JPH01218530A - 細胞質雑種植物の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、細胞融合方法により、直接ダイコン由来のプ
ロトプラストからその細胞質遺伝子をナタネ等のプラシ
カ属植物由来のプロトプラストに導入し、細胞質雑種植
物を製造する方法に関するものである。

（従来の技術および発明が解決しようとする問題点） 細胞質に含まれる核外遺伝子は、農業上有効な形質をも
つことが知られており、ダイコンの細胞質雄性不稔（Ｃ
ｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｍａｌｅ　５ｔｅｒｉｌ　ｉ　
ｔｙ：以下［ＣＭＳＪと略す）もその有用形質の１つで
ある。

従来、ナタネにダイコンのもつ０ＭＳ細胞質を導入する
方法が知られているが、それは戻し交配と呼ばれる方法
によるものであった。即ちダイコンを母本としてナタネ
の花粉を交配し、得られた後代を母本としてナタネ花粉
を交配する。この交配はダイコン核が消失し、ナタネ核
に置換されるまで行なわれ、最終的にダイコン細胞質と
ナタネ核をあわせもつ植物を得る方法であるが、目的と
する植物体を得るまでに長年月を必要とした。

近年、戻し交配法により得られ九〇ＭＳを有するナタネ
のプロトプラストにＸ線を照射してその核遺伝子を消失
乃至は破壊して、通常のナタネプロトプラストと融合し
て細胞質雑種を得ることが提案されているが、目的とす
る細胞質雑種植物を得るために依然として従来の戻し交
配を行っている〔プラントセルリボーツ（Ｐｌａｎｔ　
Ｃｅ１ｌ　　Ｒｅｐｏｒｔｓ　　）、　ｉ、り１−１０
／。

／Ｐｒ７）。また、戻し交配法により得られたＣＭＳを
有するナタネのプロトプラストニγ線を照射し、ヨード
酢酸処理された除草剤耐性（ｃｔｒ）を有するナタネの
プロトプラストを融合させる方法も提案されている〔セ
オレティカルアンドアプライドジェネティクス（Ｔｈｅ
ｏｒ。

ＡＩ）ｐｌ、Ｇｅｎｅｔ　　）、７３．１０２−ｒｏｌ
ｌ、／９１７）。

しかし−から、未だ直接ダイ・ン由来のプ・ドプラスト
からその細胞質遺伝子をナタネ等のブラーシカ属植物に
導入して、細胞質雑種植物を製造した例は本発明者らの
知る限りでは報告されていない。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らの検討によれば、ダイコン由来のプロトプラ
ストをＸ線照射し、これをヨード化合物処理したプラシ
カ属植物由来のプロトプラストと融合させ、それらを培
養してコロニーを形成させ、更に不定芽を形成させるこ
とにより、容易に目的とする細胞質雑種植物を得ること
が判った。

一方のプロトプラストにＸ線照射し、他方のプロトプラ
ストをヨード化合物処理し、それらを融合して非対称体
細胞雑種植物を製造する方法がプラシカ属において報告
されている〔第１０回「植物組織培養シンポジウム」講
演要旨集、第１６６頁（ｔ　ｙ　Ｉ　７　）　）　カ、
タイコ：／ドプラシカ属植物との雑種植物については記
載されていない。当該技術分野においては、植物種が異
なれば同様の処理条件を直ちには適用し得ないものであ
るが、本発明者らが各種条件について種々検討した結果
、今般初めて直接ダイコン由来のプロトプラストから、
その細胞質雑種植物を得ることに成功したものである。

即ち本発明の要旨は、Ｘ線照射したダイコン由来のプロ
トプラストとヨード化合物処理したプラシカ属植物由来
のプロトプラストとを融合させ、次いで、得られた融合
細胞を培養してコロニーを形成させ、該コロニーから植
物体を再生させることを特徴とする細胞質雑種植物の製
造方法に存する。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明で使用するダイコンとしては０ＭＳ系統などが挙
げられ、特にＵＫ−／・、コセナというコ系統が好適で
ある。

またプラシカ属植物としては春播きナタネ、秋播きナタ
ネキャベツ、ブロッコリー、カリフラクー、ハボタン等
の各栽゛培・品ｌが・°挙−建られる。

プロトプラストは常法に従い、植物体の１部を細分し、
セルラーゼやペクチナ〒ゼ等の細胞壁分解酵素を含む酵
素液中に２ｊ〜３０℃で５〜２０時間処理したのち得ら
れる。

得られたプロトプラストはポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）を含む溶液中で融合するが、融合に先立ち、ダイ
コンプロトプラストにＸ線を３０〜ＪＯＯｋレントゲン
照射し、核遺伝子を不活化する。またプラシカ属植物の
プロトプラストは、ヨードアセトアミド等のヨード化合
物２〜ｕＯｍＭでφ〜Ｊｊ”Ｃ，で５〜３０分間の条件
で処理し、プロトプラストが単独で分裂できないように
しておく。

プロトプラストを融合きせる溶液はＡ、７〜４ｃＱ％の
ＰＥＧを含むＷｊＣプラントセルリボーツ（Ｐｌａｎｔ
　　Ｃｅ１ｌ　　Ｒｅｐｏｒｔｓ　　）、ｊ　、／り４
−／りｔ。

／ｌ？Ｆりを用いた〔プラントサイエンス（’Ｐｌａｎ
ｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　）　、４ＣＪ　、　／　！ｊ−／
　＆　２　。

ｌり♂乙〕。この溶液中に両方のプロトプラストをｌ：
３ないし３：ｌの割合で合計ｌ−弘×１０６個／　ｙｔ
ｌ　　になるように混合し、室温で融合させる。この時
使用するＰＥＧはベーリンガーマンハイム社の分子量／
　ｊｏｏのＰＥＧが適している。

上述のように融合処理した細胞は、ＰＥＧを除去したの
ち、同じシオーレに培養液たとえばＫＭ液体培地〔プラ
ンタ（Ｐｌａｎｔａ　）　、　ｉｘ＆　。

１０！　−／１０．／り７ｊ）に２．弘−ジクロロフェ
ノキシ酢酸（２，≠−１））ｏ、２〜３．０■／　１１
　　ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）０，０．２〜ｏ、ｓη／
ｌｓ　ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ　）　ｏ、ｔ　−
ｘ、ｏ■／１１０、μＭグルコースを含む培地を加えて
培養する。１週間から１０日後に、この培養液に０、／
　Ｍサッカロース、２．弘−Ｄｏ、２〜３．０ｍｇ／１
％　Ｎ　Ａ　Ａ　０．０２〜Ｏ０Ｓキ／　ｔ　％　Ｂ　
Ａ　Ｐ　Ｏ，１〜２．０■／ｌを含むＫＭ培地を等量加
え、更に培養を続けると、３週間位で０．６””ＩＮＪ
Ｒ程度の直径のコロニーを形成する。本発明においては
、このコロニーを更に増殖培地、たとえば０．２　Ｍマ
ンニトール、０．７Ｍサッカロース、コ、弘−ＤＯ，２
〜Ｊ、（７■／ｌ、Ｆ３Ａｐ０．０２〜０．５■／ｌを
含むに３アガロース培地〔ツアイトシュリｌトフユアブ
フランツエンフイジオロジー（Ｚ＃Ｐｆｌａｎｚｅｎｐ
　ｈｙｓｉｏｌ、）、　７Ｊ’　、弘５３−’７３１゜
ｌり７６〕または０．２Ｍマンニトール、０．１Ｍサッ
カロース、コ、≠−Ｄ０．２〜３．０岬／ｌ、ＢＡＰθ
、０２〜０．３ｒη／ｌを含むＭＳ修正培地などに移し
て増植させる。ここで増植したコロニーは次に０．１Ｍ
マンニトール、０．０ｔＭサッカロース、インドール酢
酸（ＩＡＡ）０．ＯＪ〜０．ｊ　ｍ９／　ｔ　ｓ　ゼア
チン０．３−　ｊ、Ｏｍｅ　／　ｌ硫酸アデニン２０−
１００■／　ｔ　ｓ　カゼイン加水分解物！θ〜２００
■／ｌを含むＭＳ修正培地で再分化させる。再分化培地
に置床したカルスは、早いもので７４４日めには不定芽
を形成する。こζではカルスを０．Ｏｊ　Ｍサッカロー
ス、ＩＡＡ（７，λ〜Ｊ、０１１１ｇ／　ｔ、ゼアチン
θ、ｊ〜！、θダ／ｌを含むに３アガロース培地に２０
日〜３０日後に植え継ぐことによｐ、ｉｏ〜３Ｑ％のカ
ルスから不定芽形成を誘導することができた。

これらの不定芽は常法に従って成育させ、バーミキュラ
イト上に移植して発根させると、目的とする細胞質雑種
植物を得ることができる。

（実施例） 以下に、実施例をあげて本発明を具体的に説明する。

■　ダイコンからのプロトプラストの調製ダイコンＵＫ
−／の無菌苗から葉をとり、それを０．３６Ｍサッカロ
ース、２．４１−］）　０３ｍｙ／ｌ、　ＮＡＡ（ｌｂ
、／ＩＩ！ｇ／ｌ、　Ｔ３ＡＰＯ，１１ｎＶｔを含むＮ
Ｎ６７液体培地内できざみ、弘℃の暗所に１６時間静置
する。次いでそれを０．１チセルラーゼＲ−１０，０，
０ｊ％マセロサイムＲｉｏ、ｏ、ｏｔ％ペクトリアーゼ
Ｙ−２３，２％セルラーゼＲ８を含むＯ０弘サッカロー
ス液に移して、３０℃で！時間放置する。

この酵素液をろ過して未消化物を除去し、ろ液をｔｏ　
ｏ　ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心して沈澱物を集め、そ
れをｏ、ｔ　Ｍサッカロース液の上に静かにのせる。こ
れをｒ　００　ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心し、プロト
プラストのバンドを回収する。

■　Ｘ線照射 ■で得られたプロトプラストを７０６ｆｍ／ｍｌの濃度
に調製し、ｌ≠００レントゲン／分の線量率で約１０７
分照射し、計／　ｊＯｋレントゲンのＸ線を照射した。

■　ナタネからの調製 春播きナタネの種子を無菌的に発芽させて弘〜を日月の
下胚軸を切取り、（７，ｊＭ塩化カルシウムを含む水溶
液中で細かくきざむ。水クロースを含むＮＮ４７培地を
加え、３０℃で≠〜！時間酵素処理したのちｒ　００　
ｒ、ｐ、ｍ。

で１０分間遠心して、上層のプロトプラスト画分を回収
した。

■　ヨードアセトアミド処理 上記■で回収したプロトプラストをＷＳ溶液中で、２　
Ｘ　／　０”　　個／　ｔｕｇの濃度に懸濁し、これＩ
ｃ　／　００　ｍＭのヨードアセトアミド液を最終濃度
が／　ＯｍＭになるよう加えた。これを室温でｉｏ分間
放置し、ｒθθｒ、ｐ、ｍ、で！分間遠心分離してプロ
トプラストを集め、　Ｗｔ液で３回洗ってヨードアセト
アミド処理プロトプラストを得た。

■　細胞融合 Ｘ線照射したＵＫ−／プロドブ２ストト、ヨードアセト
アミド処理した春播きナタネブロトプラストを２：ｌの
割合で、最終濃度コＸ１０’個／扉ｌ　になるよう混合
し、１００ａｔのドロップとしてｔ　ｃｍシャーレ上に
３コ〜弘コのドロップを置いた。これらのドロップ内で
２種の細胞が沈むまで！分間放置した。次に≠１７１Ｐ
ＥＧを含むＷｊ液１００μｔを各ドロップに静かに加え
、５分間放置した。その後ＰＥＧ液を吸いとｐ、ｔｓ％
ＰＥＧを含むＷｔ液を／ＤＯμｌ加え、５分間放置した
。

／ＪｉＰＥＧ液を吸いとり、ｔ、７チＰＥＧを含むＷｔ
液１００μｔ　を加えて５分間放置した。６．７％ＰＥ
Ｇを除去したのち、０．４ｇＭグルコース、コ、グーＤ
　／　ｍｌ／　ｔ、　Ｎ　Ａ　Ａ　Ｏ，／■／ｌ、ＢＡ
ＰＯ，ダ■／ｌを含むＫＭ液体培地をシャーレに加え、
２！〜２７℃、１００〜２００１ｕｘで培養を行なった
。

■　融合細胞の培養 ■の培養液中で７日〜ＩＯ日間培養したのち、０．１Ｍ
サッカロース、２．４ｇ−［）　／■／ｌＮ　Ａ　Ａ　
Ｏ，／■／　ｔ　、　Ｂ　Ａ　Ｐ　Ｏｏｐ　ｍｙ　／　
ｔを含むＫＭ液体培地を等量加えさらに培養を続けたと
ころ、３〜４Ｌ週間で０．１　”−’　／　ｍのコロニ
ーが形成された。このコロニーヲ０．２　Ｍマンニトー
ル、０．／　Ｍサッカロース、２．≠−［）／η／１％
Ｂ　Ａ　Ｐ　Ｏ，／　ｍｙ／　ｔ、アガロースｏ、ｓ％
含むＭＳ修正培地に移し、約ｌか月培養してλ園程度に
まで増殖させた。このカルスを００２Ｍマンニトール、
０．０　Ａ　Ｍサッカロース、ＩＡ　Ａ　Ｏ１／■／１
．ゼアチン２■／　ｔ　ｓ硫酸アデニンｔＯη／　ｔ　
ｓ　カゼイン加水分解物ｉｏ。

■／ｌ、　０，６％アガロースを含むＭＳ修正培地に置
床し、不定芽形成を誘導した。カルスは約ｌか刃稜に０
．０３ｐＪｉサツカロース、ＩＡＡｏ、ｔ■／１．ゼア
チン２■／　ｔ　ｓアガロースｏ３％を含む培地に植え
継ぎ、不定芽誘導を促した。

得られた不定芽はｏ、ｔ■／ゴＢ　Ａ　Ｐ、０．１　Ｍ
サッカロース、０．ｔ％アガロースを含むＢｔ培地で成
育させ、その後ｏ、ｉ■／１ＮＡＡ。

０、／Ｍ＋ツカロース、００ｌｒ％アガロースヲ含むＭ
Ｓ培地で発根させた。植物体はノ（−ミキュライトに移
植し、さらに培地に移して育て（発明の効果） 本発明によれば、ダイコツ０ＭＳ細胞質は戻し交配の手
法を経ることなく、短期間にプラシカ属植物に導入する
ことができる。

出願人　　三菱化成工業株式会社 三菱商事株式会社 代理人　　弁理士　長谷用　　− ほか１名

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｘ線照射したダイコン由来のプロトプラストとヨ
   ード化合物処理したプラシカ属植物由来のプロトプラス
   トとを融合させ、次いで得られた融合細胞を培養してコ
   ロニーを形成させ、該コロニーから植物体を再生させる
   ことを特徴とする細胞質雑種植物の製造方法。