ES2547068T3

ES2547068T3 - Planta híbrida citoplasmática perteneciente al género Lactuca y método para la producción de la misma

Info

Publication number: ES2547068T3
Application number: ES06822425.2T
Authority: ES
Inventors: Shingo Horiuchi
Original assignee: Sakata Seed Corp
Current assignee: Sakata Seed Corp
Priority date: 2005-10-26
Filing date: 2006-10-20
Publication date: 2015-10-01
Anticipated expiration: 2026-10-20
Also published as: AU2006307069A1; KR20080063418A; JP4139429B2; EP1950290A1; AU2006307069B2; US20100077499A1; EP2944692A1; CN101522896A; KR101106932B1; EP1950290B1; WO2007049730A1; BRPI0618023A2; AU2006307069C1; US8058505B2; EG26029A; JPWO2007049730A1; CN101522896B; EP1950290A4

Abstract

Planta cíbrida del género Lactuca, progenie de la misma, o parte de la misma, que comprende, en el citoplasma de la misma, un gen derivado de las mitocondrias de una planta del género Helianthus y que tiene esterilidad masculina citoplasmática, en la que la planta cíbrida se produce mediante un método caracterizado porque comprende: fusionar protoplastos de una planta del género Helianthus con protoplastos de una planta del género Lactuca; cultivar una o más de las células fusionadas; y en la que la etapa de cultivo de las células fusionadas comprende cultivar las células fusionadas en un medio líquido; y luego añadir goma gelán al medio y continuar con el cultivo, en la que la goma gelán se añade a los de 3 a 7 días tras el inicio del cultivo y regenerar una planta del género Lactuca a partir de células cultivadas de una o más de las células fusionadas.

Description

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CaCl2·2H2O: 2.000 mg/l

KCl: 250.000 mg/l

MES: 700 mg/l

pH: 5,6

Entonces, se realiza de manera deseada un tratamiento de inactivación para impedir la división celular de los protoplastos de la planta del género Lactuca. El tratamiento de inactivación puede llevarse a cabo mediante la suspensión de los protoplastos en una disolución de sales CPW, etc. que contiene compuestos de yodo tales como ácido yodoacético y yodoacetamida. En la presente invención, el tratamiento de inactivación se lleva a cabo preferiblemente mediante la suspensión de los protoplastos en una disolución CPW que contiene yodoacetamida a de 5 a 30 mM de concentración, e incubación durante de 5 a 20 minutos.

Entonces, los protoplastos se lavan preferiblemente con la disolución S de 1 a 3 veces mediante centrifugación. Los protoplastos se purifican adicionalmente mediante centrifugación en gradiente de densidad, etc., porque fragmentos de recipientes y células contaminan la suspensión de protoplastos. Puede usarse azúcar, coloide sintético, etc., como reactivo en la purificación. En la presente invención, se usa preferiblemente una disolución de sacarosa, y más preferiblemente se usa una disolución de sacarosa a del 15 al 20%. Tras la purificación de los protoplastos, se mide la densidad celular con un hemocitómetro, y el volumen de la suspensión se ajusta con la disolución S para que tenga una densidad celular adecuada para la fusión de protoplastos. Las densidades celulares preferidas de la suspensión de protoplastos son de 1 x 105 a 1 x 107 células/ml, y la disolución S se usa preferiblemente para ajustar el volumen.

(ii) Aislamiento de protoplastos de una planta del género Helianthus

Puede usarse una planta del género Helianthus como material donador para proporcionar el citoplasma en la presente invención. En el género Helianthus, se prefiere particularmente Helianthus annuus L., que es una variedad cultivada de girasol, o una línea de sustitución citoplasmática de H. annuus L. con citoplasma de H. petiolaris, H. argophyllus, H. debilis, H. decapetalus, H. giganteus, H. rigidus, H. salicifolius, H. anomalus, H. bolanderi, H. exilis,

H. maximiliani, H. neglectus, H. praecox o H. tuberosus.

La planta del género Helianthus usada en la presente invención es una línea con esterilidad masculina citoplasmática.

De manera convencional, se han producido muchas líneas con esterilidad masculina citoplasmática en H. annuus L. Se sabe que se derivan de mutaciones naturales o la progenie de diversas hibridaciones interespecíficas en especies cultivadas. En particular, se conocen líneas con esterilidad masculina citoplasmática derivadas de mutantes naturales de H. annuus L., o diversas líneas de sustitución citoplasmática de H. annuus L., yse ha mostrado su divergencia usando técnicas de biología molecular (documento no de patente 10). Por tanto, ya se han obtenido muchas líneas de sustitución citoplasmática que presentan esterilidad masculina citoplasmática. En la presente invención, diversas líneas de sustitución citoplasmática del género Helianthus pueden usarse como material donador para proporcionar el citoplasma.

Para obtener una planta cíbrida del género Lactuca con esterilidad masculina citoplasmática según la presente invención, se usan plantas del género Helianthus que tienen un gen de esterilidad masculina citoplasmática como material donador para proporcionar el citoplasma. Cuando se fusionan protoplastos de una planta del género Helianthus y protoplastos de una planta del género Lactuca, las líneas que expresan esterilidad masculina citoplasmática pueden obtenerse como resultado de la recombinación o redisposición entre los genomas mitocondriales de esas plantas. Las plantas híbridas resultantes del género Lactuca que tienen esterilidad masculina citoplasmática también están englobadas por la presente invención.

La inactivación del genoma nuclear también puede realizarse mediante irradiación a las células de las plantas del género Helianthus que se usan en la fusión de protoplastos. Como resultado de la inactivación del genoma nuclear en las células del género Helianthus, la regeneración tras la fusión de células del género Helianthus y el género Lactuca se produce sin ninguna influencia del genoma nuclear en la planta del género Helianthus, pero con la capacidad de rediferenciación del genoma nuclear del género Lactuca, se hace posible la regeneración de una planta del género Lactuca que tiene los genes citoplasmáticos de la planta del género Helianthus.

En la presente invención, diversas plantas materiales del género Helianthus pueden elegirse como células donadoras para proporcionar el citoplasma, tal como se describió anteriormente, y es posible producir plantas cíbridas del género Lactuca con diversos contextos genéticos.

Para preparar protoplastos de una planta del género Helianthus, en primer lugar se corta un tejido celular de la planta del género Helianthus en trozos finos, y se empapan con una disolución enzimática para el aislamiento de protoplastos, para aislar los protoplastos. El tejido celular que va a usarse es preferiblemente hipocótilo, debido al alto rendimiento y la robustez de la membrana celular, pero pueden usarse otros tejidos tales como hoja y tallo como

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material. Las enzimas de digestión de pared celular no se limitan a enzimas particulares, sino que puede ser cualquier enzima que pueda usarse para digerir una pared celular vegetal; se usa preferiblemente la combinación de Driserase y Maserozyme R-10 en la presente invención. Además, las enzimas de digestión de pared celular se usan preferiblemente en una disolución cuya presión osmótica se ajusta con sales inorgánicas tales como KCl y NaCl, porque los protoplastos aislados de hipocótilo en la planta del género Helianthus tienen bajas densidades relativas. Por ejemplo, se usa preferiblemente la disolución S en la presente invención. Preferiblemente, el tratamiento enzimático se realiza a de 25 a 30ºC durante de 8 a 20 horas sin movimiento. Los protoplastos aislados mediante el tratamiento enzimático se filtran a través de malla de nailon con el tamaño de poro de 30 a 100 m. Debido a que no se requieren los genes nucleares en los protoplastos derivados de la planta del género Helianthus, los genes nucleares en los protoplastos aislados se inactivan de manera deseada mediante irradiación. La irradiación no se limita a una clase particular, sino que puede ser de cualquier clase que pueda inactivar genes nucleares, incluyendo rayos X, rayos gamma y ultravioleta, etc. Preferiblemente, la cantidad de irradiación es la menor en el intervalo que es suficiente para inactivar los núcleos. Por ejemplo, las cantidades preferidas de irradiación son de 0,1 a 0,6 Gy de rayos X blandos en la presente invención.

(2): Tratamiento de fusión de protoplastos

Entonces, se fusionan los protoplastos de las dos clases que recibieron el tratamiento de inactivación tal como se describió anteriormente. El método de fusión no se limita a métodos particulares, sino que puede ser uno de los métodos conocidos de manera pública incluyendo electrofusión (Plant, 151, 26-32, 1981), método con PEG (Plant, 120, 215-227, 1974) y método con dextrano (Jap. J. Genet., 50, 235, 1975), etc. En la presente invención, se usa preferiblemente un método con PEG modificado.

(3): Cultivo de células híbridas fusionadas

Se cultivan preferiblemente las células que recibieron el tratamiento de fusión en un medio adecuado para cultivar protoplastos de una planta del género Lactuca. Se conocen muchos métodos para cultivar protoplastos de una planta del género Lactuca, y puede usarse adecuadamente cualquier método en la presente invención. En particular, se usa preferiblemente un método modificado de un método conocido de manera pública (Nishio, T., et al., Japanese Journal of Breeding, 38,165-171) en la presente invención. El método de Nishio et al. es un excelente método que es eficaz para cultivar protoplastos de plantas del género Lactuca. Sin embargo, este método de Nishio et al. no es aplicable a la presente invención sin ninguna modificación. Nishio et al. notificaron el cultivo de protoplastos de una única planta del género Lactuca, y esos protoplastos no recibieron ningún tratamiento de fusión y, por tanto, tenían un pequeño daño en su membrana celular. Esto hizo posible cultivar esos protoplastos sobre un medio sólido que contenía goma gelán desde el comienzo del cultivo. En la presente invención, la membrana celular de células que van a cultivarse tras el tratamiento de fusión es frágil debido al estrés del tratamiento. Por tanto, es difícil cultivar células fusionadas eficazmente en el método de Nishio et al., porque esas células se rompen cuando se mezclan con goma gelán. Por consiguiente, se cultivan las células tras el tratamiento de fusión en primer lugar en un medio líquido que no contiene goma gelán para facilitar la restauración de la membrana celular antes de añadir goma gelán al medio tras de 3 a 7 días de cultivo. Esta modificación del método de Nishio et al. permite el cultivo eficaz de células fusionadas. Las células fusionadas se hacen pasar de manera adecuada a un nuevo medio con presión osmótica disminuida porque forman microcallos a través de divisiones celulares repetidas.

(4): Regeneración de plantas a partir de microcallos

Cuando los microcallos han crecido hasta varios milímetros de tamaño, se transfieren a medio de rediferenciación y se permite que se regeneren. Las respuestas al medio de rediferenciación pueden diferir dependiendo de la planta material del género Lactuca y el estado de los microcallos. Por ejemplo, es adecuado usar medio MS (Murasige, T. & Skoog, Physiol. Plant., 15, 473-497 (1962)) que contiene de 0,3 a 1,0 mg/l de BA o un medio similar. Los brotes regenerados se transfieren a un medio de enraizado, por ejemplo medio MS de 1/2 de concentración, que permite que se regeneren para dar una planta. Las plantas regeneradas se plantan en un invernadero tras la aclimatación.

(5): Selección de planta cíbrida

Se extrae ADN de hojas de las plantas regeneradas según el procedimiento descrito anteriormente, y las plantas del género Helianthus y el género Lactuca se usan como plantas materiales. Por ejemplo, pueden distinguirse plantas cíbridas en las que se introducen los genes mitocondriales de H. annuus L. mediante el uso de PCR para detectar los genes mitocondriales específicos para H. annuus L., tales como orf522, orf708 u orf873 como marcador. En primer lugar, se diseñan cebadores que amplifican específicamente el gen diana para realizar la PCR. Entonces, se realiza electroforesis para confirmar el tamaño de banda esperado. De esta manera, pueden seleccionarse los individuos con una planta del género Lactuca y el ADN mitocondrial de una planta del género Helianthus introducido en la planta. Además, puede usarse PCR-RFLP (Tsumura, Y., Yoshimura, K. Tomaru, N. et al., Theor. Appl. Genet. 91, 1222-1236, 1995) para detectar el ADN mitocondrial de la planta del género Helianthus distinguiéndolo del ADN mitocondrial de la planta del género Lactuca.

De manera deseada, también se usa PCR-RFLP para confirmar que los cloroplastos de las plantas cíbridas

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esterilidad masculina citoplasmática pueden usarse como planta semillera parental para producir semillas F1.

Más preferiblemente, pueden crearse plantas semilleras parentales con esterilidad masculina citoplasmática en corto tiempo mediante el uso de las plantas cíbridas con esterilidad masculina citoplasmática del género Lactuca producidas mediante la presente invención como material donador para proporcionar el citoplasma, y mediante la realización de fusión asimétrica de protoplastos entre el material donador y una lechuga de interés. Tal fusión asimétrica de protoplastos provoca, por ejemplo, recombinación o redisposición del genoma mitocondrial, y pueden seleccionarse líneas que mantienen la esterilidad masculina citoplasmática y que incluyen un citoplasma que tiene mayor compatibilidad con el gen nuclear de la lechuga.

Además, el citoplasma de las plantas cíbridas con esterilidad masculina citoplasmática del género Lactuca producidas mediante la presente invención también pueden introducirse en otras especies del género Lactuca. Se conocen aproximadamente 100 especies silvestres de plantas del género Lactuca, y la variedad de lechuga cultivada L. sativa puede cruzarse con 9 especies silvestres en la subsección Lactuca: L. serriola, L. aculeate, L. scarioloides, L. azerbaijanica, L. georgica, L. dregeana, L. altaica, L. saligna, y L. virosa (documento de patente 17).

Si pueden cruzarse, las sustituciones del citoplasma y el núcleo pueden lograrse fácilmente mediante una técnica de reproducción convencional de retrocruzamiento sucesivo para crear combinaciones novedosas de citoplasma y núcleo (sustitución nuclear). Por tanto, puede introducirse fácilmente un citoplasma que expresa esterilidad masculina citoplasmática en estas especies silvestres o híbridos interespecíficos mediante cruzamiento de los mismos con una planta cíbrida con esterilidad masculina citoplasmática del género Lactuca producida mediante la presente invención. Además, el alcance de aplicabilidad puede ampliarse mediante el cultivo de óvulos y embriones. Además, en el género Lactuca, se han creado muchos híbridos somáticos con especies silvestres mediante fusión de protoplastos con el propósito de introducir rasgos útiles de las especies silvestres (por ejemplo, documento de patente 17; Plant cell reports 9: 531-534 (1991); y documento no de patente 18). Tales especies silvestres incluyen, por ejemplo, L. tatarica, L. virosa, L. indica, L. debilis, etc., y puede introducirse el citoplasma de las plantas cíbridas con esterilidad masculina citoplasmática del género Lactuca producidas mediante la presente invención en muchas de las especies silvestres del género Lactuca y sus híbridos interespecíficos usando estas técnicas de fusión de protoplastos. La introducción del citoplasma puede realizarse más eficazmente mediante irradiación e inactivación de los núcleos de las plantas cíbridas con esterilidad masculina citoplasmática del género Lactuca producidas mediante la presente invención, y usando las mismas como células donadoras de citoplasma para realizar la fusión asimétrica de protoplastos. Por tanto, puede introducirse el citoplasma de las plantas cíbridas con esterilidad masculina citoplasmática del género Lactuca producidas mediante la presente invención en muchas plantas del género Lactuca usando técnicas convencionales tales como retrocruzamiento sucesivo y técnicas de fusión de protoplastos. De manera conveniente, también puede introducirse esterilidad masculina citoplasmática en una planta híbrida interespecífica del género Lactuca en la que se han introducido genes útiles de especies silvestres.

Por consiguiente, puede lograrse la producción eficaz de semillas F1 de plantas del género Lactuca mediante el uso de, como planta semillera parental, una planta cíbrida con esterilidad masculina citoplasmática del género Lactuca producida mediante la presente invención, o la progenie que se crea o se produce a partir de la planta pertinente mediante los procedimientos descritos anteriormente; cruzándolas con una planta con la que puede cruzarse del género Lactuca como planta polinífera parental; y recogiendo las semillas de la primera generación filial producidas por la planta semillera parental tras el cruzamiento. El método de cruzamiento no se limita a ningún método particular, sino que puede ser cualquier método convencional que permita la polinización de polen de la línea polinífera parental en los pistilos de la planta semillera parental, incluyendo, por ejemplo, polinización por el viento, polinización por insectos (por ejemplo, documento de patente 20) y cruzamiento artificial en el que se coloca manualmente polen de la línea polinífera parental en los pistilos de la planta semillera parental. Un método seleccionado preferiblemente es un método económico adecuado para la región y la facilidad de la producción de semillas.

La producción de variedades F1 de lechuga según los procedimientos anteriores permite la rápida reproducción de variedades de lechuga con rasgos favorables, y la producción de variedades de lechuga comercializables con calidad uniforme del producto y capacidad de adaptación al entorno superior, etc.

La presente invención se describe en detalle con los siguientes ejemplos, pero no se limita a estos ejemplos.

Ejemplo 1

(1): Preparación de protoplastos

(i): Aislamiento de protoplastos de lechuga

Este ejemplo describe un procedimiento que usa la variedad de lechuga “Tell me” (Sakata Seed). Se sembraron en placas semillas esterilizadas sobre medio MS complementado con sacarosa 10 g/l y agar 8 g/l, y se cultivaron durante un mes a 20ºC con 16 horas de luz al día. Se recogió aproximadamente 1 g de hojas abiertas, y se cortaron en trozos de aproximadamente 2 mm de tamaño. Se empaparon con 10 ml de la disolución de sales CPW que

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contenía Meicelase al 0,4%, Maserozyme R-10 al 0,08% y manitol, y se incubó a 25ºC durante 16 horas sin movimiento.

Se filtró la suspensión de protoplastos a través de malla de nailon de 92 micrómetros, y se centrifugó a 500 rpm durante 3 minutos. Tras retirar el sobrenadante, se resuspendió el sedimento en 2 ml de disolución S que contenía yodoacetamida 15 mM, y se incubó a 25ºC durante 5 minutos sin movimiento. Se centrifugaron los protoplastos tratados con yodoacetamida a 300 rpm durante 3 minutos, y se resuspendieron en 10 ml de disolución S tras retirar el sobrenadante, y se lavaron 3 veces con disolución S. Tras centrifugación a 300 rpm durante 3 minutos, se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en disolución de sales CPW que contenía sacarosa al 20% en un volumen final de 9,5 ml. Se dispusieron en una capa 0,5 ml de disolución S sobre la suspensión y esto se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos.

Se recogieron los protoplastos purificados, que se desplazaron hacia la fase superior en la disolución S, en un tubo para centrífuga con una pipeta Pasteur. Se suspendieron los protoplastos en 2 ml de disolución S y se retiró una pequeña cantidad de la suspensión para determinar la densidad celular de la suspensión de protoplastos usando un hemocitómetro. Se añadió disolución S a la suspensión hasta 1 x 106 células/ml.

(ii) Aislamiento de protoplastos de girasol

Este ejemplo describe un procedimiento que usa la variedad cultivada “Nozomi” (Sakata Seed) (que tiene los genes específicos de girasol orf522 y orf873) de girasol para flor cortada y la línea de reproducción “IB5” (que tiene uno de los genes específicos de girasol, el gen orf873, pero no orf522) de girasol para flor cortada. Se sembraron en placas semillas esterilizadas sobre medio MS complementado con sacarosa 10 g/l y agar 8 g/l, y se cultivaron a 25ºC en la oscuridad durante 7 días. Cuando los hipocótilos habían crecido hasta aproximadamente 50 mm, se cortaron a 1 cm de longitud, y se dividieron adicionalmente en mitades a lo largo de la dirección de elongación del hipocótilo. Se empaparon trozos cortados de aproximadamente 10 hipocótilos con 10 ml de disolución S que contenía celulasa Onozuka R-10 al 0,5% y Maserozyme R-10 al 0,1%, y se incubaron durante 16 horas sin movimiento.

Se filtró la suspensión de protoplastos a través de malla de nailon de 92 micrómetros. En un tubo para centrífuga, se transfirieron 2 ml de disolución de sales CPW que contenía sacarosa al 17%, y se dispuso sobre la misma la suspensión de protoplastos. Tras centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos, se reunieron los protoplastos purificados en una banda, y se retiró cuidadosamente la fase superior sobre la banda evitando la aspiración de protoplastos. Se suspendieron los protoplastos en un volumen final de 9,5 ml mediante la adición de disolución de sales CPW que contenía sacarosa al 17%. Se dispusieron como una capa 0,5 ml de disolución S sobre la suspensión y esto se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos.

Se recogieron los protoplastos, que se desplazaron hacia la fase superior en la disolución S, con pipeta Pasteur, se transfirieron a una placa de plástico y se expusieron a rayos X blandos a 0,5 Gy. Se transfirió la suspensión de protoplastos expuesta a los rayos X blandos a un tubo para centrífuga, y se enrasó a 9,5 ml con la disolución de sales CPW que contenía sacarosa al 17%. Se dispusieron como una capa 0,5 ml de disolución S sobre la suspensión y esto se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos. Se transfirieron los protoplastos que se desplazaron hacia la fase de disolución S a un tubo para centrífuga, y se enrasó la suspensión a 10 ml con disolución S. Se retiró una pequeña cantidad de la suspensión para determinar la densidad celular de la suspensión de protoplastos usando un hemocitómetro. Se añadió disolución S a la suspensión hasta 3 x 106 células/ml.

(2) Tratamiento de fusión de protoplastos

Se mezclaron los volúmenes iguales de la suspensión de protoplastos de lechuga tratada con yodoacetamida y la suspensión de protoplastos de girasol irradiada con rayos X blandos y se añadieron por goteo 2 ml de la mezcla sobre el centro del fondo de la placa de 9 cm. Tras incubación durante 30 minutos sin movimiento, se añadieron gota a gota 3 ml de disolución de PEG (PEG3350300 g/l, CaCl2-2H2O 1.500 mg/l y KH2PO4 100 mg/l, pH 5,5) alrededor de la mezcla de protoplastos.

1 minuto después, se añadieron gota a gota 3,5 ml de la disolución de sales CPW alrededor de la mezcla de protoplastos. Otros 2 minutos después, se añadieron gota a gota 3,5 ml de la disolución de sales CPW alrededor de la mezcla de protoplastos de nuevo. 5 minutos después, se retiró el líquido añadido gota a gota en el borde de la placa mediante aspiración cuidadosa. Se añadieron 20 ml de la disolución de sales CPW en el borde de la placa. Se repitió este lavado con la disolución de sales CPW tres veces a intervalos de cinco minutos.

(3) Cultivo de células híbridas fusionadas

Tras retirar la disolución de lavado, se añadieron a los protoplastos 10 ml de medio MS de concentración 1/2 (pH 5,8) que contenía succinato de disodio hexahidratado 2,7 g/l, casaminoácidos 1,0 g/l, NAA 1,0 mg/l, BA 0,3 mg/l y sacarosa 0,3 M con la concentración de NH4NO3 reducida hasta 200 mg/l (a continuación en el presente documento, denominado medio de cultivo para protoplastos de lechuga), se cultivaron a 25ºC en la oscuridad.

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Debido a la incompatibilidad entre los genes nucleares de la lechuga y los genes mitocondriales del girasol introducidos, muchos individuos de tales plantas cíbridas muestran anomalías morfológicas. Se retiraron aquellos individuos con una anomalía morfológica. Puesto que el genoma mitocondrial experimenta la recombinación y redisposición a altas frecuencias en la fusión de protoplastos, se observaron variaciones morfológicas en cada individuo de las plantas regeneradas. Debido a que el órgano floral es particularmente susceptible a las anomalías morfológicas debido a la incompatibilidad, se produjeron muchas plantas y se examinaron para detectar líneas favorables que presentasen esterilidad masculina y morfologías normales en otros aspectos. Generalmente, la lechuga presenta protandria y se poliniza cuando el pistilo está todavía elongándose en el tubo de anteras, por tanto en el momento de la floración, se adhiere una gran cantidad de polen al pistilo tal como se muestra en la figura 4. Por este motivo, la lechuga tiene tasas muy altas de autopolinización. En el candidato más deseable de línea con esterilidad masculina citoplasmática (a continuación en el presente documento, denominada “1216-2” (derivada de “IB5” de girasol)) que se seleccionó en la presente invención, no había polen en absoluto adherido sobre el pistilo, y ni siquiera en los tubos de anteras había ningún signo de polen, tal como se muestra en la figura 5. Además, no se observaba una clara diferencia en las morfologías del órgano floral y otros órganos. Además, la investigación del número de cromosomas confirmó que era de 2n = 18, igual que en la lechuga normal (figura 6).

Cuando se cruzó la línea con esterilidad masculina citoplasmática seleccionada “1216-2” con polen de lechuga con citoplasma normal, fructificó y produjo semillas normalmente tal como se muestra en la figura 7. Esto confirmó que se mantenía la fertilidad femenina en la línea.

Además, cuando se cruzó “1216-2” con una lechuga con fertilidad masculina, todas las plantas de la progenie presentaron esterilidad masculina. Esto confirmó que la esterilidad masculina se producía en el citoplasma, y se transmitía mediante herencia citoplasmática.

La figura 8 muestra el resultado de PCR con los cebadores específicos para el gen mitocondrial de girasol orf873, para someter a prueba 14 individuos en la generación BC3 tras el segundo retrocruzamiento de “1216-2” con “Tell me” (símbolos en la figura 8: M: marcador de peso molecular, S: IB5, L: Tell me, 1 a 14: 14 individuos en la generación BC3 de la lechuga con esterilidad masculina citoplasmática (1216-2-T1-1 a 14)). Todos los individuos tenían orf873. Este resultado demostró que el gen mitocondrial de girasol se transmitía de modo estable.

Además, se diseñaron los cebadores enumerados en la tabla 3 basándose en la información de secuencia de ácido nucleico de genes mitocondriales en girasol y lechuga, disponible de manera pública en la técnica (n.os de registro Gene Bank X82387, X62341, X98362, AF319170, X73425 y X87209) y se analizaron otros genes mitocondriales usando los métodos de PCR y PCRRFLP. Se analizaron gen mitocondrial rps3, la región intergénica entre trnN y trnY (a continuación en el presente documento, denominada trnN-trnY) y la región intergénica entre trnS y trnP (a continuación en el presente documento, denominada trnS-trnP) distinguiendo los genotipos a partir de la diferencia de tamaño de los productos de amplificación por PCR, y se analizaron los genes mitocondriales atp6, cox II y cob mediante PCR-RFLP, es decir mediante la digestión de los productos de amplificación por PCR con enzimas de restricción. Es decir, se digirió el producto de amplificación por PCR por la enzima de restricción y basándose en la diferencia en el patrón de digestión. Además, se analizó el gen cloroplástico rbcL mediante PCR-RFLP. La figura 9 es una fotografía de electroforesis que resulta de los experimentos de PCR y PCR-RFLP (símbolos en la figura 9: M: marcador de peso molecular, S: IB5, L: Tell me, 1 a 14: 14 individuos en la generación BC3 de la lechuga con esterilidad masculina citoplasmática (1216-2-T1-1 a 14)). En la tabla 5, también se resumen los resultados

Tabla 5

Análisis del citoplasma en la progenie en la generación BC3 de la lechuga con esterilidad masculina citoplasmática “1216-2” mediante métodos de PCR y PCR-RFLP

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incluyendo “1216-2-T1” y las 5 variedades genéticamente puras anteriores presentaron el 100% de esterilidad masculina. Además, tal como se muestra en las figuras 11 a 14, no se observó en absoluto la adhesión de polen sobre el pistilo mediante autopolinización, tampoco en los casos de cruzamiento con las variedades de lechuga distintas a “Tell me”, y no hubo ningún signo de polen en las anteras. Además, tal como se muestra en la figura 15, no se observó la adhesión de polen sobre el pistilo mediante autopolinización en una progenie híbrida desarrollada a partir de cruzamiento con polen de la especie silvestre de lechuga L. serriola, y tampoco hubo ningún signo de polen en las anteras.

Este resultado demostró que se mantenía la esterilidad masculina sin producir ninguna cantidad de polen si siquiera cuando se cambiaron los genes nucleares a un genotipo distinto a “Tell me”, y se confirmó que su esterilidad masculina se producía en el citoplasma. Por tanto, se demostró que las plantas cíbridas producidas según la presente invención mostraban esterilidad masculina citoplasmática estable.

Además, se investigó la fertilidad femenina de las líneas con esterilidad masculina citoplasmática, que no producen polen, mediante cruzamiento con polen de la misma variedad usada para producir F1. Se examinaron 10 flores para una cepa, y las líneas o variedad con la capacidad para producir 10 o más semillas por flor se puntuaron como “sí” en cuanto a la fertilidad femenina. Tal como se muestra en la tabla 6, todas las líneas con esterilidad masculina citoplasmática tenían fertilidad femenina independientemente de la diferencia en el genotipo. Esto confirmó que puede usarse la lechuga con esterilidad masculina citoplasmática producida según la presente invención para la producción eficaz de semillas F1.

Tabla 6

Análisis de las propiedades en el órgano floral de plantas F1 entre variedades de prueba de lechuga y lechuga con esterilidad masculina citoplasmática en la generación BC3 “1216-2-T1”

Línea o variedad: Tasa de producción de polen (%) Color del pétalo Anomalía en el órgano floral Semilla de autopolinización Fertilidad femenina

Tell Me: 100 Amarillo No Sí Sí

Steady: 100 Amarillo No Sí Sí

Logic: 100 Amarillo No Sí Sí

Miya: 100 Amarillo No Sí Sí

V lettuce: 100 Amarillo No Sí Sí

1216-2-T1 x Tell Me: 0 Amarillo No No Sí

1216-2-T1 x Steady: 0 Amarillo No No Sí

1216-2-T1 x Logic: 0 Amarillo No No Sí

1216-2-T1 x Miya: 0 Amarillo No No Sí

1216-2-T1 x V lettuce: 0 Amarillo No No Sí

Tasa de producción de polen: número de flores que producen polen / número total de flores examinadas.

Se depositaron las semillas de “1216-2-T1”, la progenie del cruzamiento entre “1216-2” y “Tell me” ante el Depositorio Internacional de Organismos de Patentes en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (Chuo 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón) el 29 de septiembre de 2005 (referencia de identificación facilitada por el depositante SSCLET-05-001 y número de registro FERM BP-10421).

Ejemplo 2

Se produjo la planta cíbrida con esterilidad masculina citoplasmática “50125-3” usando “1216-2-T1” como material donador para proporcionar el citoplasma y realizando fusión asimétrica de protoplastos con “V lettuce” (Kaneko Seed). En la flor de “50125-3”, no se observaron granos de polen adheridos al pistilo, y tampoco se observaron granos de polen en la antera de la flor. Además, no se observaron diferencias obvias en la forma del órgano floral y similares, en comparación con “V lettuce”. Cuando se cruzó la línea con esterilidad masculina citoplasmática seleccionada “50125-3” con polen de una lechuga con citoplasma normal, fructificó y produjo semillas normalmente. Esto confirmó que se mantenía la fertilidad femenina en la línea. Además, cuando se cruzó “50125-3” con polen de una lechuga con fertilidad masculina, todas las plantas de la progenie tenían esterilidad masculina. Esto confirmó que la esterilidad masculina se producía por el citoplasma y era de herencia citoplasmática.

La tabla 7 muestra los resultados del análisis de PCR y PCR-RFLP de genes mitocondriales de diez individuos

Claims

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