JPH0671398B2 - 雑種植物の製造方法 - Google Patents
雑種植物の製造方法Info
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- JPH0671398B2 JPH0671398B2 JP61075699A JP7569986A JPH0671398B2 JP H0671398 B2 JPH0671398 B2 JP H0671398B2 JP 61075699 A JP61075699 A JP 61075699A JP 7569986 A JP7569986 A JP 7569986A JP H0671398 B2 JPH0671398 B2 JP H0671398B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protoplasts
- medium
- plant
- brassica
- solution
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、細胞融合法を用いて効率よくブラシカ属植物
を作出する方法に関するものである。
を作出する方法に関するものである。
従来の交配法によつては得ることができない種間あるい
は属間の雑種植物を得る方法として、細胞融合法は有効
な手段である。
は属間の雑種植物を得る方法として、細胞融合法は有効
な手段である。
しかし、細胞融合法は、プロトプラストの調製、細胞融
合、培養、分裂、増殖、不定芽誘導、植物体への再分化
といつた多数のステツプからなり、各ステツプは例えば
植物種等によつても条件が異なり、必ずしもこれら一連
のプロセスが種々の植物について十分確立されていると
はいえない。また、雑種植物を得るためにはこれら一連
のプロセスにおいて、目的とする雑種植物のみを選択的
に選抜できるような条件を各植物種について決めなけれ
ばならない。
合、培養、分裂、増殖、不定芽誘導、植物体への再分化
といつた多数のステツプからなり、各ステツプは例えば
植物種等によつても条件が異なり、必ずしもこれら一連
のプロセスが種々の植物について十分確立されていると
はいえない。また、雑種植物を得るためにはこれら一連
のプロセスにおいて、目的とする雑種植物のみを選択的
に選抜できるような条件を各植物種について決めなけれ
ばならない。
Z.Pflanzenzchth.89,278−288（1982）には、B.olera
cea由来のプロトプラストとB.campestris由来のプロト
プラストとをポリエチレングリコール（PEG）を含む溶
液中で融合させた後培養して、コロニーを形成させ、該
コロニーを0.2mg/lのベンジルアミノプリン（BAP）を含
むLS培地中で再分化させてこれらの種間雑種植物を作出
することが報告されている。
cea由来のプロトプラストとB.campestris由来のプロト
プラストとをポリエチレングリコール（PEG）を含む溶
液中で融合させた後培養して、コロニーを形成させ、該
コロニーを0.2mg/lのベンジルアミノプリン（BAP）を含
むLS培地中で再分化させてこれらの種間雑種植物を作出
することが報告されている。
本発明は、B.oleraceaとB.campestrisの雑種植物をより
効率よく作出する方法の提供を目的とするものである。
効率よく作出する方法の提供を目的とするものである。
この目的は本発明に従つて、ブラシカキヤンペストリス
由来のプロトプラストと予めヨード化合物で処理したブ
ラシカオレラセア由来のプロトプラストとを、ポリエチ
レングリコールおよびジメチルスルホキシドを含む溶液
中で融合させた後培養してコロニーを形成させ、該コロ
ニーを植物ホルモンとして少くともインドール−３−酢
酸およびゼアチンを含む培地中で培養することを特徴と
する雑種植物の製造方法により達成される。
由来のプロトプラストと予めヨード化合物で処理したブ
ラシカオレラセア由来のプロトプラストとを、ポリエチ
レングリコールおよびジメチルスルホキシドを含む溶液
中で融合させた後培養してコロニーを形成させ、該コロ
ニーを植物ホルモンとして少くともインドール−３−酢
酸およびゼアチンを含む培地中で培養することを特徴と
する雑種植物の製造方法により達成される。
以下本発明を説明するに、本発明で使用するブラシカキ
ヤンペストリス（B.campestris）としては、ハクサイ、
コマツナ、アブラナ等が挙げられ、また、ブラシカオレ
ラセア（B.oleracea）としては、キヤベツ等が挙げられ
る。
ヤンペストリス（B.campestris）としては、ハクサイ、
コマツナ、アブラナ等が挙げられ、また、ブラシカオレ
ラセア（B.oleracea）としては、キヤベツ等が挙げられ
る。
プロトプラストは、常法に従い、植物体またはその部分
を細分し、セルラーゼやペクチナーゼ等の細胞壁分解酵
素を含む酵素液中、28〜30℃、40〜80spmの条件で３〜
４時間程度酵素処理してプロトプラスト化することによ
つて得ることができる。
を細分し、セルラーゼやペクチナーゼ等の細胞壁分解酵
素を含む酵素液中、28〜30℃、40〜80spmの条件で３〜
４時間程度酵素処理してプロトプラスト化することによ
つて得ることができる。
その際、使用するB.campestrisの植物体またはその部分
は予め暗所に２〜４日間保持しておき、その後例えば、
0.3〜0.4Mシユークロースを含むNN67培地（Planta,72,3
55−370,1967）中で、３〜15℃、15〜20時間程度暗所に
保持しておくのがよい。
は予め暗所に２〜４日間保持しておき、その後例えば、
0.3〜0.4Mシユークロースを含むNN67培地（Planta,72,3
55−370,1967）中で、３〜15℃、15〜20時間程度暗所に
保持しておくのがよい。
この様に植物体を暗所に保持することによりでん粉の生
成が抑制され、プロトプラスト調製の際プロトプラスト
の破壊が抑えられ、活性の高いプロトプラストを得るこ
とが可能となる。
成が抑制され、プロトプラスト調製の際プロトプラスト
の破壊が抑えられ、活性の高いプロトプラストを得るこ
とが可能となる。
得られたプロトプラストは、ポリエチレングリコール
（PEG）およびジメチルスルホキシド（DMSO）を含む溶
液中で融合させるが、B.oleracea由来のプロトプラスト
は、予めヨードアセトアミド、モノヨード酢酸等のヨー
ド化合物を最終濃度で１〜20mM含む溶液中、３〜５℃、
10〜30分間処理しておく。かかるヨード化合物処理によ
つてB.oleracea由来のプロトプラストはそれ単独では分
裂能がなくなる。
（PEG）およびジメチルスルホキシド（DMSO）を含む溶
液中で融合させるが、B.oleracea由来のプロトプラスト
は、予めヨードアセトアミド、モノヨード酢酸等のヨー
ド化合物を最終濃度で１〜20mM含む溶液中、３〜５℃、
10〜30分間処理しておく。かかるヨード化合物処理によ
つてB.oleracea由来のプロトプラストはそれ単独では分
裂能がなくなる。
プロトプラストを融合させる溶液は、PEGおよびDMSO
を、それぞれ、10〜40％および５〜25％、好ましくは、
５〜15％および10〜15％の範囲で含む0.05〜0.15Mグリ
シン−NaOH,pH9.5〜10.5の溶液（Plant Cell Reports,
3,196−198,1984）等が好適に使用できる。かかる溶液
中に、上記プロトプラストを等密度で合計が３〜４×10
6個/mlとなるように混合し、20〜30℃で５〜30分間保持
し、次いでW5液（Plant Cell Reports 3,196〜198（198
4））を加えて、１〜３時間静置して、融合させる。こ
の時使用するPEGの分子量は、1,540〜8,000位の水溶性
のものがよい。
を、それぞれ、10〜40％および５〜25％、好ましくは、
５〜15％および10〜15％の範囲で含む0.05〜0.15Mグリ
シン−NaOH,pH9.5〜10.5の溶液（Plant Cell Reports,
3,196−198,1984）等が好適に使用できる。かかる溶液
中に、上記プロトプラストを等密度で合計が３〜４×10
6個/mlとなるように混合し、20〜30℃で５〜30分間保持
し、次いでW5液（Plant Cell Reports 3,196〜198（198
4））を加えて、１〜３時間静置して、融合させる。こ
の時使用するPEGの分子量は、1,540〜8,000位の水溶性
のものがよい。
上述のようにして融合処理した処理液を遠心分離して沈
澱面分を集め、これを例えば0.5mg/lナフタリン酢酸（N
AA）、0.5mg/lBAP、0.5mg/l2,4−D0.4Mシユークロース
を含むKM液体培地（Planta 126,105−110、1975）中、
３〜４×105個/mlとなるように懸濁し、23〜27℃、100
〜200lux（17時間日長）下で培養する。この培養液に週
１回の頻度で新しいKM培地を追加しながら更に培地を続
けると、３週間位で0.3〜0.7mmφ程度のコロニーが形成
される。
澱面分を集め、これを例えば0.5mg/lナフタリン酢酸（N
AA）、0.5mg/lBAP、0.5mg/l2,4−D0.4Mシユークロース
を含むKM液体培地（Planta 126,105−110、1975）中、
３〜４×105個/mlとなるように懸濁し、23〜27℃、100
〜200lux（17時間日長）下で培養する。この培養液に週
１回の頻度で新しいKM培地を追加しながら更に培地を続
けると、３週間位で0.3〜0.7mmφ程度のコロニーが形成
される。
本発明においては、このコロニーを、植物ホルモンとし
て、インドール−３−酢酸（IAA）およびゼアチンを含
む再分化培地、例えば、K3アガロース培地（Z.Pflanzen
physiol.78,453−455（1976））で23〜27℃、2,000〜4,
000luxの条件下に培養する。
て、インドール−３−酢酸（IAA）およびゼアチンを含
む再分化培地、例えば、K3アガロース培地（Z.Pflanzen
physiol.78,453−455（1976））で23〜27℃、2,000〜4,
000luxの条件下に培養する。
再分化培地には更にBAP、カイネチン等の植物ホルモン
を添加することができるが、少くともIAA及びゼアチン
を含むことが必要であり、いずれかを含まない培地で培
養を行なつてもシユートの形成はみられない。
を添加することができるが、少くともIAA及びゼアチン
を含むことが必要であり、いずれかを含まない培地で培
養を行なつてもシユートの形成はみられない。
IAAの濃度は0.001〜0.5mg/lが適当であり、またゼアチ
ンは１〜10mg/lが適当である。その際、予めコロニーを
K3ソフトアガー培地（同上）等の増殖培地で、23〜27
℃、1,000−3,000luxの条件下に培養してカルスを形成
しておき、これを上記の再分化培地で培養するのが好ま
しい。
ンは１〜10mg/lが適当である。その際、予めコロニーを
K3ソフトアガー培地（同上）等の増殖培地で、23〜27
℃、1,000−3,000luxの条件下に培養してカルスを形成
しておき、これを上記の再分化培地で培養するのが好ま
しい。
上記再分化培地で約１ケ月毎に新しい培地に植え継ぎな
がら培養を続けると２〜３ケ月に亘つてシユートが形成
される。このシユートが形成されたカルスを常法に準
じ、例えばB5培地（Exp.cell Res,50,151−158（196
8））等の発根培地で発根させ、次いで、バーミキユラ
イト等に移植して生長させると目的とする種間雑種植物
を得ることができる。
がら培養を続けると２〜３ケ月に亘つてシユートが形成
される。このシユートが形成されたカルスを常法に準
じ、例えばB5培地（Exp.cell Res,50,151−158（196
8））等の発根培地で発根させ、次いで、バーミキユラ
イト等に移植して生長させると目的とする種間雑種植物
を得ることができる。
以下に実施例を挙げて本発明を説明する。
実施例１ （１）プロトプラストの調製 コマツナ（B.campestris）を無菌的に25℃、3,000luxの
条件下、３週間生育させ、その後３日間25℃、暗所に置
く。その後本葉を刻み、0.35Mシユークロースを含むNN6
7培地に入れ、10℃で16時間暗条件下に保持した。
条件下、３週間生育させ、その後３日間25℃、暗所に置
く。その後本葉を刻み、0.35Mシユークロースを含むNN6
7培地に入れ、10℃で16時間暗条件下に保持した。
次いで、それを0.5％セルラーゼおよび0.05％ペクチナ
ーゼを含む0.35Mシユークロース溶液（pH5.6）に移して
30℃、60spmの条件で２時間処理した。
ーゼを含む0.35Mシユークロース溶液（pH5.6）に移して
30℃、60spmの条件で２時間処理した。
酵素処理液をろ過して未消化物を除去し、ろ液を800rpm
で５分間遠心分離して沈澱画分を集め、約１×106個/g
（fw（fresh weight））の収率でプロトプラストを得
た。
で５分間遠心分離して沈澱画分を集め、約１×106個/g
（fw（fresh weight））の収率でプロトプラストを得
た。
一方、キヤベツ（B.oleracea）を無菌的に発芽させた４
〜５日目の下胚軸を細分して２％セルラーゼを含む0.4M
シユークロース溶液（pH5.6）中で30℃、60spmの条件で
２時間酵素処理した。
〜５日目の下胚軸を細分して２％セルラーゼを含む0.4M
シユークロース溶液（pH5.6）中で30℃、60spmの条件で
２時間酵素処理した。
酸素処理液をろ過して未消化物を除去し、ろ液を800rpm
で５分間遠心分離して沈澱画分を集め、約２×105個/g
（fw）の収率でプロトプラストを得た。
で５分間遠心分離して沈澱画分を集め、約２×105個/g
（fw）の収率でプロトプラストを得た。
（２）ヨードアセトアミド処理 上記（１）で調製したキヤベツの下胚軸由来のプロトプ
ラスト２×105個を、W5液5mlに懸濁し、これに50mMヨー
ドアセトアミド液を最終濃度が15mMとなるように添加
し、４℃15分間、暗条件下で処理した。
ラスト２×105個を、W5液5mlに懸濁し、これに50mMヨー
ドアセトアミド液を最終濃度が15mMとなるように添加
し、４℃15分間、暗条件下で処理した。
処理後800rpm、５分間遠心分離してプロトプラストを集
め、W5液で洗浄してヨードアセトアミド処理プロトプラ
ストを得た。
め、W5液で洗浄してヨードアセトアミド処理プロトプラ
ストを得た。
（３）細胞融合 上記（１）および上記（２）で調製したプロトプラスト
をそれぞれ等密度で合計が３〜４×106個/mlとなるよう
に混合し、予め6cmφのシヤーレに20−25μｌの量で置
いた10％PEGおよび10％DMSOを含む0.15Mグリシン−NaOH
（pH10）溶液の上に静かに20−25μｌ加え、25℃で10分
間放置した。次いで、6mlのW5液を加えて２時間静置後8
00rpmで５分間遠心分離して沈澱画分を得た。
をそれぞれ等密度で合計が３〜４×106個/mlとなるよう
に混合し、予め6cmφのシヤーレに20−25μｌの量で置
いた10％PEGおよび10％DMSOを含む0.15Mグリシン−NaOH
（pH10）溶液の上に静かに20−25μｌ加え、25℃で10分
間放置した。次いで、6mlのW5液を加えて２時間静置後8
00rpmで５分間遠心分離して沈澱画分を得た。
（４）融合細胞の培養 上記（３）で得た融合細胞を0.5mg/lのNAA、BAPおよび
2,4−Ｄと0.4Mグルコースを含むKM液体培地中に、３〜
４×105個/mlの密度で懸濁し、23〜27℃、100〜200lux
（17時間日長）下で培養を行つた。週１回の頻度で新し
いKM培地を追加しながら更に培養を続けたところ、約３
週間で0.3〜0.7mmφのコロニーが形成された。
2,4−Ｄと0.4Mグルコースを含むKM液体培地中に、３〜
４×105個/mlの密度で懸濁し、23〜27℃、100〜200lux
（17時間日長）下で培養を行つた。週１回の頻度で新し
いKM培地を追加しながら更に培養を続けたところ、約３
週間で0.3〜0.7mmφのコロニーが形成された。
次いで、0.05mg/lの2,4−Ｄ、0.5mg/lのBAP、1mg/lのゼ
アチン、0.1Mのシユークロースおよび0.08％のジエルラ
イトを含むK3ソフトアガー培地に移し、２〜３週間培養
したところ、2mm程度のカルスに生長した。
アチン、0.1Mのシユークロースおよび0.08％のジエルラ
イトを含むK3ソフトアガー培地に移し、２〜３週間培養
したところ、2mm程度のカルスに生長した。
このカルスを0.1mg/lのIAA、5mg/lのゼアチン、0.5mg/l
のABPあるいは0.1mg/lIAA、2mg/lゼアチン、2mg/lカイ
ネチンおよび１％アガロースを含むK3アガロース培地に
移して、１ケ月毎に新しい培地に植継ぎながら培養を続
けた。培養後２〜３ケ月にわたつてシユートが形成され
た。
のABPあるいは0.1mg/lIAA、2mg/lゼアチン、2mg/lカイ
ネチンおよび１％アガロースを含むK3アガロース培地に
移して、１ケ月毎に新しい培地に植継ぎながら培養を続
けた。培養後２〜３ケ月にわたつてシユートが形成され
た。
シユートが形成されたカルスを0.03mg/lのGA3、0.01mg/
lのNAA、２％シユークロースおよび２％アガロースを含
むB5培地に移し、23〜27℃、2,000〜4,000lux（17hr日
長）の条件下で発根させた。次いで、バーミキユライ
ト、培土に植え継いで、４ケ月間育てた。
lのNAA、２％シユークロースおよび２％アガロースを含
むB5培地に移し、23〜27℃、2,000〜4,000lux（17hr日
長）の条件下で発根させた。次いで、バーミキユライ
ト、培土に植え継いで、４ケ月間育てた。
得られた植物体を下記の方法によつて雑種検定したとこ
ろ、約87％の植物体が雑種植物であることがわかつた。
ろ、約87％の植物体が雑種植物であることがわかつた。
雑種検定は、常法に従い、染色体数、核型解析、LAP
（ロイシンアミノペプチターゼ）のアイソザイムの電気
泳動パターンおよび形態的特徴を基に解析した。得られ
た雑種植物におけるこれらの特徴は全て合致していた。
（ロイシンアミノペプチターゼ）のアイソザイムの電気
泳動パターンおよび形態的特徴を基に解析した。得られ
た雑種植物におけるこれらの特徴は全て合致していた。
本発明方法に依れば、B.oleraceaとB.campestrisの種間
雑種植物を効率よく得ることができる。
雑種植物を効率よく得ることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山下 裕美子 神奈川県横浜市緑区鴨志田町1000番地 株 式会社植物工学研究所内 (56)参考文献 １．Ｈ．Ｒ．Ｓｃｈｅｎｃｋ＆Ｇ．Ｒｏ ｂｂｅｌｅｎ，Ｚ．Ｐｆｌａｕｚｅｎｚｕ ｃｈｔｇ，Ｖｏｌ．89，（1982），Ｐ. 278−288 ２．Ｌａｓｚｌｏ Ｍｅｎｃｚｅｌ ｅ ｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ. 100，（1983），Ｐ．487−495
Claims (2)
- 【請求項１】ブラシカキヤンペストリス（Brassica cam
pestris）由来のプロトプラストと予めヨード化合物で
処理したブラシカオレラセア（Brassica oleracea）由
来のプロトプラストとを、ポリエチレングリコールおよ
びジメチルスルホキシドを含む溶液中で融合させた後培
養してコロニーを形成させ、該コロニーを、植物ホルモ
ンとして少くともインドール−３−酢酸およびゼアチン
を含む培地中で培養することを特徴とする雑種植物の製
造方法。 - 【請求項２】ブラシカキヤンペストリス由来のプロトプ
ラストが、予め暗所に保持されたブラシカキヤンペスト
リスから得られたものである特許請求の範囲第１項記載
の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61075699A JPH0671398B2 (ja) | 1986-04-02 | 1986-04-02 | 雑種植物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61075699A JPH0671398B2 (ja) | 1986-04-02 | 1986-04-02 | 雑種植物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62232324A JPS62232324A (ja) | 1987-10-12 |
| JPH0671398B2 true JPH0671398B2 (ja) | 1994-09-14 |
Family
ID=13583723
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61075699A Expired - Lifetime JPH0671398B2 (ja) | 1986-04-02 | 1986-04-02 | 雑種植物の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0671398B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2547068T3 (es) | 2005-10-26 | 2015-10-01 | Sakata Seed Corporation | Planta híbrida citoplasmática perteneciente al género Lactuca y método para la producción de la misma |
| JP2019129705A (ja) * | 2016-03-31 | 2019-08-08 | 日本たばこ産業株式会社 | 植物に物質を導入する方法 |
-
1986
- 1986-04-02 JP JP61075699A patent/JPH0671398B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| １．Ｈ．Ｒ．Ｓｃｈｅｎｃｋ＆Ｇ．Ｒｏｂｂｅｌｅｎ，Ｚ．Ｐｆｌａｕｚｅｎｚｕｃｈｔｇ，Ｖｏｌ．８９，（１９８２），Ｐ．２７８−２８８ |
| ２．ＬａｓｚｌｏＭｅｎｃｚｅｌｅｔ．ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１００，（１９８３），Ｐ．４８７−４９５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62232324A (ja) | 1987-10-12 |
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