CN1067511C - 引入育性恢复基因并由此制备芸苔属植物f1杂种的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用细胞融合或属间杂交将萝卜属植物的育性恢复基因引入芸苔属植物的方法，以及由此制得的芸苔属植物。本发明还提供利用来源于Kosena萝卜的CMS基因和来源于任何萝卜植物的育性恢复基因制备菜籽植物F1杂种的方法，以及由此制备的菜籽植物F1杂种。

Description

引入育性恢复基因并由此制备芸苔属植物F1杂种的方法
本发明涉及利用细胞融合或属间杂交将萝卜属植物的育性恢复基因引入CMS系芸苔属植物方法，和由此制备的芸苔属植物。本发明还涉及利用来源于Kosena萝卜的细胞质雄性不育基因和来源于任何萝卜属植物的育性恢复基因制备菜籽植物的商品化第一子代(F1)杂种的方法，以及由此制备的菜籽植物的F1杂种植物。
菜籽植物的繁育，利用所说植物的自交亲和性高的优点而把注意力放在开放式传粉的种子上。呈现显著杂种优势的F1杂种在实践中被用在大量的植物中。然而，这种方法也开始应用到菜籽植物的繁育。F1植物常常呈现出由杂种优势表现的优点。因此它具有优异的农用特性，诸如产量及抗疾病性，生长的品种具有相对均匀的特性。再者，培育者的利益由于基因特性在后代中的分离而得到保护。
已试图利用自交不亲和性或者细胞质雄性不育性(下文叫作CMS)繁育菜籽植物的F1杂种。与CMS相关的方法依据种子生产的效率和保存交配亲本的方便性而被认为是大有希望的。
在菜籽植物的F1杂种的商品化生产中用到的唯一的CMS来源于菜籽植物Polima。然而Polima产生的CMS有些问题，如高温下雄性不育性的不稳定性。因此，花粉育性能根据开花的温度来恢复。结果F1杂种缺少其均一性。在某些核背景(nuclearbackground)和Polima CMS之间发生不相容的某些情况里，所得F1杂种植株的个体小，而且不表现F1杂种的最重要特性之一-杂种优势。
发明人以前公开一种方法，可将萝卜的细胞质基因直接从其原生质体引入诸如菜籽的芸苔属植物的原生质体，该方法包括将预先用X射线辐照的来源于萝卜的原生质体与预先用含碘化合物(iodinated compound)处理过的来源于芸苔属的原生质体进行融合(日本专利公开号218530/1989)；以及另一种方法，即将萝卜的细胞质基因直接从其胞质体引入诸如菜籽的芸苔属植物的原生质体，该方法包括将来源于萝卜的胞质体与预先用含碘化合物处理过来源于芸苔属的原生质体进行融合(日本专利公开号303426/1990)。为制备F1杂种种子，两者的亲本具有育性恢复基因(Rf基因)是必要的。在上述我们以前公开的方法中，来源于萝卜的CMS基因可被引入菜籽，可是也需要引入来源于萝卜的Rf基因，因为菜籽缺少相应于所说CMS基因的Rf基因。萝卜Rf基因向菜籽植物的引入可用诸如属间杂交方法的任何公知技术来进行。然而属间杂交方法涉及各种遗传的或生理学的问题，例如杂交的不相容性，所得杂种的致死现象等等，因此，所说方法几乎不能用来得到所要求的杂种。虽然针对Tokumasu的CMS(W.Paulmann和G.Robbelen等人，Plant Breeding,100,299-309,1988)，以及Ogura的CMS(R.Pellan-delourme等人，第7届国际菜籽会议，1987)报导了利用属间杂交方法将萝卜Rf基因引入菜籽植物，它们仍未得到实际应用。关于利用细胞融合方法将萝卜基因引入菜籽植物，尚未见报导。
发明人现已发现，萝卜属植物(如萝卜(radish))的CMS和相应的Rf基因可以用来得到芸苔属植物(如菜籽(rapeseed))的商品化F1杂种，所说的品种是稳定的和高度杂种优势的。因此，利用属间杂交与一种改良的子房培养方法相结合或者利用细胞融合，可将萝卜属植物的Rf基因有效地引入芸苔属植物。
另外，发明人对繁育优异的F1杂种，避免涉及Polima的细胞质的方法所伴随的上述问题进行了研究，而且利用来自Kosena萝卜(Raphanus sativus,cv.Kosena)的CMS与来自任何萝卜植物的Rf基因共同建立了本发明，所说的Rf基因能够恢复Kosena萝卜的CMS的育性。
因此，本发明提供一种将相应于萝卜属CMS的Rf基因引入芸苔属植物的方法，以及引入了萝卜属植物Rf基因的CMS系芸苔属植物，所述方法的特征在于进行细胞融合或属间杂交。本发明还提供一种制备菜籽植物F1杂种的方法，以及由此方法制备的菜籽植物F1杂种，所述方法的特征在于进行杂交时把已引入了Kosena萝卜的CMS的菜籽CMS系用作花粉受体系，并把引入了来源于萝卜的Rf基因的菜籽育性恢复系用作花粉供体系，所述来源于萝卜的Rf基因能够恢复由来源于Kosena萝卜的CMS产生的花粉育性。
可用于本发明方法的芸苔属植物的实例包括任何引入了萝卜属植物的CMS的植物或具有正常细胞质的原种系(elite line)。优选蔓菁(Brassica napus)，更优选引入Kosena萝卜的CMS的Westar蔓菁(Brassica napus cv.Westar)或其原种系。
可用于本发明方法的萝卜属植物的实例包括任何植物品系或栽培品种，其条件是该植物含有萝卜属植物的Rf基因。本发明优选采用萝卜(Raphanus sativus)，日本Kosena萝卜(R.Sativus,cv.Kosena)和中国萝卜栽培品种Yuanhong(R.Sativus,cv.Yuanhong)以及Xinlimei(R.Sativus,cv.Xinlimei)更为优选。
按照本发明，育性恢复基因可利用细胞融合或属间杂交方法而引入CMS系芸苔属植物。
对于细胞融合而言，首先制备上述CMS系芸苔属植物和萝卜属植物的原生质体。
原生质体的制备可按照任何标准方法进行，例如，将小植株(plantlet)的胚轴或叶片切成小片，将小片于25-30℃浸在含有细胞壁消化酶(如纤维素酶或果胶酶)的等渗溶液中5-20小时。
融合纯化的原生质体可用例如聚乙二醇(PEG)方法来进行。融合方法的实例包括对称融合，即两种原生质体彼此直接融合，和不对称融合，即原生质体之一含有灭活的核以便仅仅引入特定的基因。为实现本发明的目的，后一方法是优选的。因此，将来源于萝卜属植物的原生质体用X射线(10-300KR)、γ射线、紫外光等辐照，以便使核内DNA产生某种程度的损伤。另一方面，将芸苔属植物的原生质体用2-40mM的含碘化合物(碘乙酰胺，碘乙酸等)于室温处理5-30分钟以便灭活细胞质。
然后，例如用PEG方法融合处理过的原生质体，下文将对此详述。
融合在含有6.7-50％PEG的W5溶液内进行(Plant Cell Report,3,196-198,1984；Plant Science,43,155-162,1986)。加到溶液中的原生质体的比例是3∶1-1∶3(芸苔属∶萝卜属)，加入量为总细胞密度达到1-4×106细胞/ml，于室温进行融合。可用的PEG实例包括分子量为1500的那些，可由Boehringer Mannheim等公司购得。
原生质体融合后要除去PEG，再加入合适的原生质体培养基，例如KM液体培养基(Planta,126,105-110,1975)，该培养基含有0.05-0.5mg/l的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D),0.02-0.5mg/l的萘乙酸(NAA),0.1-2.0mg/l的苄氨基嘌呤(BAP)和0.4M的葡萄糖，然后培养大约一周。向混合物加入等体积含0.1M蔗糖，0.2-3.0mg/l的2,4-D,0.02-0.5mg/l的NAA和0.1-2.0mg/l的BAP的KM培养基。当持续培养大约三周后形成大量直径为0.5-1mm的细胞团(colonies)。此时把细胞团转移到愈伤组织增生培养基，例如含有下列成分的MS固体培养基：0.5-2mg/l的2,4-D,0.1-0.5mg/l的BAP,1-5％的山梨醇，1-5％的蔗糖，0.5-2g/l酪蛋白水解物(CH)和0.5-1％琼脂(Murashige & Skoog,1962)；然后在暗光条件下培养2-3周得到绿色愈伤组织。
立即将所得愈伤组织转移到再分化培养基，例如含有下列成分的MS固体培养基：0.01-0.1mg/l的NAA,0.5-2mg/l的BAP,1-5％的山梨醇，0.5-2％的蔗糖，0.05-0.5g/l的CH和0.5-1％的琼脂，以便再生枝苗(shoot)。在本发明中，再生的枝苗进一步转移到合适的培养基中以便生根，所述培养基例如含有下列成分的MS固体培养基：0.05-0.2mg/l的NAA,0.01-0.05mg/l的BAP,1-5％的蔗糖和0.2％的Gelite(Kelco,Division of Merck & Co.,Inc.)；从而得到正常的小植株。最后，将小植株移植到用大约稀释1000倍的Hyponex(Murakami Bussan)补充的蛭石(Showa Vermiculite)中，用例如透气的Miliwrap(Milipore)而不用管帽来封口，使其生长而得到引入萝卜属Rf基因的芸苔属体细胞杂种植物。从所得杂种植物中，根据花粉育性、染色体数目等筛选出引入Rf基因的个体品种。如果需要，通过与芸苔属植物连续回交可得到形态正常，细胞学稳定，具有萝卜属植物Rf基因的芸苔属植物。
通过属间杂交引入育性恢复基因的方法如下所述。
在本发明方法中，首先进行CMS系芸苔属植物和具有相应于CMS的育性恢复基因的萝卜属植物之间的属间杂交。因此，将CMS系芸苔属的花(在栽培品种的情况下，花药应预先去雄)用萝卜属植物的花粉来受粉。
随后，收获3-10天的子房，灭菌，置于固体培养基(例如Nitsch& Nitsch(1967)琼脂板)上。培养基优选含有0.1-1g/l的酪蛋白水解物(CH)和1-10％的椰子乳(CM)。蔗糖浓度可为3-8％。优选在25±1℃的恒温箱中培养，在500-1000勒克斯荧光光照条件下，每目光照时间12-14小时。
培养2-4周后，从荚(pod)中分离长成的杂种胚，将胚植入MS培养基(Murashige & Skoog,1962)或B5培养基(Gamborg等人，1968)以便生芽，所说培养基不含激素或含0.05-0.2mg/l的苄氨基嘌呤(BAP)。将发育出叶的胚移植到培养基(含0.05-0.1mg/l的NAA和0.01-0.05mg/l的BAP的MS培养基)中以诱导根的发育，从而得到引入萝卜Rf基因的正常小植株。对未能发育出叶的胚可进行再分化，方法是捣碎胚轴，放入补充了0.1-2mg/l的NAA或吲哚乙酸(IAA),0.1-2mg/l的BAP和0.1-2g/l的CH的MS固体培养基内。当用类似于正常发芽所用的方法诱导所得枝苗发育出根时，它就长成正常的引入萝卜Rf基因的植株。
为使植物驯化(acclimatization)，可采用补充了例如稀释的Hyponex(Murakami Bussan)作为营养成分的蛭石苗床(ShowaVermiculite)。在本发明中，可利用蛭石和透气Miliwrap(Milipore)使杂种植株有效地驯化。
当所得杂种植株被用作与蔓菁(Brassica napus)，油菜(BrassicaCampestris)等连续回交的花粉亲本或母本时，可得到形态正常、细胞学稳定、具有萝卜属Rf基因的芸苔属植物。
制备菜籽植物F1杂种的方法详述如下。
本发明菜籽的F1杂种可利用繁育CMS系菜籽花粉受体系和菜籽花粉供体系来制备。每个系的制备方法如下。
制备具有Kosena萝卜的CMS的CMS系菜籽花粉受体系的方法是：先将来源于Kosena萝卜的胞质体或经辐照(X射线，γ射线，UV等)的原生质体与来源于菜籽(即蔓菁(Brassica napus))的用含碘化合物(碘乙酰胺，碘乙酸等)处理过的原生质体进行融合，然后培养融合的细胞直至生成细胞团。由细胞团再生出枝苗，以长出所需的菜籽花粉受体系(JP公开218530/1989，JP公开303426/1990等)。Kosena萝卜的CMS有优异特性，它在雄性不育方面高度稳定，不受任何因素(如温度)的影响并且永不恢复。如果需要，这种花粉受体系可进一步与一种可选的菜籽栽培品种或品系进行杂交。可用的菜籽植物的实例包括春种型菜籽栽培品种Westar(B.napus cv.Westar等)。
具有相应于Kosena萝卜CMS的Rf基因的花粉供体系的制备可用上述的CMS系，或可选的CMS系菜籽栽培品种或品系，与含有能够针对来源于Kosena萝卜的CMS使花粉育性恢复的Rf基因的萝卜植物杂交(交配)或细胞融合方法。这种花粉供体系可进一步与可选的菜籽栽培品种或品系进行杂交。从菜籽(蔓菁，基因组组成AACC)和萝卜(Raphanus sativus，基因组构成RR)获得的杂种植株的基因组组成是ACR。尽管杂交可以用菜籽(蔓菁)的回交来进行，但其他方法也可用于本发明。例如，将菜籽和萝卜的F1植株(ACR基因组)用秋水仙碱处理使染色体倍增以便得到具有基因组为AACCRR的杂种植株，然后将其与菜籽(油菜，AA基因组)杂交以促使C基因组与R基因组进行重组，从而产生具有基因组AAC′R′的植株。此外，可用菜籽和萝卜的细胞融合方法得到具有基因组为AACCRR的杂种植株。可用的萝卜的实例包括日本Kosena萝卜，中国Yuanhong萝卜(R.sativus,cv.Yuanhong)和Xinlimei萝卜(R.sativus,cv.Xinlimei)，可用的菜籽的实例是春种型菜籽栽培品种“Westar”等。
按照本发明，尽管生物学上的属(genus)不同，萝卜属植物的Rf基因可在短时间内引入CMS系芸苔属植物，方法是利用细胞融合，尤其是不对称细胞融合方法，或者利用属间杂交方法。因此，作为本发明的结果，利用来源于萝卜属的CMS使芸苔属F1杂种的繁育得到实际应用成为可能。
再者，由于本发明利用的是比常规的CMS优异的来源于Kosena萝卜的CMS，因此可得到更加优良的菜籽植物F1杂种的繁育。
附图中，图1：菜籽恢复系的繁育流程图，所述繁育包括在CMS系菜籽和中国Yuanhong罗卜栽培品种之间进行属间杂交制备F1杂种，随后用F1杂种与菜籽连续回交。
图2：引入萝卜育性恢复基因的菜籽恢复系RF88的花(c)，花粉(b)，染色体(a)的照片。
图3：菜籽CMS系SW18-3的花(a)，花器官(b)的照片。
下列实施例被用于进一步说明本发明而非对其进行限制。
实施例1通过细胞融合引入Rf基因
(1)从萝卜制备原生质体
从含Rf基因的Kosena萝卜的无菌幼苗(seedling)中收集叶片，在酶溶液中捣碎，然后于25℃置于暗处过夜。酶溶液是NN67培养基(Nitsch & Nitsch,1967)，它含有0.35M的蔗糖，0.5ml/l的2,4-D,0.5mg/l的NAA和1mg/l的BAP，并补充有：0.5％的纤维素酶R-10,2％的纤维素酶RS,0.05％的解析酶R10和0.02％的果胶糖酶(pectoriase)Y-23。
酶处理后，过滤酶溶液以除去未消化物，然后将滤液以800rpm离心10分钟，收集沉淀。将沉淀缓缓加入0.6M蔗糖溶液中，然后以800rpm离心10分钟以收集原生质体带。
(2)X射线辐照
将上述(1)中纯化的原生质体调整到106细胞/ml，然后用X射线辐照(总剂量60K伦琴)。
(3)从CMS系菜籽制备原生质体
令CMS系菜籽(Brassica napus,cv.Westar)的种子在灭菌条件下发芽。在第4-6天取出胚轴，在酶溶液中捣碎并令其在25℃于暗处静置过夜。酶溶液是包括NN67培养基(Nitsch & Nitsch,1967)的无机溶液，含有0.4M蔗糖和0.1％的MES(Dojin Kagaku)并用2％纤维素酶RS和0.01％的果胶溶酶(pectolyase)Y-23补充。酶处理后过滤酶溶液除去未消化的物质，滤液以800rpm离心10分钟，收集上层原生质体级分。
(4)碘乙酰胺处理
将在上述(3)中收集的原生质体悬浮在浓度为2×105细胞/ml的W5溶液中。向此悬液加入100mM碘乙酰胺溶液，使终浓度为10mM。令悬液于室温静置10分钟，然后以800rpm离心5分钟，收集原生质体，并用W5洗三次。
(5)细胞融合
经X射线辐照过Kosena萝卜的原生质体和已用碘乙酰胺处理的菜籽原生质体以2∶1的比率混和，得到终浓度为2×106细胞/ml的悬液。将三或四滴悬液(每滴的量为100μl)逐滴加入6cm培养皿上。静置5分钟以确保液滴内含有的细胞沉降后，向每液滴小心加入100μl含40％PEG的W5，将培养皿再静置5分钟。通过抽吸除去40％PEG后，用含13％PEG的W5和含6.7％PEG的W5类似地处理细胞。
(6)融合细胞的培养
完全吸除PEG流体。向每个培养皿中加3ml KM液体培养基，培养基含0.4M的葡萄糖，1mg/l的2,4-D,0.1mg/l的NAA和0.4ml/l的BAP；然后于低强度光照条件下于25±1℃培养。一周后加入等体积的类似于上述的KM溶液，所不同的是它含有0.1M的蔗糖来代替0.4M的葡萄糖。进一步培养2-3周后形成大量细胞团。
将这些细胞团移植到含有下列成分的MS培养基中：1mg/l的2,4-D,0.25mg/l的BAP,3％的山梨醇，2％的蔗糖，1g/l的CH和0.5％的琼脂；并令其增殖。将愈伤组织移植到含有下列成分的MS培养基中：0.2mg/l的NAA,2mg/l的BAP,3％的山梨醇，0.5％的蔗糖，0.1g/l的CH和0.6％的琼脂，诱导枝苗再生。
将再生的枝苗移植到含有下列成分的MS培养基中：1mg/l的NAA,0.01mg/l的BAP,3％的蔗糖和0.2％的Gelite，以诱导根的生成，得到正常的小植株。
将长出叶和根的小植株移植到用稀释1000倍的Hyponex补充的蛭石中，同时用透气的Miliwrap来代替管帽，以此方式很容易使体细胞杂种植株驯化。因此获得的杂种植株具有高的育性并具有与菜籽同样数目的染色体(2n=38)。
当单个植株自身授粉时，就得到形态正常、细胞学稳定、具有萝卜Rf基因的菜籽植物。当该植株进一步与CMS系菜籽植株杂交时，与标准菜籽品种作为花粉亲本进行杂交时的情况类似，可以得到足够量的F1杂种种子，所述种子具有高的杂种优势而且没有雌性不育性。
实施例2通过属间杂交引入Rf基因
将含Kosena萝卜CMS基因的CMS系菜籽植物(B.napus,CMS系)用含相应Rf基因的Kosena萝卜(R.sativus,cv.Kosena)，中国Yuanhong萝卜(R.sativus,cv.Yuanhong)和Xinlimei萝卜(R sativus,cv.Xinlimei)进行授粉。授粉4-7天后，分离子房并用0.5％的次氯酸钠灭菌10分钟。用无菌水洗涤子房三次后将它放在直径10cm的塑料盘内，每个塑料盘含有20ml琼脂培养基。培养基的制备是将White氏维他命(1943),300mg/l的CH,2％的CM和5％的蔗糖加到Nitsch & Nitsch的无机盐(1967)中并用0.6％的琼脂糖固化。在荧光强度1000勒克司每日光照14小时的条件下于25±1℃的恒温箱中进行培养。
培养一个月后观察到杂种胚的发育，此时在无菌条件下将胚从荚(pod)中分离出，并移植到含有0.1mg/lBAP的B5培养基中生芽。将那些正常生芽的移植到含有下列成分的MS培养基中：0.1mg/l的NAA,0.01mg/l的BAP,3％的蔗糖和2％的Gelite(Kelco,Division of Merck & Co.,Inc.)，诱导根的发育，然后使它长成健康的正常植株。另一方面，将未能正常长出叶子的那些进行再分化，方法是将伸出的胚轴切碎成3-5mm的小块，然后转移到含有下列成分的MS培养基上：1mg/l的BAP,0.25mg/l的NAA,500mg/l的CH,1％的蔗糖和0.6％的琼脂糖。当以类似于正常生芽所用的方式诱导根的发育时，再生枝苗长成健康的正常植物。
通过将长出叶和根的小植株移植到补充了稀释1000倍的Hyponex的无菌蛭石，并用透气的Miliwrap代替管帽，可以有效地实现植物的驯化。
按上述方法，CMS系菜籽(Brassica napus,CMS系，基因组：AACC,2n=38，黄色花)与下列萝卜的每一个杂交：Kosena萝卜(Raphanus sativus,cv.Kosena，基因组：RRfRRf,2n=18，白色花)和Yuanhong萝卜(Raphanus sativus,cv.Yuanhong；基因组：RRfRRf,2n=18，白色花)；及Xinlimei萝卜(Raphanus sativus,cv.Xinlimei，基因组：RRfRRf,2n=18，白色花)；培养总数944个子房。结果得到285个F1杂种植物体(平均生长比率=30.2％)。由于属间杂种的生长比率一般是2-5％，本发明的F1植株的生长比率显著地高。例如，通过CMS系菜籽和Yuanhong萝卜之间杂交得到的F1系(Y11-23)，其花粉育性为42.3％，基因组构成为ACRRf，染色体数为2n=28，花的颜色为白色。
将所得到的每种F1杂种用作花粉亲本或母本，与菜籽(Brassicanapus,cv.Westar)或Campestris(Brassica campestris,cv.Tobin)进行连续回交，然后根据花粉育性、雌性育性以及染色体数进行筛选。结果得到形态正常、细胞学稳定并具有萝卜Rf基因的菜籽恢复系。例如Y11-23系和菜籽之间回交得到的Y11-23W-9系(花粉育性47.0％，基因组AACCRRf,2n=42，白色花)，当它与CMS系菜籽回交时，得到：RF222系(花粉育性78.4％，基因组：AACCRf,2n=38，黄色花)和RF277系(花粉育性83.1％，基因组AACCRf,2n=38，黄色花)等。Y11-23系和菜籽回交所得Y11-23W-10系(花粉育性0.8％，基因组AACCRRf,2n=46，白花)，当它与菜籽回交时就得到：RF88系(花粉育性91.2％，基因组AACCRf,2n=38，黄花)，RF92系(花粉育性75.2％，基因组AACCRf,2n=38，黄色花)，RF94系(花粉育性79.4％，基因组AACCRf,2n=38，黄色花)和RF138系(花粉育性73.4％，基因组AACCRf,2n=38，黄色花)(见下表)。
表：引入来源于萝卜的育性恢复基因的菜籽恢复系的特性
恢复基因 花颜色  染色体数    花粉育性(％)
RF88     黄色       38          91.2
RF92     黄色       38          75.2
RF94     黄色       38          79.4
RF138    黄色       38          73.4
RF222    黄色       38          78.4
RF277    黄色       38          83.1
这些恢复系通过自身授粉很容易维持，且当它们与CMS系菜籽杂交时，所得F1杂种显示高的杂种优势。
实施例3菜籽的F1杂种的制备
(1)花粉受体系的繁育
用类似于日本专利公开303426/1990所述方法，使用来源于春种型菜籽栽培品种Westar的原生质体和含CMS的来源于Kosena萝卜的胞质体进行细胞融合。从原生质体和胞质体融合实验得到雄性不育植株。使该雄性不育植株(CMS系植株)与Westar连续回交三次而得到花粉受体系SW18-3。从下面表1可见，来源于Kosena萝卜的含CMS的SW18-3系在所有情况下都不表现花粉育性的恢复，表明所说的系在育性方面是特性稳定的。
                 表1
   生长条件  所研究的花的数目  表现育性恢复的花的数目  育性恢复率(％)
  塑料花房(15-25℃)     375       0       0
  生物人工气候室(15℃)     223       0       0
  生物人工气候室(25℃)     248       0       0
花粉受体系SW18-3的花的结构在图2和图3的照片中显示，表明无花粉发育。
(2)花粉供体系的繁育
通过花粉受体系SW18-3(CMS系植株)和中国Yuanhong萝卜杂交，以及子房和胚的培养来制备杂种植株。在所得杂种植株中，挑选恢复花粉育性的那些作为引入Rf基因的植株，然向令其与Westar回交。在所得回交第一子代植株中，挑选恢复花粉育性的那些，令其以类似方式再进行总数为6次的回交。为了得到纯合型Rf基因，将可育植物自身授粉以得到花粉供体系ESW-7R。此外，具有纯合型Rf基因的供体系可通过花粉培养制备，以得到单倍体植物，使单倍体植物自发地或用秋水仙碱转变成双倍体植物。花粉供体系ESW-7R的花的结构和花粉生育率与正常的菜籽品种(Westar)类似，后者的花粉生育率为95-98％。由于花粉供体系ESW-7R的胞质体来源于花粉受体系SW18-3的雄性不育细胞质，所以花粉供体系ESW-7R含有的Rf基因有能力完全恢复来源于Kosena萝卜的CMS。
(3)F1杂种植株的繁育
花粉受体系SW18-3(CMS系植株)和花粉供体系ESW-7R在隔离的温室中于15-25℃下生长，为的是在免受外来花粉侵入的情况下进行种子的收集，得到F1杂种种子0012-HY。将所得的F1杂种种子播种、生长，并在开花期间检验出现的雄性不育株系(strain)。结果，未检验出不育株系。另一方面，对于利用来源于Polima的CMS制备的市售F1杂种Hyola40，大约30％的株系是不育的(表2)。
               表2
生长条件 试验株系数 不育株系数 不育株系的发生率(%)
0012-HY 52 0 0
Hyola40 37 11 29.7
然后，将通过菜籽0012-HY的F1杂种与Westar交配所得的种子播种并生长，在开花期间检验花粉育性株系的出现。结果，花粉育性和不育株系之比为大约1∶3。可以证实，育性的恢复可归因于菜籽0012-HY的F1杂种具有纯合型Rf基因。
从上述结果可以预料，利用来源于Polima的CMS的花粉受体系以相对高的发生率引起育性的恢复，导致F1杂种的均一性降低。反过来，利用来源于Kosena萝卜的CMS的花粉受体系，在改善F1杂种的均一性方面被认为是有用的，这是因为没有花粉育性的恢复，这可从上述表1中明显看出。

Claims (15)

1．将萝卜属植物的CMS的育性恢复基因引入芸苔属植物的方法，其特征在于通过细胞融合或属间杂交将所述基因引入CMS系的芸苔属植物，并在F1杂种中进行育性恢复的筛选。
2．根据权利要求1的方法，其中细胞融合是如下进行的：使CMS系的芸苔属植物的原生质体与含有相应于CMS的育性恢复基因的萝卜属植物的原生质体进行融合，培养所得融合细胞以形成细胞团，  由细胞团再生植物体。
3．根据权利要求2的方法，其中融合是不对称融合。
4．根据权利要求3的方法，其中不对称融合是用经含碘化舍物处理过的CMS系芸苔属植物的原生质体，与经辐照处理过的萝卜属植物的原生质体进行的。
5．根据权利要求1的方法，其中在CMS系芸苔属植物和含相应于CMS的育性恢复基因的萝卜属植物之间进行属间杂交，然后培养胚。
6．根据权利要求5的方法，其中在培养胚后进行连续回交。
7．根据权利要求1-6中任一权项的方法，其中芸苔属植物是菜籽植物(Brassica napus)。
8．根据权利要求1-6中任一权项的方法，其中萝卜属植物是萝卜(Raphanus sativus)。
9．制备菜籽植物F1杂种的方法，其特征在于进行杂交时，用作花粉受体系的是引入Kosena萝卜的CMS的菜籽CMS系，用作花粉供体系的是根据权利要求1的方法引入来源于萝卜的育性恢复基因的菜籽育性恢复系，所述育性恢复基因能够针对来源于Kosena萝卜的CMS恢复花粉育性。
10．根据权利要求9的方法，其中利用细胞融合或属间杂交向CMS系菜籽引入来源于萝卜的育性恢复基因。
11．根据权利要求10的方法，其中细胞融合是如下进行的：使CMS系菜籽的原生质体与具有相应于CMS的育性恢复基因的萝卜原生质体融合，培养所得融合细胞形成细胞团，由细胞团再生植物体。
12．根据权利要求11的方法，其中融合是不对称融合。
13．根据权利要求12的方法，其中不对称融合是用经含碘化合物处理过的CMS系菜籽植物的原生质体，以及经辐照处理过的萝卜植物的原生质体进行的。
14．根据权利要求10的方法，其中在CMS系菜籽植物和具有相应于CMS的育性恢复基因的萝卜植物之间进行属间杂交，然后培养胚。
15．根据权利要求14的方法，其中在培养胚后进行连续回交。
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