴＲタンパク質であって、欠失又は挿入が、ｉｎ ｖｉｖｏで有意に減少した活性を有するか、又は活性を有しない突然変異タンパク質をもたらす、ＧＴＲタンパク質である。
別の実施態様では、トランケーションされた突然変異ＧＴＲタンパク質であって、トランケーションが、ｉｎ ｖｉｖｏで有意に減少した活性を有するか、又は活性を有しない突然変異タンパク質をもたらす、突然変異ＧＴＲタンパク質が提供される。このようなトランケーションされたＧＴＲタンパク質は、対応する野生型ＧＴＲタンパク質のＣ末端部分において機能ドメインを欠き、対応する野生型ＧＴＲタンパク質のＮ末端部分を保持するＧＴＲタンパク質である。突然変異ＧＴＲタンパク質が、野生型ＧＴＲタンパク質と比較してよりトランケーションされるほど、トランケーションは、ＧＴＲタンパク質の活性の有意な減少又は消失をよりもたらし得る。
さらに別の実施態様では、１つ以上の置換突然変異を含む突然変異ＧＴＲタンパク質であって、置換が、ｉｎ ｖｉｖｏで有意に減少した活性を有するか、又は活性を有しない突然変異タンパク質をもたらす、突然変異ＧＴＲタンパク質が提供される。このような突然変異ＧＴＲタンパク質は、特定の機能（例えば、基質又はプロトン結合における機能）を有する保存されたアミノ酸残基が置換されているＧＴＲタンパク質である。
リン酸化／脱リン酸化状態が変化されている変異体ＧＴＲタンパク質も提供される。このようなタンパク質の例は、リン酸化部位のセリン又はスレオニン残基がアスパラギン酸（その部位で構成的リン酸化を模倣する）又はアラニン（その部位で構成的脱リン酸化を模倣する）に置換されている、本明細書において記載されるＧＴＲ１又はＧＴＲ２タンパク質であり、例えば、以下：
ａ．２２位のＳのＡへの置換
ｂ．２２位のＳのＤへの置換
ｃ．１０５位のＴのＡへの置換
ｄ．１０５位のＴのＤへの置換
ｅ．６０５位のＳのＡへの置換
ｆ．６０５位のＳのＤへの置換
を有する配列番号２のアミノ酸配列を含むＧＴＲ１タンパク質、
又は、以下：
ｇ．５２位のＳのＡへの置換
ｈ．５２位のＳのＤへの置換
ｉ．１３５位のＴのＡへの置換
ｊ．１３５位のＴのＤへの置換
ｋ．６３５位のＳのＡへの置換
ｌ．６３５位のＳのＤへの置換
を有する配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＧＴＲ１タンパク質、
又は、以下：
ｍ．５８位のＴのＡへの置換
ｎ．５８位のＴのＤへの置換
ｏ．１１７位のＴのＡへの置換
ｐ．１１７位のＴのＤへの置換
ｑ．３２３位のＴのＡへの置換
ｒ．３２３位のＴのＤへの置換
を有する配列番号４のアミノ酸配列を含むＧＴＲ２タンパク質である。
本明細書において記載されるものなどのBrassica種に由来するＧＴＲ１及びＧＴＲ２タンパク質において、対応する置換が行われ得る。
本発明の方法
突然変異ｇｔｒアレルは、当技術分野における様々な従来の方法を使用して（例えば、ｇｔｒゲノム又はｃＤＮＡの一部又は全部を増幅するためのＰＣＲベースの方法を使用して）、作製（例えば、突然変異誘発により誘発）及び／又は同定され得る。
突然変異誘発に続き、植物は、処理された種子から生育されるか、又は、公知の技術を使用して処理された細胞から再生される。例えば、突然変異誘発された種子は、従来の生育手順に従って植えられ得、そして、自家受粉種子が植物に形成される。あるいは、例えばCoventry et al.(1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Canada)により記載されるように、倍加半数体小植物は、処理された小胞子又は花粉細胞から抽出されて、直ぐにホモ接合性植物を形成し得る。この世代又はその後の世代におけるこのような自家受粉の結果として形成されるさらなる種子は、収穫され、当技術分野における従来の技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの技術（ｇｔｒアレルの増幅）又はハイブリダイゼーションベースの技術（例えば、サザンブロット解析、ＢＡＣライブラリースクリーニングなど）及び／又はｇｔｒアレルの直接配列決定）を使用して、突然変異ＧＴＲアレルの存在に関してスクリーニングされ得る。特定の突然変異アレルをスクリーニングするためのいくつかの技術が公知であり、例えば、Deleteagene（商標）（Delete-a-gene; Li et al., 2001, Plant J 27: 235-242）は、高速中性子突然変異誘発によって作製された欠失突然変異をスクリーニングするために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを使用し、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム内ターゲット誘発性局所損傷（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ）；McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol 18:455-457）は、ＥＭＳ誘発性点突然変異を同定する、等。突然変異ＧＴＲアレルにおける点突然変異（いわゆる一塩基多型又はＳＮＰ）の存在に関してスクリーニングするために、当技術分野において従来法であるＳＮＰ検出方法を使用することができる（例えば、オリゴライゲーション（ｏｌｉｇｏｌｉｇａｔｉｏｎ）ベースの技術、単一塩基伸長ベースの技術、又は制限酵素部位における差異に基づく技術（例えばＴＩＬＬＩＮＧなど））。
上記のように、特定の野生型ＧＴＲアレルの突然変異誘発（自発的並びに誘発的）は、その結果として得られる突然変異ＧＴＲアレルにおいて１つ以上の欠失、挿入、又は置換されたヌクレオチド（以下、「突然変異領域」と称される）の存在をもたらす。従って、突然変異ＧＴＲアレルは、野生型ＧＴＲアレルにおける１つ以上の欠失、挿入、又は置換されたヌクレオチドの位置及び配置により特徴付けられ得る。１つ以上のヌクレオチドがそれぞれ挿入、欠失、又は置換された野生型ＧＴＲアレルにおける部位は、本明細書において、「突然変異領域又は配列」とも称される。本明細書において使用される「５’又は３’隣接領域又は配列」は、突然変異（又は対応する野生型）ＧＴＲアレルにおけるＤＮＡ領域又は配列であって、１つ以上の欠失、挿入、又は置換されたヌクレオチドを含むＤＮＡ、好ましくは、突然変異ＧＴＲアレル（又は対応する野生型ＧＴＲアレル）における突然変異領域の直ぐ上流及び近接して（５’隣接領域又は配列）又は直ぐ下流及び近接して（３’隣接領域又は配列）位置する突然変異（又は対応する野生型）ＧＴＲアレルに由来するＤＮＡとは異なるＤＮＡの少なくとも２０ｂｐ、好ましくは少なくとも５０ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、及び最大５０００ｂｐの、突然変異（又は対応する野生型）ＧＴＲアレルにおけるＤＮＡ領域又は配列を指す。本明細書において使用される「連結領域」は、突然変異領域及び５’又は３’隣接領域が互いに連結されている、突然変異（又は対応する野生型）ＧＴＲアレルにおけるＤＮＡ領域を指す。従って、「突然変異領域と５’又は３’隣接領域の間の連結領域に及ぶ配列」は、突然変異配列並びにそれと近接する隣接配列を含む。
特定の突然変異ＧＴＲアレル又は特定の突然変異ＧＴＲアレルを含む植物若しくは植物材料、又は特定の突然変異ＧＴＲアレルを含む植物材料を含む産物を同定するために開発されたツールは、対応する野生型ＧＴＲアレルのゲノム特徴と比較した、特定の突然変異ＧＴＲアレルの特定のゲノム特徴（例えば、突然変異領域を含むゲノム領域の特定の制限地図、分子マーカー、又は隣接領域及び／又は突然変異領域の配列）に基づく。
ひとたび特定の突然変異ＧＴＲアレルが配列決定されれば、分子生物学的技術により、サンプルの核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）における突然変異ＧＴＲアレルの５’隣接、３’隣接、及び／又は突然変異領域内の配列を特異的に認識するプライマー及びプローブが開発され得る。例えば、ＰＣＲ法は、生物学的サンプル（例えば、植物、植物材料、又は植物材料を含む産物）において突然変異ＧＴＲアレルを同定するために開発され得る。このようなＰＣＲは、少なくとも２つの特異的「プライマー」に基づく：一方は、突然変異ＧＴＲアレルの５’又は３’隣接領域内の配列を認識し、他方は、突然変異ＧＴＲアレルの３’又は５’隣接領域内の配列をそれぞれ認識する；あるいは、一方は、突然変異ＧＴＲアレルの５’又は３’隣接領域内の配列を認識し、他方は、突然変異ＧＴＲアレルの突然変異領域内の配列を認識する；あるいは、一方は、突然変異ＧＴＲアレルの５’又は３’隣接領域内の配列を認識し、他方は、特定の突然変異ＧＴＲアレルの３’又は５’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域に及ぶ配列（以下でさらに記載される）をそれぞれ認識する。
特定のフラグメント（「突然変異ＧＴＲ特異的フラグメント」又は識別アンプリコン）が特定の突然変異ＧＴＲアレルを含む核酸サンプルから増幅されるように、プライマーは、好ましくは、最適化されたＰＣＲ条件下で、５’又は３’隣接領域内の配列、突然変異領域内の配列、又は特定の突然変異ＧＴＲアレルの３’又は５’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域に及ぶ配列を「特異的に認識する」１５〜３５の間のヌクレオチドの配列を有する。これは、最適化されたＰＣＲ条件下で、ターゲット突然変異ＧＴＲアレルだけが増幅され、植物ゲノム中の他の配列は増幅されないことを意味する。
本発明に好適なＰＣＲプライマーは、以下のものであり得る：
−特定の突然変異ＧＴＲアレル又はその相補体の５’又は３’隣接配列から選択される少なくとも１７の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、長さ１７ｎｔ〜約２００ｎｔに及ぶオリゴヌクレオチド（すなわち、例えば、本発明の突然変異ＧＴＲアレルにおいて欠失、挿入、又は置換された１つ以上のヌクレオチドの５’又は３’に隣接する配列、例えば上記ナンセンス、ミスセンス、又はフレームシフト突然変異の５’又は３’に隣接する配列、あるいは上記表において示される終止コドン突然変異又は上記置換突然変異の５’又は３’に隣接する配列、あるいはその相補体）（５’隣接配列を認識するプライマー）；又は
−特定の突然変異ＧＴＲアレル又はその相補体の突然変異領域の配列から選択される少なくとも１７の連続ヌクレオチド、好ましくは２０のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、長さ１７ｎｔ〜約２００ｎｔに及ぶオリゴヌクレオチド（すなわち、例えば、本発明のＧＴＲ遺伝子において挿入又は置換されたヌクレオチドの配列あるいはその相補体）（突然変異配列を認識するプライマー）。
当然ながら、プライマーは、言及した１７の連続ヌクレオチドより長くなり得る（例えば、１８、１９、２０、２１、３０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００ｎｔ又はさらに長くなり得る）。プライマーは、全体的に、隣接配列及び突然変異配列の言及したヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列からなり得る。しかしながら、プライマーのそれらの５’末端の（すなわち、３’に位置する１７の連続ヌクレオチドの外側の）ヌクレオチド配列は、それほど重要ではない。従って、プライマーの５’配列は、適宜、隣接配列又は突然変異配列から選択されるヌクレオチド配列からなり得るが、いくつかの（例えば、１、２、５、１０）ミスマッチを含み得る。プライマーの５’配列は、さらに全体的に、隣接配列又は突然変異配列と無関係のヌクレオチド配列（例えば、制限酵素認識部位を表わすヌクレオチド配列など）からなり得る。ミスマッチを有するこのような無関係の配列又は隣接ＤＮＡ配列は、好ましくは、１００より長くならず、より好ましくは５０又はさらに２５ヌクレオチドより長くならない。
さらに、適切なプライマーは、隣接配列と突然変異配列の間の連結領域（すなわち、例えば、本発明の突然変異ＧＴＲアレルにおいて欠失、挿入、又は置換された１つ以上のヌクレオチドの５’又は３’に隣接する配列と挿入又は置換された１つ以上のヌクレオチドの配列あるいは欠失された１つ以上のヌクレオチドの３’又は５’にそれぞれ隣接する配列の連結領域、例えば上記本発明のＧＴＲ遺伝子におけるナンセンス、ミスセンス、又はフレームシフト突然変異の５’又は３’に隣接する配列と、ナンセンス、ミスセンス、又はフレームシフト突然変異の間の連結領域、あるいは上記表において示す潜在的な終止コドン突然変異又は上記置換突然変異の５’又は３’に隣接する配列と、潜在的な終止コドン突然変異又は置換突然変異の配列の間のそれぞれ連結領域）に及ぶヌクレオチド配列を含み得るか、又は、それからなり得る（ただし、ヌクレオチド配列が突然変異領域又は隣接領域のいずれかにもっぱら由来しないことを条件とする）。
適切に選択されたＰＣＲプライマー対が、また、互いに相補的な配列を含んではならないことも当業者に直ちに明らかである。
本発明の目的のために、「配列番号Ｘにおいて表わされるヌクレオチド配列の相補体」は、それらの相補ヌクレオチドを通じてChargaff則（Ａ←→Ｔ；Ｇ←→Ｃ）に従ってヌクレオチドを交換し、５’から３’の方向において（すなわち、表わしたヌクレオチド配列の逆方向において）配列を読むことにより表わしたヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列である。
特定の突然変異ＧＴＲアレルを同定するのに好適なプライマーの例は、実施例において記載される。
本明細書において使用される「配列番号Ｚの位置Ｘから位置Ｙまでのヌクレオチド配列」は、両方のヌクレオチドのエンドポイントを含むヌクレオチド配列を示す。
好ましくは、増幅されたフラグメントは、５０〜１０００の間のヌクレオチドの長さ、例えば５０〜５００の間のヌクレオチドの長さ、又は１００〜３５０の間のヌクレオチドの長さを有する。特異的プライマーは、５’又は３’隣接領域内の配列、突然変異領域内の配列、又は特定の突然変異ＧＴＲアレルの３’又は５’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域に及ぶ配列と８０〜１００％の間で同一である配列を有し得る（ただし、ミスマッチによって、依然として、これらのプライマーを用いた特異的突然変異ＧＴＲアレルの特異的な同定が最適化されたＰＣＲ条件下で可能になることを条件とする）。しかしながら、許容可能なミスマッチの範囲は、実験的に容易に決定され得、当業者に公知である。
「突然変異ＧＴＲ特異的フラグメント」の検出及び／又は同定は、様々な方法で（例えば、ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動後のサイズ推定を通じて又は蛍光ベースの検出方法を通じて）起こり得る。突然変異ＧＴＲ特異的フラグメントは、また、直接配列決定され得る。増幅されたＤＮＡフラグメントの検出のための他の配列特異的方法も、当技術分野において公知である。
標準的なＰＣＲプロトコールは、当技術分野において記載されている（例えば、'PCR Applications Manual" (Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999)及び他の参考文献）。ＰＣＲのための最適な条件（特異的プライマーの配列を含む）が、各特異的な突然変異ＧＴＲアレルに関しての「PCR identification protocol」において特定される。しかしながら、ＰＣＲ同定プロトコールにおける多くのパラメーターは、実験室条件を特定するために調整される必要があり得、わずかに改変されて、類似の結果が得られ得ると理解される。例えば、ＤＮＡの調製のための異なる方法の使用は、例えば、プライマーの量、ポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２濃度、又は使用するアニーリング条件の調整を必要とし得る。同様に、他のプライマーの選択は、ＰＣＲ同定プロトコールのための他の最適条件を指示し得る。しかしながら、これらの調整は、当業者に明らかであり、現行のＰＣＲ適用マニュアル（例えば、上記に引用するもの）においてさらに詳述される。
特定の突然変異ＧＴＲアレルを同定するためのＰＣＲ同定プロトコールの例は、実施例において記載される。
あるいは、特異的プライマーは、生物学的サンプル中の特定の突然変異ＧＴＲアレルを同定するための「特異的プローブ」として使用され得る突然変異ＧＴＲ特異的フラグメントを増幅するのに使用され得る。生物学的サンプルの核酸を、プローブと、プローブとその対応する核酸中のフラグメントとのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させることによって、核酸／プローブハイブリッドの形成が起こる。このハイブリッドの形成は、検出され得（例えば、核酸又はプローブのラベル化）、それによりこのハイブリッドの形成は、特定の突然変異ＧＴＲアレルの存在を示す。特異的プローブとのハイブリダイゼーションに基づく（固相担体上又は溶液中のいずれかでの）このような同定方法は、当技術分野において記載されている。特異的プローブは、好ましくは、最適化された条件下で、特定の突然変異ＧＴＲアレルの５’又は３’隣接領域内及び／又は突然変異領域内の領域（以下、「突然変異ＧＴＲ特異的領域」と称される）に特異的にハイブリダイズする配列である。好ましくは、特異的プローブは、１０〜１０００ｂｐ、５０〜６００ｂｐの間、１００〜５００ｂｐの間、１５０〜３５０ｂｐの間、少なくとも８０％、好ましくは８０〜８５％の間、より好ましくは８５〜９０％の間、特に好ましくは９０〜９５％の間、最も好ましくは９５％〜１００％の間で特定の領域のヌクレオチド配列と同一である（又は相補的である）配列を含む。好ましくは、特異的プローブは、特定の突然変異ＧＴＲアレルの特定の領域と同一である（又は相補的である）約１３〜約１００の連続ヌクレオチドの配列を含む。
本発明に好適な特異的プローブは、以下のものであり得る：
−特定の突然変異ＧＴＲアレル又はその相補体の５’又は３’隣接配列から選択される少なくとも１３の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、長さ１３ｎｔ〜約１０００ｎｔに及ぶオリゴヌクレオチド（すなわち、例えば、本発明の突然変異ＧＴＲアレルにおいて欠失、挿入、又は置換された１つ以上のヌクレオチドの５’又は３’に隣接する配列、例えば上記ナンセンス、ミスセンス、又はフレームシフト突然変異の５’又は３’に隣接する配列、あるいは上記表において示す潜在的な終止コドン突然変異又は上記置換突然変異の５’又は３’に隣接する配列）、又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列（５’隣接配列を認識するプローブ）；又は
−特定の突然変異ＧＴＲアレル又はその相補体の突然変異配列から選択される少なくとも１３の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、長さ１３ｎｔ〜約１０００ｎｔに及ぶオリゴヌクレオチド（すなわち、例えば、本発明のＧＴＲ遺伝子において挿入又は置換されたヌクレオチドの配列あるいはその相補体）、又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列（突然変異配列を認識するプローブ）。
プローブは、全体的に、隣接配列及び突然変異配列の言及したヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列からなり得る。しかしながら、プローブのそれらの５’又は３’末端のヌクレオチド配列は、それほど重要ではない。従って、プローブの５’又は３’配列は、適宜、隣接配列又は突然変異配列から選択されるヌクレオチド配列からなり得るが、隣接配列又は突然変異配列とは無関係のヌクレオチド配列からなり得る。このような無関係の配列は、好ましくは、５０より長くならず、より好ましくは２５又はさらに２０又は１５ヌクレオチドより長くならない。
さらに、適切なプローブは、隣接配列と突然変異配列の間の連結領域（すなわち、例えば、本発明の突然変異ＧＴＲアレルにおいて欠失、挿入、又は置換された１つ以上のヌクレオチドの５’又は３’に隣接する配列と挿入又は置換された１つ以上のヌクレオチドの配列あるいは欠失された１つ以上のヌクレオチドの３’又は５’にそれぞれ隣接する配列の連結領域、例えば上記本発明のＧＴＲ遺伝子におけるナンセンス、ミスセンス、又はフレームシフト突然変異の５’又は３’に隣接する配列と、ナンセンス、ミスセンス、又はフレームシフト突然変異の間の連結領域、あるいは上記表において示す潜在的な終止コドン突然変異又は上記置換突然変異の５’又は３’に隣接する配列と、潜在的な終止コドン又は置換突然変異の配列の間のそれぞれ連結領域）に及ぶヌクレオチド配列を含み得るか、又は、それからなり得る（ただし、言及したヌクレオチド配列が突然変異領域又は隣接領域のいずれかにもっぱら由来しないことを条件とする）。
特定の突然変異ＧＴＲアレルを同定するのに好適なプローブの例は、実施例において記載される。
特異的プローブにハイブリダイズする「突然変異ＧＴＲ特異的領域」の検出及び／又は同定は、様々な方法で（例えば、ゲル電気泳動後のサイズ推定を通じて又は蛍光ベースの検出方法を通じて）起こり得る。特異的プローブにハイブリダイズする「突然変異ＧＴＲ特異的領域」の検出のための他の配列特異的方法も、当技術分野において公知である。
あるいは、１つ以上の突然変異ｇｔｒアレルを含む植物又は植物部分は、他の方法（例えば、「Delete-a-gene（商標）」（ＰＣＲを使用して、高速中性子突然変異誘発により生成される欠失突然変異体に関してスクリーニングする（Li and Zhang, 2002, Funct Integr Genomics 2:254-258により概説））、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム内ターゲット誘発性局所損傷（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｅｓ））（変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を使用してヘテロ二本鎖解析による塩基対変化を検出することでＥＭＳ誘発性点突然変異を同定する）（McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18: 455、及びMcCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442)）等を使用して作製及び同定され得る。述べたように、ＴＩＬＬＩＮＧは、突然変異に関してのハイスループットスクリーニングを使用する（例えば、突然変異野生型ＤＮＡヘテロ二本鎖のＣｅｌ１切断、及び、配列決定ゲルシステムを使用した検出を使用する）。従って、１つ以上の突然変異ｇｔｒアレルを含む植物又は植物部分を同定するためのＴＩＬＬＩＮＧ並びにこのような植物、植物器官、組織、及び種子を生成及び同定するための方法の使用は、本明細書において包含される。従って、一実施態様では、本発明の方法は、植物種子の突然変異誘発（例えば、ＥＭＳ突然変異誘発）、植物個体又はＤＮＡのプール、関心対象の領域のＰＣＲ増幅、ヘテロ二本鎖形成及びハイスループット検出、突然変異植物の同定、突然変異ＰＣＲ産物の配列決定の工程を含む。他の突然変異誘発及び選択の方法は、このような突然変異植物を作製するのに等しく使用され得ると理解される。
ＧＴＲアレルにおいて突然変異を誘発する代わりに、自然（自発的）突然変異アレルは、当技術分野において公知の方法により同定され得る。例えば、ＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧ（Henikoff et al. 2004, Plant Physiology 135(2): 630-6）は、自然突然変異ｇｔｒアレルの存在に関して複数の植物又は植物部分をスクリーニングするのに使用され得る。上記突然変異誘発技術に関しては、好ましくは、同定されたｇｔｒアレルが、その後に他のBrassica種（例えば、Brassica napus）に、交雑（種間又は種内交雑）及び選択により導入され得るように、Ａ及び／又はＣゲノムを含むBrassica種がスクリーニングされる。ＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧにおいて、育種系統又は関連種における天然多型は、植物の個体又はプールが、ｇｔｒターゲットのＰＣＲ増幅、ヘテロ二量体形成、及びハイスループット分析のために使用される上記ＴＩＬＬＩＮＧ方法論によりスクリーニングされる。この後、所望の突然変異アレルを取り込むための育種プログラムにおいて続いて使用され得る必要な突然変異を有する植物個体を選択し得る。
次いで、同定された突然変異アレルは配列決定され得、配列は野生型アレルと比較されて、突然変異を同定し得る。場合により、上記のように、機能性が試験され得る。このアプローチを使用し、複数の突然変異ｇｔｒアレル（及びこれらの１つ又は複数を含むBrassica植物）が同定され得る。次いで、所望の突然変異アレルは、以下でさらに記載される交雑及び選択の方法により、所望の野生型アレルと組み合わせられ得る。最後に、所望の数の突然変異ｇｔｒ及び所望の数の野生型ＧＴＲアレルを含む単一の植物が作製される。
特定の突然変異ＧＴＲアレルの検出のためのＰＣＲプライマー又は特異的プローブとして好適なオリゴヌクレオチドも、特定の突然変異ＧＴＲアレルの接合状態を決定する方法を開発するのに使用され得る。
特定の突然変異ＧＴＲアレルの接合状態を決定するために、突然変異及び／又は対応する野生型ＧＴＲ特異的アレルの存在を決定するＰＣＲベースのアッセイが開発され得る。
特定の突然変異ＧＴＲアレルの接合状態を決定するために、野生型ＧＴＲアレルを特異的に認識する２つのプライマーは、それらが互いに向き合い、プライマーの間に位置する突然変異領域を有するように設計され得る。これらのプライマーは、５’及び３’隣接配列をそれぞれ特異的に認識するプライマーであり得る。このセットのプライマーは、突然変異体、並びに対応する野生型ＧＴＲアレルの同時診断的ＰＣＲ増幅を可能にする。
あるいは、特定の突然変異ＧＴＲアレルの接合状態を決定するために、野生型ＧＴＲアレルを特異的に認識する２つのプライマーは、それらが互いに向き合い、それらの１つが突然変異領域を特異的に認識するように設計され得る。これらのプライマーは、野生型ＧＴＲアレルの５’又は３’隣接領域の配列及び突然変異領域をそれぞれ特異的に認識するプライマーであり得る。このセットのプライマーは、突然変異ＧＴＲアレルにおける突然変異領域の配列を特異的に認識する第３のプライマーと一緒に、突然変異ＧＴＲ遺伝子、並びに野生型ＧＴＲ遺伝子の同時診断的ＰＣＲ増幅を可能にする。
あるいは、特定の突然変異ＧＴＲアレルの接合状態を決定するために、野生型ＧＴＲアレルを特異的に認識する２つのプライマーは、それらが互いに向き合い、それらの１つが５’又は３’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域を特異的に認識するように設計され得る。これらのプライマーは、５’又は３’隣接配列及び野生型ＧＴＲアレルの突然変異領域と３’又は５’隣接領域の間の連結領域をそれぞれ特異的に認識するプライマーであり得る。このセットのプライマーは、突然変異ＧＴＲアレルの突然変異領域と３’又は５’隣接領域の間の連結領域を特異的に認識する第３のプライマーと一緒に、それぞれ、突然変異ＧＴＲ遺伝子、並びに野生型ＧＴＲ遺伝子の同時診断的ＰＣＲ増幅を可能にする。
あるいは、特定の突然変異ＧＴＲアレルの接合状態は、突然変異及び野生型ＧＴＲアレルを特異的に認識する代替プライマーセットを使用することにより決定され得る。
植物が突然変異ＧＴＲ遺伝子又は対応する野生型ＧＴＲ遺伝子に関してホモ接合性である場合、上記診断的ＰＣＲアッセイは、突然変異又は野生型ＧＴＲアレルのいずれかに関して、典型的な、好ましくは長さが典型的な単一のＰＣＲ産物を生じる。植物が突然変異ＧＴＲアレルに関してヘテロ接合性である場合、２つの特定のＰＣＲ産物が現れ、突然変異及び野生型ＧＴＲアレルの両方の増幅を反映する。
野生型及び突然変異ＧＴＲ特異的ＰＣＲ産物の同定は、例えば、ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動後のサイズ推定により（例えば、野生型及び突然変異ＧＴＲアレルから増幅されるフラグメントの間でサイズの差異をもたらす多くの挿入又は欠失したヌクレオチドを含む突然変異ＧＴＲアレルに関して、フラグメントは可視的にゲル上で分離することができる）；ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動後に２つの異なるフラグメントの存在又は非存在を評価することにより（それにより突然変異ＧＴＲアレルの診断的ＰＣＲ増幅が、場合により、野生型ＧＴＲアレルの診断的ＰＣＲ増幅とは別々に実施することができる）；増幅されたフラグメントの直接配列決定により；又は蛍光ベースの検出方法により起こり得る。
特定の突然変異ＧＴＲアレルの接合性を決定するのに好適なプライマーの例は、実施例において記載される。
あるいは、特定の突然変異ＧＴＲアレルの接合状態を決定するために、突然変異及び／又は対応する野生型ＧＴＲ特異的アレルの存在を決定するハイブリダイゼーションベースのアッセイが開発され得る：
特定の突然変異ＧＴＲアレルの接合状態を決定するために、野生型ＧＴＲアレルを認識する２つの特異的プローブは、各プローブがＧＴＲ野生型ＧＴＲアレル内の配列を特異的に認識し、突然変異領域がプローブにより認識される配列間に位置するように設計され得る。これらのプローブは、５’及び３’隣接配列をそれぞれ特異的に認識するプローブであり得る。これらのプローブの１つ又は、好ましくは両方の使用によって、突然変異体、並びに対応する野生型ＧＴＲアレルの同時診断的ハイブリダイゼーションが可能になる。
あるいは、特定の突然変異ＧＴＲアレルの接合状態を決定するために、野生型ＧＴＲアレルを認識する２つの特異的プローブは、それらの１つがＧＴＲ野生型アレル内の配列を突然変異領域の上流又は下流で、好ましくは突然変異領域の上流で特異的に認識し、それらの１つが突然変異領域を特異的に認識するように設計され得る。これらのプローブは、野生型ＧＴＲアレルの５’又は３’隣接領域、好ましくは５’隣接領域、及び突然変異領域の配列をそれぞれ特異的に認識するプローブであり得る。これらのプローブの１つ又は、好ましくは両方の使用によって、場合により、突然変異ＧＴＲアレルにおける突然変異領域の配列を特異的に認識する第３のプローブと一緒に、突然変異体及び野生型ＧＴＲ遺伝子の診断的ハイブリダイゼーションが可能になる。
あるいは、特定の突然変異ＧＴＲアレルの接合状態を決定するために、野生型ＧＴＲアレルを認識する特異的プローブは、プローブが、野生型ＧＴＲアレルの５’又は３’隣接領域、好ましくは５’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域を特異的に認識するように設計され得る。このプローブは、場合により、突然変異ＧＴＲアレルの５’又は３’隣接領域、好ましくは５’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域を特異的に認識する第２のプローブと一緒に、突然変異体及び野生型ＧＴＲ遺伝子の診断的ハイブリダイゼーションを可能にする。
あるいは、特定の突然変異ＧＴＲアレルの接合状態は、突然変異体及び野生型ＧＴＲアレルを特異的に認識する代替セットのプローブを使用することにより決定され得る。
植物が突然変異ＧＴＲ遺伝子又は対応する野生型ＧＴＲ遺伝子に関してホモ接合性である場合、上記診断的ハイブリダイゼーションアッセイは、突然変異又は野生型ＧＴＲアレルのいずれかに関して、典型的な、好ましくは長さが典型的な単一の特定のハイブリダイゼーション産物、例えば１つ以上のハイブリダイズするＤＮＡ（制限）フラグメントなどを生じる。植物が突然変異ＧＴＲアレルに関してヘテロ接合性である場合、２つの特定のハイブリダイゼーション産物が現れ、突然変異体及び野生型ＧＴＲアレルの両方のハイブリダイゼーションを反映する。
野生型及び突然変異ＧＴＲ特異的ハイブリダイゼーション産物の同定は、例えば、ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動後のサイズ推定により（例えば、野生型及び突然変異ＧＴＲアレルからのハイブリダイズするＤＮＡ（制限）フラグメントの間でサイズの差異をもたらす多くの挿入又は欠失したヌクレオチドを含む突然変異ＧＴＲアレルに関して、フラグメントは可視的にゲル上で分離することができる）；ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動後に２つの異なる特定のハイブリダイゼーション産物の存在又は非存在を評価することにより（それにより突然変異ＧＴＲアレルの診断的ハイブリダイゼーションが、場合により、野生型ＧＴＲアレルの診断的ハイブリダイゼーションとは別々に実施することができる）；ハイブリダイズするＤＮＡ（制限）フラグメントの直接配列決定により；又は蛍光ベースの検出方法により起こり得る。
特定の突然変異ＧＴＲアレルの接合性を決定するのに好適なプローブの例は、実施例において記載される。
さらに、ＰＣＲベース又はハイブリダイゼーションベースの増幅方法とは異なる特定の突然変異ＧＴＲアレルに特異的な検出方法も、本明細書において提供される特定の突然変異ＧＴＲアレルに特異的な配列情報を使用して開発され得る。このような別の検出方法は、特定の核酸構造の侵襲的切断に基づく線形シグナル増幅検出方法（Invader（商標）技術としても公知）（例えば、US patent 5,985,557 “Invasive Cleavage of Nucleic Acids”、6,001,567 “Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavageにおいて記載され、これらは参照により本明細書において組み入れられる）、ＲＴ−ＰＣＲベースの検出方法（例えば、Taqman）、又は他の検出方法（例えば、SNPlex）を含む。簡単に説明すると、Invader（商標）技術において、ターゲット突然変異配列は、例えば、突然変異配列又は５’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域に及ぶ配列のヌクレオチド配列を含むラベル化した第１の核酸オリゴヌクレオチドと、及び、突然変異配列の直ぐ下流及び近接する３’隣接配列を含む第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされ得、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドにより重なる。このハイブリダイゼーションにより産生される二本鎖構造又は三本鎖構造によって、酵素（Cleavase（登録商標））を用いた選択的なプローブ切断が可能になり、ターゲット配列をインタクトなままにする。切断されたラベル化プローブは、その後に、さらなるシグナル増幅をもたらす中間工程をおそらくは通じて検出される。
本明細書において使用される「キット」は、本発明の方法を実施する目的のため、特に、生物学的サンプル中での特定の突然変異ＧＴＲアレルの同定又は特定の突然変異ＧＴＲアレルを含む植物材料の接合状態の決定のための試薬セットを指す。より具体的には、本発明のキットの好ましい実施態様は、特定の突然変異ＧＴＲアレルの同定のための少なくとも２つの上記特異的プライマー、又は接合状態の決定のための少なくとも２つ若しくは３つの特異的プライマーを含む。場合により、キットは、本明細書において記載される、ＰＣＲ同定プロトコールにおける任意の他の試薬をさらに含み得る。あるいは、本発明の別の実施態様によれば、キットは、少なくとも１つの特異的プローブ（これは、特定の突然変異ＧＴＲアレルの同定に関して、上記のように、生物学的サンプルの核酸と特異的にハイブリダイズして、その中の特定の突然変異ＧＴＲアレルの存在を同定する）又は接合状態の決定のための少なくとも２つ又は３つの特異的プローブを含み得る。場合により、キットは、特異的プローブを使用した、生物学的サンプル中の特定の突然変異ＧＴＲアレルの同定のための任意の他の試薬（例えば、限定はされないが、ハイブリダイズバッファー、ラベル化）をさらに含み得る。
本発明のキットは使用され得、その構成要素は、品質管理（例えば、種子ロットの純度）、植物材料又は植物材料を含む若しくはそれに由来する材料（例えば、限定はされないが、食物又は飼料産物）における特定の突然変異ＧＴＲアレルの存在又は非存在の検出の目的のために特異的に調整され得る。
本明細書において使用される「プライマー」という用語は、鋳型依存的プロセス（例えばＰＣＲ、）における新生核酸の合成を刺激することができる任意の核酸を包含する。典型的には、プライマーは、１０〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を用いられ得る。プライマーは、一本鎖形態が好ましいが、二本鎖形態で提供され得る。プローブは、プライマーとして使用され得るが、ターゲットＤＮＡ又はＲＮＡに結合するように設計され、増幅プロセスにおいて使用する必要はない。
本明細書において使用される「認識する」という用語は、特異的プライマーに関して言及する場合は、特異的プライマーが、方法に記載される条件（例えば、ＰＣＲ同定プロトコールの条件）下で、特定の突然変異ＧＴＲアレルにおける核酸配列に特異的にハイブリダイズすることにより、特異性が、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールの存在により決定されるという事実を指す。
本明細書において特異的プローブを指す場合に使用される「ハイブリダイズする」という用語は、プローブが特定の突然変異ＧＴＲアレルの核酸配列中の特定の領域に、標準的なストリンジェンシー条件下で結合するという事実を指す。本明細書において使用される標準的なストリンジェンシー条件は、本明細書において記載されるハイブリダイゼーションのための条件又はSambrook et al., 1989(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY)により記載される従来のハイブリダイズ条件を指し、例えば、以下の工程を含み得る：１）植物ゲノムＤＮＡフラグメント又はＢＡＣライブラリーＤＮＡをフィルター上に固定すること、２）フィルターを１〜２時間６５℃で６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬、０．５％ＳＤＳ、及び２０μg/ml変性キャリアＤＮＡ中でプレハイブリダイズすること、３）ラベル化されたハイブリダイゼーションプローブを加えること、４）１６〜２４時間インキュベートすること、５）フィルターを３０分間６８℃で６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回洗浄すること、６）フィルターを３回（３０分間３０ml中で２回及び１０分間５００ml中で１回）６８℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄すること、及び７）フィルターを４〜４８時間Ｘ線フィルムに−７０℃で曝露すること。
本明細書において使用される「生物学的サンプル」は、植物、植物材料、又は植物材料を含む産物のサンプルである。「植物」という用語は、任意の成熟段階にある植物組織、並びに任意のこのような植物から採取された又はそれに由来する任意の細胞、組織、又は器官、限定はされないが、任意の種子、葉、茎、花、根、単一細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物、又はプロトプラストなどを包含することを意図する。本明細書において使用される「植物材料」は、植物から得られるか、又は植物に由来する材料を指す。植物材料を含む産物は、植物材料を使用して産生されるか又は植物材料が混入し得る食品、飼料、又は他の産物に関する。本発明の文脈では、このような生物学的サンプルは、特定の突然変異ＧＴＲアレルに特異的な核酸の存在に関して試験され、これは、サンプル中の核酸の存在を意味すると理解される。従って、本明細書において言及される、生物学的サンプルにおいて特定の突然変異ＧＴＲアレルを同定するための方法は、特定の突然変異ＧＴＲアレルを含む核酸の生物学的サンプルにおける同定に関する。
また、本発明は、１つの植物における特定のＧＴＲアレルの組み合わせ、ある植物から別の植物への１つ以上の突然変異ＧＴＲアレルの移入、１つ以上の特定の突然変異ＧＴＲアレルを含む植物、これらの植物から得られた後代、並びにこれらの植物に由来する植物細胞、植物部分、及び植物種子に関する。
従って、本発明の一実施態様では、１つの植物において２つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルを組み合わせるための方法であって、以下の工程を含む方法が提供される：
（ａ）上記のように、１つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルを各々含む２つ以上の植物を作製及び／又は同定すること、
（ｂ）上記のように、１つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルを含む第１の植物と１つ以上の他の選択された突然変異ＧＴＲアレルを含む第２の植物とを交雑し、交雑からＦ１種子を回収し、そして、場合により、第２の植物に由来する１つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルを有する第１の植物に由来する１つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルを含むＦ１植物を同定すること、
（ｃ）場合により、すべての選択された突然変異ＧＴＲアレルを含むＦ１植物が得られるまで工程（ｂ）を繰り返すこと、
（ｄ）場合により、
− 上記のように、突然変異ＧＴＲアレルの接合状態を決定することにより、選択された突然変異ＧＴＲアレルに関してホモ接合性又はヘテロ接合性であるＦ１植物を同定すること、又は
− １つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルに関してホモ接合性である植物を、以下の工程の１つを実施することにより作製すること：
− 上記のように、１つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルを含むＦ１植物の処理された小胞子又は花粉細胞から倍加半数体植物を抽出すること、
− 上記のように、１つ以上の世代（ｙ）に関して１つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルを含むＦ１植物を自家受粉し、自家受粉からのＦ１ Ｓｙ種子を回収し、そして、１つ以上の突然変異ＧＴＲアレルに関してホモ接合性であるＦ１ Ｓｙ植物を同定すること。
本発明の別の実施態様では、１つ以上の突然変異ＧＴＲアレルをある植物から別の植物に移すための方法であって、以下の工程を含む方法が提供される：
（ａ）上記のように、１つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルを含む第１の植物を作製及び／又は同定すること、又は、上記のように、１つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルを１つの植物において組み合わせることにより第１の植物を作製すること（ここで第１の植物は、１つ以上の突然変異ＧＴＲアレルに関してホモ接合性又はヘテロ接合性である）、
（ｂ）上記のように、１つ以上の突然変異ＧＴＲアレルを含む第１の植物と１つ以上の突然変異ＧＴＲアレルを含まない第２の植物とを交雑し、交雑からＦ１種子を回収し（ここで第１の植物がその突然変異ＧＴＲアレルに関してホモ接合性である場合、種子は、突然変異ＧＴＲアレルに関してヘテロ接合性であり、第１の植物はその突然変異ＧＴＲアレルに関してヘテロ接合性である場合、種子の半分は、突然変異ＧＴＲアレルに関してヘテロ接合性であり、種子の半分は、不対性である（すなわち、突然変異ＧＴＲアレルを含まない）、そして、場合により、１つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルを含むＦ１植物を同定すること、
（ｃ）上記のように、１つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルを含むＦ１植物を、１つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルを含まない第２の植物と、１つ以上の世代（ｘ）にわたり戻し交雑し、交雑からＢＣｘ種子を回収し、そして、各世代において、１つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルを含むＢＣｘ植物を同定すること、
（ｄ）場合により、１つ以上の選択された突然変異ＧＴＲアレルに関してホモ接合性であるＢＣｘ植物を、以下の工程の１つを実施することにより作製すること：
− 上記のように、１つ以上の所望の突然変異ＧＴＲアレルを含むＢＣｘ植物の処理された小胞子又は花粉細胞から倍加半数体植物を抽出すること、
− 上記のように、１つ以上の世代（ｙ）に関して１つ以上の所望の突然変異ＧＴＲアレルを含むＢＣｘ植物を自家受粉し、自家受粉からＢＣｘ Ｓｙ種子を回収し、そして、１つ以上の所望の突然変異ＧＴＲアレルに関してホモ接合性であるＢＣｘ Ｓｙ植物を同定すること。
本発明の一態様において、第１及び第２の植物は、Brassicaceae植物、特にBrassica植物、特にBrassica napus植物、又は別のBrassica作物種（例えば、Brassica rapa、B. juncea又はBrassica oleracea）に由来する植物である。本発明の別の態様において、第１の植物は、Brassicaceae植物、特にBrassica植物、特にBrassica napus植物、又は別のBrassica作物種に由来する植物であり、第２の植物は、Brassicaceae育種系統、特にBrassica育種系統、特にBrassica napus育種系統、又は別のBrassica作物種に由来する育種系統に由来する植物である。本明細書において使用される「育種系統」は、好ましくは、雑種子孫を産生するために使用される好ましい遺伝子型及び／又は表現型により他の植物系統から識別可能であるホモ接合性植物系統である。
本発明者らは、ＧＴＲ１又はＧＴＲ２トランスポーターのいずれかをノックアウトしたArabidopsis植物の種子は、野生型植物と比較して、総脂肪族ＧＳＬ濃度がそれぞれ有意に減少しなかったか又は約５０％減少したこと、及び、ＧＴＲ１及びＧＴＲ２トランスポーターの両方をノックアウトしたArabidopsis植物の種子は、ゼロＧＳＬ種子表現型であったことをさらに見出した。加えて、ＧＳＬレベルは、ｇｔｒノックアウト植物の花序及び根組織において、野生型植物のこれらの組織におけるＧＳＬレベルと比較して減少した。驚くべきことに、ｇｔｒノックアウト植物に由来する老化葉のＧＳＬレベルは高かったのに対して、野生型植物では、老化すると葉はＧＳＬが激減していた。加えて、ｇｔｒノックアウト植物の長角果壁のＧＳＬレベルは、野生型植物と比較して増加した。B. rapaにおいて、同様の観察を行った。
従って、本発明者らは、ＧＴＲ活性、特にＧＴＲ２活性又はＧＴＲ１及びＧＴＲ２活性が減少しているBrassicaceae植物では、種子、花序及び根組織におけるＧＳＬ含量が検出不能に減少しているのに対して、緑色組織（例えば、ロゼット葉、茎生葉、長角果壁）におけるＧＳＬのレベルは、依然として高いことを見出した。この観察結果は、本発明のＧＴＲタンパク質、特にＧＴＲ１及びＧＴＲ２タンパク質が、緑色組織（例えば、ロゼット葉、茎生葉及び長角果壁（いわゆる「ソース」組織））から種子、花及び、植物の生活環の一定時期における根（いわゆる「シンク」組織）へのＧＳＬの輸送に関与する輸送経路の不可欠な要素であることを示している。
一実施態様では、本発明は、真核細胞又は生物（例えば、Xenopus卵母細胞及び植物）におけるＧＳＬ輸送を改変する方法であって、前記真核細胞又は生物における機能性ＧＴＲ活性を改変することを含む、方法を提供する。
別の実施態様では、本発明は、植物及び植物部分におけるＧＳＬ含量を改変する方法であって、前記植物又は植物部分における機能性ＧＴＲ活性を改変することを含む、方法を提供する。
植物及び植物部分におけるＧＳＬ含量の改変は、例えば、アブラナ科植物の油糧種子のミールの質、ガン予防活性、並びに、園芸用アブラナ科植物の風味、並びに／又は、草食動物及び病原体に対する抵抗性、並びに、生物燻蒸活性に対して改変を行うことを可能にする。
一態様では、ＧＳＬ含量は、機能性ＧＴＲ活性を減少させることによって、植物種子において減少される。
本明細書において使用される「種子」は、胚、内胚乳及び／又は種皮を含む。
別の態様では、ＧＳＬ含量は、機能性ＧＴＲ活性を減少させることによって、緑色植物組織において増加又は維持される。
本明細書において使用される「緑色植物組織」は、葉、ロゼット葉、茎生葉及び長角果壁を指す。
さらに別の態様では、ＧＳＬ含量は、機能性ＧＴＲ活性を減少させることによって、植物種子において減少され、緑色植物組織において増加される。
本発明の一実施態様では、植物は、高含量のＧＳＬを有するBrassicales又はCapparales目に由来する植物である。このような植物の非限定的な例は、Akaniaceae科、Bataceae科、Brassicaceae又はCruciferae科、Capparaceae科、Caricaceae科、Gyrostemonaceae科、Koeberliniaceae科、Limnanthaceae科、Moringaceae科、Pentadiplandraceae科、Resedaceae科、Salvadoraceae科、Setchellanthaceae科、Tovariaceae科及びTropaeolaceae科の植物である。
本発明の具体的な実施態様では、植物は、Brassicaceae科に属する。本発明のさらにより具体的な実施態様では、植物は、Brassica napus植物（例えば、菜種、キャノーラ及びルタバガ）、Brassica rapa植物（例えば、白菜及びカブ）、Brassica oleracea植物（例えば、ケール、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ及びコールラビ）、Brassica carinata植物（アビシニアマスタード）、Brassica juncea植物（インディアンマスタード）又はBrassica nigra植物（黒マスタード）である。
例えば、種子におけるＧＳＬ含量を減少させることによる種子ミールの質の改変に関して、最も重要な作物は、油糧種子の形態のBrassica種（例えば、B. napus、B. rapa（ｓｙｎ B. campestris）、B. juncea及びB. carinata）である。
例えば、緑色植物組織におけるＧＳＬ含量を増加させることによる風味及びガン予防特性の増強に関して、最も重要な種は、B. oleracea（例えば、ブロッコリー及びカリフラワーを含む）、園芸用の形態のB. napus（例えば、スイード［＝ルタバガ、napobrassica種］、菜種油）及びB. rapa（カブ及び白菜［＝チンゲン菜］の両方を含む）、アブラナ科のサラダ（例えば、Eruca sativa及びDiplotaxis tenuifoliaを含む）及び園芸用の形態のRaphanus（例えば、ダイコン（Raphanus sativa））である。
ＧＳＬ含量は、機能性ＧＴＲ活性を減少させることによって、改変され得る。本明細書において使用される、植物又は植物部分における「機能性ＧＴＲ活性」は、前記植物又は植物部分において存在するＧＴＲ活性を指す。機能性ＧＴＲ活性は、ＧＴＲ遺伝子発現レベル及びＧＴＲ活性の結果である。従って、植物又は植物部分における機能性ＧＴＲ活性は、ＧＴＲ遺伝子発現レベルをダウンレギュレーションすることによって、若しくは、ＧＴＲ活性をダウンレギュレーションすることによって、又は、それらの両方によって、減少され得、本発明によれば、植物、植物組織、植物器官、植物部分又は植物細胞のＧＳＬ含量の改変は、ＧＴＲ遺伝子発現レベルのダウンレギュレーションによって、ＧＴＲ活性のダウンレギュレーションによって、又は、それらの両方によって、達成され得る。
便利なことに、ＧＴＲ遺伝子発現レベル又はＧＴＲ活性は、ＧＴＲ遺伝子発現レベルを変化させるキメラ遺伝子の導入によって、及び／又は、ＧＴＲ活性を変化させるキメラ遺伝子の導入によって、及び／又は、ＧＴＲをコードする内因性遺伝子の変化によって、遺伝的にコントロールされる。
本発明によれば、ＧＳＬ含量を改変するために、機能性ＧＴＲ活性は、有意に減少されることが好ましい。好ましくは、ターゲット細胞における機能性ＧＴＲ活性は、ターゲット細胞における正常レベル及び／又は活性の約７５％、好ましくは約８０％、特に約９０％、より具体的には約９５％、より好ましくは約１００％減少されるべきである。ＧＴＲタンパク質などの特異的タンパク質の含量を決定する方法は当業者に周知であり、特異的抗体を使用してこのようなタンパク質を（組織化学的に）定量化することを含むが、これに限定されない。ＧＴＲ活性を定量化する方法は、以下の実施例に記載される。
従って、本発明の一実施態様では、植物又は植物部分のＧＳＬ含量を改変するための方法は、ＧＴＲ遺伝子発現をダウンレギュレーションする工程を含む。本発明の別の実施態様では、植物、植物組織、植物器官、植物部分又は植物細胞のＧＳＬ含量を改変するための方法は、ＧＴＲ活性をダウンレギュレーションすることを含む。
本発明の実施態様では、ＧＴＲ遺伝子発現は、以下の機能的に連結されたＤＮＡ領域：
ａ）植物又は植物部分で機能する植物発現プロモーター；
ｂ）転写されると、ＧＴＲ遺伝子発現をダウンレギュレーションできるＧＴＲ阻害ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；及び
ｃ）転写終結及びポリアデニル化に関与する、植物細胞において機能的なＤＮＡ領域
を含むキメラＤＮＡ構築物を植物又は植物部分に導入することによって、ダウンレギュレーションされる。
転写ＤＮＡ領域は、翻訳に利用可能なＧＴＲ ｍＲＮＡのレベルを減少させる生物学的に活性なＲＮＡをコードする。これは、共抑制（センスＲＮＡ抑制）、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む十分に確立された技術によって、達成され得る。
一実施態様では、ＧＴＲ遺伝子発現は、共抑制によりＧＴＲ遺伝子発現をダウンレギュレーションできるセンスＲＮＡ分子を生じるキメラＤＮＡ構築物を導入することによって、ダウンレギュレーションされ得る。転写ＤＮＡ領域は、転写されると、転写又は転写後的な方法により、ターゲット植物又は植物細胞におけるＧＴＲ遺伝子の発現を減少させることができるいわゆるセンスＲＮＡ分子を生じる。転写ＤＮＡ領域（及びその結果として生じるＲＮＡ分子）は、植物細胞又は植物において存在するＧＴＲをコードする遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも２０の連続ヌクレオチドを含む。
別の実施態様では、ＧＴＲ遺伝子発現は、ＧＴＲ遺伝子発現をダウンレギュレーションできるアンチセンスＲＮＡ分子を生じるキメラＤＮＡ構築物を導入することによって、ダウンレギュレーションされ得る。転写ＤＮＡ領域は、転写されると、転写又は転写後的な方法により、ターゲット植物又は植物細胞におけるＧＴＲ遺伝子の発現を減少させることができるいわゆるアンチセンスＲＮＡ分子を生じる。転写ＤＮＡ領域（及びその結果として生じるＲＮＡ分子）は、植物細胞又は植物において存在するＧＴＲをコードする遺伝子のヌクレオチド配列の相補体と少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも２０の連続ヌクレオチドを含む。
しかしながら、ＧＴＲをコードする領域の約２０ｎｔのアンチセンス又はセンスＲＮＡ領域の最小ヌクレオチド配列は、２０ｎｔからターゲット遺伝子のサイズと等しい長さまでサイズが変化するより大きなＲＮＡ分子に含まれ得る。従って、前記アンチセンス又はセンスヌクレオチド領域は、約２１ｎｔ〜約５０００ｎｔの長さ、例えば２１ｎｔ、４０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、５００ｎｔ、１０００ｎｔ、２０００ｎｔ又はさらに約５０００ｎｔ、又はより大きな長さであり得る。また、本発明の目的のために、使用される阻害ＧＴＲ ＲＮＡ分子又はトランスジーンのコード領域のヌクレオチド配列が、内因性ＧＴＲ遺伝子（この発現が、植物細胞において減少されることを目的とする）と完全に同一又は相補的であることは必要ではない。配列が長いほど、全体的な配列同一性の要件はより低ストリンジェントになる。従って、センス又はアンチセンス領域は、内因性ＧＴＲ遺伝子又はその相補体のヌクレオチド配列と約４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％又は１００％の全体的な配列同一性を有し得る。しかしながら、述べたように、アンチセンス又はセンス領域は、内因性ＧＴＲ遺伝子のヌクレオチド配列と約９５〜約１００％の配列同一性を有する２０の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むべきである。約９５〜約１００％の配列同一性のストレッチは、約５０、７５又は１００ｎｔであり得る。
アンチセンスＲＮＡ又はセンスＲＮＡによって媒介される遺伝子発現レベルのダウンレギュレーションに関する上記キメラ遺伝子の効率は、異常な、非ポリアデニル化ＧＴＲ阻害ＲＮＡ分子の発現をもたらすＤＮＡエレメントの組み込みによって、さらに高められ得る。その目的に好適なこのようなＤＮＡエレメントの１つは、WO 00/01133に記載される、自己スプライシングリボザイムをコードするＤＮＡ領域である。この効率は、WO 03/076619に記載される、核局在性又は保留性シグナルを有する生成されたＲＮＡ分子を提供することによっても、高められ得る。
さらに別の実施態様では、ＧＴＲ遺伝子発現は、ＧＴＲ遺伝子発現をダウンレギュレーションできる二本鎖ＲＮＡ分子を生じるキメラＤＮＡ構築物を導入することによって、ダウンレギュレーションされ得る。ＤＮＡ領域が転写されると、ＲＮＡは、センス及びアンチセンス領域の間の従来型の塩基対合によって、ｄｓＲＮＡ分子を形成でき、それにより、センス及びアンチセンス領域は、上記ヌクレオチド配列になる。ｄｓＲＮＡをコードし、ＧＴＲ発現を減少させる本発明のキメラ遺伝子は、WO 99/53050（参照により本明細書に組み込まれる）の開示に従って、例えば、センス及びアンチセンス領域の間のスペーサー配列に位置するイントロン（例えば、異種イントロン）をさらに含み得る。このようなトランスジーンの構築を達成するために、WO 02/059294 A1に記載されているベクターが使用され得る。
さらに別の実施態様では、ＧＴＲ遺伝子発現は、ＧＴＲ ｍＲＮＡの切断を誘導できるｍｉＲＮＡにプロセシングされるｍｉＲＮＡ前駆体ＲＮＡ分子を生じるキメラＤＮＡ構築物を導入することによって、ダウンレギュレーションされる。ｍｉＲＮＡは、植物、しかし他の真核生物においても遺伝子発現をレギュレーションする内因性低分子ＲＮＡである。植物において、これらの約２１ヌクレオチド長のＲＮＡは、ＤＩＣＥＲＬＩＫＥ１（ＤＣＬ１）の切断活性によって、長い内因性ｍｉＲＮＡ前駆体のステムループ領域からプロセシングされる。植物ｍｉＲＮＡは、保存されたターゲットｍＲＮＡと高度に相補的であり、それらのターゲットの切断を誘導する。ｍｉＲＮＡは、とりわけ発生に関与する経路の複合ネット操作の遺伝子発現をもたらす重要な要素であると思われる。
本明細書において使用される「ｍｉＲＮＡ」は、ＲＩＳＣ複合体にロードされて、ｍｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列と本質的に相補的なヌクレオチド配列を含むターゲットＲＮＡ分子の切断を指令し得る約２０〜２２ヌクレオチド長のＲＮＡ分子であり、それにより、１つ以上の以下のミスマッチが起こり得る：
− 前記ｍｉＲＮＡの５’末端のヌクレオチドと、ターゲットＲＮＡ分子の対応するヌクレオチド配列の間のミスマッチ；
− 前記ｍｉＲＮＡの１位〜９位のヌクレオチドのいずれか１つと、ターゲットＲＮＡ分子の対応するヌクレオチド配列の間のミスマッチ；
− 前記ｍｉＲＮＡの１２位〜２１位のヌクレオチドのいずれか１つと、ターゲットＲＮＡ分子の対応するヌクレオチド配列の間の３個のミスマッチ、但し連続するミスマッチは２個以下である；
ｍｉＲＮＡの１０及び１１位において、いかなるミスマッチも許容されない（すべてのｍｉＲＮＡ位置は、ｍｉＲＮＡ分子の５’末端から出発して示される）。
本明細書において使用される「ｍｉＲＮＡ前駆体」分子は、ｄｓＲＮＡステム及び一本鎖ＲＮＡループを含み、二本鎖ＲＮＡステムにおいてｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列及びその相補配列のｍｉＲＮＡ＊をさらに含む二次構造をとることができる、約１００個〜約２００個、好ましくは約１００個〜約１３０個のヌクレオチドのＲＮＡ分子である。好ましくは、ｍｉＲＮＡ及びその相補体は、ｍｉＲＮＡ ｄｓＲＮＡステムの自由末端から約１０〜約２０個のヌクレオチドに位置する。一本鎖ループ領域の長さ及び配列は重要ではなく、例えば、３０〜５０ｎｔ長の間で大きく変わり得る。好ましくは、非対合ＲＮＡ構造と対合ＲＮＡ構造の間の自由エネルギーの差は、−２０〜−６０kcal/mole、特に約−４０kcal/moleである。ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ＊の間の相補性は完全である必要はなく、非対合ヌクレオチドの約１個〜３個のバルジが許容され得る。ＲＮＡ分子によってとられる二次構造は、当技術分野における通常のコンピューターアルゴリズム（例えば、ｍＦｏｌｄ、ＵＮＡＦｏｌｄ及びＲＮＡＦｏｌｄ）によって、予測され得る。ＤＣＬ活性によって放出されてＲＩＳＣ複合体にロードされる、ｍｉＲＮＡ前駆体に由来するｄｓＲＮＡステムの特定の鎖は、５’末端における相補性の程度によって決定され、それにより、切断されたｄｓＲＮＡステムの異なる鎖のヌクレオチド間の水素結合にその５’末端においては最も関与しない鎖は、ＲＩＳＣ複合体にロードされ、ターゲットＲＮＡ分子分解の配列特異性を決定する。しかしながら、経験的には、「誤った」鎖がＲＩＳＣ複合体にロードされたために、特定の合成ｍｉＲＮＡ前駆体分子に由来するｍｉＲＮＡ分子が機能的ではない場合、この問題が、ｍｉＲＮＡ前駆体分子のｄｓＲＮＡステムの各鎖上のｍｉＲＮＡ分子とその相補体の位置を交換することによって解決され得ることは、直ちに明らかである。当技術分野において公知であるように、２個の水素結合を含むＡとＵの間の結合、又は、２個の水素結合を含むＧとＵの間の結合は、３個の水素結合を含むＧとＣの間の結合よりも弱い。
ｍｉＲＮＡ分子は、天然に存在するそれらのｍｉＲＮＡ前駆体分子に含まれ得るが、それらは、既存のｍｉＲＮＡ前駆体分子から通常プロセシングされるｍｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を、関心対象の別のｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列と交換することによって、既存のｍｉＲＮＡ前駆体分子骨格にも導入され得る。ｍｉＲＮＡ前駆体分子の骨格も、完全に合成のものであり得る。同様に、合成ｍｉＲＮＡ分子は、既存のｍｉＲＮＡ前駆体分子骨格又は合成ｍｉＲＮＡ前駆体分子骨格に含まれ、それらからプロセシングされ得る。
本発明の別の実施態様では、ＧＴＲタンパク質活性は、以下の機能的に連結されたＤＮＡ領域：
ａ）植物、植物組織、植物器官、植物部分又は植物細胞で作動するプロモーター；
ｂ）転写されると、ＧＴＲ活性をダウンレギュレーションできるＧＴＲ阻害ＲＮＡ分子を生じるＤＮＡ領域；及び
ｃ）転写終結及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域
を含むキメラＤＮＡ構築物を植物、植物組織、植物器官、植物部分又は植物細胞に導入することによって、ダウンレギュレーションされ得る。
一態様では、内因性ＧＴＲタンパク質活性をダウンレギュレーションできるＧＴＲ阻害ＲＮＡ分子は、ＧＴＲ活性のレベルを減少させることができる生物学的に活性なタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ分子である。これは、例えば、ＧＴＲタンパク質に対する不活性化抗体によって、達成され得る。「ＧＴＲタンパク質に対する不活性化抗体」は、ＧＴＲタンパク質のいくつかのエピトープ（例えば、基質／プロトン結合ドメイン又は上記の保存されたドメイン）に特異的に少なくとも結合するか、又は輸送をすることができないコンフォメーションに輸送タンパク質をトラップして（例えば、JBC 274(22): 15420-15426, 1999に記載される）、ターゲットタンパク質の活性を阻害する抗体又はその一部である。
ＧＴＲ遺伝子発現レベルのダウンレギュレーションによって、及び／又は、ＧＴＲタンパク質活性のダウンレギュレーションによって機能性ＧＴＲ活性を減少させるのに使用されるキメラＤＮＡ構築物は、従来の方法で、単一植物細胞の核ゲノムに安定的に挿入され得、こうしてトランスフォーメーションされた植物細胞は、従来の方法で、改変されたＧＳＬ含量を有するトランスフォーメーション植物を製造するのに使用され得る。これに関して、機能性ＧＴＲ活性を減少させるのに使用されるキメラＤＮＡ構築物を含む、Agrobacterium tumefaciensのＴ−ＤＮＡベクターは、植物細胞をトランスフォーメーションするのに使用され得、その後、トランスフォーメーション植物は、例えば、EP0116718、EP0270822、WO84/02913及び公開されたEuropean Patent application EP 0 242 246及びGould et al. (1991)に記載されている手順を使用して、トランスフォーメーションされた植物細胞から再生され得る。Agrobacteriumによって媒介される植物トランスフォーメーション用のＴ−ＤＮＡベクターの構築は、当技術分野において周知である。Ｔ−ＤＮＡベクターは、EP0120561及びEP0120515に記載されているバイナリーベクター、又は、EP0116718に記載されている、相同的組換えによってAgrobacterium Ｔｉ−プラスミドに組み込むことができるコインテグレートベクターのいずれかであり得る。好ましいＴ−ＤＮＡベクターは、Ｔ−ＤＮＡ境界配列の間にあるか、又は少なくとも右側境界配列の左側に位置する転写ＤＮＡ領域に機能的に連結されたプロモーターをそれぞれ含む。境界配列は、Gielen et al. (1984)に記載されている。AgrobacteriumへのＴ−ＤＮＡベクターの導入は、エレクトロポレーション又は三親接合（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ）などの公知の方法を使用して行われ得る。当然ながら、他の種類のベクターが、遺伝子直接導入（例えば、EP0223247に記載される）、花粉媒介性トランスフォーメーション（例えば、EP0270356及びWO85/01856に記載される）、例えばUS4,684,611に記載されるプロトプラストトランスフォーメーション、植物ＲＮＡウイルス媒介性トランスフォーメーション（例えば、EP0067553及びUS4,407,956に記載される）、リポソーム媒介性トランスフォーメーション（例えば、US4,536,475に記載される）及び他の方法などの手順を使用して、植物細胞をトランスフォーメーションするのに使用され得る。得られたトランスフォーメーション植物は、従来の植物育種スキームで、改変された総ＧＳＬ含量を有するさらにトランスフォーメーションされた植物を製造するのに使用され得る。
本発明の別の実施態様では、ＧＴＲの機能活性は、内因性ＧＴＲ遺伝子のヌクレオチド配列の改変によって、減少され得る。好ましい実施態様では、ＧＴＲ遺伝子発現をレギュレーションする配列は、ＧＴＲ遺伝子発現レベルがダウンレギュレーションされるように変化される。
内因性ＧＴＲ遺伝子のこのような改変を達成する方法は、例えば、US patent 5,527,695に記載されている方法によって、内因性ＧＴＲ遺伝子を突然変異ＧＴＲ遺伝子に交換する相同的組換えを含む。好ましい実施態様では、内因性ＧＴＲ遺伝子のヌクレオチド配列のこのような部位特異的改変は、WO 96/22364又はUS patent 5,565,350に記載されているキメラＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドの導入によって、達成される。
内因性ＧＴＲ遺伝子のこのような改変を達成する方法は、突然変異誘発も含む。機能性ＧＴＲ活性が減少されている突然変異植物細胞及び植物系統が使用されて、本明細書において記載されるトランスジェニック植物細胞及び植物系統と同じ効果になり得ることは、当業者には直ちに明らかである。植物細胞又は植物のＧＴＲ遺伝子における突然変異は、当技術分野において公知のスクリーニング方法を使用して、容易に同定され得、それにより、化学的な突然変異誘発（例えば、ＥＭＳ突然変異誘発など）は、高感度検出法（例えば、変性ＨＰＬＣなど）と併用される。このような技術の例は、McCallum et al, Plant Physiology 123 439-442又はWO 01/75167に記載されているいわゆる「ゲノム内ターゲット誘発性局所損傷（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅｓ）」法である。しかしながら、特定のゲノム領域あるいはアレルにおける突然変異を検出する他の方法も利用可能であり、既存の又は新たに作製された挿入突然変異植物系統のスクリーニングを含み、それにより、これらの突然変異植物系統のゲノムＤＮＡのプールは、挿入されたＤＮＡフラグメントに特異的なプライマーと、挿入が予測されるゲノム領域又はアレルに特異的なプライマーとを使用するＰＣＢ増幅に供される（例えば、Maes et al., 1999, Trends in Plant Science, 4, pp 90-96を参照のこと）。従って、ＧＴＲ遺伝子における突然変異を含む植物細胞及び植物系統を同定する方法が、当技術分野において利用可能である。次いで、この突然変異細胞又は植物系統の集団は、機能性ＧＴＲ活性及びＧＳＬ含量に関して試験され得、類似の遺伝的背景を有する非突然変異細胞又は植物系統と比較され得る。
上記方法によって得られる植物並びにその部分及び産物（種子、種子ミール、種子油、緑色植物組織（例えば、ロゼット葉、茎生葉、長角果壁）、根組織を含む）、並びに、例えば動物飼料、害虫管理（例えば、生物燻蒸）及びガン予防におけるそれらの使用が、さらに提供される。
本発明の特定の実施態様によれば、本発明の方法によって得られるトランスフォーメーション又は突然変異植物細胞及び植物は、それぞれ、関心対象タンパク質をコードする核酸を含む少なくとも１つの他の又は少なくとも１つのキメラ遺伝子を含み得る。このような関心対象タンパク質の例は、グルホシネート系除草剤に対する耐性のためのｂａｒ又はｐａｔ酵素（EP 0 257 542, WO 87/05629 and EP 0 257 542, White et al. 1990）、グリホサート系除草剤に対する耐性のためのＥＰＳＰＳ酵素（例えば、二重突然変異トウモロコシＥＰＳＰＳ酵素（US 6,566,587及びWO 97/04103））、又は、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性のためのＨＰＰＤ酵素（例えば、イソオキサゾール（WO 96/38567））などの除草剤に対する抵抗性のための酵素を含む。
本発明の方法によって得られるトランスフォーメーション又は突然変異植物細胞及び植物は、当技術分野において周知の育種手順（例えば、交雑、自家受粉及び戻し交雑）においてさらに使用され得る。育種プログラムは、交雑してＦ１（雑種第１）世代を作製し、続いて何世代か自家受粉する（Ｆ２、Ｆ３などを作製する）ことを含む。育種プログラムは、戻し交雑（ＢＣ）工程も含み得、それにより、子孫は、反復親と称される親系統の１つと戻し交雑される。
本発明の方法によって得られるトランスフォーメーション又は突然変異植物細胞及び植物は、その後のトランスフォーメーション手順においてもさらに使用され得る。
以下の非限定的な実施例は、本発明により得られる植物の特徴を記載する。特に明記しない限り、すべてのリコンビナントＤＮＡ技術は、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY及びVolumes 1 and 2 of Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAに記載されている標準プロトコールに従って行われる。植物分子操作に関する標準的な材料と方法は、Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Croy published by BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications, UKに記載されている。
明細書及び実施例において、以下の配列を参照する：
配列番号１：Arabidopsis thalianaに由来する野生型ＧＴＲ１タンパク質をコードするＧＴＲ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号２：配列番号１によってコードされる野生型ＧＴＲ１タンパク質。
配列番号３：Arabidopsis thalianaに由来する野生型ＧＴＲ２タンパク質をコードするＧＴＲ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号４：配列番号３によってコードされる野生型ＧＴＲ２タンパク質。
配列番号５：Arabidopsis thalianaに由来する野生型ＧＴＲ３タンパク質をコードするＧＴＲ３遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号６：配列番号５によってコードされる野生型ＧＴＲ３タンパク質。
配列番号７：Arabidopsis thalianaに由来する野生型ＧＴＲ４タンパク質をコードするＧＴＲ４遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号８：配列番号７によってコードされる野生型ＧＴＲ４タンパク質。
配列番号９：Arabidopsis thalianaに由来する野生型ＧＴＲ５タンパク質をコードするＧＴＲ５遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号１０：配列番号９によってコードされる野生型ＧＴＲ５タンパク質。
配列番号１１：Arabidopsis thalianaに由来する野生型ＧＴＲ６タンパク質をコードするＧＴＲ６遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号１２：配列番号１１によってコードされる野生型ＧＴＲ６タンパク質。
配列番号１３：Brassica napusに由来する野生型ＧＴＲ１−Ａ１タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ａ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号１４：配列番号１３によってコードされる野生型ＧＴＲ１−Ａ１タンパク質。
配列番号１５：Brassica napusに由来する野生型ＧＴＲ１−Ａ２タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ａ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号１６：配列番号１５によってコードされる野生型ＧＴＲ１−Ａ２タンパク質。
配列番号１７：Brassica napusに由来する野生型ＧＴＲ１−Ａ３タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ａ３遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号１８：配列番号１７によってコードされる野生型ＧＴＲ１−Ａ３タンパク質。
配列番号１９：Brassica napusに由来する野生型ＧＴＲ１−Ｃ１タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ｃ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号２０：配列番号１９によってコードされる野生型ＧＴＲ１−Ｃ１タンパク質。
配列番号２１：Brassica napusに由来する野生型ＧＴＲ１−Ｃ２タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ｃ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号２２：配列番号２１によってコードされる野生型ＧＴＲ１−Ｃ２タンパク質。
配列番号２３：Brassica napusに由来する野生型ＧＴＲ１−Ｃ３タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ｃ３遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号２４：配列番号２３によってコードされる野生型ＧＴＲ１−Ｃ３タンパク質。
配列番号２５：Brassica napusに由来する野生型ＧＴＲ２−Ａ１タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ａ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号２６：配列番号２５によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ａ１タンパク質。
配列番号２７：Brassica napusに由来する野生型ＧＴＲ２−Ａ２タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ａ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号２８：配列番号２７によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ａ２タンパク質。
配列番号２９：Brassica napusに由来する野生型ＧＴＲ２−Ａ３タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ａ３遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号３０：配列番号２９によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ａ３タンパク質。
配列番号３１：Brassica napusに由来する野生型ＧＴＲ２−Ｃ１タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ｃ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号３２：配列番号３１によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ｃ１タンパク質。
配列番号３３：Brassica napusに由来する野生型ＧＴＲ２−Ｃ２タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ｃ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）（部分配列）。
配列番号３４：配列番号３３（部分配列）によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ｃ２タンパク質。
配列番号３５：Brassica napusに由来する野生型ＧＴＲ２−Ｃ３タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ｃ３遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号３６：配列番号３５によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ｃ３タンパク質。
配列番号３７：Brassica rapaに由来する野生型ＧＴＲ１−Ａ１タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ａ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号３８：配列番号３７によってコードされる野生型ＧＴＲ１−Ａ１タンパク質。
配列番号３９：Brassica rapaに由来する野生型ＧＴＲ１−Ａ２タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ａ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号４０：配列番号３９によってコードされる野生型ＧＴＲ１−Ａ２タンパク質。
配列番号４１：Brassica rapaに由来する野生型ＧＴＲ１−Ａ３タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ａ３遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号４２：配列番号４１によってコードされる野生型ＧＴＲ１−Ａ３タンパク質。
配列番号４３：Brassica rapaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ａ１タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ａ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号４４：配列番号４３によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ａ１タンパク質。
配列番号４５：Brassica rapaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ａ２タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ａ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号４６：配列番号４５によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ａ２タンパク質。
配列番号４７：Brassica rapaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ａ３タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ａ３遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号４８：配列番号４７によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ａ３タンパク質。
配列番号４９：Brassica oleraceaに由来する野生型ＧＴＲ１−Ｃ１タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ｃ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号５０：配列番号４９によってコードされる野生型ＧＴＲ１−Ｃ１タンパク質。
配列番号５１：Brassica oleraceaに由来する野生型ＧＴＲ１−Ｃ２タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ｃ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号５２：配列番号５１によってコードされる野生型ＧＴＲ１−Ｃ２タンパク質。
配列番号５３：Brassica oleraceaに由来する野生型ＧＴＲ１−Ｃ３タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ｃ３遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号５４：配列番号５３によってコードされる野生型ＧＴＲ１−Ｃ３タンパク質。
配列番号５５：Brassica oleraceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ｃ１タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ｃ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号５６：配列番号５５によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ｃ１タンパク質。
配列番号５７：Brassica oleraceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ｃ２タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ｃ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号５８：配列番号５７によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ｃ２タンパク質。
配列番号５９：Brassica oleraceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ｃ３タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ｃ３遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号６０：配列番号５９によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ｃ３タンパク質。
配列番号６１：Arabidopsis thalianaに由来する野生型ＧＴＲ１タンパク質をコードするＧＴＲ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号６２：配列番号６１によってコードされる野生型ＧＴＲ１タンパク質。
配列番号６３：Arabidopsis thalianaに由来する野生型ＧＴＲ２タンパク質をコードするＧＴＲ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号６４：配列番号６３によってコードされる野生型ＧＴＲ２タンパク質。
配列番号６５：Brassica rapa ecotype pekinensisに由来する野生型ＧＴＲ２−Ａ２タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ａ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号６６：配列番号６５によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ａ２タンパク質。
配列番号６７：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−ｆ（８位のウラシル）
配列番号６８：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−ｒ（８位のウラシル）
配列番号６９：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−Ｔｉｌｌ−ｆ
配列番号７０：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−Ｔｉｌｌ−ｒ
配列番号７１：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−Ｉｎｎｅｒ−ｆｗ
配列番号７２：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−Ｉｎｎｅｒ−ｆｗ２
配列番号７３：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−Ｉｎｎｅｒ−ｒｖ
配列番号７４：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−１２６−ｆ（１０位のウラシル）
配列番号７５：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−１２６−ｒ（１０位のウラシル）
配列番号７６：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−１４５−ｆ（９位のウラシル）
配列番号７７：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−１４５−ｒ（９位のウラシル）
配列番号７８：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−１９２−ｆ（９位のウラシル）
配列番号７９：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−１９２−ｒ（９位のウラシル）
配列番号８０：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−２２９−ｆ（１１位のウラシル）
配列番号８１：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−２２９−ｒ（１１位のウラシル）
配列番号８２：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−３５９−ｆ（１０位のウラシル）
配列番号８３：プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−３５９−ｒ（１０位のウラシル）
配列番号８４：プライマーＡｔＧＴＲ２ｆ（８位のウラシル）
配列番号８５：プライマーＡｔＧＴＲ２ｒ（８位のウラシル）
配列番号８６：プライマーＡｔＧＴＲ４ｅ１ｆ（８位のウラシル）
配列番号８７：プライマーＡｔＧＴＲ４ｅ１ｒ（９位のウラシル）
配列番号８８：プライマーＡｔＧＴＲ４ｅ２ｆ（９位のウラシル）
配列番号８９：プライマーＡｔＧＴＲ４ｅ２ｒ（１３位のウラシル）
配列番号９０：プライマーＡｔＧＴＲ４ｅ３ｆ（１３位のウラシル）
配列番号９１：プライマーＡｔＧＴＲ４ｅ３ｒ（９位のウラシル）
配列番号９２：プライマーＡｔＧＴＲ４ｅ４ｆ（９位のウラシル）
配列番号９３：プライマーＡｔＧＴＲ４ｅ４ｒ（８位のウラシル）
配列番号９４：プライマーＡｔＧＴＲ５ｆ（８位のウラシル）
配列番号９５：プライマーＡｔＧＴＲ５ｒ（８位のウラシル）
配列番号９６：プライマーＴ７
配列番号９７：プライマーｐＮＢ１ｒｅｖ
配列番号９８：プライマーＡｔＧＴＲ１＿Ｎ８７９７４２＿ＲＰ
配列番号９９：プライマーＡｔＧＴＲ１＿Ｎ８７９７４２＿ＲＰ
配列番号１００：プライマーＡｔＧＴＲ１＿Ｎ８７０２１０＿ＲＰ
配列番号１０１：プライマーＡｔＧＴＲ１＿Ｎ８７０２１０＿ＲＰ
配列番号１０２：プライマーＡｔＧＴＲ１＿Ｎ４０９４２１＿ＲＰ
配列番号１０３：プライマーＡｔＧＴＲ１＿Ｎ４０９４２１＿ＲＰ
配列番号１０４：プライマーＡｔＧＴＲ１＿ＲＰ＿ｆｗ
配列番号１０５：プライマーＡｔＧＴＲ１＿ＲＰ＿ｒｅｖ
配列番号１０６：プライマーＡｔＧＴＲ２＿ＲＰ＿ｆｗ
配列番号１０７：プライマーＡｔＧＴＲ２＿ＲＰ＿ｒｅｖ
配列番号１０８：プライマーＡｔＧＴＲ３＿ＲＰ＿ｆｗ
配列番号１０９：プライマーＡｔＧＴＲ３＿ＲＰ＿ｒｅｖ
配列番号１１０：プライマーＡｔＧＴＲ１ｐｆ
配列番号１１１：プライマーＡｔＧＴＲ１ｐｒ
配列番号１１２：プライマーＡｔＧＴＲ２ｐｆ
配列番号１１３：プライマーＡｔＧＴＲ２ｐｒ
配列番号１１４：プライマーＡｔＧＴＲ１ｒ−ＹＦＰ
配列番号１１５：プライマーＹＦＰｆ−ＡｔＧＴＲ１−融合
配列番号１１６：プライマーＹＦＰｒ−ＡｔＧＴＲ１−３’ｕｔｒ−融合
配列番号１１７：プライマーＡｔＧＴＲ１（３’ｕｔｒ）ｆ−ＹＦＰ融合
配列番号１１８：プライマーＡｔＧＴＲ１（３’ｕｔｒ）ｒ
配列番号１１９：Brassica junceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ａ１タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ａ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号１２０：配列番号１１９によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ａ１タンパク質。
配列番号１２１：Brassica junceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ａ２タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ａ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号１２２：配列番号１２１によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ａ２タンパク質。
配列番号１２３：Brassica junceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ａ３タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ａ３遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号１２４：配列番号１２３によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ａ３タンパク質。
配列番号１２５：Brassica junceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ｂ１タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ｂ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）（エクソン２上の部分配列）。
配列番号１２６：配列番号１２５（部分配列）によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ｂ１タンパク質。
配列番号１２７：Brassica junceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ｂ２タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ｂ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号１２８：配列番号１２７によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ｂ２タンパク質。
配列番号１２９：Brassica junceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ｂ３タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ｂ３遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号１３０：配列番号１２９によってコードされる野生型ＧＴＲ２−Ｂ３タンパク質。
配列番号１３１：Brassica junceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ｃ１タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ａ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号１３２：Brassica junceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ａ２タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ａ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号１３３：Brassica junceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ａ３タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ａ３遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号１３４：Brassica junceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ｂ１タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ｂ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号１３５：Brassica junceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ｂ２タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ｂ２遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号１３６：Brassica junceaに由来する野生型ＧＴＲ２−Ｂ３タンパク質をコードするＧＴＲ２−Ｂ３遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号１３７：Brassica napus（変異体）に由来する野生型ＧＴＲ１−Ｃ１タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ｃ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含む）。
配列番号１３８：Brassica napusにおけるＧＴＲ１発現の発現のダウンレギュレーションのためのｄｓＲＮＡ構築物。
配列番号１３９：Brassica napusにおけるＧＴＲ２発現の発現のダウンレギュレーションのためのｄｓＲＮＡ構築物。
配列番号１４０：Brassica napusにおけるＧＴＲ１及びＧＴＲ２発現の発現のダウンレギュレーションのためのｄｓＲＮＡ構築物。
配列番号１４１：３０アミノ酸ＮＨ２末端延長を含むArabidopsis thalianaに由来する野生型ＧＴＲ１タンパク質をコードするＧＴＲ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号１４２：配列番号１４１によってコードされる３０アミノ酸Ｎ末端延長を含む野生型ＧＴＲ１タンパク質。
配列番号１４３：２３アミノ酸ＮＨ２末端延長を含むBrassica napusに由来する野生型ＧＴＲ１＿Ａ１タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ａ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号１４４：配列番号１４３によってコードされる２３アミノ酸Ｎ末端延長を含む野生型ＧＴＲ１−Ａ１タンパク質。
配列番号１４５：２３アミノ酸ＮＨ２末端延長を含むBrassica napusに由来する野生型ＧＴＲ１タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ｃ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号１４６：配列番号１４５によってコードされる２３アミノ酸Ｎ末端延長を含む野生型ＧＴＲ１−Ｃ１タンパク質。
配列番号１４７：２３アミノ酸ＮＨ２末端延長を含むBrassica rapaに由来する野生型ＧＴＲ１−Ａ１タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ａ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号１４８：配列番号１４７によってコードされる２３アミノ酸Ｎ末端延長を含む野生型ＧＴＲ１−Ａ１タンパク質。
配列番号１４９：２３アミノ酸ＮＨ２末端延長を含むBrassica oleraceaに由来する野生型ＧＴＲ１−Ｃ１タンパク質をコードするＧＴＲ１−Ｃ１遺伝子のコードＤＮＡ（イントロンを含まない）。
配列番号１５０：配列番号１４９によってコードされる２３アミノ酸Ｎ末端延長を含む野生型ＧＴＲ１−Ｃ１タンパク質。
実施例において特に記載のない限り、すべてのリコンビナントＤＮＡ技術は、Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al.(1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA and in Volumes I and II of Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK)に記載されている標準的な分子生物学的技術に従って行われる。植物分子操作に関する標準的な材料と方法は、Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Croy, jointly published by BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications, UKに記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応に関する標準的な材料と方法は、Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、及びMcPherson at al.(2000) PCR - Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germanyに見られ得る。
当業者であれば、本明細書における開示を考慮して、過度の負担なく、以下で具体的に記載されていない本発明のあらゆる方法を実施し得る。
実施例１：ＧＴＲタンパク質の同定及び特性決定
Arabidopsis ＧＴＲ配列の同定及び特性決定
最も豊富なArabidopsis ＧＳＬ４−メチルチオブチルグルコシノレート（４−ＭＴＢ）のXenopus卵母細胞への取り込みに関して、全長ｃＤＮＡとして利用可能なArabidopsisトランスポーターのライブラリー（RIKEN bioresource center (Ibaraki, Japan)製）を、１０個の遺伝子のプールで機能的スクリーニングした。構築したライブラリーは、Arabidopsis膜タンパク質ライブラリーデータベースにおいて、「有機溶質トランスポーター」又は１０〜１４個の膜貫通セグメントを有する「機能未知」として分類される２３９個のトランスポーターからなる（Nour-Eldin et al., 2006, Plant Methods 2 : 17）。本研究において意図する輸送タンパク質ターゲットは、アポプラストからのインポーターである可能性があったので、Xenopus卵母細胞取り込みアッセイを酸性バッファー（ｐＨ５）で実施した。この手順に従って、Ａｔ３ｇ４７９６０（本明細書においてＡｔＧＴＲ１と名付けられる；配列番号１、２、６１及び６２）及びＡｔ１ｇ１８８８０（本明細書においてＡｔＧＴＲ３と名付けられる；配列番号５及び６）をＧＳＬトランスポーターとして同定した（Nour-Eldin, 2007、前掲）。
Ａｔ３ｇ４７９６０及びＡｔ１ｇ１８８８０は、ＮＲＴ／ＰＴＲトランスポーターファミリーに属し（Steiner et al., 1995, Molecular Microbiology 16: 825-834; Tsay et al., 2007, FEBS letters 581: 2290-2300）、これは、硝酸塩、亜硝酸塩及びペプチドトランスポーターからなることが示されている（Tsay et al., 2007, FEBS letters 581: 2290-2300; Segonzac et al., 2007, Plant Cell 19 : 3760-3777; Komarova et al., 2008, Plant Physiol 148 : 856-869）。系統発生解析により、これらの２個の遺伝子は、６個のホモログで小さなサブクレードを形成することが示された（図１ａを参照のこと）：Ａｔ３ｇ４７９６０（本明細書においてＡｔＧＴＲ１と名付けられる；配列番号１、２、６１及び６２）、Ａｔ５ｇ６２６８０（本明細書においてＡｔＧＴＲ２と名付けられる；配列番号３、４、６３及び６４）、Ａｔ１ｇ１８８８０（本明細書においてＡｔＧＴＲ３と名付けられる；配列番号５及び６）、Ａｔ１ｇ６９８６０（本明細書においてＡｔＧＴＲ４と名付けられる；配列番号７及び８）、Ａｔ１ｇ６９８７０（本明細書においてＡｔＧＴＲ５又はＮＲＴ１．７と名付けられる；配列番号９及び１０）、Ａｔ１ｇ２７０８０（本明細書においてＡｔＧＴＲ６又はＮＲＴ１．６と名付けられる；配列番号１１及び１２）図１ｂ及び表４は、異なるＡｔＧＴＲ配列の間の配列同一性を示す。
Brassica種ＧＴＲ配列の同定及び特性決定
上記で同定したArabidopsis ＧＴＲ１及びＧＴＲ２配列と本質的に類似する配列に関してゲノムデータベースをスクリーニングすることによって、Brassica napus、Brassica rapa及びBrassica oleracea ＧＴＲ１及びＧＴＲ２核酸配列並びにアミノ酸配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで同定した。Arabidopsis ＧＴＲ１ホモログとの類似性の減少（表５ａ及びｂ）に従って、Brassica ＧＴＲ１配列をＧＴＲ１−（Ａ／Ｃ）１、２及び３と名付けた（配列表の配列番号１３〜２４、配列番号３７〜４２、配列番号４９〜５４及び配列番号６１〜６２を参照のこと）。同様に、Arabidopsis ＧＴＲ２ホモログとの類似性の減少（表６ａ及びｂ）に従って、Brassica ＧＴＲ２配列をＧＴＲ２−（Ａ／Ｃ）１、２及び３と名付けた（配列表の配列番号２５〜３６、配列番号４３〜４８、配列番号５５〜６０及び配列番号６３〜６６を参照のこと）。B. junceaヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を配列番号１１９〜１３６に提供する。
加えて、B. napus胚トランスクリプトームデータベースにおいて、ＧＴＲ１及びＧＴＲ２配列のタイプ１並びに２の配列（すなわち、ＧＴＲ１−Ａ１、ＧＴＲ１−Ｃ１、ＧＴＲ１−Ａ２、ＧＴＲ１−Ｃ２、ＧＴＲ２−Ａ１、ＧＴＲ２−Ｃ１、ＧＴＲ２−Ａ２及びＧＴＲ２−Ｃ２配列）を同定したところ、これらのタイプのＧＴＲ１及びＧＴＲ２配列は、B. napus胚で発現していることが示された。
さらに、プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−ｆ（配列番号６７）及びＢｒＧＴＲ２−Ａ２−ｒ（配列番号６８）を使用してB. rapa ecotype pekinensisの葉から単離したｃＤＮＡをクローニングすることによって、Brassica rapa ＧＴＲ２−Ａ２核酸配列及びアミノ酸配列（配列表における配列番号６５及び６６）を同定した。
実施例２：ＧＴＲタンパク質の機能特性決定
Arabidopsis及びBrassica ＧＴＲタンパク質の機能特性決定
Xenopus卵母細胞における４−ＭＴＢの取り込み活性に関して、Arabidopsis ＮＲＴ／ＰＴＲファミリーに由来するＡｔＧＴＲ１〜５、ＢｒＧＴＲ２−Ａ２及び１２個の他のメンバーを個別に試験した。
ＡｔＧＴＲ１及び２は、ＡｔＧＴＲ３に対して５倍高い取り込み活性を示したのに対して、ＡｔＧＴＲ４及びＡｔＧＴＲ５は、ＡｔＧＴＲ１と比較して、１０％４−ＭＴＢ取り込み活性を示した。すべての他の試験したＮＲＴ／ＰＴＲの取り込み活性は、未注射卵母細胞と区別できなかった。
ＢｒＧＴＲ２−Ａ２を発現する卵母細胞は、卵母細胞１個について１時間あたり約２．５nmol ４−ＭＴＢを取り込んだ（図２）のに対して、未注射卵母細胞は、４−ＭＴＢの検出可能な取り込みを示さなかった。比較すると、ＡｔＧＴＲ２を発現する卵母細胞は、１時間あたり約５nmol ４−ＭＴＢを取り込んだ（図３Ａ）。
Arabidopsisグルコシノレート輸送タンパク質の生化学的特性決定
最も高いＧＳＬ取り込み活性を示したＡｔＧＴＲ１及びＡｔＧＴＲ２を、Xenopus卵母細胞で生化学的に特性決定した。両遺伝子に関して、取り込み培地のｐＨを６から５に下げると、卵母細胞内の４−ＭＴＢ蓄積が約８倍高くなったのに対して、ｐＨ７における取り込みは、ｐＨ５における未注射卵母細胞と区別できなかった（図３Ａ）。これにより、ＡｔＧＴＲがプロトン：ＧＳＬシンポーターであることが示された。
ＡｔＧＴＲ１及びＡｔＧＴＲ２をそれぞれ発現する卵母細胞を１００μM ４−ＭＴＢ、ｐＨ５及びに曝露し、電圧を−５０mVに固定して電流記録を実施すると、３０nA範囲の内向き電流が生じた。これは、ＧＳＬに曝露した場合のＡｔＧＴＲを介した陽イオンの純流入を示している。ＧＳＬ誘発性内向き電流は、＋３０〜−１２０mVの範囲内の過分膜電位を伴って、電圧依存的に増加した（図３Ｂ及びＦ）。ＧＳＬは、１分子あたり負電荷１個を運ぶので、負に帯電した基質を輸送する場合、ＧＳＬに対するプロトンの化学量論的組成は、少なくとも２：１でなければならず、これが、一般的には、プロトン依存性オリゴペプチド輸送タンパク質（ＰＯＴ）の典型的な特性であると思われる（Daniel et al. , 2006, Physiology 21 : 93-102）。−６０mVに固定したｐＨ５において、ＡｔＧＴＲ１及び２による４−ＭＴＢの取り込みは、それぞれ、Michaelis-Menten飽和速度に従い、Ｋｍ＝２０±１．２μM及びＫｍ＝１８，７±４，２μMという４−ＭＴＢに対するＡｔＧＴＲ１及びＡＴＧＴＲ２の高親和性を示した（図３Ｃ〜Ｄ）。これは、ＧＳＬが、ｉｎ ｐｌａｎｔａにおけるＡｔＧＴＲの生理学的基質である可能性があることを示唆している。注目すべきことに、５００μM ４−ＭＴＢにおけるＡｔＧＴＲ２の基質依存性輸送速度は、２５０μM及び１mMにおいてよりも２５％低かった。この観察結果も、ＧＳＬ取り込みの直接ＬＣ−ＭＳ検出によって測定した基質依存性輸送速度において注目に値するものであった。
側鎖を変化させて、ＧＳＬに対するＡｔＧＴＲの基質特異性を調査した。ｐＨ５で−５０mVに固定したＡｔＧＴＲ１を発現する卵母細胞を、１００μMの内因性短鎖メチオニンに由来するＧＳＬ ４−ＭＴＢ、４−メチルスルフィニルブチル−ＧＳＬ及び外因性フェニルアラニンに由来するｐ−ヒドロキシベンジル−ＧＳＬ（ｐＯＨＢＧ）で灌流した場合、ＡｔＧＴＲ１に関して、３０、１０及びnAの規模の内向き電流が観察された（図３Ｆ）。同様に、ＡｔＧＴＲ２は、卵母細胞抽出物のＬＣ−ＭＳ分析によって測定した３個のグルコシノレートすべてを取り込んだ（データは示さず）。これにより、トランスポーターは、ＧＳＬ側鎖に関して広範な特異性を有することが示された。
基質特異性の調査を拡大して、ＮＲＴ／ＰＴＲトランスポーターファミリーに関して以前に同定した基質、すなわち、ジペプチド及びトリペプチド並びに硝酸塩、を含めた。ＡｔＧＴＲ１を発現する卵母細胞を、ｐＨ５、１３３μMのジペプチド（ａｌａ−ｈｉｓ、ｇｌｙ−ｌｅｕ、ａｓｐ−ａｌａ）及びトリペプチド（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ及びｍｅｔ−ａｌａ−ｓｅｒ）で灌流すると、いかなる検出可能な電流も生じなかった。しかしながら、１mM ＮＯ３−で灌流すると電流は生じたが、これらの量は、１００μM ４−ＭＴＢで灌流した場合に測定した電流のわずか１／１０になった（図３Ｆ）。これにより、ＡｔＧＴＲは、おそらく二重基質特異性を有することが示された。これをさらに調査するために、ＡｔＧＴＲ１及びＡｔＧＴＲ２を発現する卵母細胞を、５０ｘ超の非ラベル化４−ＭＴＢ、ＮＯ３ −及びジペプチド／トリペプチドの混合物の存在下で４０μM Ｃ１４ラベル化ｐＯＨＢＧに曝露した。５０ｘ超の４−ＭＴＢのみが、ｐＯＨＢＧの取り込みをバックグラウンドレベルに減少させたのに対して、他の化合物は、有意な阻害効果を有しなかった（図３Ｅ）。まとめると、本発明者らの生化学的分析により、ＡｔＧＴＲ１及びＡｔＧＴＲ２は、高親和性、特異的、起電性なプロトン駆動性ＧＳＬトランスポーターであり、広範囲のＧＳＬに対して広範な特異性を有することが示された。
材料と方法−実施例２：
Xenopus卵母細胞におけるトランスポーターｃＤＮＡライブラリーの機能的スクリーニング：２箇所改変したが本質的にはNour-Eldin et al. (2006, Plant Methods 2 : 17)に記載されているように、Xenopus卵母細胞において、２３９個のArabidopsisトランスポーターのライブラリーの調製及び機能的スクリーニングを実施した。第１に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写前に、ＤＮＡ鋳型をプールしなかった。代わりに、各ＰＣＲ産物を個別にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、次いで、プール１個あたり１０個の転写産物にプールした。転写を個別に実施して、プールしたＰＣＲフラグメントの転写効率が変化する可能性により、遺伝子プールがアンバランスになるのを防止した。第２に、ライブラリーを、１０個の転写産物をそれぞれ含む２３個のプールと、９個の転写産物を含む２４番目のプールとに分割した。１mM ４−ＭＴＢ（Arabidopsis配列の場合）又は０．５mM ４−ＭＴＢ（Brassica配列の場合）を含むKulori（ｐＨ５）中、室温で、取り込みアッセイを実施した。続いて、注射した卵母細胞へのＧＳＬ取り込みを媒介した転写産物プールを、個別の転写産物として注射して、ＧＳＬトランスポーターを同定した。
Xenopus卵母細胞における発現のための構築物：プライマー対ＡｔＧＴＲ２ｆ（配列番号８４）及びＡｔＧＴＲ２ｒ（配列番号８５）並びにプライマー対ＡｔＧＴＲ５ｆ（配列番号９４）及びＡｔＧＴＲ５ｒ（配列番号９５）（Nour-Eldin et al., 2006, Nucl Acids Res 34 : e122）をそれぞれ使用して、葉組織に由来するｃＤＮＡから、ＡｔＧＴＲ２及びＡｔＧＴＲ５のコード配列をクローニングした。第１エクソンに関するプライマー対ＡｔＧＴＲ４ｅ１ｆ及びＡｔＧＴＲ４ｅ１ｒ（配列番号８６及び８７）、第２エクソンに関するプライマー対ＡｔＧＴＲ４ｅ２ｆ及びＡｔＧＴＲ４ｅ２ｒ（配列番号８８及び８９）、第３エクソンに関するプライマー対ＡｔＧＴＲ４ｅ３ｆ及びＡｔＧＴＲ４ｅ３ｒ（配列番号９０及び９１）、並びに、第４エクソンに関するプライマー対ＡｔＧＴＲ４ｅ４ｆ及びＡｔＧＴＲ４ｅ４ｒ（配列番号９２及び９３）を使用するＰＣＲ増幅によって、ＡｔＧＴＲ４をクローニングし、続いて、ゲノムＤＮＡに由来するその４個のエクソンを融合した。以前に記載されているように（Geu-Flores et al., 2007, Nucl Acids Res 35 :e55）、ＵＳＥＲ融合及びｐＮＢ１ｕへのクローニングを実施した。
B. rapa ecotype pekinensisの葉から単離したｃＤＮＡから、ＢｒＧＴＲ２−Ａ２のコード配列（配列番号６５）をクローニングした。プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−ｆ（配列番号６７）及びＢｒＧＴＲ２−Ａ２−ｒ（配列番号６８）を使用してＣＤＳをクローニングし、Xenopus発現ベクターｐＮＢ１ｕ（Nour-Eldin et al., 2006, Nucl Acids Res 34 : e122）にＵＳＥＲクローニングした。
プライマーＴ７（配列番号９６）及びｐＮＢ１ｒｅｖ（配列番号９７）を使用するＰＣＲによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための直鎖状鋳型を作製した。以下のように、５０μlの反応容量で、ｃＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写した：８０Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Fermentas）；０，０１Ｍ ＤＴＴ；０，１μg/μl ＢＳＡ；６０μM 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNA Cap Structure Analog (New England Biolabs)；２０Ｕ Ribolock（商標）ＲＮａｓｅ阻害剤（Fermentas）；０，０１Ｕピロホスファターゼ（Fermentas）；１mM ｒＡＴＰ、ｒＵＴＰ、ｒＣＴＰ及び０，０５mM ｒＧＴＰ（LAROVA）を含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼ転写バッファー中、３７℃で、１〜５μgの直鎖状鋳型を３０分間インキュベーションした。次いで、ｒＧＴＰを添加して１mMの最終濃度とし、反応液を３時間インキュベーションした。塩化リチウム沈殿によってＲＮＡを精製し、ヌクレアーゼフリーのＨ２Ｏに溶解させて、０，５μg/μlの最終濃度とした。
Xenopus卵母細胞におけるＧＳＬ輸送アッセイ：
卵母細胞処置及び注射：以前に記載されているように（1998, Methods Enzymol. 296: 17-52）卵母細胞を準備し、５０ngのｃＲＮＡを注射した。輸送活性をアッセイする前に、卵母細胞を、１７℃で３〜４日間インキュベーションした。
アッセイ条件：ＴＲＩＳでｐＨ５に調整した生理食塩水バッファーkulori（９０mM ＮａＣｌ、１mM ＫＣｌ、１mM ＣａＣｌ２、１mM ＭｇＣｌ２、５mM ＭＥＳ）中で、アッセイを実施した。kuloriバッファー（ｐＨ５）中で、卵母細胞を５分間プレインキュベーションして細胞内定常状態ｐＨを確保し、続いて、示された濃度の基質を含む５００μlのkuloriバッファー（ｐＨ５）に移し、室温で１時間インキュベーションした。氷冷kuloriバッファー（ｐＨ５）で、卵母細胞を４回洗浄した。
輸送定量化：放射性ラベル化基質を用いるアッセイの場合、４mlのシンチレーションバイアルに入れた１００μlの１０％ＳＤＳ中で２０〜３０分間振とうすることによって、単一の卵母細胞を破裂させた。２．５mlのEcoScint（商標）scintillation fluid (National Diagnostics）を添加し、シンチレーション計数によって、取り込まれた化合物を定量化した。非ラベル化基質を用いるアッセイの場合、ＬＣ−ＭＳによって、卵母細胞抽出物を分析した。繰り返し１回あたり卵母細胞５個のバッチで、卵母細胞を分析した。洗浄した卵母細胞を、１mg/mlスルファターゼ（Sigma A-25-120）を含む１００μlのkulori（ｐＨ５）中でホモジナイズし、室温で１２時間放置した。次いで、等容量の１００％メタノールを添加し、サンプルを−２０℃で１時間インキュベーションし、２００００ｇで１５分間遠心分離した。Bruker HCT-Ultra ion trap mass spectrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)と連結したAgilent 1100 Series LC (Agilent Technologies, Germany)を使用するＬＣ−ＭＳ分析によって、脱硫酸化グルコシノレートを含む３μlの上清を分析した。Zorbax SB-C18 column (Agilent; 1,8 mm, 2,1 mm X 50 mm)を０，２ml／分の流速で使用し、オーブン温度を３５℃に維持した。移動相を、Ａ、０，１％（ｖ／ｖ）ＨＣＯＯＨ及び５０μM ＮａＣｌを含む水；Ｂ、０，１％（ｖ／ｖ）ＨＣＯＯＨを含むアセトニトリルとした。勾配プログラムを、０〜０，５分、等張２％Ｂ；０，５〜７，５分、直線勾配２〜４０％Ｂ；７，５〜８，５分、直線勾配４０％〜９０％Ｂ；８，５〜１１，５分等張９０％Ｂ；１１，６〜１５分、等張２％Ｂとした。１１，２〜１３，５分の合間に、流速を０，３ml／分に増加した。質量分析計をポジティブエレクトロスプレーモードで実行した。
実施例３：突然変異ＧＴＲ遺伝子を有する植物及び植物部分の作製並びに特性決定
突然変異ＧＴＲ遺伝子を有する植物の作製及び特性決定
ＡｔＧＴＲ１（ａｔｇｔｒ１−１）、ＡｔＧＴＲ２（ａｔｇｔｒ２−１）及びＡｔＧＴＲ３（ａｔｇｔｒ３−１）のArabidopsis Ｔ−ＤＮＡ突然変異体を、それぞれ、SALK T-DNA collection (Alonso et al., 2003, Science 301: 653-657)から同定した。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏゲノム配列分析により、ａｔｇｔｒ１−１は、第１エクソンにＴ−ＤＮＡ挿入を含むのに対して、ａｔｇｔｒ２−１は、コード領域の第４エクソンにＴ−ＤＮＡ挿入を含み、ａｔｇｔｒ３−１は、第３エクソンにＴ−ＤＮＡ挿入を含むことが示された。遺伝子型決定［ａｔｇｔｒ１に関するプライマー対ＡｔＧＴＲ１＿Ｎ８７９７４２＿ＲＰ（配列番号９８）及びＡｔＧＴＲ１＿Ｎ８７９７４２＿ＬＰ（配列番号９９）、ａｔｇｔｒ２に関するＡｔＧＴＲ２＿Ｎ８７０２１０＿ＲＰ（配列番号１００）及びＡｔＧＴＲ２＿Ｎ８７０２１０＿ＬＰ（配列番号１０１）；並びにａｔｇｔｒ３に関するＡｔＧＴＲ３＿Ｎ４０９４２１＿ＲＰ（配列番号１０２）及びＡｔＧＴＲ３＿Ｎ４０９４２１＿ＬＰ（配列番号１０３）を使用する］、及び、ＲＴ−ＰＣＲ分析［ＡｔＧＴＲ１に関するプライマー対ＡｔＧＴＲ１＿ＲＴ＿ｆｗ（配列番号１０４）及びＡｔＧＴＲ１＿ＲＴ＿ｒｅｖ（配列番号１０５）、ＡｔＧＴＲ２に関するＡｔＧＴＲ２＿ＲＴ＿ｆｗ（配列番号１０６）及びＡｔＧＴＲ２＿ＲＴ＿ｒｅｖ（配列番号１０７）並びにＡｔＧＴＲ３に関するＡｔＧＴＲ３＿ＲＴ＿ｆｗ（配列番号１０８）及びＡｔＧＴＲ３＿ＲＴ＿ｒｅｖ（配列番号１０９）を使用する］により、ａｔｇｔｒ１、ａｔｇｔｒ２及びａｔｇｔｒ３ホモ接合性突然変異体は、それらの各ＡｔＧＴＲに関するヌル突然変異体であったことが示された。ａｔｇｔｒ１突然変異植物とａｔｇｔｒ２突然変異植物を交雑することによって、ダブルノックアウト突然変異体を作製した。野生型、ａｔｇｔｒ１、ａｔｇｔｒ２及びａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２遺伝子型のそれぞれに関して、分離Ｆ２集団から、３個のホモ接合性系統を同定した。
配列番号６５のＢｒＧＴＲ２−Ａ２配列、並びに、ｔｉｌｌｉｎｇプライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−Ｔｉｌｌ−ｆ（配列番号６９）、ＢｒＧＴＲ２−Ａ２−Ｔｉｌｌ−ｒ（配列番号７０）、ＢｒＧＴＲ２−Ａ２−Ｉｎｎｅｒ−ｆｗ（配列番号７１）、ＢｒＧＴＲ２−Ａ２−Ｉｎｎｅｒ−ｆｗ２（配列番号７２）及びＢｒＧＴＲ２−Ａ２−Ｉｎｎｅｒ−ｒｖ（配列番号７３）を使用するＴＩＬＬＩＮＧによって、突然変異B. rapa ecotype R-0-18植物集団（RevGenUK）において、ＢｒＧＴＲ２−Ａ２のBrassica rapa置換突然変異体を同定した。２０個の置換突然変異を見出した：７個のサイレント突然変異（同じアミノ酸をコードするコドンをもたらす核酸突然変異）、８個の重篤でない突然変異（同じ機能クラスに属するアミノ酸をコードするコドンをもたらす核酸突然変異）、４個の重篤な突然変異（異なる機能クラス（例えば、大型に対して小型、極性に対して非極性、非脂肪族に対して脂肪族、非芳香族に対して芳香族、極性に対して疎水性、非酸性側鎖に対して酸性側鎖）に属するアミノ酸をコードするコドンをもたらす核酸突然変異）、及び、１個の終止コドン突然変異。B. rapa ecotype R-0-18に由来するＢｒＧＴＲ２−Ａ２のゲノムＤＮＡ配列において見出された重篤又は終止突然変異コドンのヌクレオチド位置、及び、配列番号６６における対応するアミノ酸位置を、表７に示す。B. rapa ecotype pekinensisに由来するＢｒＧＴＲ２−Ａ２の示したアミノ酸をコードするコドンは、配列番号６５における示したアミノ酸位置に見出すことができる。各突然変異に関して、プライマーＢｒＧＴＲ２−Ａ２−Ｉｎｎｅｒ−ｆｗ（配列番号７１）、ＢｒＧＴＲ２−Ａ２−Ｉｎｎｅｒ−ｆｗ２（配列番号７２）及びＢｒＧＴＲ２−Ａ２−Ｉｎｎｅｒ−ｒｖ（配列番号７３）を使用し、得られたアンプリコンを配列決定し、表７に示した位置における野生型又は突然変異コドンの存在を決定して、ホモ接合性野生型及び突然変異B. rapa植物を同定した。突然変異植物を生育し、異なる植物部分においてＧＳＬ含量を測定する。
突然変異植物を生育し、異なる植物部分においてＧＳＬ含量を測定する。結果を図９にまとめる。Ｂｒｇｔｒ２ノックアウト突然変異体に由来する種子（ＢｒＧＴＲ２（Ｗ２２９Ｘ Ｍｕｔ１−９））は、「真の」ＷＴ B. rapa種子及びＢｒＧＴＲ２ Ｓ（Ｗ２２９Ｘ）ＷＴＳの両方と比較して、グルコシノレート含量が減少していた。各遺伝子型の種子をプールする場合、減少は、ＢｒＧＴＲ２（Ｗ２２９Ｘ−ＷＴ）植物と比較して、〜８０％である。アミノ酸Ｇ１４５Ｒ（Ｇ１４５Ｒ Ｍｕｔ１〜４）の突然変異をしたＢｒＧＴＲ２を含むB. rapa植物は、非常にばらつきのあるグルコシノレート含量を示しているが、これは、種子グルコシノレート含量に影響を与える遺伝子におけるさらなるＥＭＳ誘発性点突然変異の分離が、おそらく原因である。
突然変異Brassica rapa ＧＴＲ２−Ａ２タンパク質の機能特性決定
Xenopus卵母細胞における４−ＭＴＢの取り込み活性に関して、同定した突然変異ＢｒＧＴＲ２−Ａ２タンパク質を個別に試験した。以前に記載されているように（Geu-Flores et al., 2007, Nucl Acids Res 35 :e55）、ＵＳＥＲ融合によって、ＢｒＧＴＲ２−Ａ２に点突然変異を作製した。つまり、コード配列を、所望の突然変異位置に隣接する２個のフラグメントとしてＰＣＲ増幅する。各フラグメントは、塩基置換が組み込まれた相補的なテイルを有する。加えて、ウラシル特異的切断試薬（ＵＳＥＲ）により切断されると長い一本鎖オーバーハング（これは、他のフラグメントに由来する相補的なテイルと容易にかつしっかりとアニーリングする）を生じるウラシル残基を、各テイルは含む。各フラグメントの末端終結部において、突然変異の上流に位置するフラグメントのためのフォワードプライマーとしてＢｒＧＴＲ２−Ａ２−ｆプライマーを使用し、突然変異の下流に位置するフラグメントのためのリバースプライマーとしてＢｒＧＴＲ２−Ａ２−ｒを使用した。ジャンクションにおいて使用したプライマーを、配列番号７４及び７５（表７に示されるアミノ酸１２６置換のためのフォワード及びリバースプライマー）、配列番号７６及び７７（表７に示されるアミノ酸１４５置換のためのフォワード及びリバースプライマー）、配列番号７８及び７９（表７に示されるアミノ酸１９２置換のためのフォワード及びリバースプライマー）、配列番号８０及び８１（表７に示されるアミノ酸２２９置換のためのフォワード及びリバースプライマー）並びに配列番号８２及び８３（表７に示されるアミノ酸３５９置換のためのフォワード及びリバースプライマー）に示す。ｐＮＢ１ｕベクターへの挿入後に配列決定することによって各クローンを確認し、上記のようにＲＮＡを作製し、卵母細胞に注射した。各クローンの取り込み活性を図２及び表７に示す。
結論としては、終止コドンを含むＢｒＧＴＲ２は非機能的であり、これは、トランケーション型のタンパク質がｉｎ ｐｌａｎｔａで非機能的であることを示しているのに対し、残りの突然変異は様々な輸送活性を示した。これらの様々な輸送活性は、置換を受けるアミノ酸位置が、ＢｒＧＴＲ２輸送活性に重要であることを示している。ＰＯＴタンパク質の提案モデルによれば、膜貫通ヘリックス番号１、２、４、５、７、８、１０及び１１は、トランスポーターの中心孔を１列に並べ、輸送機構に関与する。残りのヘリックス（番号３、６、９及び１２）は周辺に見られ、構造的安定性を付与し得る。突然変異ＢｒＧＴＲ２（Ｇ１２６Ｒ）及びＢｒＧＴＲ２（Ｓ３５９Ｆ）は、それぞれ膜貫通ヘリックス３及び７に存在する。ヘリックス３は、輸送機構に関与しないはずである；従って、ＢｒＧＴＲ２（Ｇ１２６Ｒ）は、タンパク質の三次構造をひどく破壊し、取り込み活性がほとんどなくなった原因の可能性があるという仮説を立てることができる。ヘリックス７は、輸送が起こる場所である中心孔を１列に並べる；従って、このＢｒＧＴＲ２（Ｓ３５９Ｆ）に関して見られた取り込み活性の増加は、小さい側鎖（セリン）から大きい側鎖（フェニルアラニン）に転移して、孔の拡大が起こったためである可能性がある。さらに、Ｓ３５９Ｆ転移の極性の変化は、活性の増加に寄与する可能性がある。突然変異ＢｒＧＴＲ２（Ｇ１４５Ｒ）は、４−ＭＴＢの取り込みに有意な変化を引き起こさない。ヘリックス４とヘリックス５の間の細胞質ループにおける突然変異ＢｒＧＴＲ２（Ｅ１９２Ｋ）は、グルコシノレート取り込みの減少を引き起こすようである。負に帯電したグルタミン酸から正に帯電したリシンへのアミノ酸シフトは、非常に劇的であり、おそらくタンパク質構造を破壊する可能性がある。さらに、リン酸化部位は、ＡｔＧＴＲ２のペプチド配列「ｓｅｒ−ｇｌｕ−ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｌｙｓ−ａｒｇ」上に示唆された。ＡｔＧＴＲ２とＢｒＧＴＲ２のアライメントは、この配列が保存されていること、及び、当該ペプチドがＢｒＧＴＲ２の残基１９１〜１９６に対応することを示している。従って、突然変異グルタミン酸（Ｅ１９２Ｋ）の周囲のセリン（１９１及び１９３）の一方が、正常にリン酸化（又は脱リン酸化）される場合、これは、リシンへの転移によって防ぐことができる；次いで、これが取り込み活性を減少させ得る。
突然変異ＧＴＲ Arabidopsis植物の種子におけるＧＳＬ含量の特性決定
ヘテロ接合性ａｔｇｔｒ１、ａｔｇｔｒ２及びａｔｇｔｒ３突然変異体に由来する分離後代のＧＳＬ分析により、ホモ接合性ａｔｇｔｒ３植物に由来する種子は、野生型レベルの総脂肪族及びインドールＧＳＬを含むことが示された。同様に、ａｔｇｔｒ１は、種子１個あたりの総脂肪族及びインドールグルコシノレート含量が有意に減少していなかったのに対して、ａｔｇｔｒ２種子は、総脂肪族ＧＳＬ濃度が約５０％減少していた（図４Ａ〜Ｃ及び５Ａ）。加えて、インドールＧＳＬ含量は、ａｔｇｔｒ２種子において検出できなかった。植物１個体あたり２０個の種子を分析したところ、各ホモ接合性ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２系統に由来する種子におけるＧＳＬレベルは、検出限界未満であったが、これは、種子へのＧＳＬ輸送においてＡｔＧＴＲ１及びＡｔＧＴＲ２の複合的な活動が果たす重要な役割を示している。野生型及びａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物に由来する１０mgの種子を分析したところ、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物に由来する種子において、野生型と比較して２５０倍低いレベルの微量のグルコシノレートを検出できた。
分子相補性に関して、それぞれ、２ｋｂプロモーターと、ＹＦＰに融合したゲノム配列と、３’ＵＴＲとを含むＡｔＧＴＲ１構築物、及び、２ｋｂプロモーターとそれに続くゲノム配列とからなるＡｔＧＴＲ２構築物を、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２二重突然変異体に導入したところ、種子における脂肪族及びインドールＧＳＬ含量の両方を回復させることが示された（図４Ｅ〜Ｆ）。これにより、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２突然変異体におけるＧＳＬフリーの種子の表現型は、ＡｔＧＴＲ１及びＡｔＧＴＲ２輸送タンパク質の欠如が原因であることが実証された。
突然変異ＧＴＲ Arabidopsis植物の葉におけるＧＳＬ含量の特性決定
抽だい前、抽だい後及び老化時のロゼット全体において、ＧＳＬレベルを測定した。野生型植物に由来するロゼットにおいて、脂肪族ＧＳＬ含量を測定したところ、抽だいの前後ではロゼット１個あたりそれぞれ２８±１３及び６８±１９nmolであり、老化ロゼットでは８±３nmolであった。対照的に、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物に由来するロゼットでは、脂肪族ＧＳＬ含量は、ロゼット１個あたり抽だい前の２７±１１nmolから抽だい後の４１０±７８nmolに劇的に増加し、老化時はロゼット１個あたり１６１±３１nmolに保たれていた。ａｔｇｔｒ１及びａｔｇｔｒ２単一ノックアウト系統のロゼットは、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２のロゼットと比較して、中間レベルを含んでいた（図４Ｂ）。脂肪族ＧＳＬと比較して、インドールＧＳＬ含量は、ロゼット組織において、より大きな変動を示した。しかしながら、抽だい後及び老化時において野生型とａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２のロゼットを比較すると、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２のロゼットは、平均して２倍高いインドールＧＳＬを含んでいた。まとめると、これらの観察結果は、ロゼット組織が、脂肪族及びインドールＧＳＬの両方を連続的に合成して輸出することを示しており、ＡｔＧＴＲ１及びＡｔＧＴＲ２の両方が、野生型植物におけるこの活動に重要であることを実証している。
突然変異ＧＴＲ Arabidopsis植物の茎、花、葉、長角果及び長角果壁におけるＧＳＬ含量の特性決定
抽だい後の植物から、花序（長角果及び茎生葉を含まない）、茎生葉、すべてのインタクトな長角果（種子を含む）、及び、単一の切開した長角果（最も未成熟及び最も成熟なもの）に由来する長角果壁において、ＧＳＬ含量を別々に測定した。加えて、老化時において、単一の長角果壁を分析した。
抽だい後の野生型では、花序（長角果及び茎生葉を含まない）は、花序１個あたり２００±４６nmolの脂肪族ＧＳＬを含んでいたのに対して、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物に由来する花序は、６１±２８nmolを含んでおり、ａｔｇｔｒ１及びａｔｇｔｒ２植物の花序は、中間レベルを含んでいた（図５Ｃ）。抽だい後の野生型植物に由来する茎生葉では、脂肪族ＧＳＬ含量は、茎生葉合計で５９±１５nmolの量であったのに対して、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２突然変異体は、それらの茎生葉において１８１±２０nmolを含んでいた（図５Ｃ）。脂肪族ＧＳＬの含量の増加は、長角果壁においても観察され、抽だい後のａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物における濃度は、長角果壁１個あたり８．８±３nmolであったのに対して、野生型植物では、長角果壁１個あたり２．９±０，８nmolであった。老化時において、野生型に由来する長角果壁におけるＧＳＬレベルは、長角果壁１個あたり０．３±０，１３nmolに減少したのに対して、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２の長角果壁は、３±０，７８nmolに保たれていた（図５Ｄ）。
まとめると、これらの観察結果は、この発生段階において、ロゼット組織に加えて茎生葉及び長角果壁が、ＧＳＬ源として機能するのに対して、花序全体又はその一部は、ＡｔＧＴＲ１及びＡｔＧＴＲ２媒介性ＧＳＬ輸送のシンクを構成するようであることを示している。長角果を分析した際の２つのさらなる観察結果は、注目に値する。第１に、抽だい後の野生型又はａｔｇｒｔ１／ａｔｇｔｒ２突然変異体に由来するインタクトな長角果を分析した際に、ＧＳＬ含量に有意差は観察されず（図５Ｃ）、これは、この発生段階において、インタクトな長角果のＧＳＬ含量が、ＡｔＧＴＲ１及びＡｔＧＴＲ２の活性にもっぱら依存していないことを示している（図５Ｄ）。第２に、他の組織とは対照的に、抽だい後のａｔｇｔｒ１及びａｔｇｔｒ２単一突然変異体は、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２と比較して中間の表現型を示さず、反対に、ａｔｇｔｒ１及びａｔｇｔｒ２は両方とも野生型と似ていたが、これはおそらく、両方のトランスポーターを突然変異させることの興味深い相乗効果を示している（図５Ｄ）。
抽だい後の植物の様々な組織における総脂肪族ＧＳＬ含量のバランスを計算すると、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物は、ロゼット及び茎生葉において、野生型と比較して、約４６０nmolの過剰分を含むことが見られる。この増加は、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物の茎及びインタクトな長角果における約１６０nmolの減少によってのみ達成されるので、これは、野生型と比較して、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物の地上部合計で総脂肪族ＧＳＬ含量の約３００nmolの増加をもたらす（表８）。
突然変異ＧＴＲ Arabidopsis植物の根におけるＧＳＬ含量の特性決定
抽だい前後の水耕栽培植物に由来する根、ロゼット及び花序において、ＧＳＬ濃度を測定した。抽だい前では、野生型の根における脂肪族グルコシノレート含量は、１，７５±０．２８nmol/mg生重量であったのに対して、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２の根に含まれるのは、２０倍少なかった（０，０８±０，０６nmol/mg）。抽だい後では、野生型植物に由来する根は、０，８±０，１４nmol/mgの脂肪族グルコシノレートを含んでいたのに対して、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物に由来する根は、０．２±０．０６nmol/mg（すなわち、４倍未満）を含んでいた（図６Ａ）。土壌栽培植物とは対照的に、抽だい前の水耕栽培植物に由来する対応するロゼットにおける脂肪族グルコシノレート含量は、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物（１，３３±０，１１nm／mg）では、野生型（０，６４±０，１nmol/mg）と比較して、２倍超であった（図６Ｂ）。抽だい後では、野生型とａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物に由来するロゼットの間の倍差は、より顕著になり、野生型植物は、０．３５±０，１３nmol/mgを含んでいたのに対して、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２のロゼットは、１．４４±０，１６nmol/mg（すなわち、４倍超の濃度）を含んでいた（図６Ｂ）。最後に、野生型とａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２植物に由来する花序の間の脂肪族グルコシノレート濃度に、有意差は見られなかった（図６Ｂ）。まとめると、これらの観察結果は、ａｔｇｔｒ１／ａｔｇｔｒ２の地上組織におけるグルコシノレート蓄積の大幅な増加が、根に輸送されるはずであった量によって説明できることを示している。従って、根は、グルコシノレート輸送に関する、まだ同定されていない強力なシンクを構成する。
Arabidopsis植物におけるＡｔＧＴＲ１及び２の組織、細胞並びに細胞内局在の特性決定
β−Ｄ−グルクロニダーゼ（ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ）（ＧＵＳ）の発現を駆動するのに、２ｋｂの各プロモーターを使用した。抽だい前は、ｐＧＴＲ１：：ＧＵＳ活性は、排水組織の周囲の明確なスポットに限定されていた。対照的に、抽だい後は、ロゼット葉の維管束組織、葉肉及び表皮を含む葉全体にわたって、ｐＧＴＲ１：：ＧＵＳ活性を検出した。発生中の花では、ｐＧＴＲ１：：ＧＵＳ活性は、萼片の表皮の個々の細胞において見られたのに対して、発生中の長角果は、表皮及び珠柄において活性を示した。この発現パターンにより、ＡｔＧＴＲ１は、抽だい後の葉全体にわたって、細胞間のグルコシノレート輸送において普遍的な役割を果たす可能性があることが示された。表皮への局在により、グルコシノレートは、葉の外周に輸送される可能性があることが示された。
ｐＧＴＲ２：：ＮＬＳ−ＧＦＰ−ＧＵＳトランスジェニック植物では、ＧＵＳ活性は、発生を通じて維管束組織において強くかつ主に検出され、いくらかの活性が、葉の表皮においても検出された。さらに、ＧＵＳ活性は、萼片の維管束構造、花弁及び発生中の花の花糸において検出された。発現は、長角果壁の維管束組織及び発生中の種子の珠柄においても検出された。比較すると、ＧＵＳ活性は、いかなる発生段階の非トランスフォーメーション植物のいかなる組織においても検出できなかった。ＡｔＧＴＲ２が維管束組織において明らかに限定的かつ構成的に発現していることにより、維管束組織におけるバリアを越えてグルコシノレートを輸送して、シンクへの長距離輸送を可能にする主な役割が示された。
材料と方法−実施例３：
植物材料及び生育条件：地上組織におけるＧＳＬ分析及び発現局在研究に関して、２０℃、１６時間明期（７００μE*m*-2*s-1）のグロースチャンバーにおいて、４cmの植木鉢に入れた土壌で、Arabidopsis植物（ecotype Columbia-0）を栽培した。根におけるＧＳＬ分析に関して、（Lehmann et al. 2009, Mol Plant 2: 390-406）に記載されている水耕システムにおいて、植物を生育した。つまり、空のピペット−チップボックス内に保持した０．５mlのマイクロチューブに入れた０．５％植物寒天／５０％Gibeaut’s栄養溶液（Gibeaut et al., 1997, Plant Physiol 115 : 317-319）上で、種子を発芽させた。発芽後約１週間にチューブの底を切り取り、ボックスを１００％栄養溶液で満たした。約２週間後に植物をより大きなコンテナに移し、２０℃、１６時間：８時間光周期の下で生育した。栄養溶液を毎週交換し、遺伝子型を別々のコンテナで生育した。土壌栽培植物に関して記載したように、グルコシノレート分析のための個々の組織の回収を実施した。
植物組織からのＧＳＬ抽出及び分析：ａｔｇｔｒ１−１×ａｔｇｔｒ２−１の交雑から生じた各遺伝子型の各系統（それぞれに関して同定した３つ）において、３つの時点でＧＳＬレベルを分析した。１）抽だい前：花序の出現前の１０〜１４枚の葉を有する完全に形成されたロゼットを特徴とする３週齢植物（成長段階１．１０〜１．１２）、２）抽だい後：全長が最低である長角果、及び、少なくとも７〜１０個の発生中の長角果が存在することを特徴とする５週齢植物（成長段階６．１０〜６．３０）、３）老化：老化して乾燥した緑色組織、及び、発生した長角果すべてが成熟種子を含むことを特徴とする８〜９週齢植物（成長段階９．７）。成長段階の定義は、以前に記載されている通りである（Boyes et al., 2001, Plant cell 13: 1499-1510）。各遺伝子型の各系統において、抽だい前後の水耕栽培植物のロゼット、根及び花序におけるＧＳＬレベルも分析した。
土壌栽培又は水耕栽培した抽だい前後の植物で実施した分析に関して、新鮮組織を採取し、ホモジナイズした。具体的には、抽だい後の長角果壁の分析に関して、長角果壁及び未成熟種子に切開する前に、インタクトな長角果を凍結乾燥した。老化植物の分析に関して、乾燥組織を採取し、ホモジナイズした。成熟種子の分析に関して、２０個の種子を分析した。ＧＳＬを抽出し、以前に記載されているように（Hansen et al. 2007, Plant J 50 : 902-910）、C 18 reversed phase column （Supelcosil LC-18-DB、２５cm×４．６mm、５μm粒径、Supelco, Bellefonte, PA, USA）を備えるHP1200 Series HPLC（Agilent製）を用いて、１ml分−１の流速（注入量４５μl）で水（溶媒Ａ）−アセトニトリル（溶媒Ｂ）勾配を使用することにより、脱硫酸化ＧＳＬとして分析した。勾配を以下のようにした：１．５〜７％Ｂ（５分）、７〜２５％（６分）、２５〜８０％（４分）、８０％Ｂ（３分）、８０−３５％Ｂ（２分）、３５〜１．５％Ｂ（２分）及び１．５％Ｂ（３分）。２００〜４００nm（２nm間隔）のダイオードアレイ検出によって、溶出液をモニタリングした。公知の基準のもの（Reichelt et al., 2002）との保持時間及びＵＶ吸収スペクトルの比較に基づいて、脱硫酸化ＧＳＬを同定した。応答係数（Brown et al., 2003; Fiebig and Arens, 1992）に対して計算したnmolとして、結果を示す。
レポーター及び相補構築物の構築：すべてのクローニングにE.coli株DH10Bを使用した。ＡｔＧＴＲ１及びＡｔＧＴＲ２プロモーター：レポーター構築物に関して、ＡｔＧＴＲ１プロモーター用のプライマーＡｔＧＴＲ１ｐｆ（配列番号１１０）及びＡｔＧＴＲ１ｐｒ（配列番号１１１）、並びに、ＡｔＧＴＲ２プロモーター用のプライマーＡｔＧＴＲ２ｐｆ（配列番号１１２）及びＡｔＧＴＲ２ｐｒ（配列番号１１３）を使用して、Arabidopsis（Col-0）ゲノムＤＮＡから、プロモーターを増幅した。ｐＣａｍｂｉａ３３００ｕ−ＮＬＳ−ＧＰＦ−ＧＵＳ、すなわちβ−Ｄ−グルクロニダーゼに融合したＧＦＰが後ろにある核局在シグナルの上流（Chytilova et al., 1999, Ann. Bot. 83: 645-654）に、プロモーターフラグメントをＵＳＥＲクローニングした。相補構築物ＡｔＧＴＲ２プロモーター−ＡＴＧＴＲ２ゲノム遺伝子に関して、プライマープライマーＡｔＧＴＲ２ｐｆ（配列番号１１２）及びＡｔＧＴＲ２ｐｒ（配列番号１１３）を使用して、フラグメントをＰＣＲ増幅し、ｐＣａｍｂｉａ１３００ｕにＵＳＥＲクローニングした。相補構築物ＡＧＴＲ１プロモーター−ＡｔＧＴＲ１ゲノム遺伝子−ＹＦＰ−３’ＵＴＲに関して、プロモーター−ゲノム遺伝子フラグメント用のプライマーＡｔＧＴＲ１ｐｆ（配列番号１１０）及びＡｔＧＴＲ１ｒ−ＹＦＰ（配列番号１１４）、ＹＦＰフラグメント用のプライマーＹＦＰｆ−ＡｔＧＴＲ１−融合（配列番号１１５）及びＹＦＰｒ−ｐｏｔ１３’ＵＴＲｆｕｓｉｏｎ（配列番号１１６）、並びに、３’ＵＴＲフラグメント用のプライマーＡｔＧＴＲ１（３’ＵＴＲ）ｆ−ＹＦＰ融合（配列番号１１７）及びＡｔＧＴＲ１（３’ＵＴＲ）ｒ（配列番号１１８）を使用して、各フラグメントをＰＣＲ増幅した。ｐＣａｍｂｉａ１３００ｕベクターにフラグメントをＵＳＥＲ融合した。植物発現プラスミドを、安定的ArabidopsisトランスフォーメーションのためのAgrobacterium（GV3101）をトランスフォーメーションするのに使用した。
ＧＵＳ活性に関するトランスジェニックArabidopsis植物の染色：１mM Ｘ−ＧＩｃ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０％（ｖ／ｖ）メタノール、１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１０mMアスコルビン酸塩を含む溶液に、Ｘ週齢Arabidopsis ＧＴＲ１ ｐｒｏｍ−ＧＦＰ−ＧＵＳ及びＧＴＲ２ ｐｒｏｍ−ＧＦＰ−ＧＵＳ植物を浸し、３７℃で１６時間インキュベーションした。染色後に洗浄し、７０％エタノール中でインキュベーションすることによって、クロロフィルを除去した。
実施例４：突然変異Brassica ＧＴＲ遺伝子及びそれを含む植物及び植物部分の作製並びに特性決定
Brassica植物に由来する種子（Ｍ０種子）をＥＭＳに曝露する。突然変異を起こした種子（Ｍ１種子）からＭ１植物を生育し、自家受粉させてＭ２種子を作製する。Ｍ２植物を生育し、植物サンプルからＤＮＡサンプルを調製する。ＧＴＲ遺伝子のタンパク質コード領域における終止コドンの導入、ＧＴＲタンパク質におけるアミノ酸の置換、又は、スプライス部位突然変異を引き起こすＧＴＲ遺伝子における点突然変異の存在に関して、ＤＮＡサンプルを、上記ＧＴＲ特異的プライマーを用いて直接配列決定し、点突然変異の存在に関して配列を分析することによってスクリーニングする。Ｍ２植物のＤＮＡサンプルにおいて同定した各突然変異ＧＴＲ遺伝子に関して、ＧＴＲ突然変異を含むＭ２植物と同じＭ１植物に由来するＭ２植物を生育し、各Ｍ２植物個体の植物サンプルから、ＤＮＡサンプルを調製する。同定したＧＴＲ点突然変異の存在に関して、ＤＮＡサンプルをスクリーニングする。
B. napusにおいて以下の突然変異アレルを単離し、Ｍ３湿潤種子において総グルコシノレート含量を試験した：
ａ．ＧＴＲ２−Ｃ２−ｅｍｓ０２
ｂ．ＧＴＲ２−Ｃ１−ｅｍｓ０５
ｃ．ＧＴＲ２−Ｃ１−ｅｍｓ０１
ｄ．ＧＴＲ２−Ａ２−ｅｍｓ０９
ｅ．ＧＴＲ２−Ａ２−ｅｍｓ０３
ｆ．ＧＴＲ２−Ａ１−ｅｍｓ０１
突然変異アレルに関するさらなる詳細は、表３ａ及び３ｂを参照のこと。結果を図１０にまとめる。観察された総グルコシノレートの最大減少は、単一遺伝子ノックアウトによる５１％であった。試験した各遺伝子コピーは、類似の効果をもたらした。高レベルのばらつきは、戻し交雑していない材料における多数の無関係なバックグラウンド突然変異に関係している可能性がある。
このようにして、突然変異ＧＴＲアレルを作製し、単離する。また、このような突然変異アレルを含む植物を、以下のように、植物（例えば、Brassica育種系統）における選択した突然変異体及び／又は野生型アレルを組み合わせるのに使用できる：突然変異ＧＴＲ遺伝子を含むBrassica植物（ドナー植物系統）を、突然変異ＧＴＲ遺伝子を持たないBrassica植物（アクセプター植物系統）と交雑する。以下の遺伝子移入スキームを使用する（突然変異ＧＴＲ遺伝子をｇｔｒと略すのに対して、野生型をＧＴＲと示す）：
初回交雑：ｇｔｒ／ｇｔｒ（ドナー植物） × ＧＴＲ／ＧＴＲ（アクセプター植物、例えば、育種系統）
Ｆ１植物：ＧＴＲ／ｇｔｒ
ＢＣ１交雑：ＧＴＲ／ｇｔｒ × ＧＴＲ／ＧＴＲ（アクセプター植物）
ＢＣ１植物：５０％ＧＴＲ／ｇｔｒ及び５０％ＧＴＲ／ＧＴＲ
突然変異ＧＴＲアレル（ｇｔｒ）に関する分子マーカー（例えば、ＡＦＬＰ、ＰＣＲ、Invader（商標）など）を使用して、５０％ＧＴＲ／ｇｔｒを選択する。
ＢＣ２交雑：ＧＴＲ／ｇｔｒ（ＢＣ１植物） × ＧＴＲ／ＧＴＲ（アクセプター植物）
ＢＣ２植物：５０％ＧＴＲ／ｇｔｒ及び５０％ＧＴＲ／ＧＴＲ
突然変異ＧＴＲアレル（ｇｔｒ）に関する分子マーカーを使用して、５０％ＧＴＲ／ｇｔｒを選択する。
戻し交雑をＢＣ３〜ＢＣ６まで繰り返す
ＢＣ３〜６植物：５０％ＧＴＲ／ｇｔｒ及び５０％ＧＴＲ／ＧＴＲ
突然変異ＧＴＲアレル（ｇｔｒ）に関する分子マーカーを使用して、５０％ＧＴＲ／ｇｔｒを選択する。戻し交雑の回数を減らすために（例えば、ＢＣ６の代わりにＢＣ３まで）、アクセプター植物系統の遺伝的背景に特異的な分子マーカーを使用できる。
ＢＣ３〜６ Ｓ１交雑：ＧＴＲ／ｇｔｒ × ＧＴＲ／ｇｔｒ
ＢＣ３〜６ Ｓ１植物：２５％ＧＴＲ／ＧＴＲ及び５０％ＧＴＲ／ｇｔｒ及び２５％ｇｔｒ／ｇｔｒ
突然変異ＧＴＲアレル（ｇｔｒ）に関する分子マーカーを使用して、ｇｔｒを含む植物を選択する。突然変異及び野生型ＧＴＲアレルに関する分子マーカーを使用して、突然変異ＧＴＲアレル（ｇｔｒ／ｇｔｒ）に関してホモ接合性であるＢＣ３〜６ Ｓ１植物個体を選択する。次いで、これらの植物を種子生産に使用する。
突然変異ＧＴＲ Brassica植物の部分におけるＧＳＬ含量の特性決定
突然変異ＧＴＲ Arabidopsis植物に関して上記に記載したように、突然変異ＧＴＲ Brassica植物において、種子、茎、花、葉、根、長角果及び長角果壁のＧＳＬ含量を分析する。さらなる育種、種子生産又は作物栽培のために、特定の植物部分において特定のＧＳＬ含量をもたらす突然変異ＧＴＲ遺伝子の特定の組み合わせを含むBrassica植物を選択する。
ecotype「R-0-18」（Brassica rapa亜種trilocularisの近交系統）のＷＴ及び突然変異（ゲノム内ターゲット誘発性局所損傷（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｅｓ）、ＴＩＬＬＩＮＧによる）Brassica rapa種子を、Reverse Genetics UK (RevGenUK)から購入した。種子を植物基質上に播種し、Bactimos (B. thuringiensis israelensis)と水を与えた；播種後に、種子を４℃で２日間冷却層積して、一定の高発芽率を得た。最後に、発芽中の種子を、１６時間日長及び温度２０℃のグロースチャンバーに移した。分析に使用したB. rapa植物は、２．５月齢であった；それらは、緑色の未成熟種子を含む緑色の長角果を有していた。実験において使用した反復植物の数は、ｎ＝５植物であった。
B. rapaの葉及び他の組織の重量を量り、モルタル（葉及び根）又はブレンダー（茎及び長角果）のいずれかを使用して、液体Ｎ２中でホモジナイズした。内部標準としてｐ−ヒドロキシベンジルグルコシノレート（ｐＯＨＢ）を含む８５％メタノール中で、ホモジナイズした氷冷植物材料から、グルコシノレートを抽出した。４５μl ＤＥＡＥ sephadex（商標）Ａ−２５カラム材料でロードした９６ウェルフィルタープレートに、上清の一部を移した。グルコシノレートはカラム材料に結合させたが、サンプルは、簡単な真空処理を行うことによってフィルタープレートから吸い出した。その後、カラムを７０％メタノール及び水で洗浄した。スルファターゼ溶液（２mg/ml）をカラムに添加し、室温で一晩インキュベーションした。１００μlの水をカラムに注入し、ショートスピンにより、脱硫酸化グルコシノレートを９６ウェルフォーマットプレートに溶出した。サンプルをAgilent technologies 1200 series HPLC-DADシステムで分析し、Zorbax SB-AQカラムで分離した。ｗｔ及びノックアウトB. rapaの異なる組織におけるグルコシノレート濃度を図１２にまとめ、これらの組織の重量を図１３にまとめる。
実施例５：リン酸化／脱リン酸化状態が変化した突然変異ＧＴＲ１及びＧＴＲ２アレルの作製並びに特性決定
http://phosphat.mpimp-golm.mpg.de/（ホスホプロテオミクスデータを収集しているデータベース）で検索可能な実験的に確認されたリン酸化部位に基づいて、構成的リン酸化又は脱リン酸化を模倣するArabidopsis thaliana ＧＴＲ１及びＧＴＲ２アレルを構築した。リン酸化部位候補のアミノ酸（Ｓ又はＴ）をアスパラギン酸で置換することによって、リン酸化を模倣した。アラニンに置換することによって、脱リン酸化を模倣した。以下の構築物を作製した：
以下：
ａ．２２位のＳのＡへの置換
ｂ．２２位のＳのＤへの置換
ｃ．１０５位のＴのＡへの置換
ｄ．１０５位のＴのＤへの置換
ｅ．６０５位のＳのＡへの置換
ｆ．６０５位のＳのＤへの置換
を有する配列番号２のアミノ酸配列（これは、以下：
ｇ．５２位のＳのＡへの置換
ｈ．５２位のＳのＤへの置換
ｉ．１３５位のＴのＡへの置換
ｊ．１３５位のＴのＤへの置換
ｋ．６３５位のＳのＡへの置換
ｌ．６３５位のＳのＤへの置換
を有する配列番号１４２のアミノ酸配列に対応する）を有するＧＴＲ１タンパク質をコードする構築物、
又は、以下：
ｍ．５８位のＴのＡへの置換
ｎ．５８位のＴのＤへの置換
ｏ．１１７位のＴのＡへの置換
ｐ．１１７位のＴのＤへの置換
ｑ．３２３位のＴのＡへの置換
ｒ．３２３位のＴのＤへの置換
を有する配列番号４のアミノ酸配列を有するＧＴＲ２タンパク質をコードする構築物。
また、４９２（又は５２２）位のプロリンをロイシンで置換したＧＴＲ１又はＧＴＲ２をコードする構築物も試験した。
１００μMの濃度のグルコシノレート４−ＭＴＢ（４−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート）のプロトン依存性取り込みに関して、リン酸化／脱リン酸化構築物をアッセイした。構築物（１００ng/μl）の１つのｃＲＮＡを５個の卵母細胞に注射（４回反復）し、１７℃で５日間維持した。５日目に、卵母細胞をKulori（ｐＨ５）中で５分間プレインキュベーションし、次いで、アッセイ培地（１００μMの濃度の４−ＭＴＢを含むKulori（ｐＨ５））に移した。１時間後に、４−ＭＴＢを含む培地から卵母細胞を取り出し、１００％メタノール中で抽出する前に、４回洗浄した。４−ＭＴＢの取り込みを検出するためのＬＣ−ＭＳ分析を行い、結果を図１１に示す。
位置Ｓ２２（Ｓ５２＊）におけるＧＴＲ１の構成的脱リン酸化は、輸送を完全に止めることが観察できた。同様に、同じ残基のリン酸化は、取り込みをインタクトな状態に維持することが観察できた。さらに、ＧＴＲ２ Ｔ５８の脱リン酸化は、輸送活性をインタクトな状態に維持するのに対して、同じ残基のリン酸化は、輸送を不活性化することが観察できた。ＧＴＲ１のＴ１０５（Ｔ１３５＊）及びＧＴＲ２のＴ１１７の構成的リン酸化並びに脱リン酸化は両方とも、輸送活性を遮断する。ＧＴＲ１ Ｐ４９２（Ｐ５２２＊）及びＧＴＲ３ Ｐ４９２のロイシンへの突然変異は、輸送活性を不活性化することも観察できた。つまり、特定の残基におけるリン酸化／脱リン酸化は、ＧＴＲ１及びＧＴＲ２媒介性グルコシノレート輸送をレギュレーションするという結論を出すことができる。（＊によって示したアミノ酸位置は、３０ＡＡのＮ末端延長を含むロングバージョンのＧＴＲ１に関するものである）
実施例６：ｄｓＲＮＡ構築物を使用した、Brassica種におけるＧＴＲ１及び／又はＧＴＲ２発現のダウンレギュレーション
標準リコンビナントＤＮＡ技術を使用して、以下の機能的に連結されたＤＮＡフラグメントを含むリコンビナント遺伝子をコードするｄｓＲＮＡを構築する。
ａ）ＧＴＲ１をダウンレギュレーションするリコンビナント遺伝子
ｉ．植物発現プロモーター（例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ）
ｉｉ．配列番号１３８のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ領域
ｉｉｉ．転写終結及びポリアデニル化領域（例えば、３’ｎｏｓ領域）
ｂ）ＧＴＲ２をダウンレギュレーションするリコンビナント遺伝子
ｉ．植物発現プロモーター（例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ）
ｉｉ．配列番号１３９のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ領域
ｉｉｉ．転写終結及びポリアデニル化領域（例えば、３’ｎｏｓ領域）
ｃ）ＧＴＲ１／ＧＴＲ２をダウンレギュレーションするリコンビナント遺伝子
ｉ．植物発現プロモーター（例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ）
ｉｉ．配列番号１４０のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ領域
ｉｉｉ．転写終結及びポリアデニル化領域（例えば、３’ｎｏｓ領域）
リコンビナント遺伝子をコードするこれらのｄｓＲＮＡを、選択可能マーカー遺伝子（例えば、リン酸化アセチルトランスフェラーゼをコードする選択可能マーカー遺伝子）と共に、Ｔ−ＤＮＡベクターの境界の間に（別々に）導入する。従来の方法を使用して、Ｔ−ＤＮＡベクターを、ヘルパーＴｉプラスミドを含むAgrobacterium株に導入する。本質的にはDe Block et al. (1989), Plant Physiol. 91: 694に記載されているように、Brassica napusの胚軸外植片を入手し、培養し、トランスフォーメーションして、キメラ遺伝子をBrassica napus植物に移動させる。
トランスジェニックBrassica napus植物を同定し、葉及び種子におけるグルコシノレート含量に関して分析する。
従って、本発明は、以下の段落に記載される実施態様を含む。
段落１．
Brassicales植物又はその部分におけるグルコシノレート（ＧＳＬ）含量を改変するための方法であって、前記植物若しくは前記植物部分の細胞における配列番号２又は配列番号１４２と少なくとも３３％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのグルコシノレート輸送（ＧＴＲ）タンパク質の機能活性を改変することを含む、方法。
段落２．
ＧＴＲタンパク質が、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、段落１記載の方法。
段落３．
ＧＴＲタンパク質が、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１４４、１４６、１４８又は１５０のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、段落１又は２記載の方法。
段落４．
ＧＴＲタンパク質が、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１４４、１４６、１４８又は１５０から選択されるアミノ酸を含む、段落１又は２記載の方法。
段落５．
ＧＴＲタンパク質が、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４３、１４５、１４７又は１４９のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸によってコードされる、段落１〜４のいずれか１つに記載の方法。
段落６．
ＧＴＲタンパク質が、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１４３、１４５、１４７又は１４９から選択される核酸によってコードされる、段落１〜５のいずれか１つに記載の方法。
段落７．
少なくとも２つのＧＴＲタンパク質の機能活性を改変することを含む、段落１〜６のいずれか１つに記載の方法。
段落８．
第１のＧＴＲタンパク質が、配列番号２又は配列番号１４２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＧＴＲタンパク質が、配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、段落７記載の方法。
段落９．
前記第１のＧＴＲタンパク質が、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、３８、４０、４２、５０、５２、５４又は１４４、１４６、１４８又は１５０のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＧＴＲタンパク質が、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５６、５８、６０、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８又は１３０のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、段落７記載の方法。
段落１０．
前記第１のＧＴＲタンパク質が、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、３８、４０、４２、５０、５２又は５４又は１４４、１４６、１４８、１５０から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２のＧＴＲタンパク質が、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５６、５８、６０、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８又は１３０から選択されるアミノ酸配列を含む、段落７記載の方法。
段落１１．
前記第１のＧＴＲタンパク質が、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、３７、３９、４１、４９、５１、５３又は１３７又は１４３、１４５、１４７、１４９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸によってコードされ、前記第２のＧＴＲタンパク質が、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、４３、４５、４７、５５、５７、５９、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、段落７記載の方法。
段落１２．
前記第１のＧＴＲタンパク質が、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、３７、３９、４１、４９、５１、５３又は１３７又は１４３、１４５、１４７、１４９から選択される核酸によってコードされ、前記第２のＧＴＲタンパク質が、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、４３、４５、４７、５５、５７、５９、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる、段落７記載の方法。
段落１３．
前記植物又は植物部分の細胞における機能性ＧＴＲ活性を減少させることを含む、段落１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
段落１４．
ＧＳＬ含量が、植物種子において減少される、段落１３記載の方法。
段落１５．
ＧＳＬ含量が、緑色植物組織において増加される、段落１３記載の方法。
段落１６．
機能性ＧＴＲ活性の前記減少が、ＧＴＲ遺伝子発現のダウンレギュレーションを含む、段落９〜１２のいずれか１つに記載の方法。
段落１７．
機能性ＧＴＲ活性の前記減少が、ＧＴＲタンパク質活性のダウンレギュレーションを含む、段落１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
段落１８．
ＲＮＡ分子を前記植物又は植物部分に導入することを含み、前記ＲＮＡ分子は、前記ＧＴＲ遺伝子の発現をダウンレギュレーションできるＧＴＲ阻害ＲＮＡ分子を含む、段落１７記載の方法。
段落１９．
キメラＤＮＡ構築物を前記植物又は植物部分に導入することを含み、前記キメラＤＮＡ構築物は、以下の機能的に連結されたＤＮＡ領域：
ａ）前記植物又は植物部分で作動するプロモーター；
ｂ）転写されると、前記ＧＴＲ遺伝子の発現をダウンレギュレーションできるＧＴＲ阻害ＲＮＡ分子を生じる転写ＤＮＡ領域；
ｃ）転写終結及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域
を含む、段落１８記載の方法。
段落２０．
前記転写ＤＮＡ領域が、センスＲＮＡ分子をコードし、前記ＤＮＡ領域が、前記ＧＴＲ遺伝子のＤＮＡ鎖と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも２０個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、段落１９記載の方法。
段落２１．
前記転写ＤＮＡ領域が、アンチセンスＲＮＡ分子をコードし、前記ＤＮＡ領域が、前記ＧＴＲ遺伝子のＤＮＡ鎖の相補体と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも２０個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、段落１９記載の方法。
段落２２．
前記転写ＤＮＡ領域が、
ａ）前記ＧＴＲ遺伝子と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも２０の連続ヌクレオチドを含むセンスＲＮＡ領域；
ｂ）前記センスＲＮＡ領域と相補的な少なくとも２０個のヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡ領域；
を含む二本鎖ＲＮＡ分子をコードし、前記センス及びアンチセンスＲＮＡ領域が、二本鎖ＲＮＡ領域を形成でき、前記二本鎖ＲＮＡ分子が、前記ＧＴＲ遺伝子の発現をダウンレギュレーションできる、段落１９記載の方法。
段落２３．
前記転写ＤＮＡ領域が、配列番号１３８、１３９又は１４０のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、段落２２記載の方法。
段落２４．
前記転写ＤＮＡ領域が、前記ＧＴＲ遺伝子から転写されるｍＲＮＡの切断を誘導できるｍｉＲＮＡにプロセシングされるｍｉＲＮＡ前駆体分子をコードする、段落１９記載の方法。
段落２５．
前記プロモーターが、組織特異的又は誘導性プロモーターである、段落１９〜２４のいずれか１つに記載の方法。
段落２６．
前記プロモーターが、種子特異的プロモーターである、段落２５記載の方法。
段落２７．
内因性ＧＴＲ遺伝子のヌクレオチド配列を変化させることを含む、段落１６又は１７記載の方法。
段落２８．
ＧＴＲタンパク質が、以下：
ａ）２２位のＳのＡへの置換
ｂ）２２位のＳのＤへの置換
ｃ）１０５位のＴのＡへの置換
ｄ）１０５位のＴのＤへの置換
ｅ）６０５位のＳのＡへの置換
ｆ）６０５位のＳのＤへの置換
のいずれかを有する配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質であるか、
又は、ＧＴＲタンパク質が、以下：
ｇ）５２位のＳのＡへの置換
ｈ）５２位のＳのＤへの置換
ｉ）１３５位のＴのＡへの置換
ｊ）１３５位のＴのＤへの置換
ｋ）６３５位のＳのＡへの置換
ｌ）６３５位のＳのＤへの置換
のいずれかを有する配列番号１４２のアミノ酸配列を含むタンパク質である、段落２７記載の方法。
段落２９．
ＧＴＲタンパク質が、以下：
ａ）５８位のＴのＡへの置換
ｂ）５８位のＴのＤへの置換
ｃ）１１７位のＴのＡへの置換
ｄ）１１７位のＴのＤへの置換
ｅ）３２３位のＴのＡへの置換
ｆ）３２３位のＴのＤへの置換
を有する配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質である、段落２７記載の方法。
段落３０．
ＧＴＲタンパク質が、
ａ）１２４１〜１２４３位に終止コドンを含む
配列番号２５の核酸によってコードされる、段落２７記載の方法。
段落３１．
ＧＴＲタンパク質が、
ａ）９２９〜９３１位に終止コドンを含む
ｂ）１１４５〜１１４７位に終止コドンを含む
配列番号３１の核酸によってコードされる、段落２７記載の方法。
段落３２．
ＧＴＲタンパク質が、
ａ）８７０〜８７２位に終止コドンを含む
ｂ）１３８０〜１３８２位に終止コドンを含む
配列番号２７の核酸によってコードされる、段落２７記載の方法。
段落３３．
ＧＴＲタンパク質が、
ａ）７８０〜７８２位に終止コドンを含む
配列番号３３の核酸によってコードされる、段落２７記載の方法。
段落３４．
ＧＴＲタンパク質が、以下の位置：
ａ）Ｇｌｙ１２６
ｂ）Ｇｌｙ１４５
ｃ）Ｇｌｕ１９２
ｄ）Ｔｒｐ２２９
ｅ）Ｓｅｒ３５９
のいずれかに突然変異を含む配列番号６６のアミノ酸配列を有するタンパク質である、段落２７記載の方法。
段落３５．
前記植物が、Brassica植物である、段落１〜３４のいずれか１つに記載の方法。
段落３６．
段落１〜３４のいずれか１つに記載の方法によって得られる、植物又は植物部分。
段落３７．
段落３６記載の植物に由来する、種子。
段落３８．
段落３７記載の種子に由来する、種子ミール。
段落３９．
段落３６記載の植物に由来する、緑色植物組織。
段落４０．
段落３５記載の植物又は段落３７記載の種子に由来する、油。
段落４１．
動物飼料における、段落３６記載の植物又は植物部分の使用。
段落４２．
害虫管理、特に生物燻蒸における、段落３６記載の植物又は植物部分の使用。
段落４３．
ガン予防における、段落３６記載の植物又は植物部分の使用。
段落４４．
植物又は植物部分において改変されたＧＳＬ含量を得るための、ＧＴＲをコードする核酸配列の使用。
段落４５．
種子又は種子ミールを製造するための方法であって、減少された機能性ＧＴＲ活性を有する植物を生育すること、及び、前記植物から種子を回収することを含む、方法。
段落４６．
段落１９〜３２のいずれか１つに記載される、キメラＤＮＡ構築物。
段落４７．
突然変異ＧＴＲタンパク質をコードする核酸であって、対応する野生型ＧＴＲタンパク質が、配列番号２又は配列番号１４２と少なくとも３３％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、核酸。
段落４８．
野生型ＧＴＲタンパク質が、配列番号２、４、６、８、１０又は１２又は配列番号１４２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、段落３３記載の核酸。
段落４９．
段落４７又は４８記載の核酸によってコードされる、突然変異ＧＴＲタンパク質。
段落５０．
生物学的サンプルにおける段落４７又は４８記載の核酸を同定するための方法であって、サンプルの核酸における突然変異ＤＮＡ領域の存在を決定することを含み、前記突然変異ＤＮＡ領域が、対応する野生型ＧＴＲタンパク質をコードする核酸と比較して、突然変異ＧＴＲ核酸における少なくとも１つの欠失、挿入又は置換されたヌクレオチドを含む、方法。
段落５１．
生物学的サンプルにおける段落４５又は４６記載の核酸を同定するためのキットであって、プライマー又はプローブのセットを含み、前記セットが、
− プライマー又はプローブの一方が、突然変異ＤＮＡ領域の５’側に隣接するＤＮＡ領域を特異的に認識し、プライマー又はプローブの他方が、突然変異ＤＮＡ領域の３’側に隣接するＤＮＡ領域を特異的に認識する、プライマー又はプローブのセット、
− プライマー又はプローブの一方が、突然変異ＤＮＡ領域の５’又は３’側に隣接するＤＮＡ領域を特異的に認識し、プライマー又はプローブの他方が、突然変異ＤＮＡ領域を特異的に認識する、プライマー又はプローブのセット、
− それぞれ、プライマー又はプローブの一方が、突然変異ＤＮＡ領域の５’又は３’側に隣接するＤＮＡ領域を特異的に認識し、プライマー又はプローブの他方が、３’又は５’隣接領域と突然変異ＤＮＡ領域の間の連結領域を特異的に認識する、プライマー又はプローブのセット、
− 突然変異ＤＮＡ領域の５’又は３’側に隣接するＤＮＡ領域と、突然変異ＤＮＡ領域の間の連結領域を特異的に認識する、プローブ
からなる群より選択される、キット。
段落５２．
配列番号２、４、６、８、１０又は１２又は１４２のアミノ酸配列をコードする、単離されたＤＮＡ配列。
段落５３．
配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０又は１４４、１４６、１４８又は１５０のアミノ酸配列をコードする、単離されたＤＮＡ配列。
段落５４．
配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、４３、４５、４７、５５、５７、５９、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６又は１４３、１４５、１４７又は１４９のヌクレオチド配列を含む、単離されたＤＮＡ配列。
段落５５．
以下の機能的に連結されたＤＮＡフラグメント
ａ）異種植物発現プロモーター
ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０又は１４２又は１４４、１４６、１４８又は１５０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ領域
ｃ）植物細胞で機能的な転写終結及びポリアデニル化シグナル
を含む、キメラ遺伝子。
段落５６．
段落５５記載のキメラ遺伝子を含む、植物。
段落５７．
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０又は１４２又は１４４、１４６、１４８又は１５０のアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質。
段落５８．
以下：
ａ）２２位のＳのＡへの置換
ｂ）２２位のＳのＤへの置換
ｃ）１０５位のＴのＡへの置換
ｄ）１０５位のＴのＤへの置換
ｅ）６０５位のＳのＡへの置換
ｆ）６０５位のＳのＤへの置換
のいずれかを有する配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＧＴＲタンパク質をコードするか、
又は、以下：
ｇ）５２位のＳのＡへの置換
ｈ）５２位のＳのＤへの置換
ｉ）１３５位のＴのＡへの置換
ｊ）１３５位のＴのＤへの置換
ｋ）６３５位のＳのＡへの置換
ｌ）６３５位のＳのＤへの置換
のいずれかを有する配列番号１４２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＧＴＲタンパク質をコードする、突然変異ＧＴＲアレル。
段落５９．
以下：
ａ）５８位のＴのＡへの置換
ｂ）５８位のＴのＤへの置換
ｃ）１１７位のＴのＡへの置換
ｄ）１１７位のＴのＤへの置換
ｅ）３２３位のＴのＡへの置換
ｆ）３２３位のＴのＤへの置換
を有する配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＧＴＲタンパク質をコードする、突然変異ＧＴＲアレル。
段落６０．
ａ）１２４１〜１２４３位に終止コドンを含む
配列番号２５の核酸と少なくとも８０％の配列同一性を有する突然変異ＧＴＲアレル。
段落６１．
ａ）９２９〜９３１位に終止コドンを含む
ｂ）１１４５〜１１４７位に終止コドンを含む
配列番号３１の核酸と少なくとも８０％の配列同一性を有する突然変異ＧＴＲアレル。
段落６２．
ａ）８７０〜８７２位に終止コドンを含む
ｂ）１３８０〜１３８２位に終止コドンを含む
配列番号２７の核酸と少なくとも８０％の配列同一性を有する突然変異ＧＴＲアレル。
段落６３．
ａ）７８０〜７８２位に終止コドンを含む
配列番号３３の核酸と少なくとも８０％の配列同一性を有する突然変異ＧＴＲアレル。
段落６４．
以下の位置：
ａ）Ｇｌｙ１２６
ｂ）Ｇｌｙ１４５
ｃ）Ｇｌｕ１９２
ｄ）Ｔｒｐ２２９
ｅ）Ｓｅｒ３５９
のいずれかに突然変異を含む配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＧＴＲタンパク質をコードする、突然変異ＧＴＲアレル。

Claims (28)

  1. ブラシカ目（Brassicales）植物又はその部分におけるグルコシノレート（ＧＳＬ）含量を改変するための方法であって、前記植物若しくは前記植物部分の細胞における配列番号２又は配列番号１４２と少なくとも３３％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのグルコシノレート輸送（ＧＴＲ）タンパク質の機能活性を改変することを含む、方法。
  2. ＧＴＲタンパク質が、配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載の方法。
  3. ＧＴＲタンパク質が、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８又は１３０又は１４４、１４６、１４８又は１５０のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２記載の方法。
  4. ＧＴＲタンパク質が、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８又は１３０又は１４４、１４６、１４８又は１５０から選択されるアミノ酸を含む、請求項１又は２記載の方法。
  5. ＧＴＲタンパク質が、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６又は１３７又は１４３、１４５、１４７又は１４９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸によってコードされる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ＧＴＲタンパク質が、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６又は１３７又は１４３、１４５、１４７又は１４９から選択される核酸によってコードされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 少なくとも２つのＧＴＲタンパク質の機能活性を改変することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 第１のＧＴＲタンパク質が、配列番号２又は配列番号１４２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のＧＴＲタンパク質が、配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７記載の方法。
  9. 前記第１のＧＴＲタンパク質が、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、３８、４０、４２、５０、５２又は５４又は１４４、１４６、１４８又は１５０のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のＧＴＲタンパク質が、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５６、５８、６０、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８又は１３０のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７記載の方法。
  10. 前記第１のＧＴＲタンパク質が、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、３８、４０、４２、５０、５２又は５４又は又は１４４、１４６、１４８又は１５０から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２のＧＴＲタンパク質が、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５６、５８、６０、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８又は１３０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７記載の方法。
  11. 前記第１のＧＴＲタンパク質が、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、３７、３９、４１、４９、５１、５３又は１３７又は１４３、１４５、１４７又は１４９のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸によってコードされ、前記第２のＧＴＲタンパク質が、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、４３、４５、４７、５５、５７、５９、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６のいずれかと少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる、請求項７記載の方法。
  12. 前記第１のＧＴＲタンパク質が、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、３７、３９、４１、４９、５１、５３又は１３７又は１４３、１４５、１４７又は１４９から選択される核酸によってコードされ、前記第２のＧＴＲタンパク質が、配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、４３、４５、４７、５５、５７、５９、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項７記載の方法。
  13. ＧＳＬ含量が、植物種子において減少される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 植物細胞におけるＧＴＲ活性を減少させる方法であって、ＲＮＡ分子を前記植物又は植物部分に導入することを含み、前記ＲＮＡ分子は、前記ＧＴＲ遺伝子の発現をダウンレギュレーションできるＧＴＲ阻害ＲＮＡ分子を含む、方法。
  15. キメラＤＮＡ構築物を前記植物又は植物部分に導入することを含み、前記キメラＤＮＡ構築物は、以下の機能的に連結されたＤＮＡ領域：
    ａ）前記植物又は植物部分で作動するプロモーター；
    ｂ）転写されると、前記ＧＴＲ遺伝子の発現をダウンレギュレーションできるＧＴＲ阻害ＲＮＡ分子を生じる転写ＤＮＡ領域；
    ｃ）転写終結及びポリアデニル化に関与するＤＮＡ領域
    を含む、請求項１４記載の方法。
  16. 植物細胞におけるＧＴＲ活性を減少させる方法であって、内因性ＧＴＲ遺伝子のヌクレオチド配列を変化させることを含む、方法。
  17. ＧＴＲタンパク質が、以下：
    ａ．２２位のＳのＡへの置換（配列番号１４２の５２位）
    ｂ．２２位のＳのＤへの置換（配列番号１４２の５２位）
    ｃ．１０５位のＴのＡへの置換（配列番号１４２の１３５位）
    ｄ．１０５位のＴのＤへの置換（配列番号１４２の１３５位）
    ｅ．６０５位のＳのＡへの置換（配列番号１４２の６３５位）
    ｆ．６０５位のＳのＤへの置換（配列番号１４２の６３５位）
    のいずれかを有する配列番号２又は配列番号１４２のアミノ酸配列を含むタンパク質であるか、
    又は、ＧＴＲタンパク質が、以下：
    ａ）５８位のＴのＡへの置換
    ｂ）５８位のＴのＤへの置換
    ｃ）１１７位のＴのＡへの置換
    ｄ）１１７位のＴのＤへの置換
    ｅ）３２３位のＴのＡへの置換
    ｆ）３２３位のＴのＤへの置換
    を有する配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質であるか、
    又は、ＧＴＲタンパク質が、
    ｇ）１２４１〜１２４３位に終止コドンを含む
    配列番号２５の核酸によってコードされるか、
    又は、ＧＴＲタンパク質が、
    ｈ）９２９〜９３１位に終止コドンを含む
    ｉ）１１４５〜１１４７位に終止コドンを含む
    配列番号３１の核酸によってコードされるか、
    又は、ＧＴＲタンパク質が、
    ｊ）８７０〜８７２位に終止コドンを含む
    ｋ）１３８０〜１３８２位に終止コドンを含む
    配列番号２７の核酸によってコードされるか、
    又は、ＧＴＲタンパク質が、
    ｌ）７８０〜７８２位に終止コドンを含む
    配列番号３３の核酸によってコードされるか、
    又は、ＧＴＲタンパク質が、以下の位置：
    ｍ）Ｇｌｙ１２６
    ｎ）Ｇｌｙ１４５
    ｏ）Ｇｌｕ１９２
    ｐ）Ｔｒｐ２２９
    ｑ）Ｓｅｒ３５９
    のいずれかに突然変異を含む配列番号６６のアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項１６記載の方法。
  18. 前記植物が、ブラシカ（Brassica）植物である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法によって得られる、植物又は植物部分。
  20. 請求項１９記載の植物に由来する、種子。
  21. 植物又は植物部分において改変されたＧＳＬ含量を得るための、ＧＴＲをコードする核酸配列の使用。
  22. 配列番号２、４、６、８、１０、１２又は１４２のアミノ酸配列をコードする、単離されたＤＮＡ配列。
  23. 配列番号１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８又は１３０又は１４４、１４６、１４８又は１５０のアミノ酸配列をコードする、単離されたＤＮＡ配列。
  24. 配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５、４３、４５、４７、５５、５７、５９、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６又は１４３、１４５、１４７又は１４９のヌクレオチド配列を含む、単離されたＤＮＡ配列。
  25. 以下の機能的に連結されたＤＮＡフラグメント：
    ａ）異種植物発現プロモーター；
    ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０又は１４２又は１４４、１４６、１４８又は１５０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ領域；
    ｃ）植物細胞で機能的な転写終結及びポリアデニル化シグナル
    を含む、キメラ遺伝子。
  26. 請求項２５記載のキメラ遺伝子を含む、植物。
  27. 配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０又は１４２又は１４４、１４６、１４８又は１５０のアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質。
  28. 以下：
    ａ）２２位のＳのＡへの置換（配列番号１４２の５２位）
    ｂ）２２位のＳのＤへの置換（配列番号１４２の５２位）
    ｃ）１０５位のＴのＡへの置換（配列番号１４２の１３５位）
    ｄ）１０５位のＴのＤへの置換（配列番号１４２の１３５位）
    ｅ）６０５位のＳのＡへの置換（配列番号１４２の６３５位）
    ｆ）６０５位のＳのＤへの置換（配列番号１４２の６３５位）
    のいずれか１つを有する配列番号２又は配列番号１４２と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＴＲタンパク質、
    若しくは、以下：
    ｇ）５８位のＴのＡへの置換
    ｈ）５８位のＴのＤへの置換
    ｉ）１１７位のＴのＡへの置換
    ｊ）１１７位のＴのＤへの置換
    ｋ）３２３位のＴのＡへの置換
    ｌ）３２３位のＴのＤへの置換
    を有する配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＧＴＲタンパク質をコードする、突然変異ＧＴＲアレル、
    又は、１２４１〜１２４３位に終止コドンを含む配列番号２５の核酸と少なくとも８０％の配列同一性を有する突然変異ＧＴＲアレル、
    又は、
    ｍ）９２９〜９３１位に終止コドンを含む
    ｎ）１１４５〜１１４７位に終止コドンを含む
    配列番号３１の核酸と少なくとも８０％の配列同一性を有する突然変異ＧＴＲアレル、
    又は、
    ｏ）８７０〜８７２位に終止コドンを含む
    ｐ）１３８０〜１３８２位に終止コドンを含む
    配列番号２７の核酸と少なくとも８０％の配列同一性を有する突然変異ＧＴＲアレル、
    又は、
    ｑ）７８０〜７８２位に終止コドンを含む
    配列番号３３の核酸と少なくとも８０％の配列同一性を有する突然変異ＧＴＲアレル、
    又は、以下の位置：
    ｒ）Ｇｌｙ１２６
    ｓ）Ｇｌｙ１４５Ｇｌｕ１９２
    ｔ）Ｔｒｐ２２９
    ｕ）Ｓｅｒ３５９
    のいずれかに突然変異を含む配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＧＴＲタンパク質をコードする、突然変異ＧＴＲアレル。
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