CN111937740B - 芙蓉菊与匍地菊的属间远缘杂种创制方法 - Google Patents

芙蓉菊与匍地菊的属间远缘杂种创制方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了芙蓉菊与匍地菊的属间远缘杂种创制方法。所述方法包括：以菊科芙蓉菊属二倍体耐盐种芙蓉菊为母本，菊科菊属四倍体耐盐种匍地菊为父本，进行人工杂交育种。通过杂交授粉及幼胚离体培养，得到F1代植株。对F1代材料进行杂种形态学观察、细胞学鉴定和流式细胞分析，最终获得芙蓉菊和匍地菊的属间真杂种后代，成功克服了芙蓉菊与匍地菊的属间远缘杂交障碍。提高了杂种成活率，缩短了菊花培育周期，创制了一批新种质。

Description

芙蓉菊与匍地菊的属间远缘杂种创制方法
技术领域
本发明涉及植物育种领域，具体地说，涉及芙蓉菊与匍地菊的属间远缘杂种创制方法。
背景技术
芙蓉菊(Crossostephium chinense)，菊科芙蓉菊属单属单种，为我国特有，产于东南沿海地区。常绿亚灌木。叶常狭倒披针形，常全缘，两面密被灰色柔毛，质地厚；花径约0.5cm，淡黄色，无舌状花，11月下旬到翌年1月开花。芙蓉菊是少有的天然异色叶和芳香植物，又有耐盐碱、抗风及病虫害少等特性，所以广泛应用于园林。杨海燕(2016年)以8份广义菊属野生种为实验材料，对盐胁迫下生理指标的综合分析，证明芙蓉菊是一种优异的耐盐种质；林双冀(2017年)对盐胁迫下芙蓉菊和其它4种菊属植物的解剖结构及生理指标变化研究后，表明芙蓉菊具有独特的耐盐机理。国内关于芙蓉菊的研究主要集中在药用功能及耐盐机理方面，有关育种的研究甚少。
匍地菊(Chrysanthemum yantaiense)，分布于山东烟台海滨地区。植株匍地生长，高仅10-20厘米，冠幅达2米以上，覆盖地面能力强，着花量大，是优良的匍匐和耐盐种质(Chen et al.，2018；钟剑，2018)。匍地菊参与育种对培育匍匐型耐盐小菊新品种将会发挥非常大的作用，园林开发前景广阔。
菊花生产在我国呈区域化发展，沿海和北方地区的盐碱地限制了菊花的栽培推广。利用耐盐野生种质(如芙蓉菊)进行远缘杂交从而培育具有较强耐盐性的菊花品种是菊花育种的一个重要方向。胚拯救作为克服远缘杂交障碍的重要手段在菊属植物间已有所应用，但由于芙蓉菊无舌状花、未成熟胚小且难以剥离，相关技术在芙蓉菊属中的应用并不多。利用胚拯救技术获得的芙蓉菊和匍地菊的杂种后代，一方面继承了芙蓉菊的耐盐性状，可作为遗传材料用于细胞学和分子学研究，另一方面，作为桥梁可以显著提高芙蓉菊属和菊属的杂交亲和性。
发明内容
本发明的目的是提供芙蓉菊与匍地菊的属间远缘杂种创制方法。
为了实现本发明目的，本发明提供了一种芙蓉菊与匍地菊的属间远缘杂种创制方法，其是以芙蓉菊属芙蓉菊与菊属匍地菊为亲本进行杂交，利用幼胚拯救技术获得远缘杂种。
前期研究发现，芙蓉菊做父本与匍地菊杂交，其结实率为零。因此，本发明是以二倍体芙蓉菊为母本，四倍体匍地菊为父本进行远缘杂交并通过胚拯救来创制远缘杂种。
所述方法具体包括：
1)亲本准备：对两亲本植株进行花期调控，使花期相遇；
2)远缘杂交：当父母本均开花时，母本去雄，取父本新鲜花粉进行授粉并套袋；
3)胚珠剥取：取杂交授粉后8-24天(优选18天)的头状花序，(消毒灭菌后)取出胚珠；
4)幼胚离体培养：将胚珠接种到不同激素配比的诱导培养基中进行培养，然后转入生根培养基中培养至出苗；
5)杂种F1代的获得：待幼苗根长至1cm以上，移植到基质中进行炼苗，之后上盆常规管理；
6)真杂种的筛选：根据对亲本及杂种F1代的表型观察，并结合染色体鉴定和流式细胞分析，从F1代植株中筛选出真杂种。
前述的方法，步骤1)包括：从8月份开始对母本芙蓉菊进行8-10小时的短日照养护，使其10月中旬达到盛花期，父本正常开花。
优选地，短日照人工气候室条件：湿度70-75％，白天温度24-28℃，晚上20-22℃，每天光照8-10小时，光照强度1600-2000lx。
前述的方法，步骤3)包括：取杂交授粉后的头状花序，对雌性小花进行消毒灭菌，去掉子房壁，取出胚珠。
优选地，取杂交授粉后18天的头状花序。
优选地，消毒灭菌的方法包括：用70％-75％的酒精对雌花表面消毒30-45秒，无菌水冲洗，然后用8％-13％的H2O2水溶液灭菌10-15分钟，再无菌水冲洗。
前述的方法，步骤4)中所述诱导培养基含有6-BA和NAA；所述生根培养基含有NAA。
不同杂交组合胚培养，对培养基的要求不尽相同。在其它菊花近缘属植物杂交中，有文献报道使用MS+2.0mg/L KT+1.0mg/L IAA培养基可获得栽培菊花‘钟山金桂’和黄金艾蒿的杂交后代(陈发棣，2011)；也有文献报道使用MS+0.2mg/L IAA 培养基得到木茼蒿和蒿子秆的杂交后代，但发芽率仅为12.9％(Hisao Ohtsuka，2008)。通过使用含6-BA和NAA的MS培养基进行芙蓉菊属间杂交后代胚培养进而获得愈伤组织及杂种幼苗的相关研究鲜见报道。
所述诱导培养基为含有1.0-2.0mg/L 6-BA和0.2-1.0mg/L NAA的MS培养基，pH5.0-5.8。
优选地，所述诱导培养基为含有1.5mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA、pH5.8的MS培养基；含有2.0mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA、pH5.6的MS培养基；含有2.0mg/L 6-BA和 0.5mg/L NAA、pH5.0的MS培养基；含有2.0mg/L 6-BA和1.0mg/L NAA、pH5.6的MS 培养基；或含有1.0mg/L6-BA和0.5mg/L NAA、pH5.4的MS培养基。
更优选地，所述诱导培养基为含有2.0mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA，pH5.6的MS 培养基。
所述生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA，pH5.8。
前述的方法，步骤4)中进行诱导培养和生根培养的条件为：温度20-25℃(优选 20℃)，每日光照14-16h，光照强度1600-2000lx(优选2000lx)；诱导培养4-6周后转为生根培养。
前述的方法，步骤5)中所述基质由蛭石和珍珠岩按体积比1:1混合而成。
炼苗的条件为：温度27-30℃，相对湿度60-70％，培养30-45天。
前述的方法，步骤6)所述表型选自株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长等中的至少一种。其中株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长介于父母本之间的确定为真杂种。
所述染色体鉴定(根解离染色)包括：取幼根，无菌水冲洗3-5次，转入1-2mol/LHCl溶液中，在60-80℃水浴条件下解离10-15min，用无菌水冲洗3-5次，再用蒸馏水漂洗5-8min，截取根尖白色部分，滴加改良的苯酚品红染色液(李新，2013)，染色 10-15min。
其中，幼根剪取的最佳时间为室外条件下早晨8点至9点。
所述流式细胞分析包括：以二倍体芙蓉菊作为参照，对杂交后代进行倍性水平检测。
本发明中，母本选用芙蓉菊属二倍体耐盐野生种芙蓉菊(Cr.chinense)，父本选用菊属四倍体耐盐野生种匍地菊(C.yantaiense)。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明利用具较强耐盐性的芙蓉菊为母本，具较强耐盐性和匍匐性的匍地菊为父本进行属间远缘杂交，结合幼胚拯救技术进行种质创新，创造了一批匍匐且耐盐的菊花新种质。
(二)本发明在组织培养技术上比较了不同胚胎发育时期、不同激素配比培养基下的胚发育效果。筛选出授粉后18天的幼胚发育效果最好。诱导培养基以MS添加 2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，pH5.6时效果较好，出愈率可达到59.22％，发芽率可达到17.65％。
(三)本发明使大量属间杂种胚继续发育成正常植株，有效避免了胚早衰，同时获得了大量远缘杂交后代。
(四)本发明使利用广义菊属菊花新种质进行菊花育种成为可能，同时有利于菊花起源演化及芙蓉菊属与菊属亲缘关系方面研究的展开。
附图说明
图1为本发明母本芙蓉菊(左)、父本匍地菊(中)、杂种后代(右)植株对比图。
图2为本发明较佳实施例中芙蓉菊、匍地菊及杂种后代的形态对比图。其中，A：亲本花叶对比；B：杂种后代无性扩繁；C：杂种后代与亲本形态对比。
图3为本发明较佳实施例中芙蓉菊、匍地菊及杂种后代的初生叶对比图。其中， A：阔叶毛华菊；B：匍地菊；C-Q：杂种后代。
图4为本发明较佳实施例中芙蓉菊、匍地菊及杂种后代的染色体鉴定结果。其中，A：芙蓉菊；B：匍地菊；C-P：杂种后代。
具体实施方式
本发明针对目前我国特有菊花资源育种利用率低、遗传基础狭窄、培育菊花品种耐盐性弱等问题，利用耐盐野生种芙蓉菊为母本与匍地菊杂交，通过幼胚拯救技术解决二者在远缘杂交时存在的杂种胚败育、杂交不结实等问题，最终得到芙蓉菊和匍地菊的远缘杂种后代。
本发明提供芙蓉菊与匍地菊的属间远缘杂种创制方法，包括以下步骤：
1)亲本准备：母本选用2n＝18的芙蓉菊，父本选用2n＝36的匍地菊。对芙蓉菊进行花期调整，使父母本花期相遇。
2)远缘杂交：当父母本均开花时，母本去雄，取父本新鲜花粉授粉并套袋。
3)胚珠剥取：取步骤2)杂交授粉8d、10d、12d、14d、16d、18d、20d、24d后的头状花序，在超净工作台剥取雌性小花，进行表面消毒灭菌，然后剥掉子房壁，取出胚珠。
4)幼胚离体培养：在无菌条件下，将步骤3)得到的胚珠接种到不同激素配比的诱导培养基中，培养温度20-25℃，每日光照16h，光照强度约1600-2000lx；共设置5 种培养基类型，6-BA和NAA浓度为变量，每板接种约9个胚珠。
5)生根培养：4周后转入生根培养基，1/2MS+0.1mg/L NAA，pH5.8，培养温度 20℃，每日光照16h，光照强度约2000lx。
6)杂种F1代植株的获得：待小苗根长至1cm以上，移植到基质(粗粒蛭石:珍珠岩＝1:1，体积比)中进行炼苗。一个月后，上盆常规管理。
7)杂种后代真实性鉴定：对父母本及后代材料进行形态学观察、染色体鉴定和流式细胞分析，确定杂种后代的真实性。
优选地，步骤1)所用母本材料芙蓉菊需进行花期调整，从八月份开始进行8小时的短日照养护，使其10月中旬达到盛花期。短日照人工气候室条件为湿度70-75％，白天温度24-28℃，晚上20-22℃，光照强度1600-2000lx。
优选地，步骤2)所述的授粉时间为上午9-10时或下午3-4时，同一花序重复授粉2次，每天授粉一次。
优选地，步骤2)所述套袋为授粉后套硫酸纸袋。
优选地，步骤3)所述取的是杂交授粉后生长发育8d、10d、12d、14d、16d、18d、 20d、24d的头状花序，更优选地是授粉后18d的头状花序。
优选地，步骤3)所述雌花消毒灭菌的方法为：用70％的酒精表面消毒30秒，无菌水冲洗4次，再用12％的H2O2水溶液灭菌10分钟，无菌水冲洗5次。
优选地，步骤4)所述幼胚离体培养的培养基为具有5种不同激素配比的MS培养基，6-BA与NAA浓度为变量，分别为培养基A：1.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，pH5.8；培养基B：2.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA，pH5.6；培养基C：2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，pH5.0；培养基D：2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA，pH5.6；培养基E：1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，pH5.4。
优选地，步骤5)所述生根培养基为1/2MS+0.1mg/L NAA(pH5.8)，即在1/2MS 基本培养基中添加0.1mg/L NAA，促进生根。
优选地，步骤6)所述杂种F1代植株移栽种植的方法为先开瓶炼苗2-3天，通过逐渐降低相对湿度和增强光照使小苗适应大田的自养生长和有菌环境。然后移栽到粗粒蛭石:珍珠岩＝1:1(体积比)的穴盘中，培养30天后上盆常规管理。
优选地，步骤7)包括测定株高、冠幅。叶长、叶宽、叶柄长；每株随机选择三片完全展开的叶片，进行叶长、叶宽的测定，并分别测定叶柄长。
优选地，步骤7)中染色体鉴定结果，后代染色体数目为27条，介于二倍体和四倍体之间的确定为真杂种。
优选地，步骤7)流式细胞分析以二倍体的芙蓉菊作为参照，对杂交后代进行倍性水平检测，后代为三倍体的为真杂种。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1利用不同胚龄幼胚进行胚拯救获得芙蓉菊与匍地菊的属间杂种后代
利用不同胚龄幼胚进行胚拯救获得芙蓉菊与匍地菊的属间杂种后代，包括以下步骤：
1、亲本准备：母本选用我国特产的芙蓉菊属二倍体耐盐野生种芙蓉菊(Cr.chinense)，父本选用菊属四倍体耐盐野生种匍地菊(C.yantaiense)，对芙蓉菊进行花期调整，8月份放进人工气候室进行8小时的短日照养护，10月中旬可达到盛花期；短日照人工气候室设定为湿度70％，白天温度25℃，晚上22℃，光照时间为6点-14点，光照强度1600-2000lx。
2、远缘杂交：在国家花卉工程中心小汤山苗圃，将芙蓉菊与匍地菊在温室内进行杂交。在开花前1-2天对母本进行人工去雄并套袋隔离，待柱头伸出并开叉呈现一定角度和分泌黏液时，取父本新鲜花粉授粉并套袋。于上午10时或下午4时授粉，同一花序重复授粉2次，每天授粉一次。
3、胚珠剥取：取杂交授粉后8d、10d、12d、14d、16d、18d、20d、24d的头状花序，放入冰箱短期保存。在超净工作台剥取授粉后的雌性小花，用70％的酒精表面消毒30秒，无菌水冲洗4次，再用12％的H2O2水溶液灭菌10分钟，无菌水冲洗5次。在灭菌纸上用刀切开雌性小花子房，然后剥掉子房壁，取出胚珠。
4、幼胚离体培养：在无菌条件下，将步骤3得到的胚珠接种到含有1.0-2.0mg/L 6-BA和0.2-1.0mg/L NAA，pH5.0-5.8的MS诱导培养基上，培养温度20℃，每日光照 16h，光照强度约2000lx。表1结果表明，培养授粉后8天和10天的幼胚，其出愈率为 0。在授粉后14-20天接种胚珠，其发芽率差别不大，但授粉后18天接种胚珠，其发芽率最高，为11.39％，出愈率也最高，为54.43％，因此在芙蓉菊和匍地菊的杂交组合中，授粉后18天的后代胚珠最适合进行离体培养，并最终获得25株杂种幼苗。
表1不同胚龄的幼胚对幼胚离体培养的影响
Figure BDA0002660952730000061
5、生根培养：4周后将得到的萌发幼胚转入生根培养基，1/2MS+0.1mg/LNAA，pH5.8，培养温度20℃，每日光照16h，光照强度约2000lx；观察幼胚在生根培养基中出现丛生芽的情况，直至发育成幼苗。
6、杂种F1代植株的获得：待小苗根长至1cm以上，将得到的杂种F1代植株开瓶炼苗2-3天，通过逐渐降低相对湿度和增强光照使小苗适应大田的自养生长和有菌环境。然后取出植株并洗净附着在其表面的培养基，移植到基质为粗粒蛭石:珍珠岩＝1:1 (体积比)的穴盘中。一个月后，上盆常规管理。最终获得18株芙蓉菊和匍地菊的后代植株大苗。
实施例2利用不同激素配比培养基进行胚拯救获得芙蓉菊与匍地菊的属间杂种后代
利用不同激素配比培养基进行胚拯救获得芙蓉菊与匍地菊的属间杂种后代，包括以下步骤：
1、亲本准备：母本选用我国特产的芙蓉菊属二倍体耐盐野生种芙蓉菊(Cr.chinense)，父本选用菊属四倍体耐盐野生种匍地菊(C.yantaiense)。对芙蓉菊进行花期调整，8月份放进人工气候室进行8小时的短日照养护，10月中旬可达到盛花期；短日照人工气候室设定为湿度70％，白天温度25℃，晚上22℃，光照时间为6点-14点，光照强度为1600-2000lx。
母本芙蓉菊、父本匍地菊植株对比见图1。
2、远缘杂交：在国家花卉工程中心小汤山苗圃，将芙蓉菊与匍地菊在温室内进行杂交，在开花前1-2d对母本进行人工去雄并套袋，待柱头伸出并开叉呈现一定角度和分泌黏液时，取父本新鲜花粉授粉并套袋。于上午10时或下午4时授粉，同一花序重复授粉2次，每天授粉一次。
3、胚珠剥取：取杂交授粉后的头状花序，放入冰箱短期保存，2天内接种完毕。在超净工作台剥取授粉后的雌性小花，以70％酒精表面消毒30秒，无菌水冲洗4次，再以12％H2O2水溶液灭菌10分钟，无菌水冲洗5次。在灭菌纸上用刀切开雌性小花子房，剥掉子房壁，取出胚珠。
4、幼胚离体培养：在无菌条件下，将步骤3得到的胚珠接种到MS诱导培养基中，培养温度20℃，每日光照16h，光照强度约2000lx。接种在不同6-BA、NAA(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)配比的MS培养基上。分别为培养基A：1.5mg/L 6-BA +0.5mg/L NAA，pH5.8；培养基B：2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，pH5.6；培养基 C：2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，pH5.0；培养基D：2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA， pH5.6；培养基E：1.0mg/L 6-BA +0.5mg/LNAA，pH5.4。每板接种9个左右。表2 结果表明，5种培养基中出愈率最高的为B型培养基，为59.22％，发芽率达到17.65％。实验结果表明B型培养基(pH5.6)最合适进行幼胚离体培养。
表2不同激素配比的培养基对幼胚离体培养的影响
Figure BDA0002660952730000071
Figure BDA0002660952730000081
5、生根培养：4周后将得到的萌发幼胚转入生根培养基，1/2MS+0.1mg/LNAA，pH5.8，培养温度20℃，每日光照16h，光照强度约2000lx；观察幼胚在生根培养基中出现丛生芽的情况，直至发育成幼苗。
6、杂种F1代植株的获得：待小苗根长至1cm以上时，将得到的杂种F1代植株进行2-3天的开瓶炼苗，通过逐渐降低相对湿度和增强光照使小苗适应大田的自养生长和有菌环境。取出杂种植株并洗净附着在其表面的培养基，移植到基质为粗粒蛭石: 珍珠岩＝1:1的穴盘中。一个月后，上盆常规管理。最终获得18株芙蓉菊和匍地菊的后代植株大苗。
实施例3利用形态学观察、染色体计数和流式细胞分析鉴定芙蓉菊和匍地菊的属间杂种真实性
利用形态学观察、染色体计数和流式细胞分析鉴定芙蓉菊和匍地菊的属间杂种真实性，包括以下步骤：
1.用形态学鉴定杂种真实性
1)将父母本及杂种后代于5月份露地定植，进行常规养护管理。秋季，对父母本及后代材料形态学进行观察和统计，包括：测定株高、冠幅、叶部性状。
2)每株随机选择三片完全展开的叶片，进行叶长、叶宽的测定，并分别测定叶柄的长度；其中株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长介于父母本之间的确定为真杂种。
对杂种和双亲进行表型观察：株型方面，杂交后代的株高、冠幅均介于双亲之间。叶部性状方面，杂种后代叶形更接近匍地菊，这可能跟父本提供的染色体数目更多或父本表现明显的显性相关。杂种叶质厚纸质、阔卵形、叶绿色更接近于父本匍地菊，但边缘为圆齿，可能受母本遗传物质的影响。初步判断均为真杂种后代(图 2和图3，表3)。
表3芙蓉菊、匍地菊及杂种后代的株型、叶部形态特征
Figure BDA0002660952730000082
Figure BDA0002660952730000091
注：F：芙蓉菊；YT：匍地菊。
2.杂种后代染色体鉴定
1)取芙蓉菊、匍地菊亲本及其后代进行扦插培养生根，生根基质(珍珠岩:粗粒蛭石＝1:1，体积比)。剪取新鲜幼根(室外条件下8点至9点为宜)1cm长，清洗干净后放入盛蒸馏水的离心管中，置于冰水共存条件下处理24h。转入卡诺固定液中(冰醋酸:乙醇＝1:3，体积比)；于4℃固定24h。再用95％乙醇冲洗2次，转入70％乙醇中4℃保存备用。
2)解离染色前，先用无菌水冲洗3次，转入1mol/L HCl溶液中，在60℃水浴条件下解离10min。用蒸馏水冲洗3-5次，再用蒸馏水漂洗5min。载玻片上截取根尖白色部分，滴加改良的苯酚品红染色液(李新，2013)，染色10min。盖上盖玻片，用一张滤纸盖在盖玻片上，左手固定盖玻片，右手持解剖针大头，对准根尖所在位置轻轻均匀用力，将根尖细胞敲散开。
3)光学显微镜下观察并找到分散较好的细胞，滴油换100倍油镜。每个材料观察3个根尖，每个根尖至少10个细胞。
对18株形态真杂种后代及父母本进行染色体鉴定。如果后代材料的染色体数目介于双亲之间(二倍体与四倍体杂交后代为三倍体)，即可判定其为真杂种。最后共有 13个杂交子代被鉴定为三倍体，染色体数目27条，大于母本的18条。亲本与后代染色体计数结果见图4。
3.杂种后代流式细胞分析
1)取芙蓉菊和匍地菊亲本及其后代的新生幼嫩叶1-2片，放入滴有1ml预冷细胞裂解液的培养皿中，将叶片迅速切碎(约30-60s)。再向碎片中加入1ml预冷细胞裂解液，静置1min，得到细胞悬浮液。将上述细胞悬浮液用300目尼龙网过滤，转移至流式细胞仪进样管。加入200ul 50ug/ml的PI染色液(含有终浓度为50ug/ml的Rnase A) 混匀。4℃黑暗处理20min。然后上机测定。
2)使用德国Partec流式细胞仪，以确定为二倍体的芙蓉菊作为参照，对杂交后代进行倍性水平检测。细胞裂解液的成分：EDTA-Na2(0.37224g/0.5L)， Spermine·4HCl(0.087045g/0.5L)，KCl(2.98g/0.5L)，NaCl(0.585g/0.5L)，MOPS 缓冲液(1.569g/0.5L)，PVP-10(5g/0.5L)，TritonX-100(0.5mL/0.5L)，β-巯基乙醇 (0.5mL/0.5L)。
实验结果见表4，结果表明，母本芙蓉菊与子代分离效果很明显，可以确定为真杂种。母本芙蓉菊流式荧光峰值为50，13株后代的荧光峰值介于130-170，与母本差异明显，与染色体鉴定结果相一致，即染色体数目2n＝27，可以确定为真杂种。其中 CC×CY6和CC×CY7荧光峰值有两个，初步推断为嵌合体，需进一步验证。
经过对芙蓉菊和匍地菊亲本及杂种后代的形态学观察、染色体计数和流式细胞分析，最终确定得到芙蓉菊和匍地菊杂交组合共计13株的真杂种后代。
表4芙蓉菊和匍地菊杂交组合亲本及后代流式倍性鉴定结果
Figure BDA0002660952730000101
Figure BDA0002660952730000111
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (6)

1.芙蓉菊与匍地菊的属间远缘杂种创制方法，其特征在于，以芙蓉菊属芙蓉菊与菊属匍地菊为亲本进行杂交，利用幼胚拯救技术获得远缘杂种；
以二倍体芙蓉菊为母本，四倍体匍地菊为父本进行远缘杂交；
所述方法包括：
1)亲本准备：培养两亲本使花期相遇；
2)远缘杂交：当父母本均开花时，母本去雄，取父本新鲜花粉进行授粉并套袋；
3)胚珠剥取：取杂交授粉后18天的头状花序，取出胚珠；
4)幼胚离体培养：将胚珠接种到不同激素配比的诱导培养基中进行培养，然后转入生根培养基中培养至出苗；
5)杂种F1代的获得：待幼苗根长至1cm以上，移植到基质中进行炼苗，之后上盆常规管理；
6)真杂种的筛选：根据对亲本及杂种F1代的表型观察，并结合染色体鉴定和流式细胞分析，从F1代植株中筛选出真杂种；
所述诱导培养基为含有2.0mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA，pH5.6的MS培养基；
所述生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA，pH5.8；
步骤4)中进行诱导培养和生根培养的条件为：温度20-25℃，每日光照14-16h，光照强度1600-2000lx；诱导培养4-6周后转为生根培养；
步骤5)中所述基质由蛭石和珍珠岩按体积比1:1混合而成；
炼苗条件为：温度27-30℃，相对湿度60-70％，培养30-45天。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)包括：从8月份开始对母本芙蓉菊进行8-10小时的短日照养护，使其10月中旬达到盛花期。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：取杂交授粉后的头状花序，对雌性小花进行消毒灭菌，去掉子房壁，取出胚珠。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，消毒灭菌的方法包括：用70％-75％的酒精对雌性小花表面消毒30-45秒，无菌水冲洗后，再用8％-13％的H2O2水溶液灭菌10-15分钟，然后无菌水冲洗。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤6)所述染色体鉴定包括：取幼根，用无菌水冲洗3-5次，转入1-2mol/L HCl溶液中，在60-80℃水浴条件下解离10-15min，用无菌水冲洗3-5次，再用蒸馏水漂洗5-8min，截取根尖白色部分，滴加改良的苯酚品红染色液，染色10-15min。
6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤6)所述流式细胞分析包括：以二倍体芙蓉菊作为参照，对杂交后代进行倍性水平检测；所述表型选自株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长中的至少一种。
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