CN101513167A - 一种获得栽培菊花与近缘属间远缘杂种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明获得菊属与近缘属的属间远缘杂种的方法，属于生物技术育种领域。选择栽培菊花品种为母本，以野生的抗病虫能力强或具特异观赏价值的近缘属物种为父本，采用组织培养手段进行杂种胚的离体培养，以克服菊属与近缘属远缘杂交后合子胚败育的障碍。对获得的后代材料进行杂种形态学鉴定和原位杂交鉴定，选择茎、叶、花序、表皮毛等形态学特征介于双亲之间、与母本不同、出现父本特异性状或双亲不具有的新性状的后代材料，进行原位杂交，若染色体组成为分别来源于双亲，即为获得的属间远缘杂交种。应用本方法成功地实现了菊属与多个近缘属的属间远缘杂交种，对现有栽培菊花品种进行了改良，并创造了一批有应用价值的新种质。

Description

一种获得栽培菊花与近缘属间远缘杂种的方法

一、技术领域

本发明一种获得栽培菊花与近缘属间远缘杂种的方法，涉及原产中国的栽培菊花品种和近缘属物种用于菊花种质创新、品种改良和新品种选育的方法，属于生物技术育种领域。

二、背景技术

菊花[Dendranthema morifolium]又名鞠秋、鞠、菊华、女华、黄花、茱英、金英、帝女花等，原产我国，是中国十大传统名花和世界四大切花之一，也是世界上最重要的观赏花卉之一，距今已有1600多年的栽培历史，由毛华菊、野菊和紫花野菊等天然杂交并经人工长期选育而成(Chen，1957；Chen，1985)。唐朝时期，中国菊花经朝鲜传入日本，17世纪中叶始，中国菊花传入荷兰、法国、英国等欧美国家。菊花盛开于秋季花少时节，而且花期长达一个月以上，给众花凋零的秋日园林带来了璀璨的美；也使我们十一、十二月的寒冷季节充满了花卉的芬芳，因此它在观赏园艺领域有着特殊重要的地位，特别值得花卉育种家的注意。目前，我国选育的菊花品种约有4000多个，全球品种总数在2万之上(陈俊愉，2001)，是世界上商品产值最高的花卉(Boaes，1997)。菊花不仅在切花和盆花中具有十分重要的地位，而且在露地栽培中也起到了越来越大的作用，因此加强菊花育种具有很高的经济效益和社会效益。

近年来，国内外研究者在菊花育种方法上，采用了自然杂交、人工杂交、芽变选种、辐射诱变、组织培养、卫星搭载太空诱变、转基因、单细胞培养突变育种等方法。国内外研究文献表明，目前绝大部分菊花品种都是经人工杂交育成，种间远缘杂交也已开始用到育种上。远缘杂交是研究菊花及其它园林植物起源和进化的重要途径，也是创造园林植物新类型和获得有价值的新品种的有效方法(孟金陵，1997)。随着园林植物育种工作的深入，属内的遗传资源利用日益枯竭，同时也发现某些优良性状的基因库贫乏，采用属内资源进行常规育种实践难以取得突破，到属外寻找优良的基因资源，通过采用现代生物技术手段开展属间远缘杂交，打破属间隔离，实现有利基因的转移，将其它属的有益性状(如抗逆性、抗病虫能力强等)的基因资源导入栽培菊花中，对于菊花及其它园林植物育种，具有重要意义。

菊花属间杂交工作近年来也取得了一定进展。1978年，Tanaka等曾发现春黄菊族(Anthemidinae)多数属间杂交亲和性很高，柴田道夫(1988)利用日本亚菊属的矶菊[Ajania pacificum]与从荷兰、美国引来的Spray型日中性的菊花品种杂交成功育出了耐热的切花优良品种‘Summer Queen’；1989年，荷兰De Jong和Rade Marker利用矶菊育出了切花和盆栽类的商品菊。之后，Douzono等(1998)又利用盐菊[A.shiwogiku]开展了培育抗病切花菊的研究，而且得到了很多杂交后代和回交后代。

分布于我国的菊属近缘属主要有短舌菊属Brachanthemum、亚菊属Ajania、蒿属Artemisia、芙蓉菊属Crossostephium、栉节蒿属Neopallasia、茼蒿属Chrysanthemum等。这些近缘属植物多为野生种，具有许多栽培品种所缺乏的优异性状，如长期的自然选择下进化出的较好的抗病虫性、抗逆性和某些特异的观赏价值等。例如，蒿属和茼蒿属植物多数种类含挥发油、脂肪、有机酸及生物碱，主要成分为聚己炔类(polyacetylenes)、黄酮类(flavonoids)、萜类(terpenoids)及其他化合物，如倍半萜内酯类(sesquiterpene lactones)等，许多种类入药，为重要或常用的药用植物。尤其是含有的萜类物质，有较强的杀虫和抑菌作用。Furuta(2004)曾将菊花和大籽蒿(A.sieversiana)进行原生质融合，得到的后代有23株开花，并具有较强的抗锈病能力。近缘野生种不仅含有丰富的抗性基因，很多种类还有独特的观赏价值，如亚菊属的矶菊，叶片被浓密的白色表皮毛，使叶片看上去呈现银色；蒿属黄金艾蒿的叶片表面有大小不一、不规则的黄色或白色斑点，看上去呈现金黄色。和常见的绿色叶片相比，这些特异的叶形叶色往往会给人赏心悦目的视觉享受。

与国外相比，我国有丰富的菊属近缘属植物种质资源，但在近缘属种质资源的研究和开发利用方面还相当薄弱，仅有零星报道，许多物种的优良性状，特别是各种抗性基因尚未得到充分挖掘和利用，亟待重视和加强。如果能够克服栽培菊花和近缘属物种的远缘杂交障碍，把近缘属物种抗病虫的性状(基因)或优异的观赏性状转移到栽培菊花中，则有望获得具较强抗病虫能力或特异观赏性状的菊花新种质，实现栽培菊花的品种改良，将是我国菊花育种(尤其是抗病虫育种和抗逆育种)取得重要突破的关键所在。

三、发明内容

技术问题  本发明的目的是针对目前菊花资源遗传基础狭窄尤其是抗性较弱这一现状，提供一套利用现代生物技术克服远缘杂交障碍，获得栽培菊花与近缘属间远缘杂种的方法，以达到扩大菊花基因库、引进野生植物中优异性状(基因)的目的，形成一套菊花种质创新、品种改良和新品种选育的技术。

技术方案  本发明利用克服远缘杂交障碍获得栽培菊花与近缘属间杂种的方法，包括：

1)栽培菊花与近缘属间远缘杂交后代材料的获得

选择菊属栽培菊花[Dendranthema morifolium]和近缘属物种(如亚菊属矶菊[Ajania pacificum]、蒿属黄金艾蒿[Artemisia vulgaris]、茼蒿属白晶菊[Chrysanthemum paludosum]及芙蓉菊属芙蓉菊[Crossostephium chinense]等)，于温室内进行杂交，以栽培菊花为母本进行人工去雄并套袋隔离，以近缘属物种为父本在筒状花散粉前套袋，于上午9～10时或下午3～4时授粉，同一花序重复授粉2次；

接种时取杂交授粉后15～18d的头状花序，剥取边缘舌状花的子房，在超净工作台上依次开展以下操作：用体积比为75％的乙醇浸泡30s，质量百分比为0.1％的升汞溶液消毒6min，无菌水冲洗4～5次；

用接种针将子房内的胚珠剥出，接入MS添加激动素KT 2.0mg·L^-1+生长素IAA1.0mg·L^-1或者添加细胞分裂素6-BA2.0mg·L^-1+生长素NAA 0.5mg·L^-1的培养基上，每瓶接种胚珠10个，每处理重复20～30瓶，诱导愈伤组织形成；

30d后转入分化培养基，分化培养基为MS+细胞分裂素6-BA2.0mg·L^-1+生长素NAA 0.1mg·L^-1，诱导愈伤组织分化出苗；

得到幼苗后转入MS+细胞分裂素6-BA 0.2mg·L^-1的培养基中进行扩繁和继代培养，幼苗移至1/2MS添加生长素NAA 0.1mg·L^-1的培养基上生根，培养温度为23±2℃，光照周期为14h·d^-1，光照强度为1600～2000lx，即可获得菊属栽培菊花与近缘属物种属间远缘杂交后代的无菌苗；

2)属间杂种的获得

对获得的后代材料经炼苗移栽后进行杂种形态学鉴定和基因组原位杂交(Genomic in situ hybridization，GISH)鉴定，其中：

对后代材料进行形态学鉴定，选择形态学特征在株高、冠径、分枝性、叶片、花序、表皮毛等方面出现介于双亲之间、与母本不同、父本特异性状或父母本都不具备的新性状的植株，以双亲之一的总DNA用荧光素标记后作为探针，进行分子原位杂交鉴定；经原位杂交鉴定后体细胞内含有分别来源于双亲基因组的后代材料，即为获得的菊属栽培菊花与近缘属物种的属间杂交种。

有益效果  本发明提供的克服远缘杂交障碍获得菊属与近缘属远缘杂种的方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

(1)本发明利用菊属近缘属物种结合现代生物技术进行菊花育种研究，克服了菊属与近缘属的远缘杂交障碍，拓宽了菊花育种的思路和领域，扩展了栽培菊花的遗传基础，实现了菊花的种质创新。

(2)在组织培养技术上比较了不同培养基、不同激素配比、不同胚胎发育时期等的培养效果，获得了最佳接种时期和培养基配比。筛选出培养胚龄以15～18d最好，愈伤诱导培养基以MS添加激动素KT 2.0mg·L^-1+生长素IAA1.0mg·L^-1或者添加细胞分裂素6-BA2.0mg·L^-1+生长素NAA 0.5mg·L^-1效果最好。

(3)结合利用形态学和分子原位杂交方法对属间杂种进行鉴定，结果真实可靠。

(4)获得了一批具有较强抗病虫能力的栽培菊花与近缘属物种的属间杂种，实现了栽培菊花的品种改良，生态效益和社会效益显著。

(5)在本发明基础上，使利用创新的菊花种质进一步开展菊花育种成为可能，同时可利用杂交后代进行菊属与近缘属的染色体组分析、起源演化及亲缘关系研究等，有重要的理论意义和现实意义。

四、附图说明

图1、钟山金桂×黄金艾蒿杂种与亲本的形态学和原位杂交比较鉴定

A-C：盛花期植株形态，标尺＝10cm。(A)：钟山金桂；(B)：钟山金桂×黄金艾蒿；(C)：黄金艾蒿。D-F：表皮毛形态比较，标尺＝250μm。(D)：钟山金桂；(E)：钟山金桂×黄金艾蒿；(F)：黄金艾蒿。G：钟山金桂(左)、钟山金桂×黄金艾蒿(中)和黄金艾蒿(右)的叶形态比较，标尺＝1cm。H：钟山金桂(左)、钟山金桂×黄金艾蒿(中)和黄金艾蒿(右)的花序形态比较，标尺＝1cm。I：钟山金桂(左)和钟山金桂×黄金艾蒿(右)的舌状花形态比较，标尺＝5mm。J：钟山金桂(左)和钟山金桂×黄金艾蒿(右)的筒状花形态比较，标尺＝5mm。K：钟山金桂的染色体有丝分裂中期形态(2n＝6x＝54)，标尺＝3μm。L：黄金艾蒿的染色体有丝分裂中期形态(2n＝4x＝36)，标尺＝3μm。M-O：钟山金桂×黄金艾蒿的染色体荧光原位杂交，标尺＝5μm。其中M代表有丝分裂中期，红色是钟山金桂染色体(27条)，黄色是黄金艾蒿染色体(18条)；N和O分别是间期和前期，注意来自不同亲本的染色体(质)在核空间分布上的区域性。

五、具体实施方式

本发明所提供的利用胚珠培养获得菊属与近缘属远缘杂交后代和杂种鉴定的方法，其具体实施方式如下：

1.菊属与近缘属属间杂交后代材料的获得

1.1材料选择

选择菊属栽培菊花如‘奥运火炬’、‘钟山金桂’、‘钟山紫桂’、‘寒小白’等品种(中国菊花研究网，http://www.chrysanthemum.cn)作为母本，以近缘属物种如亚菊属矶菊[Ajania pacificum]、蒿属黄金艾蒿[Artemisia vulgaris]、茼蒿属白晶菊[Chrysanthemum paludosum]及芙蓉菊属芙蓉菊[Crossostephium chinense]等作为父本。所选择的近缘属物种有较强的抗病虫能力或者特异的观赏价值，有的已经在园林绿化领域有了栽培应用。以上材料全部种植在南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”，可对外销售。

1.2杂种幼苗获得

于温室内进行杂交，以栽培菊花为母本进行人工去雄并套袋隔离，以近缘属物种为父本在筒状花快开时套袋，于上午9～10时或下午3～4时授粉，同一花序重复授粉2次。杂交后采用组织培养手段进行杂种胚的离体培养以克服远缘杂交障碍。接种时取杂交授粉后15～18d的头状花序，剥取边缘舌状花的子房，在超净工作台上依次开展以下操作：用体积比为75％的乙醇浸泡30s，质量百分比为0.1％的升汞溶液消毒6min，无菌水冲洗4～5次后用接种针将子房内的胚珠剥出，接入MS添加激动素KT 2.0mg·L^-1+生长素IAA1.0mg·L^-1或者添加细胞分裂素6-BA2.0mg·L^-1+生长素NAA 0.5mg·L^-1的培养基上，每瓶接种胚珠10个，每处理重复20～30瓶，诱导愈伤组织形成；30d后转入分化培养基，诱导愈伤组织分化出苗，分化培养基为MS+细胞分裂素6-BA2.0mg·L^-1+生长素NAA 0.1mg·L^-1。得到幼苗后转入MS+细胞分裂素6-BA 0.2mg·L^-1的培养基中进行扩繁和继代培养，待苗到一定数量后接种在1/2MS添加生长素NAA 0.1mg·L^-1的培养基上生根。培养温度为23±2℃，光照周期为14h·d^-1，光照强度为1600～2000lx，即可获得菊属栽培菊花与近缘属物种属间杂交后代的无菌苗。

2.菊属与近缘属属间杂种的获得

2.1杂种形态学鉴定

将杂交父母本及后代材料于4月份同时定植在田间，6月起开始对杂交父母本及后代材料的形态学进行观察与统计，后代材料的茎、叶、花序、表皮毛等形态学特征介于双亲之间、与母本不同、出现父本特异性状或双亲不具有的新性状，即可初步判定其为真杂种。性状登记均按李鸿渐(1993)标准(李鸿渐，邵建文.《中国菊花》.南京：江苏科学技术出版社，1993，4)进行，花色以英国皇家园艺学会的色谱为标准(Color chart，the Royal Hort.Culture Society，London，1996)。表皮毛形态是用尖头镊子撕取叶片表皮在体视显微镜下观察并照相。依据杂交父母本及后代的表现型对所得的可能的杂种植株进行鉴定。

2.2原位杂交鉴定方法

对经形态学鉴定后的材料进行DNA原位杂交鉴定，如果后代材料的细胞内含有分别来源于双亲的基因组，即可判定其为真杂种。原位杂交技术流程为：

(1)采用CTAB微量法提取亲本的总DNA(邹喻萍等，系统与进化学中的分子标记[M]，科学出版社，2001：9-17)，Lambda DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，最后将浓度调至200ng·μL-1。

(2)用缺刻平移法(Nick Translation)标记杂交用DNA探针：在PCR管中依次加入ddH₂O20μl、10×buffer、dNTP、Template DNA(父本或母本DNA均可)、Fluorescein-12-dUTP、DNase I和DNA聚合酶I(1∶1200稀释)各5μl，混匀后离心，置入PCR仪中15℃两小时后加入5μl终止缓冲液0.5M EDTA，置-20℃冰箱中保存备用。

(3)制片准备：制片置超低温(-70℃)冰箱3-4小时或过夜，冰冻揭片后用100％ETOH脱水，室温下晾干后用70％甲酰胺在80℃变性，在室温下晾干备用。

(4)配杂交液(15μl/slide)：PCR管中依次加入d.d.H₂O(1ul/slide)、dFA(7.5μl/slide)、20×SSC(1μl/slide)、Salmon sperm DNA(0.5μl/slide)、DNA probe(2μl/slide)和50％Dextran sulfate(3μl/slide)，混匀后备用。

(5)杂交：将杂交液滴于制片上，盖上盖玻片，将制片放在垫有湿润滤纸的保鲜盒内放在黑暗的37℃恒温箱内过夜。

(6)杂交后洗涤：在42℃水浴锅中预热2×SSC和FA，移去盖玻片在其中洗脱未杂交的DNA探针，气干片子。

(7)套染：探针用荧光绿标的用PI(碘化丙啶)染，探针用荧光红标的用DAPI染(双色原位杂交也用DAPI染)。

(8)观察与照相：在避光处用荧光显微镜观察并照相。

实施实例：应用本方法先后开展了栽培菊花品种与多个近缘属物种的属间远缘杂交试验，并获得了一系列远缘杂交种，如‘奥运火炬’×矶菊(亚菊属)、‘钟山金桂’×黄金艾蒿(蒿属)、‘钟山紫桂’×白晶菊(茼蒿属)、‘寒小白’×芙蓉菊(芙蓉菊属)等。现以菊属‘钟山金桂’与蒿属黄金艾蒿的远缘杂交为例具体说明如下：

以栽培菊花品种‘钟山金桂’[Dendranthema morifolium‘zhongshanjingui’]为母本，以蒿属野生种黄金艾蒿[Artemisia vulgaris](因其叶片表面有大小不一、不规则的黄色或白色斑点，看上去呈金黄色而得名，在长江流域有野生分布，在园林绿化领域作为观叶植物也有一定的栽培应用，同时具有较强的抗病虫能力)为父本，获得了杂交后代材料，经形态学和原位杂交成功地鉴定出了属间远缘杂种。

对杂交父母本及后代材料的初步观察表明：新材料的株型、冠幅、株高、叶等形态特征介于双亲之间，但偏母性遗传；花序具有超亲优势，尤其是花序直径和舌状花长度明显大于母本，但舌状花数量、宽度和筒状花数量、长度均没有明显变化；分枝性、花序繁密度、开花期等具父本特异性状，如分枝比母本多，单株花序比母本繁密，开花期较母本提前。尤其不同的是，杂交后代由于体内携带了野生种的基因，长势好，抗性强，在终花期依然保持全株为绿色叶片，而母本在开花后期的中下部叶片几乎全部枯死。杂交后代在表皮毛密度和形态上也具有父本的特征，密度和长度均较母本显著增加，尤其是在“T”形表皮毛的竖端上，母本由2或3个细胞组成，杂种和父本均由5个细胞组成。

在对杂种的根尖细胞有丝分裂中期制片进行的原位杂交图中，可以清楚地看到其45条染色体的组成为来自母本栽培菊‘钟山金桂’的27条(红色)和来自父本蒿属黄金艾蒿的18条(黄色)，直观地证明了杂种的真实性。关于杂种和亲本叶、花、表皮毛形态及原位杂交见图1。栽培菊‘钟山金桂’(染色体54条)、黄金艾蒿(染色体36条)及‘钟山金桂’×黄金艾蒿组合杂种的形态特征具体描述如下：

‘钟山金桂’[D.morifolium‘zhongshanjingui’]：株高52cm，冠径86cm，分枝性中等，叶长5.0cm，宽3.2cm，叶裂深，有或无托叶，茎绿或紫色，茎及叶片上均有较稀疏毛；花序直径4.12cm，筒状花部分直径1.8cm，均为黄色；舌状花数22，长1.97cm，宽0.52cm；筒状花数146，长1.09cm；花期10～11月。

黄金艾蒿[Artemisia vulgaris]：株高55～160cm，冠径26～64cm，分枝性强，叶长5.31cm，宽2.94cm，叶裂深，有托叶，茎浅绿或绿色，茎及叶片上被细长浓密如蛛丝状绒毛；花序无舌状花，筒状花数15，初开8月20日，此后在抽生的新枝上现蕾开花直至11月底。

‘钟山金桂’×黄金艾蒿组合杂种：株高43～63cm，冠径65～81cm，分枝性强，叶长5.8cm，宽3.2cm，叶裂深，有或无托叶，茎绿或紫色，茎及叶片上均有较密长柔毛，但较父本稀疏；花序直径4.78cm，筒状花部分直径2.01cm，均为黄色；舌状花数21，长2.41cm，宽0.54cm；筒状花数151，长1.09cm；花期9月底～11月。

Claims (1)

1、一种获得栽培菊花与近缘属间远缘杂种的方法，包括：

1)栽培菊花与近缘属间远缘杂交后代材料的获得

选择菊属栽培菊花[Dendranthema morifolium]和近缘属物种亚菊属矶菊[Ajania pacificum]、蒿属黄金艾蒿[Artemisia vulgaris]、茼蒿属白晶菊[Chrysanthemum paludosum]及芙蓉菊属芙蓉菊[Crossostephium chinense]，于温室内进行杂交，以栽培菊花为母本进行人工去雄并套袋隔离，以近缘属物种为父本在筒状花散粉前套袋，于上午9～10时或下午3～4时授粉，同一花序重复授粉2次；

接种时取杂交授粉后15～18d的头状花序，剥取边缘舌状花的子房，在超净工作台上依次开展以下操作：用体积比为75％的乙醇浸泡30s，质量百分比为0.1％的升汞溶液消毒6min，无菌水冲洗4～5次；

用接种针将子房内的胚珠剥出，接入MS添加激动素KT 2.0mg·L^-1+生长素IAA1.0mg·L^-1或者添加细胞分裂素6-BA2.0mg·L^-1+生长素NAA 0.5mg·L^-1的培养基上，每瓶接种胚珠10个，每处理重复20～30瓶，诱导愈伤组织形成；

30d后转入分化培养基，分化培养基为MS+细胞分裂素6-BA2.0mg·L^-1+生长素NAA0.1mg·L^-1，诱导愈伤组织分化出苗；

得到幼苗后转入MS+细胞分裂素6-BA 0.2mg·L^-1的培养基中进行扩繁和继代培养，幼苗移至1/2MS添加生长素NAA 0.1mg·L^-1的培养基上生根，培养温度为23±2℃，光照周期为14h·d^-1，光照强度为1600～2000lx，即可获得菊属栽培菊花与近缘属物种属间远缘杂交后代的无菌苗；

2)属间杂种的获得

对后代材料进行形态学鉴定，选择形态学特征在株高、冠径、分枝性、叶片、花序、表皮毛等方面出现介于双亲之间、与母本不同、父本特异性状或父母本都不具备的新性状的植株，以双亲之一的总DNA用荧光素标记后作为探针，进行分子原位杂交鉴定；经鉴定后体细胞内含有分别来源于双亲的基因组的后代材料，即为获得的菊属栽培菊花与近缘属物种的属间杂交种。

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