CN1271915C - 利用幼胚拯救获得菊属远缘杂种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明利用幼胚拯救获得菊属远缘杂种的方法，属于生物技术育种领域。选择原产我国的菊属二倍体野生种菊花脑与栽培菊花品种六倍体“黄英”杂交，采用子房培养手段进行幼胚拯救，对获得的后代材料同时进行杂种RAPD鉴定、杂种细胞学鉴定、杂种形态学鉴定，选择扩增谱带中出现母本不具有的父本特异带或双亲均不具有的带、染色体倍性为四倍体、茎、叶、花序等形态学特征介于双亲之间、出现父本特异性状或双亲不具有的新的性状的后代材料，即为获得的种间杂交品种，实现了菊属种间远缘杂交，创造了一批新种质。

Description

利用幼胚拯救获得菊属远缘杂种的方法

一、技术领域

本发明利用幼胚拯救获得菊属远缘杂种的方法涉及原产中国的菊属野生种、栽培菊花品种用于菊花种质创新和育种的方法，属于生物技术育种领域。

二、技术背景

我国是栽培菊花的起源中心和菊属种质资源的分布中心，37种狭义菊属(Dendranthema)植物在我国分布的有22种，占60％左右，特有资源丰富，菊花近缘种属植物中含有许多栽培菊花所缺乏的优异性状，如神农香菊(D.lavandulifolum var.aromaticum)的香味，蒙菊的抗旱性，小山菊、北极菊(D.arctium)、阿尔菊(Chrysanthemum alpinum)的抗寒性。

菊花(Dendranthema×grandifiorum)原产我国，是中国十大传统名花和世界四大切花之一，国内菊花品种3000个以上，是盆栽、切花和园林地被绿化的重要花卉种类，在花卉生产中占有十分重要的地位。

菊属植物许多种间，尤其是倍数性比较接近的小花型菊花间容易杂交，这为我们将菊花近缘种属植物的优良基因导入栽培菊花，进行菊花种质创新和新品种选育成为可能。英国萨顿种子公司(Sutton Seed Co.)早在二十世纪四十年代就以栽培菊花品种与野菊杂交，育成了生长旺盛，适合作岩石植物或悬崖盆景的悬崖小菊(Boase M.R.et al.，1997)。Douzono M.等(1998)利用D.shiwogiku为亲本开展了抗病切花小菊新品种选育；Shibata M.(1988b)等利用D.pacificum与14个栽培菊品种杂交育成了抗逆型强的早花性小菊品种，De Jong，J.等(1989)又利用D.pacificum为亲本育出了系列切花小菊和盆栽商品菊。在国内，ChenJunyu等(1995)利用毛华菊、小红菊与美国引进的栽培菊花品种杂交选育出了植株低矮、花朵繁密、抗性强的地被菊新品种群；Chen Xiulan等(1995)利用菊花脑与引自荷兰的菊花品种杂交育成了耐高温的小菊新品种。与国外相比，我国有丰富的菊属植物种质资源，但在菊属种质资源的研究和开发利用方面还相当薄弱，仅有零星报道，许多物种的优良性状，特别是各种抗性基因尚未得到充分挖掘和利用，亟待重视和加强。

我国分布的特有菊属植物多数为二倍体(2n＝2x＝18)。椐研究，在不同菊属植物杂交中，当二倍体为父本与高倍性物种杂交时，花粉管太短，到达不了胚囊而完成受精(Kaneko K.)；反交时，则因杂种胚早期败育，得不到杂种(WatanabeK.)。因此，用常规杂交手段很难将这些物种中的优良基因导入栽培菊花[一般为六倍体(2n＝6x＝54)及其非整倍体]。幼胚拯救是有效克服杂种胚败育而获得远缘杂种的重要途径，但因菊属植物的未成熟胚小，难以进行切割，因此该技术在菊属研究中的应用还不多，仅Anderson(1990)和Watanabe(1977)等作过报道，Watanabe利用两个二倍体的野生菊(Ch.boreale，Ch.makinoi)和多倍体栽培菊花杂交后进行胚拯救，获得不同倍性的杂种，杂种的外部形态性状相似于多倍体，同时还得到孤雄生殖的单倍体。因此，利用原产我国的菊属野生资源，通过幼胚拯救技术获得栽培菊花品种与各种菊属野生植物种间杂种，进行菊花种质创新，将是我国菊花抗病虫育种和抗逆育种取得重要突破的关键所在。

三、发明内容

技术问题本发明的目的是针对目前菊花资源遗传基础狭窄，抗性弱这一现状，提供一套利用幼胚拯救获得菊属远缘杂种的方法，并创造一批菊属远缘杂种。达到扩大菊花基因库，引进野生种中优异的性状(基因)目标，形成一套菊花品种改良和育种的方法。

技术方案 本发明利用幼胚拯救获得菊属远缘杂种的方法，包括；

1)菊属种间杂交后代材料的获得

选择原产我国的菊属二倍体野生种菊花脑(D.nankingense)，栽培菊花品种六倍体‘黄英’于温室内进行杂交，以二倍体野生种菊花脑为母本进行人工去雄并套袋隔离，父本栽培菊花‘黄英’在舌状花微开时套袋，于上午9～10时或下午3～4时授粉，同一花序重复授粉2次；

杂交后采用子房培养手段进行幼胚拯救，接种时取杂交授粉后13～18d的头状花序，剥取边缘舌状花的子房，以75％酒精表面消毒30s后置于0.1％(质量比)的升汞溶液中灭菌5min，无菌水冲洗4～5次后用接种针将子房接入MS添加KT 2.0mg/L，IAA2.0mg/L；BA2.0mg/L，NAA2.0mg/L的培养基上，每瓶接种子房15～20个，每处理重复12～18瓶；

30d后转入继代培养，继代培养基为MS+BA1.0mg/L+NAA 0.1mg/L，得到幼苗后转入MS+BA 0.2mg/L的培养基中扩繁，在MS添加NAA 0.1mg/L的培养基上生根，培养温度20～25℃，每日光照10～12h，光照度1600～2000lx，获得菊属二倍体野生种菊花脑与栽培菊花品种六倍体‘黄英’的种间杂交后代材料。

2)菊属种间杂种的鉴定

对获得的后代材料同时进行杂种RAPD鉴定、杂种细胞学鉴定、杂种形态学鉴定，其中

在杂种RAPD鉴定时，对获得的种间杂交后代材料进行分子标记鉴定，提取父母本及后代材料的DNA，然后进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳，获得扩增谱带；

在杂种细胞学鉴定时，对后代材料进行染色体减数分裂观察；

在杂种形态学鉴定时，对杂交父母本及后代材料的形态学进行观察与统计；

选择扩增谱带中出现母本不具有的父本特异带或双亲均不具有的带、染色体倍性为四倍体、形态学特征为株高27～40cm，冠径44～60cm，分枝性中等～强，叶长4.6～6.8cm，宽3.0～4.7cm，叶裂中等～深，有托叶，茎紫色，茎及叶片上被绒毛；花序直径1.8～3.2cm，黄色，初开9月10～20日，盛开9月23日～10月15日，舌状花17～23，管状花77～116的后代材料，即为获得的菊属二倍体野生种菊花脑与栽培菊花品种六倍体‘黄英’的种间杂交种。

有益效果本发明提供的利用幼胚拯救获得菊属远缘杂种的方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

(1)本发明利用我国原产的菊属野生种，结合幼胚拯救技术进行菊花种质创新，拓宽了栽培菊花的遗传基础，引进了野生种中的优异基因，实现了菊属种间远缘杂交，创造了一批新种质。

(2)在幼胚拯救技术上比较了不同培养基、不同激素配比、不同胚龄等的效果，筛选出培养胚龄以13～18d最好，培养基以MS添加KT 2.0mg/L+IAA2.0mg/L；BA 2.0mg/L+NAA 2.0mg/L效果较好。

(3)利用RAPD技术对菊属种间杂种进行早期鉴定。

(4)利用染色体减数分裂观察方法对菊属种间杂种进行鉴定。

(5)获得了一批我国原产菊属野生种与栽培菊花的种间杂种。

(6)在本发明基础上，使利用创新的菊花种质进行菊花育种成为可能，同时可进行菊属染色体组分析、菊花起源演化及菊属亲缘关系研究。

四、附图说明

图1、菊花脑与栽培菊花‘黄英’杂交后代的RAPD鉴定

菊花脑ב黄英’杂种RAPD分析.引物：B02.1.菊花脑；2.‘黄英’；3～7.后代材料.

图2、菊花脑与栽培菊花‘黄英’杂种减数分裂染色体配对情况

菊花脑(2n＝2x＝18)ב黄英’(2n＝6x＝54)杂种减数分裂染色体配对情况(2n＝4x＝36).

图3、菊花脑与栽培菊花‘黄英’杂种及其父母本的叶、花序形态

菊花脑ב黄英’杂种及亲本的叶、花序特征.1.菊花脑；7.‘黄英’；2～6.杂种.

五、具体实施方式

本发明所提供的菊属远缘杂种幼胚拯救和杂种鉴定的方法，其实施方式如下：

1.菊属种间杂交后代材料的的获得

1.1材料选择

选择原产我国的菊属二倍体野生种菊花脑(D.nankingense)，栽培菊花品种六倍体‘黄英’(均为公知公用品种，见参考文献李鸿渐，邵建文.《中国菊花》.南京：江苏科学技术出版社，1993，4)。

1.2幼胚拯救及杂种获得

于温室内进行杂交，二倍体野生种菊花脑为母本与栽培菊花‘黄英’杂交，母本进行人工去雄并套袋隔离，父本在舌状花微开时套袋，于上午9～10时或下午3～4时授粉，同一花序重复授粉2次。杂交后采用子房培养手段进行幼胚拯救，接种时取杂交授粉后13～18d的头状花序，用镊子剥取边缘舌状花的子房，以75％酒精表面消毒30s后置于0.1％的升汞溶液中灭菌5min，无菌水冲洗4～5次后用接种针将子房接入MS添加KT 2.0mg/L，IAA 2.0mg/L；BA 2.0mg/L，NAA 2.0mg/L的培养基上，每瓶接种子房15～20个，每处理重复12～18瓶。30d后转入继代培养，以后每月继代一次，继代培养基为MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L，得到幼苗后转入MS+BA 0.2mg/L的培养基中扩繁，在MS添加NAA 0.1mg/L的培养基上生根。培养温度20～25℃，每日光照10～12h，光照度1600～2000lx。获得菊属二倍体野生种菊花脑与栽培菊花品种六倍体‘黄英’的种间杂交后代材料。

2.菊属种间杂种的鉴定

2.1杂种RAPD鉴定(方法见参考文献戴思兰等.DNA提纯方法对9种菊属植物RAPD的影响，园艺学报，1996，23(2)：169～174.)

对获得的后代材料进行早期分子标记鉴定，提取父母本及后代材料的DNA，然后进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳，当后代材料的扩增谱带中出现母本不具有的父本特异带或双亲均不具有的带时，即可判定其为真杂种，否则为假杂种。菊花脑与栽培小菊‘黄英’及其后代材料的扩增谱带见图1，其中4、5、6号单株具有父本的特异带，为真杂种；菊花脑(2n＝2x＝18)与栽培小菊‘黄英’(2n＝6x＝54)杂交后代减数分裂染色体配对情况见图2，染色体数为36的，为真杂种。

上述RAPD鉴定的方法为，每材料于不同单株上分别取新鲜嫩叶，于研钵中用液氮混合磨样。样品DNA提取参照SDS法。DNA质量的检测应用紫外分光光度计(PERKIN ELMER MBA 2000)检测，测定OD₂₆₀、OD₂₆₀/OD₂₈₀。RAPD随机引物、dNTP、Tap DNA聚合酶、琼脂糖(进口Spanish分装)均购自南京生通生物技术有限责任公司。扩增反应采用20μl反应体系：2mmol/L MgCl₂、10×buffer 2.5μl、0.2mmol/L dNTP、1mmol/L引物、1U Taq E、模板DNA 15ng、ddH₂O。反应体系于美国MJ-Research公司PTC-0100型扩增仪中进行PCR扩增，反应程序：93℃预变性3min；93℃1min，退火36℃1min，72℃2min，循环40次；延伸72℃10min。扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)电泳分离，用紫外成像系统(上海复日公司生产的FR-200紫外与可见分析装置)观察并拍照。

2.2杂种细胞学鉴定

对后代材料进行染色体减数分裂观察，如果后代材料的染色体倍性介于双亲之间(如二倍体与六倍体杂交后代为四倍体)，即可判定其为真杂种。

减数分裂研究方法为：于晴天上午8时至11时，取直径2～6mm大小的花蕾，剥去外层膜质苞片，立即用3份95％酒精：1份冰醋酸的固定液固定，于冰箱中保存备用。制片时，取出头状花序，置于60℃1N HCL中解离5～15min，席夫试剂染色至管状花呈紫红色，取管状花的花药，在45％醋酸中压片，用临时片统计染色体数和照相。

2.3杂种形态学鉴定

将杂交父母本及后代材料杂种于4月份同时定植在田间，6月起开始对杂交父母本及后代材料的形态学进行观察与统计，后代材料的茎、叶、花序等形态学特征介于双亲之间、出现父本特异性状或双亲不具有的新的性状，即可判定其为真杂种。

上述形态学鉴定的方法为，将杂交父母本及后代材料同时定植在田间，对它们进行性状观察和登记，性状登记均按李鸿渐(1993)标准(李鸿渐，邵建文.《中国菊花》.南京：江苏科学技术出版社，1993，4)进行，花色以英国皇家园艺学会的色谱为标准(Colour chart，the Royal Hort.Culture Society，London，1996)。依据杂交父母本及杂种的表现型对所得的可能的杂种植株进行鉴定。

对杂交父母本及后代材料的初步观察表明：新材料的株型、冠幅、株高、叶、花序等形态特征介于双亲之间，具有父母本综合性状；同时具备某些父本特异性状，如二倍体野生种菊花脑茎为绿色、茎、叶光滑无毛、无托叶，栽培菊花‘黄英’的茎为紫色、有托叶、茎及叶上均被绒毛，菊花脑与‘黄英’杂种表现父本‘黄英’茎紫色、有托叶、茎及叶被绒毛的特点。菊花脑与栽培小菊‘黄英’及经RAPD鉴定与形态学观察判定为真杂种的叶、花序见图3。菊花脑、栽培小菊‘黄英’及菊花脑ב黄英’组合杂种的形态特征描述如下：

菊花脑：茎直立，株高20～160cm，冠径17～46cm，分枝性中等，叶长5.8cm，宽3.0cm，叶裂浅，无托叶，茎绿色，茎及叶片上均无毛；花序直径1.7cm，黄色，花期10～11月，舌状花16，管状花108。

‘黄英’(D.morifolium‘Huangying’)：株高25cm，冠径46cm，分枝性中等，叶长6.2cm，宽4.9cm，叶裂浅，有托叶，茎紫色，茎及叶片上被绒毛；花序直径3.9cm，黄色，初开10月10日，盛开10月24日，舌状花23，管状花126。

菊花脑与‘黄英’杂种1：株高31cm，冠径47cm，分枝性强，叶长4.9cm，宽3.0cm，叶裂中等，有托叶，茎紫色，茎及叶片上被绒毛；花序直径1.8cm，黄色，初开9月10日，盛开9月23日，舌状花23，管状花77。

菊花脑与‘黄英’杂种2：株高35cm，冠径57cm，分枝性强，叶长6.8cm，宽4.1cm，叶裂中等，有托叶，茎紫色，茎及叶片上被绒毛；花序直径3.2cm，黄色，初开9月15日，盛开10月5日，舌状花21，管状花115。

菊花脑与‘黄英’杂种3：株高40cm，冠径60cm，分枝性强，叶长5.7cm，宽3.8cm，叶裂中等，有托叶，茎紫色，茎及叶片上被绒毛；花序直径2.3cm，黄色，初开9月20日，盛开10月8日，舌状花17，管状花100。

菊花脑与‘黄英’杂种4：株高29cm，冠径46cm，分枝性中等，叶长5.7cm，宽4.7cm，叶裂深，有托叶，茎紫色，茎及叶片上被绒毛；花序直径2.9cm，黄色，初开9月20日，盛开10月8日，舌状花22，管状花107。

菊花脑与‘黄英’杂种5：株高27cm，冠径44cm，分枝性中等，叶长4.6cm，宽4.0cm，叶裂深，有托叶，茎紫色，茎及叶片上被绒毛；花序直径2.7cm，黄色，初开9月20日，盛开10月15日，舌状花18，管状花116。

Claims (1)

1、利用幼胚拯救获得菊属远缘杂种的方法，包括；

1)菊属种间杂交后代材料的获得

选择原产我国的菊属二倍体野生种菊花脑，栽培菊花品种六倍体‘黄英’于温室内进行杂交，以二倍体野生种菊花脑为母本进行人工去雄并套袋隔离，父本栽培菊花‘黄英’在舌状花微开时套袋，于上午9～10时或下午3～4时授粉，同一花序重复授粉2次；

杂交后采用子房培养手段进行幼胚拯救，接种时取杂交授粉后13～18d的头状花序，剥取边缘舌状花的子房，以75％酒精表面消毒30s后置于0.1％的升汞溶液中灭菌5min，无菌水冲洗4～5次后用接种针将子房接入MS添加KT 2.0mg/L+IAA2.0mg/L或者添加BA2.0mg/L+NAA2.0mg/L的培养基上，每瓶接种子房15～20个，每处理重复12～18瓶；

30d后转入继代培养，继代培养基为MS+BA1.0mg/L+NAA 0.1mg/L，得到幼苗后转入MS+BA 0.2mg/L的培养基中扩繁，在MS添加NAA 0.1mg/L的培养基上生根，培养温度20～25℃，每日光照10～12h，光照度1 600～2 000lx，获得菊属二倍体野生种菊花脑与栽培菊花品种六倍体‘黄英’的种间杂交后代材料；

2)菊属种间杂种的鉴定

对获得的后代材料同时进行杂种RAPD鉴定、杂种细胞学鉴定、杂种形态学鉴定，其中

在杂种RAPD鉴定时，对获得的种间杂交后代材料进行分子标记鉴定，提取父母本及后代材料的DNA，然后进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳，获得扩增谱带；

在杂种细胞学鉴定时，对后代材料进行染色体减数分裂观察；

在杂种形态学鉴定时，对杂交父母本及后代材料的形态学进行观察与统计；

选择扩增谱带中出现母本不具有的父本特异带或双亲均不具有的带、染色体倍性为四倍体、形态学特征为株高27～40cm，冠径44～60cm，分枝性中等～强，叶长4.6～6.8cm，宽3.0～4.7cm，叶裂中等～深，有托叶，茎紫色，茎及叶片上被绒毛；花序直径1.8～3.2cm，黄色，初开9月10～20日，盛开9月23日～10月15日，舌状花17～23，管状花77～116的后代材料，即为获得的菊属二倍体野生种菊花脑与栽培菊花品种六倍体‘黄英’的种间杂交种。

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