JP3149090B2 - 細胞質雑種植物の作成方法 - Google Patents
細胞質雑種植物の作成方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、細胞融合方法により、直接ダイコン由来の
サイトプラストからその細胞質遺伝子をナタネ等のブラ
シカ属植物由来のプロトプラストに導入し、細胞質雑種
を作成する方法に関するものである。
サイトプラストからその細胞質遺伝子をナタネ等のブラ
シカ属植物由来のプロトプラストに導入し、細胞質雑種
を作成する方法に関するものである。
（従来の技術および発明が解決しようとする問題点） 細胞質にある核外遺伝子には細胞質雄性不稔（Cytopl
asmic Male Sterility:以下CMSと略す）などの有用遺伝
子が存在することが知られている。細胞質の有用形質を
栽培品種に導入するためには、戻し交配を用いる従来法
のほかに、Ｘ線などによって核を不活化したプロトプラ
ストを用いた非対称細胞融合による細胞質雑種作成法な
どが行われている。ブラシカ属植物でも非対称融合によ
る細胞質雑種の作成が報告されている［セオレティカル
アンド アプライド ジェネティクス（Theor.Apll.G
enet.）、73、809−814（1987）；第10回植物組織培養
シンポジウム講演要旨集第166項（1987）］。しかし、
これらの報告の中で、核を不活化したにもかかわらず、
染色体の脱落が完全でないことが問題点としてあげられ
てきた。
asmic Male Sterility:以下CMSと略す）などの有用遺伝
子が存在することが知られている。細胞質の有用形質を
栽培品種に導入するためには、戻し交配を用いる従来法
のほかに、Ｘ線などによって核を不活化したプロトプラ
ストを用いた非対称細胞融合による細胞質雑種作成法な
どが行われている。ブラシカ属植物でも非対称融合によ
る細胞質雑種の作成が報告されている［セオレティカル
アンド アプライド ジェネティクス（Theor.Apll.G
enet.）、73、809−814（1987）；第10回植物組織培養
シンポジウム講演要旨集第166項（1987）］。しかし、
これらの報告の中で、核を不活化したにもかかわらず、
染色体の脱落が完全でないことが問題点としてあげられ
てきた。
近年プロトプラストを超遠心分陸することにより細胞
核のみを脱落させた脱核細胞を作成する方法が提案され
ている［フィジオロジア プランタルム（Physiol.Plan
t.）、53、385−391（1981）］。
核のみを脱落させた脱核細胞を作成する方法が提案され
ている［フィジオロジア プランタルム（Physiol.Plan
t.）、53、385−391（1981）］。
この脱核細胞はサイトプラストとよばれている。
サイトプラストを単離する方法にはタバコ及びトウモ
ロコシの培養細胞を用いて行った例がある。しかし、サ
イトプラストを得るためには培養細胞を用いなければな
らないこと、あるいは再現性よく十分な量のサイトプラ
ストが得られないことなどの理由から、上記方法はいま
だ実用化には至っていない。
ロコシの培養細胞を用いて行った例がある。しかし、サ
イトプラストを得るためには培養細胞を用いなければな
らないこと、あるいは再現性よく十分な量のサイトプラ
ストが得られないことなどの理由から、上記方法はいま
だ実用化には至っていない。
又、サイトプラストは核を持たないため、これを片親
にして細胞融合を行えば、Ｘ線処理などによる核の不活
化を行うことなくサイブリッドが得られると考えられる
が、サイトプラストを用いてサイブリッドを得たという
報告は、タバコで１例あるのみであり［モレキュラー
アンド ジェネラル ジェネティクス（Mol.Gen.Gene
t.）、185、211−215（1982）］、サイブリッドの作出
は未だ困難であるというのが現状である。
にして細胞融合を行えば、Ｘ線処理などによる核の不活
化を行うことなくサイブリッドが得られると考えられる
が、サイトプラストを用いてサイブリッドを得たという
報告は、タバコで１例あるのみであり［モレキュラー
アンド ジェネラル ジェネティクス（Mol.Gen.Gene
t.）、185、211−215（1982）］、サイブリッドの作出
は未だ困難であるというのが現状である。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らの検討によれば、ダイコンの下胚軸由来の
プロトプラストをパーコールとマニトールを用いた不連
続密度勾配遠心にかけると、再現性よくサイトプラスト
を単離することができ、これをヨード化合物処理したナ
タネのプロトプラストと融合させ、得られた融合細胞を
培養してコロニーを形成させ、更に不定芽を形成させる
ことにより、容易に目的とするサイブリッドが得られる
ことが分かった。即ち、本発明の要旨は、ダイコン由来
のサイトプラストとヨード化合物処理したブラシカ属植
物由来のプロトプラストとを融合させ、次いで得られた
融合細胞を培養してコロニーを形成させ、該コロニーか
ら植物体を再生させることを特徴とする細胞質雑種植物
の製造方法に存する。
プロトプラストをパーコールとマニトールを用いた不連
続密度勾配遠心にかけると、再現性よくサイトプラスト
を単離することができ、これをヨード化合物処理したナ
タネのプロトプラストと融合させ、得られた融合細胞を
培養してコロニーを形成させ、更に不定芽を形成させる
ことにより、容易に目的とするサイブリッドが得られる
ことが分かった。即ち、本発明の要旨は、ダイコン由来
のサイトプラストとヨード化合物処理したブラシカ属植
物由来のプロトプラストとを融合させ、次いで得られた
融合細胞を培養してコロニーを形成させ、該コロニーか
ら植物体を再生させることを特徴とする細胞質雑種植物
の製造方法に存する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明を使用するダイコンとしては、CMS系統などが
あげられ、特にUK−１及びコセナという２系統が好適で
ある。
あげられ、特にUK−１及びコセナという２系統が好適で
ある。
また、ブラシカ属植物としては、春蒔ナタネ、秋蒔ナ
タネ、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー及びハボ
タン等の各栽培品種があげられる。
タネ、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー及びハボ
タン等の各栽培品種があげられる。
先ず、サイトプラストの単離方法について述べる。
ダイコン下胚軸より、常法に従い酵素処理によってプ
ロトプラストを単離し、それらをW5液［プラント セル
リボーツ（Plant Cell Rep.）、３、196−198（198
4）］中に懸濁する。パーコールとマニトールを混合し
た各々の比重の異なる３層の溶液を重層した不連続密度
勾配を作成し、W5液中に懸濁したプロトプラストを静か
に乗せる。この３層の溶液のパーコール濃度は比重の重
いものから順に50％、20％、０％である。このチューブ
を８℃、4000r.p.m.の条件で超遠心分離機を用いて30分
遠心分離すると、プロトプラストは３層の比重の異なる
細胞群に分かれる。この内、一番上層に位置する細胞群
がサイトプラストである。これらを細胞質供与体として
細胞融合に用いる。
ロトプラストを単離し、それらをW5液［プラント セル
リボーツ（Plant Cell Rep.）、３、196−198（198
4）］中に懸濁する。パーコールとマニトールを混合し
た各々の比重の異なる３層の溶液を重層した不連続密度
勾配を作成し、W5液中に懸濁したプロトプラストを静か
に乗せる。この３層の溶液のパーコール濃度は比重の重
いものから順に50％、20％、０％である。このチューブ
を８℃、4000r.p.m.の条件で超遠心分離機を用いて30分
遠心分離すると、プロトプラストは３層の比重の異なる
細胞群に分かれる。この内、一番上層に位置する細胞群
がサイトプラストである。これらを細胞質供与体として
細胞融合に用いる。
一方、細胞質受容体として用いるブラシカ属植物のプ
ロトプラストは、常法に従って、植物体の一部を細分
し、セルラーゼやペクチナーゼ等の細胞壁分解酵素を含
む酵素液で25−30℃、５−20時間処理して得られる。得
られたプロトプラストは、ヨードアセトアミド等のヨー
ド化合物２−40mMで４−35℃、５−10分間処理し、プロ
トプラストが単独で分裂できないようにしておく。プロ
トプラストとサイトプラストを融合させる溶液として
は、40％のポリエチレングリコール（以下PEGと略す）
を含むW5液を用い、プロトプラストとサイトプラストを
1:2の割合で混合し、室温で融合させる。
ロトプラストは、常法に従って、植物体の一部を細分
し、セルラーゼやペクチナーゼ等の細胞壁分解酵素を含
む酵素液で25−30℃、５−20時間処理して得られる。得
られたプロトプラストは、ヨードアセトアミド等のヨー
ド化合物２−40mMで４−35℃、５−10分間処理し、プロ
トプラストが単独で分裂できないようにしておく。プロ
トプラストとサイトプラストを融合させる溶液として
は、40％のポリエチレングリコール（以下PEGと略す）
を含むW5液を用い、プロトプラストとサイトプラストを
1:2の割合で混合し、室温で融合させる。
上述のように融合処理した細胞は、PEGを除去したの
ち、同じシャーレにKM液体培地［プランタ（Planta）、
126、105−110（1975）］を加え、グリメリウスの方法
［フィジオロジア プランタルム（Physiol.Plant.）、
61、38−44（1984）］に従って培養し、不定芽を誘導す
る。これらの不定芽を、常法に従って生育させ、バーミ
キュライト上に移植して発根させると、目的とする細胞
質雑種植物を得ることができる。
ち、同じシャーレにKM液体培地［プランタ（Planta）、
126、105−110（1975）］を加え、グリメリウスの方法
［フィジオロジア プランタルム（Physiol.Plant.）、
61、38−44（1984）］に従って培養し、不定芽を誘導す
る。これらの不定芽を、常法に従って生育させ、バーミ
キュライト上に移植して発根させると、目的とする細胞
質雑種植物を得ることができる。
（実施例） 以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
１） ダイコンからのサイトプラストの調製 ダイコン（コセナ）の下胚軸を発芽後５−７日目の植
物より切り取り、２％セルラーゼRS、0.5％マセロザイ
ムＲ−10、及び0.05％ペクトリアーゼＹ−23を含む0.4M
サッカロース液中で細かく刻み、そのまま25℃で16時間
放置する。この酵素液から常法に従い、プロトプラスト
を調製する。
物より切り取り、２％セルラーゼRS、0.5％マセロザイ
ムＲ−10、及び0.05％ペクトリアーゼＹ−23を含む0.4M
サッカロース液中で細かく刻み、そのまま25℃で16時間
放置する。この酵素液から常法に従い、プロトプラスト
を調製する。
２） サイトプラストの調製 先ず、比重の異なる３種類の溶液を調製する。それら
は、１）0.9Mマニトールと、パーコール（Pharmacia
製）を1:1の割合で混合したもの、２）0.6Mマニトール
とパーコールを4:1の割合で混合したもの、３）0.6Mマ
ニトール、である。これらの日立社製の超遠心機SCP70
のスイングローターRPS−55T用の遠心チューブ内に、下
層より１）、２）、３）、の順に各1mlずつ静かに重層
する。先に調製しておいたプロトプラストをW5液中に10
5個/mlの濃度になるように懸濁し、それを上記の遠心チ
ューブの最上に静かに重層後８℃、40000r.p.m.の条件
で30分間遠心分離する。
は、１）0.9Mマニトールと、パーコール（Pharmacia
製）を1:1の割合で混合したもの、２）0.6Mマニトール
とパーコールを4:1の割合で混合したもの、３）0.6Mマ
ニトール、である。これらの日立社製の超遠心機SCP70
のスイングローターRPS−55T用の遠心チューブ内に、下
層より１）、２）、３）、の順に各1mlずつ静かに重層
する。先に調製しておいたプロトプラストをW5液中に10
5個/mlの濃度になるように懸濁し、それを上記の遠心チ
ューブの最上に静かに重層後８℃、40000r.p.m.の条件
で30分間遠心分離する。
遠心分離後チューブを取り出すと、プロトプラストは
３層に分画されている。この３層のうち、最上層にサイ
トプラスト画分が位置している。この最上層をパスツー
ルピペットで静かに吸い取り、W5液に懸濁し、800r.p.
m.、５分の条件でサイトプラストを洗ったのち、直ちに
融合操作に移す。このとき、サイトプラストを長時間
（10分以上）放置しておかないようにする。
３層に分画されている。この３層のうち、最上層にサイ
トプラスト画分が位置している。この最上層をパスツー
ルピペットで静かに吸い取り、W5液に懸濁し、800r.p.
m.、５分の条件でサイトプラストを洗ったのち、直ちに
融合操作に移す。このとき、サイトプラストを長時間
（10分以上）放置しておかないようにする。
３） 葉肉プロトプラストの調製及びヨードアセトアミ
ド処理 春蒔ナタネの無菌苗から葉を取り、常法に従ってプロ
トプラストを調製する。葉肉プロトプラストは、W5液に
２×105個/mlの濃度で懸濁し、これに100mMのヨードア
セトアミド液を最終濃度が5mMになるように加え、室温
で、10分間放置したのち、800r.p.m.で５分間遠心分離
してプロトプラストを集め、その後W5液で２回洗ってヨ
ードアセトアミド処理プロトプラストを得た。
ド処理 春蒔ナタネの無菌苗から葉を取り、常法に従ってプロ
トプラストを調製する。葉肉プロトプラストは、W5液に
２×105個/mlの濃度で懸濁し、これに100mMのヨードア
セトアミド液を最終濃度が5mMになるように加え、室温
で、10分間放置したのち、800r.p.m.で５分間遠心分離
してプロトプラストを集め、その後W5液で２回洗ってヨ
ードアセトアミド処理プロトプラストを得た。
４） 細胞融合 ヨードアセトアミド処理した葉肉プロトプラストと単
離したサイトプラストを1:2の割合で最終濃度２×106個
/mlになるように混合し、その混合液を100μｌのドロッ
プとして6cmシャーレに３−４個のドロップをおいた。
これらのドロップ内で、２種の細胞が沈むまで５分間放
置した。次に、40％のPEGを含むW5液50μｌを各ドロッ
プに加え、５分放置した。その後、PEG液を吸い取り、1
3％PEGを含むW5液を50μｌ加え、５分放置した。13％PE
Gを吸い取り、0.7％PEGを加え、５分放置した。6.7％PE
Gを吸い取り、0.4Mグルコース、2,4−ジクロロフェノキ
シ酢酸（以下2,4−Ｄと略す）1mg/、ナフタレン酢酸
（以下NAAと略す）0.1mg/、ベンジルアミノプリン
（以下BAPと略す）0.4mg/を含むKM液体培地をシャー
レに加え、25−27℃、100−200luxで培養を行った。
離したサイトプラストを1:2の割合で最終濃度２×106個
/mlになるように混合し、その混合液を100μｌのドロッ
プとして6cmシャーレに３−４個のドロップをおいた。
これらのドロップ内で、２種の細胞が沈むまで５分間放
置した。次に、40％のPEGを含むW5液50μｌを各ドロッ
プに加え、５分放置した。その後、PEG液を吸い取り、1
3％PEGを含むW5液を50μｌ加え、５分放置した。13％PE
Gを吸い取り、0.7％PEGを加え、５分放置した。6.7％PE
Gを吸い取り、0.4Mグルコース、2,4−ジクロロフェノキ
シ酢酸（以下2,4−Ｄと略す）1mg/、ナフタレン酢酸
（以下NAAと略す）0.1mg/、ベンジルアミノプリン
（以下BAPと略す）0.4mg/を含むKM液体培地をシャー
レに加え、25−27℃、100−200luxで培養を行った。
５） 融合細胞の培養 ４）の培養液中で７日〜10日間培養したのち、0.1Mサ
ッカロース、2,4−D1mg/、NAA0.1mg/、BAP0.4mg/
を含むKM液体培地を等量加えさらに培養を続けたとこ
ろ、３〜４週間で0.5〜1mmのコロニーが形成された。こ
のコロニーを0.2Mマンニトール、0.1Mサッカロース、2,
4−D1mg/、BAP0.1mg/、アガロース0.5％含むMS修正
培地に移し、約１か月培養して2mm程度にまで増殖させ
た。このカルスを0.2Mマンニトール、0.06Mサッカロー
ス、インドール酢酸（以下IAAと略す）0.1mg/、ゼア
チン2mg/、硫酸アデニン80mg/、カゼイン加水分解
物100mg/、0.6％アガロースを含むMS修正培地に置床
し、不定芽形成を誘導した。カルスは約１か月後に0.03
Mサッカロース、IAA0.1mg/、ゼアチン2mg/、アガロ
ース0.8％を含む培地に植え継ぎ、不定芽誘導を促し
た。
ッカロース、2,4−D1mg/、NAA0.1mg/、BAP0.4mg/
を含むKM液体培地を等量加えさらに培養を続けたとこ
ろ、３〜４週間で0.5〜1mmのコロニーが形成された。こ
のコロニーを0.2Mマンニトール、0.1Mサッカロース、2,
4−D1mg/、BAP0.1mg/、アガロース0.5％含むMS修正
培地に移し、約１か月培養して2mm程度にまで増殖させ
た。このカルスを0.2Mマンニトール、0.06Mサッカロー
ス、インドール酢酸（以下IAAと略す）0.1mg/、ゼア
チン2mg/、硫酸アデニン80mg/、カゼイン加水分解
物100mg/、0.6％アガロースを含むMS修正培地に置床
し、不定芽形成を誘導した。カルスは約１か月後に0.03
Mサッカロース、IAA0.1mg/、ゼアチン2mg/、アガロ
ース0.8％を含む培地に植え継ぎ、不定芽誘導を促し
た。
得られた不定芽は0.1mg/BAP、0.1Mサッカロース、
0.8％アガロースを含むB5培地で成育させ、その後0.1mg
/NAA、0.1Mサッカロース、0.8％アガロースを含むMS
培地で発根させた。植物体はバーミキュライトに移植
し、さらに培地に移して育てた。
0.8％アガロースを含むB5培地で成育させ、その後0.1mg
/NAA、0.1Mサッカロース、0.8％アガロースを含むMS
培地で発根させた。植物体はバーミキュライトに移植
し、さらに培地に移して育てた。
得られた植物は染色体数が2n＝38（菜種型）を示し、
それらの50％がCMS型のミトコンドリアDNAを持ってい
た。
それらの50％がCMS型のミトコンドリアDNAを持ってい
た。
（発明の効果） 本発明によれば、ダイコンCMS細胞質は戻し交配の手
法を経ることなく、短期間でブラシカ属植物に導入する
ことができる。
法を経ることなく、短期間でブラシカ属植物に導入する
ことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 今村 順 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 株式会社植物工学研究所内 (56)参考文献 特開 昭64−20041（ＪＰ，Ａ) 育種学雑誌 第36巻［別２ ］（1986），ｐ．106−107 育種学雑誌 第37巻［別１ ］（1987），ｐ．280−281 育種学雑誌 第38巻［１］（1988）, ｐ．43−52 鎌田博 外１名著「植物のバイオテク ノロジー」中公新書787，ｐ．143−154
Claims (1)
- 【請求項１】ダイコンの下胚軸由来のサイトプラストと
ヨード化合物処理したブラシカ属植物由来のプロトプラ
ストとを融合させ、次いで得られた融合細胞を培養して
コロニーを形成させ、該コロニーから植物体を再生させ
ることを特徴とする細胞質雑種植物の作成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12397089A JP3149090B2 (ja) | 1989-05-17 | 1989-05-17 | 細胞質雑種植物の作成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12397089A JP3149090B2 (ja) | 1989-05-17 | 1989-05-17 | 細胞質雑種植物の作成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02303426A JPH02303426A (ja) | 1990-12-17 |
| JP3149090B2 true JP3149090B2 (ja) | 2001-03-26 |
Family
ID=14873822
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12397089A Expired - Fee Related JP3149090B2 (ja) | 1989-05-17 | 1989-05-17 | 細胞質雑種植物の作成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3149090B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL194904C (nl) * | 1993-07-14 | 2003-07-04 | Sakata Seed Corp | Mannelijke steriele plant. |
| JPH0775558A (ja) * | 1993-09-08 | 1995-03-20 | Chikyu Kankyo Sangyo Gijutsu Kenkyu Kiko | 微細藻類のスクリーニング方法 |
| WO2001070939A1 (en) * | 2000-03-22 | 2001-09-27 | Icon Genetics, Inc. | Methods for transforming plant plastids and making transplastomic plants |
| ES2547068T3 (es) | 2005-10-26 | 2015-10-01 | Sakata Seed Corporation | Planta híbrida citoplasmática perteneciente al género Lactuca y método para la producción de la misma |
| CN109370977A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-02-22 | 青岛袁策集团有限公司 | 一种分离纯化水稻原生质体的方法 |
-
1989
- 1989-05-17 JP JP12397089A patent/JP3149090B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 育種学雑誌 第３６巻［別２］（１９８６），ｐ．１０６−１０７ |
| 育種学雑誌 第３７巻［別１］（１９８７），ｐ．２８０−２８１ |
| 育種学雑誌 第３８巻［１］（１９８８），ｐ．４３−５２ |
| 鎌田博 外１名著「植物のバイオテクノロジー」中公新書７８７，ｐ．１４３−１５４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02303426A (ja) | 1990-12-17 |
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