发明内容
针对目前切花菊氮高效利用研究工作基础薄弱及菊花氮利用效率高的品种的筛选方法研究在国内几乎空白这一现状,本发明的目的在于提供一种从多个切花菊品种中筛选氮利用效率相对最高的品种的方法。关于氮利用效率高的品种的筛选指标,目前尚无既定标准。本发明基于植株相对干物质重,相对含氮量,相对叶绿素含量,建立了切花菊快速、简便的氮利用效率高的品种的筛选方法。该体系方法操作简便易行,并能基本上客观地反映吸收氮肥的真实状况,筛选出优异的种质。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
一种从多个切花菊品种中筛选氮利用效率相对最高的品种的方法,包括以下步骤:
a、获取水培苗:从需要进行筛选的多个切花菊品种中选取生长一致的插穗,在水培容器中水培养生根,获得试验处理材料;
b、砂培初筛:从步骤a中获取的每个品种的水培苗中挑出长势一致的苗采用浇灌法进行砂培,将每个品种的水培苗分为两组进行砂培,用不同氮含量的营养液进行浇灌,其中一组进行低氮处理,另一组进行正常氮处理;分别测定每个品种中两组砂培苗的干物质重、含氮量、叶绿素含量,然后得出每个品种的筛选指标:相对干物质重、相对含氮量、相对叶绿素含量,其中相对性状=低氮处理的测定值/正常氮处理的测定值;将所得出的多个切花菊品种的筛选指标进行综合对比,筛选出三个指标数值综合最高的2~6个品种为氮利用效率较高的品种,筛选出三个指标数值综合最低的2~6个品种为氮利用效率较低的品种作为对照;
c、营养液培养复筛:将步骤b中筛选出的氮高效利用品种和氮低效利用品种重复步骤a进行水培获取水培苗,将每个品种的水培苗分两组进行进行营养液培养,其中一组进行低氮处理,另一组进行正常氮处理;分别测定每个品种中两组经过营养液培养的苗株的干物质重、含氮量、叶绿素含量,然后计算每个品种筛选指标:相对干物质重、相对含氮量、相对叶绿素含量,其中相对性状=低氮处理的测定值/正常氮处理的测定值;将所得出的筛选指标进行综合对比,筛选出三个指标数值综合最高的1个氮利用效率相对最高的一个品种,筛选出三个指标数值综合最低的1个氮利用效率相对最低的一个品种作为对照。
上述的从多个切花菊品种中筛选氮利用效率相对最高的品种的方法,其中步骤b和步骤c中所述的进行低氮处理和正常氮处理为培养过程中分别采用氮含量低的营养液和氮含量正常的营养液,所述的营养液的氮源为NH4NO3,氮含量低的营养液中氮含量为16mg/L;氮含量正常的营养液中氮含量为320mg/L,其它成分均相同。营养液中磷、钾、钙、镁的浓度为:K2SO4 2.500mmol/L、MgSO4.7H2O 1.50mmol/L、NaH2PO4.2H2O 1.33mmol/L、CaCl22.00mmol/L;微量元素采用Arnon营养液配方;营养液中Fe2+2.8mg/L,以Fe-EDTA配入;硝化抑制剂7μmol/L,可采用三氰胺。
筛选原理:
作物在缺氮条件下的表现症状之一就是生长缓慢,生物量有所降低。高效品种具有较大的生物积累量,低效品种则因为氮素供应不充分,生物积累量很小。不同品种切花菊苗期地上部干物质重的差异在一定程度上能反应它对养分的吸收、转运和利用效率的差异。
氮素对植物的形态建成和光合作用都起着重要作用而且是叶绿素的主要元素,施氮一般能促进植物叶片叶绿素的合成。植物缺氮时,叶片叶绿素含量降低导致叶片颜色变浅,而供氮过多时则相反,植物叶片颜色变深,叶片颜色的变化基本能反映植物的氮营养水平。
植株氮素吸收总量,即植株吸氮量,是表示植株吸氮能力大小的指标。在低氮胁迫下,不同基因型植株氮素吸收总量均有下降。但高效品种在较低的氮素水平下仍能吸收较多的氮素来满足其生长发育的需要,所以相对比值更高。
本发明技术方案的详细过程为:
a、获取水培苗:选取生长一致的插穗,将穗掰成5~7厘米,下面2.5~3厘米叶片去掉,保证顶部两叶一心。水培容器为外径410×310×145mm塑料周转箱,在周转箱的四个角各放置1个500ml组培瓶(用于支撑培养穴盘),上面放置穴盘,将插穗置于穴盘孔中,加水至穗底没入水面以下1-2cm。光照时间白天12h,夜间12h,白天最高温度32℃,夜间最低温度27℃。在水培生根2周时间内,不加营养液,用自来水培养。
b、砂培初筛
每个品种从水培苗中挑出长势一致的苗进行砂培试验。砂培试验容器采用20cm×20cm塑料盆,栽培基质为石英砂。试验采用浇灌法,每隔2天用营养液浇一次,每次每盆100ml,持续三周。
将每个品种中挑出的2n(n≥1)株水培苗分为两组,每组n株,一组浇灌低氮水平营养液(进行低氮处理),另一组浇灌正常氮水平营养液(进行正常氮处理)。
分别测定每个品种的两组砂培苗的干物质重、含氮量、叶绿素含量,然后计算每个品种的相对干物质重、相对含氮量、相对叶绿素含量,其中相对性状=低氮处理的测定值/正常氮处理的测定值;
对所计算出的多个切花菊品种的相对干物质重、相对含氮量、相对叶绿素含量进行综合对比,筛选出三个指标均较高的2~6个切花菊品种为氮利用效率较高的品种,筛选出三个指标均较低的2~6个切花菊品种为氮利用效率较低的品种作为对照。
c、营养液培养复筛
将步骤b中筛选出来的2~6个氮利用效率较高的品种,2~6个氮利用效率较低的品种,重复步骤a进行水培获取水培苗,然后从每个品种筛选出2n(n≥1)株水培苗分为两组(n株/组),一组采用低氮水平营养液(进行低氮处理),另一组采用正常氮水平营养液(进行正常氮处理),营养液培养三周,营养液培养容器为塑料周转箱,方法如a中的方法,不同的是营养液培养溶液不是自来水,而是营养液。每天加一次营养液,培养期间每天用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节溶液pH至6.5,每两天更换一次营养液。切花菊在温室中生长3周后测定其各项指标。各项指标的测定方法与砂培初筛中的测定方法相同。
根据所得出的多个切花菊品种的相对干物质重、相对含氮量、相对叶绿素含量进行综合对比,筛选出三个指标综合最高的1个切花菊品种为氮利用效率相对最高的品种,筛选出三个指标综合最低的1个切花菊品种为氮利用效率相对最低的品种作为对照,将筛选出的2个品种可进行随后的试验(生理机理和分子机理)。
去离子水配制的营养液,氮源为NH4NO3,设两个氮水平:正常水平:氮含量为:320mg/L;低氮水平:氮含量为16mg/L。营养液培养容器为塑料周转箱,方法如a中的方法,不同的是营养液培养溶液不是自来水,而是营养液。营养液中磷、钾、钙、镁的浓度采用改良的休伊特营养液配方(见表1),pH 6.5。微量元素采用Arnon营养液配方(见表2),其中Fe2+2.8mg/L,以Fe-EDTA配入。在不同氮素形态的处理中均加入7μmol/L的硝化抑制剂三氰胺(DCD),以防止微生物的硝化作用。
表1改良的休伊特营养液配方
成分 |
浓度 |
K2SO4 |
2.500mmol/L |
MgSO4.7H2O |
1.50mmol/L |
NaH2PO4.2H2O |
1.33mmol/L |
CaCl2 |
2.00mmol/L |
表2Arnon微量元素营养液配方
成分 |
浓度 |
H3BO3 |
2.86g/L |
MnCl2.4H2O |
1.81g/L |
ZnSO4.7H2O |
0.22g/L |
CuSO4.5H2O |
0.08g/L |
H2MoO4.4H2O |
0.02g/L |
d、筛选指标的测定
筛选指标即比较品种间的相对值:1、相对干物质重;2、相对含氮量;3、相对叶绿素含量。综合三项的相对值来判断品种N利用效率的高低。
相对性状=(低氮处理的测定值/正常氮处理的测定值)
1、植株干重测定:先将鲜样在105℃杀青30min,然后降温至80℃,逐尽水分,最后称重。
2、叶绿素含量测定:取新鲜叶片,擦净组织表面污物,剪碎(去掉中脉),混匀;称取剪碎的新鲜样品0.2g,共3份,分别放入研钵中,加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3ml 95%乙醇,研成均浆,再加乙醇10ml,继续研磨至组织变白。静置3~5min;取滤纸1张,置漏斗中,用乙醇湿润,沿玻棒把提取液倒入漏斗中,过滤到25ml棕色容量瓶中,用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,最后连同残渣一起倒入漏斗中;用滴管吸取乙醇,将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml,摇匀;把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内,以95%乙醇为空白,在波长663nm和645nm下测定吸光度。
3、全氮测定:植株样品烘干,磨细后,经混合酸(95%浓硫酸和5%高氯酸)消煮、定容并过滤到干净、烘干的塑料瓶,用流动注射分析仪(FLAsta:5000,瑞典)测定各样品的地上部全氮的含量。
本发明的有益效果:
1.本发明是目前较为系统的针对切花菊氮肥吸收真实状况的一套研究方法,即通过三个生理指标建立切花菊氮利用效率高的品种的筛选方法,且该方法操作简便易行,可以通过该方法对尽可能多的切花菊品种进行氮高效利用品种的筛选,从而筛选出氮利用效率最高的切花菊品种。
2.首次针对切花菊氮高效利用研究工作基础薄弱,研究切花菊不同氮水平下的生理指标,为后续的研究切花菊氮高效吸收机理及品种改良提供了最基本的实验依据和实验方法。
3.优选不同氮利用资源的研究和利用:切花菊氮吸收利用效率遗传背景差异十分明显,初步筛选出的氮利用效率高的品种,是一批宝贵的材料,可用于菊花抗性育种。
具体实施方式
实施例1
1、获取水培苗
从需要进行筛选的16个切花菊品种(见表3)中选取生长一致的插穗,将穗掰成5~7厘米,下面2.5~3厘米叶片去掉,保证顶部两叶一心。水培容器为外径410×310×145mm塑料周转箱,在周转箱的四个角各放置1个500ml组培瓶,上面放置108孔穴盘,将插穗置于穴盘孔中,加自来水至插穗底部1-2cm,每两天更换一次自来水。光照时间为白天12h,夜间12h,白天最高温度32℃,夜间最低温度27℃。两个星期后选取生根一致的苗进行下一步试验处理。
表3不同切花菊品种编号(Number of different chrysanthemum cultivars)
编号 |
品种 |
编号 |
品种 |
1 |
南农红枫 |
9 |
南农红袖 |
2 |
南农霞光 |
10 |
南农雪峰 |
3 |
南农宫粉 |
11 |
南农玉盘 |
4 |
南农双娇 |
12 |
南农花脸 |
5 |
南农小丽 |
13 |
南农玉珠 |
6 |
南农玉碟 |
14 |
南农赤峰 |
7 |
南农勋章 |
15 |
南农银山 |
8 |
南农紫勋章 |
16 |
南农金蝶 |
2、砂培初筛
从每个品种的水培苗中挑出6株长势一致的苗进行砂培试验。砂培试验容器采用20cm×20cm塑料盆,栽培基质为石英砂。试验采用浇灌法,将每个品种的水培苗分为两组(3株/组)进行砂培,用含氮量不同的营养液进行浇灌,一组浇灌低氮水平营养液(低氮处理),另一组浇灌正常氮水平营养液(正常氮处理)。每隔2天浇灌一次,每次每盆100ml,持续培养三周。
每个品种,分别测定低氮处理组中3株切花菊中每株切花菊的干物质重、含氮量、叶绿素含量,然后分别计算其平均干物质重、平均含氮量、平均叶绿素含量作为低氮处理的测定值;采用同样方法得出正常氮处理组的平均干物质重、平均含氮量、平均叶绿素含量作为正常氮处理的测定值。然后计算每个品种的筛选指标:相对干物质重、相对含氮量、相对叶绿素含量,其中相对性状=低氮处理的测定值/正常氮处理的测定值。每个品种所得的筛选指标见表4。
(1)营养液配方:
所用的营养液用去离子水配制,氮源为NH4NO3,氮含量低的营养液中氮含量为16mg/L;氮含量正常的营养液中氮含量为320mg/L,其它成分均相同。营养液中磷、钾、钙、镁的浓度采用改良的休伊特营养液配方(见表1),pH 6.5。
表1改良的休伊特营养液配方
成分 |
浓度 |
K2SO4 |
2.500mmol/L |
MgSO4.7H2O |
1.50mmol/L |
NaH2PO4.2H2O |
1.33mmol/L |
CaCl2 |
2.00mmol/L |
微量元素采用Arnon营养液配方(见表2),营养液中Fe2+2.8mg/L,以Fe-EDTA配入,在不同氮素形态的处理中均加入7μmol/L的硝化抑制剂三氰胺(DCD),以防止微生物的硝化作用。
表2 Arnon微量元素营养液配方
成分 |
浓度 |
H3BO3 |
2.86g/L |
MnCl2.4H2O |
1.81g/L |
ZnSO4.7H2O |
0.22g/L |
CuSO4.5H2O |
0.08g/L |
H2MoO4.4H2O |
0.02g/L |
(2)筛选指标的测定:
筛选指标:1、相对干物质重;2、相对含氮量;3、相对叶绿素含量
相对性状=(低N处理的测定值/正常N处理的测定值)
植株干重测定:先将鲜样在105℃杀青30min,然后降温至80℃,逐尽水分,最后称重。
叶绿素含量测定:取新鲜叶片,擦净组织表面污物,剪碎(去掉中脉),混匀;称取剪碎的新鲜样品0.2g,共3份,分别放入研钵中,加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3ml 95%乙醇,研成均浆,再加乙醇10ml,继续研磨至组织变白。静置3~5min;取滤纸1张,置漏斗中,用乙醇湿润,沿玻棒把提取液倒入漏斗中,过滤到25ml棕色容量瓶中,用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,最后连同残渣一起倒入漏斗中;用滴管吸取乙醇,将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml,摇匀;把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内,以95%乙醇为空白,在波长663nm和645nm下测定吸光度。
全氮测定:植株样品烘干,磨细后,经混合酸(95%浓硫酸和5%高氯酸)消煮、定容并过滤到干净、烘干的塑料瓶,用流动注射分析仪(FLAsta:5000,瑞典)测定各样品的地上部全氮的含量。
表4为砂培初筛所得的16个切花菊品种的筛选指标
品种编号 |
相对干物质重 |
相对含氮量 |
相对叶绿素含量 |
1 |
0.821 |
0.762 |
0.786 |
2 |
0.634 |
0.61 |
0.73 |
3 |
0.568 |
0.57 |
0.71 |
4 |
0.672 |
0.689 |
0.741 |
5 |
0.842 |
0.76 |
0.82 |
6 |
0.702 |
0.692 |
0.732 |
7 |
0.802 |
0.752 |
0.779 |
8 |
0.696 |
0.723 |
0.745 |
9 |
0.698 |
0.712 |
0.75 |
10 |
0.854 |
0.84 |
0.81 |
11 |
0.806 |
0.759 |
0.782 |
12 |
0.597 |
0.64 |
0.59 |
13 |
0.825 |
0.79 |
0.79 |
14 |
0.792 |
0.759 |
0.759 |
15 |
0.801 |
0.758 |
0.772 |
从所得出的多个切花菊品种的筛选指标进行综合对比,相对物质干重:3、12、2数值最低,13、5、10数值最高;相对含氮量:3、2、12数值最低,5、1、13、10数值最高;相对叶绿素含量:12、3、2数值最低,13、10、5数值最高。虽然植株1的相对含氮量较高,但是其两外两项指标的测定值相对较低,综合各项指标,筛选出三个指标综合数值最高的3个品种5、10、13为氮利用效率相对较高的品种,筛选出三个指标综合数值最低的3个品种2、3、12为氮利用效率较低的品种作为对照,图2为砂培初筛中筛选出的6个品种的筛选指标的柱形图。
3、营养液培养复筛
将经过砂培初筛所筛选出的3个氮利用效率较高的品种(5、10、13)和氮利用效率较低的品种(2、3、12)重复进行水培获取水培苗,将每个品种的水培苗分两组进行进行营养液培养,其中一组用低氮水平营养液培养(低氮处理),另一组用正常氮水平营养液培养(正常氮处理);营养液培养容器为塑料周转箱,装置与水培方法所用的装置相同,不同的是培养溶液不是自来水,而是营养液。培养过程中每天加一次营养液,培养期间每天用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调节溶液pH至6.5,每两天更换一次营养液。切花菊在温室中生长3周后测定其各项指标。其中所用的营养液的配方及筛选指标的测定方法与砂培初筛中的营养液和测定方法相同。
分别测定每个品种的筛选指标,将所得出的切花菊品种的筛选指标进行综合对比,筛选出三个指标综合数值最高的1个品种为在16个切花菊品种中氮利用效率最高的品种(10),筛选出三个指标综合数值最低的1个品种为在16个切花菊品种中氮利用效率最低的品种(3)作为对照。图3为营养液培养复筛中筛选出氮高效利用品种10和氮低效利用品种筛选指标的柱形图。并进一步从中筛选出高效与低效品种各1个进行下一步试验(生理机理和分子机理)。
图2为砂培初筛得出的六个品种,分别为三个高效利用品种(5、10、13)和三个低效利用品种(2、3、12)。图中可以看出高效品种在相对干物质重,相对含氮量和相对叶绿素含量上均高于低效利用品种。
图3为营养液培养复筛中得出的六个品种进行验证复筛,得出一个氮高效利用品种10,一个氮低效利用品种3。图中可以看出氮高效利用品种在三个指标上明显优于氮低效利用品种。