CN110033825B - 一种箭筈豌豆种质资源筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种箭筈豌豆种质资源筛选方法，包括以下步骤：建立主成分综合评价模型Y＝azx1+bzx2+czx3+dzx4+ezx5+fzx6+gzx7+hzx8，种植箭筈豌豆，记录生育期(X1)，待盛花期后，测定鲜草产量(X2)和鲜草杀青烘干后称重(X3)；箭筈豌豆翻耕一月后，采集土壤，测定土壤碱解氮(X4)和有机质(X5)；采用荧光PCR技术，对不同箭筈豌豆品种STR分型，分别统计群体基因频率分布，分别统计群体的有效等位基因数(X6)，杂合度(X7)和多态信息含量(X8)；数据处理，根据上述模型，计算不同箭筈豌豆种质资源综合性能得分。相对于现有技术，本发明建立的方法可以有效筛选出适合当地间作的箭筈豌豆品种，筛选的箭筈豌豆效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及一种箭筈豌豆种质资源筛选方法，属于箭筈豌豆筛选技术领域。
背景技术
绿肥是生态农业的重要组成部分，是一种养分完全的生物肥源，对改善生态环境、提高农产品产量、品质、促进农牧业协调发展等具有重要作用。箭筈豌豆是绿肥作物的最重要资源之一，我国箭筈豌豆资源丰富，但品种种性混杂、退化、产草量严重下降。为保护与开发利用箭筈豌豆资源，发展生态循环农业，我国绿肥科学家开展了大量工作。卢秉林等用籽粒产量、鲜草产量、单株粒数和单株荚数4个指标筛选出适合甘肃玉米、马铃薯和果树绿肥间作的箭筈豌豆品种(甘肃箭筈豌豆种质资源评价，卢秉林等，草业科学，2015，32(8)：1296-1302)。张爱华等用发芽率、全生育期、株高、单株分枝分蘖数、主要根群分布深度、茎粗、每株荚穗数、单株种子产量8个指标筛选出适合贵州间作绿肥的箭筈豌豆品种(张爱华等，贵州旱地绿肥箭筈豌豆种质资源筛选与评价，资源与利用，2016,35(6)：63-67)。这些筛选出来的箭筈豌豆品种资源仅利用一些绿肥农艺性状，对箭筈豌豆的产量、固氮效果及其分子遗传多样性等指标尚未涉及，因此难以展现该品种种质特性全貌，筛选出品种难以具有代表性。
目前，箭筈豌豆种质资源筛选方法，缺乏科学性，不能有效的筛选出适合当地的箭筈豌豆品种，田间绿肥效果难以得到保证。
发明内容
发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种箭筈豌豆种质资源筛选方法，其简易可靠，为箭筈豌豆种质资源筛选提供科学依据。
技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种箭筈豌豆种质资源筛选方法，包括以下步骤：
(1)通过对箭筈豌豆种质资源生育期、鲜草产量、干草重、土壤碱解氮、有机质、有效等位基因数、杂合度和多态信息含量测定，采用主成分分析法对上述指标进行多指标综合评价和权重系数确定，建立主成分综合评价模型Y＝azx1+bzx2+czx3+dzx4+ezx5+fzx6+gzx7+hzx8，式中：zx1、zx2、zx3、zx4、zx5、zx6、zx7、zx8分别代表标准化的生育期，鲜草产量，干草重，碱解氮，有机质，有效等位基因数，杂合度和多态信息含量测定值；a、b、c、d、e、f、g和h分别为相关权重系数；
(2)种植对箭筈豌豆，记录生育期(X1)，待盛花期后，测定鲜草产量(X2)和鲜草杀青烘干后称重(X3)；
(3)箭筈豌豆翻耕一月后，采集土壤，测定土壤碱解氮(X4)和有机质(X5)；
(4)采用荧光PCR技术，对不同箭筈豌豆品种STR分型，分别统计群体基因频率分布，分别统计群体的有效等位基因数(X6)，杂合度(X7)和多态信息含量(X8)；
(5)将上述测定值或计算值(X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7和X8)按
进行数据标准化，其中，X为该性状的测定值，
为该性状的平均值，S为该性状的标准差；
(6)根据步骤(5)计算的各个结果，按箭筈豌豆种质资源综合评定模型Y＝azx1+bzx2+czx3+dzx4+ezx5+fzx6+gzx7+hzx8，计算不同箭筈豌豆种质资源综合性能得分，并按照综合得分进行排序，确定不同箭筈豌豆种质资源综合性能高低。
作为优选：
所述箭筈豌豆包括兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号、贵苕、连苕、青箭和镇江野豌豆。
步骤(2)所述种植箭筈豌豆，是选择地势平坦，排水畅通的试验基地种植箭筈豌豆，每个品种种植3个小区，25m2/小区。
步骤(2)所述生育期X1包括出苗期，分枝期，现蕾期，盛花期和结荚期。
步骤(2)中，当箭筈豌豆生长至盛花期，采用样方取样，样方面积为1m2(1m×1m)，每个小区取3个样方，取样后称鲜草量，得鲜草产量X2。
步骤(2)中，每个箭筈豌豆品种取鲜草10株以上(盛花期)，在105℃烘箱内杀青，并在60℃条件下烘干称重，即得鲜草杀青烘干后称重X3。
步骤(3)中，采用碱解扩散法碱解氮，得土壤碱解氮(X4)，采用计测定土壤重铬酸钾外加热法测定有机质含量有机质(X5)。
步骤(4)中，每一箭筈豌豆随机选取60份，加入液氮充分研磨后将粉末，苯酚-氯仿法提取基因组DNA，采用荧光PCR技术，以ABI 3730XL DNA全自动基因分析仪为平台，进行STR分型，分别统计群体的：
有效等位基因数(X6)
其中，Pij：第i座位上第j个等位基因的频率；M：第j个座位的等位基因数；Nei：第i座位上的等位基因的有效数目；n：所测定座位的总数；
杂合度(X7)
其中，k:等位基因数；Pi:第i个等位基因的频率；
多态信息含量(X8)
其中，k：等位基因数目；Pi：第i个等位基因的频率；Pj：第j个等位基因的频率。
本发明通过对不同箭筈豌豆种质资源农艺性状(生育期、鲜草产量、干草重)，固氮效果(土壤碱解氮、有机质)以及分子遗传多样性(有效等位基因数、杂合度、多态信息含量)测定，采用主成分分析法对上述8个指标进行多指标综合评价和权重系数确定，建立一种箭筈豌豆种质资源筛选综合评价模型，为有效筛选适合当地的箭筈豌豆品种提供科学依据。
技术效果：相对于现有技术，本发明建立的方法可以有效筛选出适合当地间作的箭筈豌豆品种，筛选的箭筈豌豆综合性能指标显著。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。
实施例
前期方法建立：
选择地势平坦试验基地，收集江苏地区使用较为广泛的箭筈豌豆品种：兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号、青箭、贵苕、连苕和镇江野豌豆7种箭筈豌豆种质资源，每个品种种植3个小区，分别测定其农艺性状(生育期、鲜草产量、干草重)，固氮效果(土壤碱解氮、有机质)以及分子遗传多样性(有效等位基因数、杂合度、多态信息含量)，通过对8个指标标准化数据的主成分分析，得到各主成分的特征根及方差贡献率，第一、第二、第三主成分的特征根分别为2.64、2.46和1.93；方差贡献率分别为33.10％，30.86％和24.14％，累计贡献率达到88.11％>85％，基本上反映了原所有箭筈豌豆种质资源遗传多样性指标包含的全部信息，能最大限度地反映遗传多样性的综合水平。根据入选主成分的特征向量与各自的客观权重，建立箭筈豌豆种质资源遗传多样性主成分综合评价模型Y＝0.007zx1-0.063zx2-0.044zx3+0.034zx4+0.051zx5+0.066zx6+0.072zx7+0.089zx8，式中：zx1、zx2、zx3、zx4、zx5、zx6、zx7、zx8分别代表标准化的生育期(d)，鲜草产量(kg/m2)，干草重(g/株)，碱解氮(mg/kg)，有机质(g/kg)，有效等位基因数、杂合度、多态信息含量测定值。
在取得以上箭筈豌豆种质资源遗传多样性综合评定模型的基础上，通过以下方法来筛选箭筈豌豆优异种质资源，该方法按以下步骤进行：
(1)选择地势平坦，排水畅通的试验基地，种植兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号，每个品种种植3个小区，25m2以上/小区。
(2)分别记录各品种的生育进程(X1，含出苗期，分枝期，现蕾期，盛花期和结荚期)。兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号生育期测定值分别为176d，176d，174d。
(3)当箭筈豌豆生长至盛花期，采用样方取样，样方面积为1m2(1m×1m)，每个小区取3个样方，取样后称鲜草量。兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号鲜草量测定值分别为2537kg/m2，2665kg/m2，2664kg/m2。
(4)每个箭筈豌豆品种取鲜草10株以上(盛花期)，在105℃烘箱内杀青，并在60℃条件下烘干称重，即得干草重。兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号干草量测定值分别为11.3g/株，5.1g/株，9.6g/株。
(5)箭筈豌豆翻耕一月后，采集土壤，箭筈豌豆翻耕一月后，采集土壤，分别采用碱解扩散法和土壤重铬酸钾外加热法测定碱解氮和有机质。兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号种植基地土壤的碱解氮分别为82.05mg/kg，83.18mg/kg，76.77mg/kg，有机质分别为12.29g/kg，12.6g/kg，13.73g/kg。
(6)每一箭筈豌豆随机选取种子60份，加入液氮充分研磨后将粉末，苯酚-氯仿法提取基因组DNA，采用荧光PCR技术，以ABI 3730XL DNA全自动基因分析仪为平台，进行STR分型，分别统计群体的：
有效等位基因数(X6)
(其中，Pij：第i座位上第j个等位基因的频率；M：第j个座位的等位基因数；Nei：第i座位上的等位基因的有效数目；n：所测定座位的总数。)；
杂合度(X7)
(其中，k:等位基因数；Pi:第i个等位基因的频率。)
多态信息含量(X8)
(其中，k：等位基因数目；Pi：第i个等位基因的频率；Pj：第j个等位基因的频率)。兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号等位基因数分别为16个，16个和13个，观察杂合度分别为0.10，0.09，0.65，多态信息含量分别为0.14，0.15，0.43。荧光PCR如表1。
表1箭筈豌豆STR分型引物序列
(7)将上述测定值或计算值按
进行数据标准化(其中，X为该性状的测定值，
为该性状的平均值，S为该性状的标准差)；
(8)根据步骤(7)计算的各个结果，按箭筈豌豆种质资源遗传多样性综合评定模型Y＝0.007zx1-0.063zx2-0.044zx3+0.034zx4+0.051zx5+0.066zx6+0.072zx7+0.089zx8，计算不同箭筈豌豆种质资源遗传多样性综合性能得分，并按照综合得分进行排序，确定不同箭筈豌豆种质资源遗传多样性综合性能高低。兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号主成分总得分分别为-0.31，-0.22，0.10，从综合得分来看，兰箭3号优于兰箭1号和兰箭2号，可作为江苏地区发展冬季休耕绿肥生产主推品种，土壤碱解氮可增加20.0-46.7mg/kg。
Claims (8)
1.一种箭筈豌豆种质资源筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过对箭筈豌豆种质资源生育期、鲜草产量、干草重、土壤碱解氮、有机质、有效等位基因数、杂合度和多态信息含量测定，采用主成分分析法对上述指标进行多指标综合评价和权重系数确定，建立主成分综合评价模型Y＝azx1+bzx2+czx3+dzx4+ezx5+fzx6+gzx7+hzx8，式中：zx1、zx2、zx3、zx4、zx5、zx6、zx7、zx8分别代表标准化的生育期，鲜草产量，干草重，碱解氮，有机质，有效等位基因数，杂合度和多态信息含量测定值；a、b、c、d、e、f、g和h分别为相关权重系数；
(2)种植箭筈豌豆，记录生育期X1，待盛花期后，测定鲜草产量X2和鲜草杀青烘干后称重X3；
(3)箭筈豌豆翻耕一月后，采集土壤，测定土壤碱解氮X4和有机质X5；
(4)采用荧光PCR技术，对不同箭筈豌豆品种STR分型，分别统计群体基因频率分布，分别统计群体的有效等位基因数X6，杂合度X7和多态信息含量X8；
(5)将上述测定值X1、X2、X3、X4、X5和计算值X6、X7、X8按
进行数据标准化，其中，X为该性状的测定值，
为该性状的平均值，S为该性状的标准差；
(6)根据步骤(5)计算的各个结果，按箭筈豌豆种质资源综合评定模型Y＝azx1+bzx2+czx3+dzx4+ezx5+fzx6+gzx7+hzx8，计算不同箭筈豌豆种质资源综合性能得分，并按照综合得分进行排序，确定不同箭筈豌豆种质资源综合性能高低。
2.根据权利要求1所述的箭筈豌豆种质资源筛选方法，其特征在于，所述箭筈豌豆包括兰箭1号、兰箭2号、兰箭3号、贵苕、连苕、青箭和镇江野豌豆。
3.根据权利要求1所述的箭筈豌豆种质资源筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述种植箭筈豌豆，是选择地势平坦，排水畅通的试验基地种植箭筈豌豆，每个品种种植3个小区，25m2/小区。
4.根据权利要求1所述的箭筈豌豆种质资源筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述生育期X1包括出苗期，分枝期，现蕾期，盛花期和结荚期。
5.根据权利要求1所述的箭筈豌豆种质资源筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，当箭筈豌豆生长至盛花期，采用样方取样，样方面积为1m2，每个小区取3个样方，取样后称鲜草量，得鲜草产量X2。
6.根据权利要求1所述的箭筈豌豆种质资源筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，每个箭筈豌豆品种取盛花期的鲜草10株以上，在105℃烘箱内杀青，并在60℃条件下烘干称重，即得鲜草杀青烘干后称重X3。
7.根据权利要求1所述的箭筈豌豆种质资源筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，采用碱解扩散法碱解氮，得土壤碱解氮X4，采用计测定土壤重铬酸钾外加热法测定有机质含量有机质X5。
8.根据权利要求1所述的箭筈豌豆种质资源筛选方法，其特征在于，步骤(4)中，每一箭筈豌豆随机选取60份，加入液氮充分研磨后将粉末，苯酚-氯仿法提取基因组DNΔ，采用荧光PCR技术，以ABI 3730XL DNA全自动基因分析仪为平台，进行STR分型，分别统计群体的：
有效等位基因数(X6)
其中，Pij：第i座位上第j个等位基因的频率；M：第j个座位的等位基因数；Nei：第i座位上的等位墓因的有效数目；n：所测定座位的总数；
杂合度(X7)
其中，k：等位基因数；Pi：第i个等位基因的频率；
多态信息含量(X8)
其中，k：等位基因数目；Pi：第i个等位基因的频率；Pj：第j个等位基因的频率。
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