HU204561B - Process for producing hybrid brassicaceae with citoplasmic male sterility - Google Patents
Process for producing hybrid brassicaceae with citoplasmic male sterility Download PDFInfo
- Publication number
- HU204561B HU204561B HU886163A HU616388A HU204561B HU 204561 B HU204561 B HU 204561B HU 886163 A HU886163 A HU 886163A HU 616388 A HU616388 A HU 616388A HU 204561 B HU204561 B HU 204561B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protoplasts
- oleracea
- fusion
- cells
- male sterility
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
- A01H6/20—Brassicaceae, e.g. canola, broccoli or rucola
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/14—Plant cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
- A01H1/022—Genic fertility modification, e.g. apomixis
- A01H1/023—Male sterility
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
A leírás terjedelme: 8 oldal (ezen belül 1 lap ábra)Scope of the description: 8 pages (including 1 sheet)
HU 204561 ΒEN 204561
A találmány citoplazmás hímsterilitással rendelkezőThe invention relates to cytoplasmic male sterility
Brassica oleracea új szülővonalának kifejlesztésével foglalkozik. A szúlővonalak hibrid magvak előállításához alkalmazhatók. Ez a találmány képessé teszi a növénytermesztőt arra, hogy citoplazmás hímsterilitás (CMS) megfelelő minőségét építse be B.oleracea valamely kereskedelmileg kívánatos változatába.Brassica is working on developing a new birth line for oleracea. Patch lines can be used to produce hybrid seeds. This invention enables a plant cultivator to incorporate cytoplasmic male sterility (CMS) into a commercially desirable variant of B.oleracea.
A hímsterilitás a B.oleracea hibrid mag nemesítésében értékes tulajdonság, mivel a normális virágok önbeporzók. A hímsteril vonalak nem termelnek életképes virágport és nem képesek önbeporzásra. Az egyik szülőváltozat virágporának kiiktatásával a keresztezésben a növénytermesztő biztosítva lehet afelől, hogy egyenletes minőségű hibrid magot kap. Jelenleg citoplazmás hímsterilitás B .oleracea változatokban nem fordul elő. A hibrid magok ipari-kereskedelmi-termelői sejtmagon belüli önösszeférhetetlenségi rendszereket alkalmaznak, hogy elkerüljék az önbeporzást a magtermelés során. Ez a rendszer nem pontos és nem tiszta hibridmag-tételeket eredményez. Ezenkívül idő- és 2 munkaigényes, és így költséges bevezetni ezt a genetikai rendszert az összes tenyészvonalba. Raphanus sativusban olyan citoplazmát fedeztek fel, amely hímsterilitást ad át. Ez a citoplazma Ogura CMS citoplazmaként ismeretes, és a citoplazmában található mitokond- 2 riumokből és kloroplasztokból származó DNS genotípusosan különbözik a termékeny B.oleracea növények citoplazmájában lévőDNS-től. Az Ogura típusú CMS citoplazmát be lehet vezetni B.oleracea-ba ismételt visszakeresztezéssel. Az így létrejövő Ogura CMS 3 B.oleracea növényekben az R.sativus mitokondiumok CMS-fenoűpust eredményeznek. Az R.satívus kloropIasztjainak jelenléte azonban klorőzist eredményez, amikor a növények alacsony hőmérsékleten nőnek, amely viszont termeléscsökkenést okoz. Ezért az ilyen 3í Ogura CMS B.oleracea növényeket kevéssé használják az ipari-kereskedelmi hibridmag-termelésben.Male sterility is a valuable property in the breeding of B.oleracea hybrid seed, since normal flowers are self-pollinating. Male sterile lines do not produce viable pollen and are unable to self-pollinate. By eliminating the pollen of one of the parent variants, the crop generator can ensure that he receives a hybrid seed of uniform quality. Currently, cytoplasmic male sterility is not present in variants of B. oleracea. Hybrid seeds use self-incompatibility systems within industrial-commercial-producer nuclei to avoid self-pollination during seed production. This system results in inaccurate and non-pure hybrid seed items. In addition, it is time-consuming and labor intensive, and it is therefore costly to introduce this genetic system into all breeding lines. Raphanus sativus has discovered a cytoplasm that transmits male sterility. This cytoplasm is known as Ogura CMS cytoplasm, and DNA from mitochondrials and chloroplasts in the cytoplasm is genotypically different from the DNA present in the cytoplasm of prolific B.oleracea plants. The Ogura type CMS cytoplasm can be introduced into B.oleracea by repeated crosscutting. In the resulting Ogura CMS 3 B. oleracea plants, R. sativus mitochondria produce a CMS phenotype. However, the presence of chloroplasts of R.somatic results in chlorine when the plants grow at low temperatures, which in turn causes a reduction in production. Therefore, such 3 Ogura CMS B.oleracea plants are little used in industrial-commercial hybrid seed production.
A találmány olyan B.oleracea növényekre vonatkozik, amelyek Ogura CMS citoplazma mitokondriumokkal és normális megtermékenyített B.oleracea hideg-túró kló- 4( roplasztjaival bírnak. A találmány szerinti növényeknek citoplazmás hímsterilitása van, de nem mutatnak klorózist, amikor alacsony hőmérsékleten nőnek.The present invention relates to B. oleracea plants which have Ogura CMS cytoplasmic mitochondria and normal fertilized B.oleracea cold curd chloroplasts (Roplasts of the present invention. The plants according to the invention have cytoplasmic male sterility but do not show chlorosis when growing at low temperatures.
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan B.oleracea növényi anyag előállítására, amelynek citoplazmás 45 hímsterilitása és iparilag-kereskedelmileg kívánatos sejtmagjellemzői vannak, és amely nem mutat klorózíst, amikor alacsony hőmérsékleten nő. Az ilyen CMS B.oleracea növényeket iparilag-kereskedelmileg kívánatos sejtmagjellemzőkkel bíró B.oleracea protoplasz- 50 tok és Ogura CMS B.oleracea növény inaktivált vagy sejtmagmentes protoplasztjai fúziójával, majd az így kapott allogén sejtek növénnyé regenerálásával állítjuk elő.The present invention also relates to a method for producing B.oleracea plant material having cytoplasmic male sterility and industrially commercially desirable nuclear characteristics and which does not exhibit chlorosis when grown at low temperature. Such CMS B.oleracea plants are fused by fusion of industrially-commercially desirable nucleated B.oleracea protoplasts and Ogura CMS B.oleracea plants with inactivated or nuclear-free protoplasts, and regeneration of the resulting allogeneic cells into plants.
A találmány szerinti eljárás CMS kialakítására főleg az alábbi B.oleracea változatokban lehetséges:The method according to the invention for CMS is mainly available in the following B.oleracea variants:
1. Brassica oleracea L., acephala variáns (DC), botrytis L. alvariáns (karfiol),1. Brassica oleracea L., acephala variant (DC), botrytis L. subvariant (cauliflower),
2. Brassica oleracea L., capitata variáns (L), alba (DC) alvariáns (fehér káposzta),2. Brassica oleracea L., capitata variant (L), alba (DC) sub variant (white cabbage),
3. Brassica oleracea L., oleracea variáns, gemmifera (DC) alvariáns (kelbimbó),3. Brassica oleracea L., oleracea variant, gemmifera (DC) sub variant (Brussels sprouts),
4. Brassica oleracea L., acephala variáns (DC), sabellicaL. alvariáns (fodorkel),4. Brassica oleracea L., acephala variant (DC), sabellicaL. subvariant (fodorkel),
5. Brassica oleraceaL., capitata variáns (L), sabauda5. Brassica oleraceaL., Capitata variant (L), sabauda
L. alvariáns (fodros káposzta),L. subvarian (curled cabbage),
6. Brassica oleracea L., capitata variáns (L), rubra (DC) alvariáns (vörös káposzta),6. Brassica oleracea L., capitata variant (L), rubra (DC) sub variant (red cabbage),
7. Brassica oleracea L., acephala variáns (DC), 10 gongylodes alvariáns (karalábé),7. Brassica oleracea L., acephala variant (DC), 10 gongylodes sub-variant (turnip),
8. Brassica oleracea L., botrytis variáns (L), cymosa8. Brassica oleracea L., botrytis variant (L), cymosa
Duch alvariáns (brokkoli), előnyösen karfiolban, fehér káposztában, kelbimbóban és brokkoliban.Duch subvariant (broccoli), preferably cauliflower, white cabbage, brussels sprouts and broccoli.
Az Ogura CMS-kifejezés, ahogyan fentebb alkalmazzuk, Raphanus sativus eredetű citoplazmára vonatkozik; ez olyan mitokondriális DNS-t tartalmaz, amely hímsterilitást ad át növényeknek. Az Ogura CMS Brassica oleracea növény vagy növényi sejt kifejezés, aho) gyan itt alkalmazzuk, olyan Brassica oleracea növényre vagy növényi sejtre vonatkozik, amely Ogura CMS citoplazmát tartalmaz.The Ogura CMS term, as used above, refers to cytoplasm of Raphanus sativus origin; it contains mitochondrial DNA that transmits male sterility to plants. The term Ogura CMS Brassica oleracea plant or plant cell, aho, is used herein to refer to a Brassica oleracea plant or plant cell containing Ogura CMS cytoplasm.
A protoplasztfúziót a találmány szerinti eljárásban agglutinálódástokozó polietilénglikol (PEG) aJkalmazá» sával hajtjuk végre valamely fúziós puffer, azaz nagy pHjú oldat jelenlétében, hogy lehetővé váljék a membránok fúziója. Az ilyen szomatikus hibridizációt olyan körülmények között hajthatjuk végre, amelyet Sundberg és munkatársai ismertettek (Plánt Science 43, 155 (1986)] interspecifikus hibridek vagy módosulataik termeléséhez. Egy alkalmas eljárás pl. a következő.The protoplast fusion in the method according to the invention is carried out by the application of agglutinating polyethylene glycol (PEG) in the presence of a fusion buffer, i.e. a high pH solution, to allow fusion of the membranes. Such somatic hybridization may be carried out under the conditions described by Sundberg et al. (Plant Science 43, 155 (1986)) for the production of interspecific hybrids or their modifications.
A találmány szerinti eljárásban protoplasztfúziót előnyösen egy olyan protoplasztfúziós oldatban (FS-1) hajtjuk végre, amely valamely puffért, pl. trísz(hidroximetil)-amino-metán-hidrokloridot, valamely ozmózist biztosító szert, pl. szénhidrátot, pl. mannitot, szorbitot, glükózt vagy szacharózt, valamint kálium- és kalciumsókat tartalmaz. A pH 5,2· és 10 közti tartományban lehet, ez előnyösen pH 7,2. A különböző eredetű protoplasztokat összekeveqűk és koncentráljuk, alkalmasan KP-106 protoplaszt/ml végső sűrűségre.In the method according to the invention, protoplast fusion is preferably performed in a protoplast fusion solution (FS-1) which is for a buffer, e.g. tritium (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, an osmotic agent, e.g. carbohydrates, e.g. mannitol, sorbitol, glucose or sucrose, and potassium and calcium salts. The pH may range from 5.2 to 10, preferably pH 7.2. Protoplasts of different origins are mixed and concentrated, suitably at the final density of KP-10 6 protoplast / ml.
A protoplasztkeveréket ezután legalább 10 percig zavartalanul állni hagyjuk, hogy a sejtek leülepedhessenek a Petri-csésze fenekére. A keveréket azután polietilénglikollal (PEG), előnyösen 1500-6000 közti molekulatömegűpolietilénglikollal kezeljük. Általában jó eredményeket kapunk, amikor pl. 40 tömeg%-os PEGet tartalmazó vizes oldatot alkalmazunk (FS-2) 10:1 és 1:1 közti FS-l/FS-2 térfogatarányban. Az FS-2 előnyösen valamely ozmotikumot és valamely kalciumsót is tartalmaz. A sejteket 1 perc és 20 perc közti ideig FS-2-ben inkubáljuk a sejtek törékenységétől függően.The protoplast mixture is then allowed to stand for at least 10 minutes to allow the cells to settle on the bottom of the Petri dish. The mixture is then treated with polyethylene glycol (PEG), preferably with a polyethylene glycol of from 1500 to 6000. Generally, good results are obtained when e.g. An aqueous solution containing 40% PEG was used (FS-2) in a volume ratio of 10: 1 to 1: 1 FS-1 / FS-2. Preferably, FS-2 also contains an osmotic and a calcium salt. Cells were incubated for 1 minute to 20 minutes in FS-2, depending on cell fragility.
A fúziót úgy tesszük teljessé, hogy pl. kétszeri mosást végzünk olyan fúziós oldattal, amely PEG-et az FS-2-nél alacsonyabb koncentrációban, egy ozmotikumot (pl. glükózt vagy szorbitot) az FS-2-nél alacsonyabb ozmózisnyomást biztosító koncentrációban, és magnéziumsót tartalmaz.The fusion is completed by e.g. twice washing with a fusion solution containing PEG lower than FS-2, an osmotic agent (e.g. glucose or sorbitol) at a concentration lower than osmotic pressure of FS-2 and a magnesium salt.
A fúziós eljárást előnyösen 20 °C és 24 ’C közötti, előnyösen 22 ’C hőmérsékleten hajtjuk végre.The fusion process is preferably carried out at a temperature between 20 ° C and 24 ° C, preferably at 22 ° C.
HU 204561 ΒEN 204561
A PEG koncentrációját a „mosóoldatok”-ban fokozatosan csökkentjük minden egyes egymást követő mosási lépésben (lásd pl. a 9. példát és a 3. és 4. fúziós oldatot).The concentration of PEG in the "washing solutions" is gradually reduced in each successive wash step (see, e.g., Example 9 and fusion solutions 3 and 4).
Az egyes mosási lépéseknek legalább 2 percig kell tartaniuk, hogy lehetővé váljék a protoplasztok számára, hogy lassan álljanak be a közeg kisebb ozmolaritására, nehogy a sejtek szétrepedése következzék be.The individual washing steps must take at least 2 minutes to allow the protoplasts to slowly slow down the osmolarity of the medium to prevent the cells from cracking.
A mosási lépések befejezése után a fuzionált protoplasztokat megfelelő tenyésztő tápközegbe visszük át. A protoplasztok sűrűsége 105 és 106 protoplaszt/ml közti tartományban van.Upon completion of the washing steps, the fused protoplasts are transferred to a suitable culture medium. The density of protoplasts is in the range of 10 5 to 10 6 protoplasts / ml.
Egy másik eljárás szerint a protoplasztfúziót elektromos feszültség segítségével lehet végrehajtani.According to another method, the protoplast fusion can be performed by electrical voltage.
Az elektrofúzió céljából a maximum 8 sejtből, pl. 5 sejtből álló protoplasztláncokat, közvetlen áram (DC)impulzusnak vetjük alá, 400-1000 V/cm tartományban, pl. 10-50 psec impulzusidő-tartammal. Az így fuzionált protoplasztokat alkalmasan bizonyos ideig, pl. 1-2 másodpercig elektromos mezőben tartjuk, mielőtt az elektromos mezőt kikapcsolnánk, abból a célból, hogy a protoplasztoknak adjunk bizonyos időt, hogy visszanyerjék kör alakjukat.For electrofusion of up to 8 cells, e.g. 5-cell protoplast chains are subjected to direct current (DC) pulses in the range of 400-1000 V / cm, e.g. 10-50 psec pulse duration. The protoplasts thus fused are suitably for a period of time, e.g. For 1-2 seconds, we keep it in an electric field before turning off the electric field to give the protoplasts some time to regain their circular shape.
, A protoplasztláncokat önmagában ismert módon készíthetjük el, a protoplasztokat váltakozó áramú (AC) elektromos mezőnek tesszük ki. Az optimális körülményeket a váltakozó mező frekvenciájának változtatásával határozzuk meg, pl. 1 MHz körül és 15 V/cm-ig terjedő feszültségnél úgy, hogy a sejtek néhány percen belül sorba álljanak.The protoplast chains can be prepared in a manner known per se, and the protoplasts are exposed to an AC field. Optimal conditions are determined by varying the frequency of the alternating field, e.g. At a voltage of about 1 MHz and a voltage of up to 15 V / cm, so that the cells are queued within a few minutes.
Az így kapott fúziós termékeket nem fuzionált szülőprotoplasztok jelenlétében, vagy a tenyészetből való optikai szelektálás után regenerálhatjuk. Az ilyen optikai szelektálást a sejtek mikromanipulálásával hajthatjuk végre, pl. azzal az eljárással, amelyet Patnaik és munkatársai írnak le [Plánt Science Letters, 24,105 (1982)] növényi heterokarionok manuális izolálására és azonosítására, vagy sejtosztályozó berendezés alkalmazásával hajthatjuk végre, pl. azzal az eljárással, amelyet Glimelius és munkatársai ismertetnek [Plánt Science 45,133 (1986)] növényi protoplaszt-heterokarionok szelektálásához és dúsításához sejtosztályozással.The resulting fusion products can be regenerated in the presence of non-fused parent proteases or after optical selection from the culture. Such optical selection may be accomplished by micromanipulation of the cells, e.g. by the method described by Patnaik et al. (Plant Science Letters, 24, 105 (1982)) for manual isolation and identification of plant heterocarions, or using a cell sorting apparatus, e.g. by the method described by Glimelius et al., Plant Science 45,133 (1986) for the selection and enrichment of plant protoplast heterocarions by cell sorting.
Amikor a szelekciós stratégiát alkalmazzuk, a szülőprotoplasztokat fluoreszcens festékekkel, pl. fluoreszcein-izotiocianáttal festjük; ha a fúziós partnerek egyike levél eredetű, a klorofill autofluoreszcenciáját alkalmazhatjuk a szelekcióhoz.When using the selection strategy, the parent protoplasts are fluorescent dyes, e.g. staining with fluorescein isothiocyanate; if one of the fusion partners is of leaf origin, the autofluorescence of chlorophyll can be used for selection.
Az így kapott fúziós termékeket olyan tenyésztő tápközegben tenyésztjük, amely jól kiegyensúlyozott tápközeget szolgáltat a protoplasztnövesztéshez; ez mikro- és makroelemeket, vitaminokat, aminosavakat és kis mennyiségben szénhidrátokat, pl. különböző cukrokat, úgymint glükózt tartalmaz. A glükóz szénforrásként és ozmotikumként szolgál. A tenyésztő tápközeg növényi hormonokat (auxinokat és citokinineket) tartalmaz, amelyek a sejtosztódást és a hajtásregenerálódást képesek szabályozni. Megfelelő auxin például a naftil-ecetsav (NAA), a 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav (2,4D) és az indol-ecetsav (IAA). Megfelelő citokininek például a benzil-amino-purin (BAP) és a zeatin (Zea).The resulting fusion products are cultured in a culture medium that provides a well-balanced medium for protoplast growth; it includes micro- and macro-elements, vitamins, amino acids and small amounts of carbohydrates, e.g. various sugars such as glucose. Glucose serves as a carbon source and osmotic. The culture medium contains plant hormones (auxins and cytokinins) that can regulate cell division and regeneration. Examples of suitable auxin include naphthyl acetic acid (NAA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4D) and indole acetic acid (IAA). Examples of suitable cytokinins include benzylamino-purine (BAP) and zeatin (Zea).
Általában az NAA-t és a 2,4-D-t BAP-pal kombinálva alkalmazzuk, hogy beindítsuk a sejtosztódást. Az auxin/citokinin aránynak ekkor nagynak kell lennie, pl. 1-nél nagyobbnak.Generally, NAA and 2,4-D are used in combination with BAP to initiate cell division. The auxin / cytokinin ratio should then be high, e.g. Greater than 1.
7-10 nap után az auxinok koncentrációját alkalmasan hígítjuk azonos tenyésztő tápközeg hozzáadásával, amely auxinokat nem vagy jelentősen kisebb mennyiségben tartalmaz. Általában 3-4 hét múlva tipikus csillag alakú mikrokalluszok fejlődnek ki. Az ilyen mikrokalluszokat azután regeneráló tápközegbe visszük át, hogy beindítsuk a hajtásképződést, előnyösen köztes regeneráló tápközegben azokhoz a különbségekhez történő adaptálás után, amelyek a tenyésztő tápközeg és a regeneráló tápközeg között összetételben és fizikai tulajdonságokban vannak.After 7-10 days, the concentration of auxins is suitably diluted by the addition of the same culture medium containing no or significantly less auxins. Usually, after 3-4 weeks, typical star-shaped microcells are developed. Such microcells are then transferred to a regenerating medium to initiate the shoot formation, preferably in an intermediate regeneration medium after adaptation to differences in composition and physical properties between the culture medium and the regeneration medium.
A hajtásképződéshez a regenerációs tápközegben az auxin/citokinin arány előnyösen alacsony, pl. 1:10 alatti. A hajtásregeneráláshoz általában előnyös az IAA auxint a Zea és BAP citokininekkel kombinálva alkalmazni.Preferably, the auxin / cytokinin ratio for shoot formation in the regeneration medium is low, e.g. 1:10. For regeneration, it is generally preferred to use the IAA auxin in combination with Zea and BAP cytokinins.
A BR-1 és BR-2 regeneráló tápközegek a tenyésző tápközeghez viszonyítva viszonylag szegény tápközegek. Kevesebb vitamint tartalmaznak, a szénforrás-tartalom is alacsonyabb, szénforrásként csak szacharózt és xilózt tartalmaznak és nem tartalmaznak aminosavakat és kókuszdiótejet. A regeneráló tápközegeknek a viszkozitása is nagyobb, mint a tenyésztő tápközegé. A BR-1 félszilárd és az NAA; 2,4-D és BAP növekedésszabályozókat tartalmaz 1-nél kisebb auxin/citokinin arány mellett. A BR-2 Zea-t és BAP-ot és kívánt esetben IAA-t tartalmaz.BR-1 and BR-2 regeneration media are relatively poor media relative to the culture medium. They contain fewer vitamins, the carbon content is lower, they contain only sucrose and xylose as carbon sources and do not contain amino acids and coconut milk. The viscosity of the regenerating media is also higher than that of the culture medium. BR-1 is semi-solid and NAA; It contains 2,4-D and BAP growth regulators with auxin / cytokinin ratio of less than 1. BR-2 contains Zea and BAP, and optionally IAA.
4-6 hétig BR-1 tápközegben végzett regenerálás után a mintegy 3 mm átmérőjű kalluszokat BR-2 regeneráló tápközegbe visszük át, amely alacsony szacharózkoncentrációt tartalmaz. Ennél a stádiumnál 2-3 héten belül hajtások fejlődnek ki.After 4-6 weeks of regeneration in BR-1 medium, callipers with a diameter of about 3 mm are transferred to BR-2 regenerating medium containing a low sucrose concentration. At this stage, shoots develop within 2-3 weeks.
A kapott hajtásokat azután hormonadalék nélküli MS alaptápközegben gyökereztetjük.The resulting shoots are then rooted in non-hormone-free MS medium.
Az így kapott növénykék sejtmag DNS-ét és sejtorganellum DNS-ét azután ismert módon azonosíthatjuk, pl. megfelelő restrikciós endonukleázok alkalmazásával és az így kapott fúziós termékek DNS-emésztési mintáját a szülővonalak DNS-emésztési mintájával hasonlítjuk össze.The DNA of the nuclear nucleus thus obtained and the DNA of the cellular organ can then be identified by known methods, e.g. using the appropriate restriction endonucleases and the DNA digestion sample of the resulting fusion products is compared with the DNA digestion pattern of the parent lines.
A kiindulási anyagként alkalmazott Brassica oleracea protoplasztokat és Ogura CMS Brassica oleracea növény inaktivált vagy sejtmagmentes protoplasztjait ismert módon kaphatjuk meg a megfelelő növényi sejtekből.Brassica oleracea protoplasts and inactivated or nuclear-free protoplasts of the Ogura CMS Brassica oleracea plant can be obtained from known plant cells in a known manner.
Sejtfalmentes sejteket, azaz protoplasztokat zölt növényi anyagokból, pl. levélanyagokból és/vagy fehér növényi anyagokból, pl. elsárgult csírákból, sejtszuszpenziós tenyészetekből, gyökerekből vagy kifehérített növényi anyagokból hagyományos eljárásokkal állíthatunk elő, pl. azzal az eljárással, amelyet Glimelius ismertet [Physiologia Plantarum 61, 38 (1984)] a sziklevél előtti (hypocotyl) protoplasztok regenerálásához.Cell-free cells, i.e. protoplasts, are extracted from plant material, e.g. from leaf materials and / or white plant materials, e.g. yellowed germs, cell suspension cultures, roots or bleached plant materials can be prepared by conventional methods, e.g. by the method described by Glimelius [Physiologia Plantarum 61, 38 (1984)] for the regeneration of pre-cotyledon (hypocotyl) protoplasts.
Ha a fúziós termékeket optikai szelekcióval kívánjuk kiválogatni, a kiindulási anyagokat előnyösen elvá3If the fusion products are to be selected by optical selection, the starting materials are preferably removed.
HU 204561 Β lasztjuk a zöld növénytől, vagy ha fehér növényi anyagból indulunk ki, előnyösen megfestjük, hogy megkönnyítsük a szelektálást.EN 204561 is removed from the green plant, or if it is derived from white plant material, it is preferably stained to facilitate selection.
Ogura CMS Brassica oleracea növény inaktivált vagy sejtmagmentes protoplasztjait önmagában is- 5 mert módon a megfelelő Ogura CMS Brassica oleracea növényi sejtekből vagy protoplasztokból állítjuk elő, pl. besugárzás vagy más olyan standard eljárások segítségével, amelyek a sejtmagnak a sejtanyagból történő eltávolítására ismertek; ilyen pl, a centrifu- 10 gálás.Inactivated or nuclear-free protoplasts of the Ogura CMS Brassica oleracea plant alone are produced from the corresponding Ogura CMS Brassica oleracea plant cells or protoplasts, e.g. irradiation or other standard methods known to remove nucleus from cellular material; such as centrifugation.
A sejtmag inaktiválását gamma-, UV- vagy röntgensugárzás segítségével hajthatjuk végre.Inactivation of the nucleus can be accomplished by gamma, UV or X-rays.
Ahol a besugárzást valamely röntgensugár-forrással hajtjuk végre, a mag inaktiválását általában pl. 15 10 krad/perc dózis 3-20 percen át történő alkalmazásával éqük el.Where irradiation is effected by means of an X-ray source, inactivation of the core is generally effected e.g. The dose is 15 to 10 minutes per minute for 3 to 20 minutes.
A megfelelő röntgensugár-adagot, pl. annak a minimális röntgenbesugárzási szintnek a meghatározásával állapíthatjuk meg, amely a protoplaszt-populá- 20 ciő 100%-át elpusztítja; az elpusztult sejtek százaié-, kát a tenyészetben képződött telepek számából becsüljük meg 10-20 nap múlva. Ahhoz, hogy a sejttelepek kis sűrűségnél történő fejlődéséhez optimális körülményeket kapjunk, kívánatos egy tápláló rété- 25 get, egy előkondicionált tenyésztőközeget, vagy megfelelő sejtmentő eljárást alkalmazni. A sejtosztódás inaktiválásához szükséges minimális dózis meghatározása után a protoplasztokat őt különböző röntgensugárzási szintnek tesszük ki: a minimális dózisnak, 30 valamint 10 és 20 kraddal a minimális dózis felett és alatt. Az így kapott protoplasztokat azután a jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazzuk.A suitable dose of X-ray, e.g. determining the level of minimal X-ray radiation that kills 100% of the protoplast population; the number of dead cells, estimated from the number of colonies formed in the culture, is estimated to be 10 to 20 days later. In order to obtain optimal conditions for the development of cell sites at low density, it is desirable to use a nourishing layer, a preconditioned culture medium, or a suitable cell rescue method. After determining the minimum dose required to inactivate cell division, the protoplasts are subjected to different levels of X-rays at a minimum dose of 30 and 10 and 20 times the minimum dose and below. The protoplasts thus obtained are then used in the process of the present invention.
Általában kielégítő sejtmag-inaktiválást érhetünk el a’Co-tal 3-30 krad közötti tartományban végzett gam- 35 ma-besugárzással.Generally, satisfactory nucleus inactivation can be achieved with gamma irradiation in the range of 3 to 30 cr.
A sejtmagmentesítést végezhetjük úgy is, hogy a protoplasztokat nagy ozmotikus értékű tápközegben inkubáljuk, így sejtmagmentes alprotoplasztokat kapunk. 40The nucleation can also be accomplished by incubating the protoplasts in medium with high osmotic value to obtain cell-free alprotoplasts. 40
Sejtmagok ultracentrifugálásos eltávolítására alkalmas módszert, ami a találmány szerinti sejtmagmentes protoplaszt-kiíndulásí anyag előállítására alkalmas, ismertet Spangenberg az alábbi irodalmi helyen: EUROPEAN JOURNAL OF CELL BIOLOOY 45 39, 41-45 (1985). Előnyösen Cytochalasine B-t adagolunk, hogy megkönnyítsük a sejtmagok kijutását a sejtekből.A suitable method for the ultracentrifugation of cell nuclei, which is suitable for the preparation of the cell-free protoplast excretion material of the present invention, is described in Spangenberg, EUROPEAN JOURNAL OF CELL BIOLOOY 45 39, 41-45 (1985). Preferably, Cytochalasine B is added to facilitate the release of nuclei from the cells.
Ogura CMS Brassica oleracea növényeket klasszikus tenyésztési technikákkal is kaphatunk B.oleracea- 50 bői és CMS Raphanus sativusból (lásd a jelen bejelentés bevezetőrészét).Ogura CMS Brassica oleracea plants can also be obtained by conventional culture techniques from B. oleracea 50 and CMS Raphanus sativus (see introduction to this application).
‘ Figyelembe kell venni, hogy a találmány szerinti eljárással előállított Brassica növényeket kiindulási anyagként alkalmazhatjuk más Brassica oleracea vál- 55 tozatokhoz, amelyek rendelkeznek az Ogura CMS citoplazma kívánt mitokondríumaíval, a normális megtermékenyített B.oleracea kloroplasztjaival és kívánt esetben további kívánatos jellemzőkkel; ezek előállításához in vitro és/vagy keresztezés! techniká- 60 kát alkalmazhatunk. Az ilyen iv vitro és keresztezési technikák a gyakorlott tenyésztők számára ismeretesek a szakirodalomból.'It should be noted that the Brassica plants produced by the process of the present invention may be used as starting materials for other Brassica oleracea strains having the desired mitochondrial matrix of Ogura CMS, with chloroplasts of normal fertilized B.oleracea and, if desired, further desirable characteristics; for their production in vitro and / or crossing! Techniques may be used. Such in vitro and crossover techniques are well known to those skilled in the art from the literature.
A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük.The following examples illustrate the process of the invention.
A kísérletekben alkalmazott oldatok az alábbiak (a %-értékek tömeg%-ot jelölnek, hacsak másképpen nemjelöljük):The solutions used in the experiments are as follows (% values are% by weight unless otherwise indicated):
a) TVL-oldata) TVL solution
0,3 mól/Iiter szorbit0.3 mol / liter of sorbitol
0,05 mól/1 CaCl2«2H2O pH=5,6-5,80.05 mol / L CaCl 2 · 2H 2 O pH 5.6-5.8
b) Enzimoldatb) Enzyme solution
0,6-1% cellulizin0.6-1% cellulizine
0,1% maceráz0.1% macerase
BRl-ben feloldva, de kétszeres szacharózkoncentrációval, agaróz nélkül, és tízszeres koncentrációDissolved in BRl but with double sucrose without agarose and tenfold concentration
2,4-D-vel pH-5,4-5,8With 2,4-D pH-5,4-5,8
c) W5 oldat (1 liter) l8,4gCaCl2«2H2O 9,0 g NaClc) Solution W5 (1 L) of 18.4 gCaCl 2 2H 2 O 9.0 g NaCl
1,0 g glükóz1.0 g of glucose
0,8gKCl pH-5,6-5,80.8gKCl pH-5.6-5.8
d) CPW16s(l liter)d) CPW16s (l liter)
16% szacharóz 0,0272 g KH2PO4 0,1010 gKNOs 1,4800 g CaCI2«2H2O 0,2460 MgSO4«2H2O 0,00016 g KI16% Sucrose 0.0272 g KH 2 PO 4 0.1010 gKNO 1.4800 g CaCl 2 2H 2 O 0.2460 MgSO 4 2H 2 O 0.00016 g KI
0,000025 g CuSO4’5H2O pH-5,5-5,80.000025 g of CuSO 4 '5H 2 O pH 5.5-5.8
e) 1. fúziós oldat (FS-l)e) Fusion Solution 1 (FS-1)
0,015 mól/1 szorbit 0,03 mól/l CaCl2»2H2O 0,075 mól/IKCl0.015 M CaCl 2 · 2H 2 O 0.075 mol / IKCl
0,05 mól/1 trisz(hídroxi-metil)-an±io-metán-hidroklorid pH-7,20.05 mol / l tris (hydroxymethyl) -ano-methane hydrochloride pH-7.2
f) 2. fúziós oldat (FS-2)f) Fusion Solution 2 (FS-2)
30-40% PEG (molekulatömeg: 1500) 0,3 mól/1 glükóz 50 mmól/1 CaCl2«2H2O30-40% PEG (molecular weight: 1500) 0.3 mol / L glucose 50 mM CaCl 2 2H 2 O
g) 3. fúziós oldat (FS-3)g) Fusion Solution 3 (FS-3)
13,3% PEG (molekulatömeg: 1500) 0,1 mól/l glükóz 0,067 mól/l szorbit 0,067 móI/lCaCl2«2H2O13.3% PEG (molecular weight: 1500) 0.1 mol / L glucose 0.067 mol / l sorbitol 0.067 mol / lCaCl 2? 2H 2 O
h) 4. fúziós oldat (FS-4)h) Fusion Solution 4 (FS-4)
6,7% PEG (molekulatömeg: 1500) 0,05 mól/l glükóz 0,083 mól/l szorbit 0,083 mól/l CaCI2*2H2O6.7% PEG (molecular weight: 1500) 0.05 mol / l glucose 0.083 mol / l sorbitol 0.083 mol / l CaCl 2 * 2H 2 O
HU 204561 ΒEN 204561
1. táblázatTable 1
A tápközegek összetétele (mg/1)Composition of media (mg / l)
* ml/1 ** lásd a példákat* ml / 1 ** see examples
Példák 1. példaExamples Example 1
Magsterilizálás és csírázásMagsterilization and germination
Brassica oleracea Delira típusú karfiolnak, amelyBrassica oleracea Delira type cauliflower, which
Raphanus sativus CMS Ogurából származó CMS citoplazmával bír (ezt a továbbiakban B.oleracea A 61043-nak nevezzük) magjait rövid időre 20%-os alkoholba mártjuk, és 1%-os nátrium-hipoklorid-oldatban 20 percig forgó rázógépen 160 fordulat/percnél 22 °C hómérsékleten sterilizáljuk. Ezután erőteljes öblítés szükséges steril desztillált vízzel. A magokat 1 tömeg% szacharózt tartalmazó, hormon nélküli MStápközegre helyezzük (lásd az 1. táblázatot). Steril zöld palánták neveléséhez a magokat replikalemeze5Raphanus sativus CMS has a CMS cytoplasm from Ogura (hereinafter referred to as B.oleracea called 61043) for a short time, dipped in 20% alcohol and in a 1% sodium hypochlorite solution for 20 minutes on a rotating shaker at 160 rpm 22 Sterilized at a temperature of ° C. Then rinse thoroughly with sterile distilled water. Seeds were placed on hormone-free medium containing 1% by weight of sucrose (see Table 1). To grow sterile green seedlings, the seeds are replicated5
HU 204561 Β ken növesztjük 16 órás megvilágítási perióduson át 3000 lux fényben, 22 ’C hőmérsékleten. Steril hajtásokat tenyésztünk azonos körülmények között műanyag tartályban.HU 204561 is grown over a 16-hour illumination period at 3000 lux at 22 ° C. Sterile shoots were cultured under the same conditions in a plastic container.
Fehér szövetekből történő protoplaszt izolálásához pl. hypocotyl-okat vagy a magokat Petri-csészékben sötétben 22 ’C hőmérsékleten növesztjük.To isolate protoplasts from white tissues, e.g. hypocotyls or seeds in Petri dishes are grown in the dark at 22 ° C.
2. példaExample 2
Az 1. példa eljárásával analóg módon Brassica oleracea SG 121 változat (karfiol), amelyet 1987. december 8-án az American Type Culture Collection-nél ATCC 40399 letéti számon deponáltunk, magjait sterilizáljukés csíráztatjuk.Analogously to the procedure of Example 1, Brassica oleracea SG 121 variant (cauliflower), deposited on December 8, 1987 at the American Type Culture Collection under deposit number ATCC 40399, is germinated by sterilization.
3. példaExample 3
Protoplasztok izolálásaIsolation of protoplasts
Az 1. példa szerinti növényi anyag négy hetes steril hajtásait kis darabokra vágjuk és előplazmolizáljuk mintegy 1 őrán átTVL-oldatban, sötétben.The four-week sterile shoots of the plant material of Example 1 were cut into small pieces and pre-plasmized in about 1 guillocraft in a dark solution.
A TVL-oIdatot eltávolítjuk és á növényi anyag bakteriális fertőzöttségét ellenőrizzük, az inkubált TVL-oldat egy részének egy éjszakán át baktéríumtápközegben 22 ’C hőmérsékleten végzett tenyésztésével.The TVL-αdate was removed and the bacterial contamination of the plant material was checked by culturing a portion of the incubated TVL solution in culture medium at 22 ° C overnight.
Az anyaghoz enzimoldatot adunk, amely 0,6-1% celluüzint és 0,1% macerázt tartalmaz, és az anyagot 16 őrán át inkubáljuk sötétben 22 ’C hőmérsékleten.An enzyme solution containing 0.6-1% of cellulose and 0.1% macerase was added to the material and the substance was incubated through 16 guards in the dark at 22 ° C.
A szuszpenziót azután nylon hálón keresztül (70 pm) átszűrjük, és mossuk fél térfogat CPWlős oldattal 750 fordulat/percnél végzett centrifugálással 7 percig. Ez az ép protoplasztok lebegtetését eredményezi. A protoplasztokat összegyűjtjük, és először W5 oldattal öblítjük, majd az 1. fúziós oldattal mossuk 500 fordulat/percnél 5 percen át végzett centrifugálás segítségével.The suspension was then filtered through a nylon mesh (70 µm) and washed with half a volume of CPW solution at centrifugation at 750 rpm for 7 minutes. This results in the floating of intact protoplasts. The protoplasts were collected and rinsed first with W5 solution and then washed with the fusion solution 1 at 500 rpm for 5 minutes.
4. példaExample 4
Az 1. példa szerintí növényi anyag 8 napos hypocotyÍjait izoláljuk a 3. példa eljárása szerint, azzal a különbséggel, hogy az enzimes kezelés során 1 pg/ml fluoreszcein-izotiocianátof adunk hozzá. Ezen a módon kézi vagy gépi szelektáláshoz alkalmas festett protoplasztokat kapunk.The 8-day hypocotypes of the plant material of Example 1 were isolated according to the procedure of Example 3, with the exception that 1 µg / ml fluorescein isothiocyanate was added during enzymatic treatment. In this way, painted protoplasts suitable for manual or machine selection are obtained.
5. példaExample 5
Brassica oleracea SG 121 változat (karfiol) magjait sterilezzük és csíráztatjuk az 1. példa eljárása szerint, és ennek 4 hetes hajtásait kezeljük a 3. példa eljárása szerint, így kapjuk meg a B.oleracea SG 121 változat protoplasztjait.The seeds of Brassica oleracea SG 121 (cauliflower) are sterilized and germinated according to the procedure of Example 1 and treated for 4 weeks with the method of Example 3 to obtain protoplasts of B.oleracea SG 121.
6. példaExample 6
B.oleracea SG 121 változat (karfiol) magjait sterilizáljuk és csíráztatjuk az 1. példa eljárása szerint, és ennek 8 napos hypocotyljait kezeljük a 3. példa eljárása szerint azzal az eltéréssel, hogy az enzimes kezelés során 1 pg/ml fluoreszcein-izocianátot adunk hozzá, hogy a kézi vagy gépi szelektáláshoz alkalmas festett protoplasztokat kapjuk.B.oleracea SG 121 (cauliflower) seeds were sterilized and germinated according to the procedure of Example 1, and treated for 8 days with hypocotyls according to the procedure of Example 3 with the addition of 1 µg / ml fluorescein isocyanate during enzymatic treatment. to obtain painted protoplasts suitable for manual or machine selection.
7. példaExample 7
Protoplasztok besugárzása A 3. példa szerint frissen izolált protoplasztokat helyezünk 6 cm-es Petri-csészékre W5 oldatban (2 ml). A protoplasztokat röntgensugár-forrást (Baltoblac CE 100) alkalmazva 10 krad/perc dózissal 5-20 percig besugározzuk. Besugárzás után az inaktivált protoplasztokat 1. fúziós oldattal hígítjuk, mielőtt felhasználnánk fúziós kísérletekhez.Irradiation of Protoplasts The freshly isolated protoplasts of Example 3 were placed in 6 cm Petri dishes in W5 (2 mL). The protoplasts were irradiated with an X-ray source (Baltoblac CE 100) at a dose of 10 kr / min for 5-20 minutes. After irradiation, the inactivated protoplasts are diluted with the first fusion solution before being used for fusion experiments.
8. példaExample 8
Citoplasztizolálás ultracentrifugálással Egy gradiensre, amely 10 ml szacharózzal telített 15 vízből és 4ml 1,5 mól/1 szorbitból áll, és 0,5% dimetilszulfoxidot (DMSO) és 30 pg/ml cytochalasine B-t tartalmaz, 2 ml (=1406). 3. példa szerint előállított protoplasztot terhelünk 1. fúziós oldatban. Az anyagot 15 perces centrifugálásnak vetjük alá 4000 g-nál 25 ’C 20 hőmérsékleten, hogy B.oleracea A 61043 sejtmagmentes citoplasztjaitkapjuk.Cytoplasmization by Ultracentrifugation A gradient of 10 ml of sucrose saturated water and 4 ml of 1.5 mol / l sorbitol and 0.5% of dimethylsulfoxide (DMSO) and 30 pg / ml of cytochalasine Bt contains 2 ml (= 140 6 ). The protoplast prepared according to Example 3 is loaded in fusion solution 1. The material was subjected to a 15-minute centrifugation at 4000 g at 25 ° C to obtain B.oleracea A 61043 nuclear-free cytoplasm.
9. példaExample 9
Fúziós eljárásFusion procedure
Az 5. és 7. igénypont szerinti protoplasztokat steril kamrában steril légáramlás mellett 1:1 arányban összekeverjük 5405 protoplaszt (pps)/ml 1. fúziós oldat végsőkoncentrációban.The protoplasts of claims 5 and 7 are mixed in a sterile chamber at a 1: 1 sterile air flow to a final concentration of 540 5 protoplasts (pps) / ml fusion solution 1.
200 μΐ-es cseppecskéket helyezünk el be nem fedett200 μΐ droplets are placed in the uncovered
Petri-csészébe (5-7 csepp/6 cm-es Petri-csésze) és 15 percig hagyjuk leülepedni. (A steril légáramlást lekapcsoljuk, hogy elkerüljük a leülepedő protoplasztok zavarását.) 2. fúziós oldatot (25-100 pl/cseppecske) adunk hozzá, hogy agglutinációt indukáljuk 3-7 percig.Allow the petri dish (5-7 drops / 6 cm petri dish) to settle for 15 minutes. (The sterile air flow is switched off to avoid disturbing the settling protoplasts.) A fusion solution (25-100 µl / droplet) is added to induce agglutination for 3-7 minutes.
A steril légáramlást ismét bekapcsoljuk, és 5 perc múlva 1 ml oldatot lecserélünk 1 ml 3. fúziós oldattal, majd azt 5 perc múlva lecseréljük 1 ml 4. fúziós oldattal 5 percre. Végül a fúziós oldatokat 1,5 ml-es te40 nyésztő tápközeggel (BC-1) cseréljük le.The sterile airflow is again switched on and after 5 minutes, 1 ml of the solution is replaced by 1 ml of fusion solution 3 and then replaced in 5 minutes with 1 ml of fusion solution 4 for 5 minutes. Finally, the fusion solutions were replaced with 1.5 ml of te40 culture medium (BC-1).
10.példa10.példa
Fúziós termékek szelektálása és növesztése 45 A fuzionált sejteket, amelyeket vizuálisan fel lehet ismerni a kettős fluoreszcencia jelenlétével, mikromanipulátorral felvesszük.Selection and growth of fusion products 45 Fused cells, which can be visually recognized by the presence of double fluorescence, are taken up with a micromanipulator.
Hibrideket vagy cibrideket tenyésztünk Biopor szűrőmembránokon, amelyek átmérője 1,1 cm vagy 3 cm 50 és pórusmérete 0,45-3 pm; ezek 100—1G5 sejtet tartalmaznak 1 ml 1. tenyésztő tápközegre számítva. A szűrőket 2-2,5 ml táplálósejtet (lOVml) tartalmazó Petricsészébe helyezzük és az anyagot 22 ’C hőmérsékleten sötétben inkubáljuk.Hybrids or cibrides were cultured on Biopor filter membranes having a diameter of 1.1 cm or 3 cm 50 and a pore size of 0.45 to 3 µm; they contain 100-1G of 5 cells per ml of culture medium. The filters are placed in a Petri dish containing 2 to 2.5 ml of nutrient cell (IOVml) and incubated at 22 ° C in the dark.
Amikor a sejtek 20%-a osztódik, 2. tenyésztő tápközeget adunk hozzá.When 20% of the cells are divided, culture medium 2 is added.
Amikor tipikus csillag alakú mikrokallusz fejlődik ki, ezeket befedett Petri-csészében lévő 1. regeneráló tápkőzegbe visszük át (BR-1) és 22 ’C hőmérsékleten, 60 500 luxnál tenyésztjük 4-6 héten át.When a typical star-shaped microchip develops, it is transferred to a regenerating feed bed in the covered Petri dish (BR-1) and cultured at 22 ° C for 60,500 lux for 4-6 weeks.
HU 204 561 ΒEN 204 561
11. példaExample 11
A 4. példa eljárása szerint festett hypocotyl protoplasztokat sugárzunk be a 7. példa eljárása szerint. Az így kapott inaktivált, festett protoplasztokat az 5. példa szerinti protoplasztokkal fuzionáljuk, majd a fuzionált protoplasztokat olyan sejtosztályozó berendezésben szelektáljuk, amely higanylámpával (HB 100) van felszerelve két paraméteres fluoreszcenciás osztályozáshoz.The hypocotyl protoplasts stained according to the procedure of Example 4 were irradiated according to the procedure of Example 7. The inactivated stained protoplasts thus obtained were fused with the protoplasts of Example 5 and the fused protoplasts were selected in a cell sorting apparatus equipped with a mercury lamp (HB 100) for two parameter fluorescence grading.
A sejtosztályozó fluoreszcenciás gerjesztő sugarát 488 és 500 nm közé állítjuk be. A gerjesztett sejtekből jövő emissziós sugárzást „dikroitikus” tükrök bontják két fénysugárra: az egyik 560 és 610 nm közti hullámhosszúságú, ez a kloroplasztok autofluoreszcenciáját képviseli, és a másik 500 és 560 nm közti hullámhosszúságú, ez a fluoreszcein-izotiocianát fluoreszcenciáját képviseli. Két fotosokszorozót alkalmazunk ezeknek a jeleknek a mérésére. A burkoló folyadék (hordozó folyadék, amelyet a sejtosztályozóban arra alkalmazunk, hogy hígítsa a protoplasztmintát folyamatos folyadékáramban) autoklávozott és gázmentesített W5 tápközeget tartalmaz.The fluorescent excitation radius of the cell classifier is adjusted between 488 and 500 nm. Emission radiation from excited cells is broken down by "dichroic" mirrors on two light beams: one with a wavelength of between 560 and 610 nm, representing the autofluorescence of chloroplasts, and the other having a fluorescence of fluorescein isothiocyanate at 500 to 560 nm. Two photoconductors are used to measure these signals. The coating fluid (carrier fluid used in the cell classifier to dilute the protoplast sample in a continuous flow of fluid) contains autoclaved and degassed W5 medium.
Az osztályozó azon az elven alapul, hogy a nemfuzionált szülősejtek fluoreszcenciája csak egyedi fluoreszcenciát mutat (a levél mezofil protoplasztok vörös fluoreszcenciája vagy a festett hypocotyl protoplasztok fluoreszcein-izotiocianát sárga/zöld fluoreszcenciája), míg a fuzionált sejtek kettős fluoreszcenciát mutatnak (vörös és sárga/zöld).The classifier is based on the principle that the fluorescence of non-fused parent cells exhibits only unique fluorescence (red fluorescence of leaf mesophilic protoplasts or yellow / green fluorescence of fluorescein isothiocyanate of dyed hypocotyl protoplasts), while fused cells exhibit double fluorescence (red and yellow / green). ).
A kiválasztott hibrideket és cibrideket azonos módon tenyésztjük, mint amelyet a mikromanipulációval szelektált sejteknél alkalmaztunk.The selected hybrids and cibrides were cultured in the same manner as used for micromanipulated cells.
12. példaExample 12
A 9. példa szerinti teljes fúziós keveréket Petri-csészében tartjuk, amelyben a fúziót végrehajtjuk, és sötétben 22 °C hőmérsékleten tenyésztjük. 1-2 nap múlva a sejteket pipettával átvisszük egy lefedett Petri-csészébe. Mintegy 7-14 nap múlva, amikor a sejtek 10%a osztódik, kétszeres térfogatú 2. tenyésztő tápközeget (BC-2) adunk hozzá. 10 nappal később további egyszeres térfogatú BC-2-t adunk hozzá. A sejteket továbbtenyésztjük sötétben 22 °C hőmérsékleten. 2-4 hét múlva, amikor a sejtek tipikus csillag alakú mikrokalluszokat képeznek, a sejteket átvisszük 1. regeneráló tápközegbe. A mikrokalluszokat azután kis fényintenzitású (500 lux), 16 órás fotoperiódus mellett tenyésztjük 22 °C hőmérsékleten.The total fusion mixture of Example 9 was held in a Petri dish in which the fusion was performed and cultured at 22 ° C in the dark. After 1-2 days, the cells are pipetted into a covered petri dish. After about 7 to 14 days, when 10% of the cells divide, two-fold culture medium (BC-2) was added. Ten days later, additional single volume BC-2 was added. Cells were further cultured in the dark at 22 ° C. After 2-4 weeks, when the cells form typical star-shaped microcells, the cells are transferred to regeneration medium 1. The microcells are then cultured at low light intensity (500 lux) for 16 hours at 22 ° C.
13. példaExample 13
Növényregenerálásplant regeneration
A 12. igénypont szerinti kalluszokat, amelyek 2—5 mm átmérőnagyságúra fejlődtek, átvisszük 2. regeneráló tápközegbe (BR-2) és 22 °C hőmérsékleten 3000 luxnál 16 órás fotoperiódussal tenyésztjük.The callus according to claim 12, which has evolved to a diameter of 2 to 5 mm, are transferred to regeneration medium 2 (BR-2) and cultured at 22 ° C at 3000 lux for 16 hours.
Mintegy 1 cm-es hajtásokat átviszünk MS-tápközegbe, amely 1% szacharózt tartalmaz és hormont nem tartalmaz, és gyökereztetjük.Approximately 1 cm shoots are transferred to MS medium containing 1% sucrose and free of hormone and rooted.
14. példaExample 14
Fúziós termékek molekuláris elemzéseMolecular analysis of fusion products
a) Sejtmag DNS-összetétela) Cell nuclear DNA composition
A fúziós termékek sejtmagösszetételének jellemzését fajlagos DNS-vizsgáló mintákat alkalmazva hajtjuk végre. Arabidopsis thaliana béta-tubulin génjének egy 0,9 kb-s KpnI/BamHI fragmentuma hibridizál különböző csíkokkal a B.oleracea A 61043 CMS donor sejtmag DNS-e endonukleázos emésztési mintájában. Ez az emésztési minta B.oleracea A 61043-ra fajlagos és külbözik azokétól a B.oleracea tenyésztővonalakétól, amelyeket befogadóként alkalmazunk a CMS-jellemzőkhöz. (1. A ábra)The characterization of the nucleus composition of the fusion products is performed using specific DNA test samples. A 0.9 kb KpnI / BamHI fragment of the beta tubulin gene of Arabidopsis thaliana hybridizes with different bands in the endonuclease digestion of B.oleracea A 61043 CMS donor nucleus DNA. This digestion pattern is specific for B.oleracea A 61043 and differs from the B.oleracea culture lines that are used as receptors for CMS characteristics. (Figure 1A)
b) Mitokondriális DNS-kompozíciób) Mitochondrial DNA composition
A jellemzést pBO 604 DNS-sel végezzük; egy olyan kiónt, amelyet Raphanus sativus Ogura CMS citöplazmája mitokondriális DNS-éből eredő 1,5 kbp-s SacI fragmentumot tartalmaz. A klón hibridizáló jeleket ad B.oleracea A 61043 Ogura CMS citoplazmáiból eredő mitokondriális DNS restrekciós, endonukleázos emésztményével, de nem ad jeleket a B.oleracea tenyészvonal megtermékenyített citoplazmájából származó mitokondriális DNS-sel.Characterization is performed with pBO 604 DNA; a clone containing a 1.5 kbp SacI fragment from the mitochondrial DNA of raphanus sativus Ogura CMS. The clone gives hybridizing signals to B. oleracea The mitochondrial DNA digestion of endothelial DNA from the cytoplasm of the 61043 Ogura CMS cytoplasm, but it does not signal mitochondrial DNA from the fertilized cytoplasm of B.oleracea breeding line.
c) Kloroplaszt DNS-összetételc) Chloroplast DNA composition
Az Ogura CMS citoplazma klorózisra érzékeny kloroplasztjaiban jelen lévő DNS-t a lambda Bcp 17 vizsgáló mintával jellemezzük. Ez a klón egy Ogura CMS-kloroplaszt DNS-ből származó 4,5 kbp-s XhoI/SacI fragmentumot tartalmaz. A klón hibridizál egy 57,5 kbp-s csíkkal, amely az Ogura CMS-kloroplaszt DNS Sall emésztményében van és egy 9,9 kbp-s csíkkal, amely B.oleracea tenyészvonalban levő megtermékenyített citoplazmákból származó kloroplaszt DNS Sall emésztményében van (1. C ábra).DNA present in chloroplasts of chloroplasts susceptible to Ogura CMS cytoplasm is characterized by the lambda Bcp17 assay. This clone contains a 4.5 kbp XhoI / SacI fragment from Ogura CMS chloroplast DNA. The clone hybridizes with a 57.5 kbp band in the Ogura CMS-chloroplast DNA Saliva digestion and a 9.9 kbp band in the Sall digestion of chloroplast DNA from fertilized cytoplasm in B.oleracea (line 1) figure).
Az 1. A, 1. B és 1. C ábrák a fotók pontos, kézzel rajzolt másolatai.Figures 1 A, 1 B and 1 C are accurate, hand-drawn copies of photographs.
Claims (1)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB878729403A GB8729403D0 (en) | 1987-12-17 | 1987-12-17 | Improvements in/relating to organic systems |
GB888807501A GB8807501D0 (en) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | Improvements in/relating to organic systems |
GB888820643A GB8820643D0 (en) | 1988-09-01 | 1988-09-01 | Improvements in/relating to organic systems |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUT52665A HUT52665A (en) | 1990-08-28 |
HU204561B true HU204561B (en) | 1992-01-28 |
Family
ID=27263709
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU886163A HU204561B (en) | 1987-12-17 | 1988-12-02 | Process for producing hybrid brassicaceae with citoplasmic male sterility |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE3842473C2 (en) |
FR (1) | FR2628601B1 (en) |
GB (1) | GB2211205B (en) |
HU (1) | HU204561B (en) |
IT (1) | IT1233373B (en) |
NL (1) | NL195093C (en) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2667078B1 (en) * | 1990-09-21 | 1994-09-16 | Agronomique Inst Nat Rech | DNA SEQUENCE GIVING MALE CYTOPLASMIC STERILITY, MITOCHONDRIAL, MITOCHONDRIA AND PLANT CONTAINING THE SAME, AND PROCESS FOR THE PREPARATION OF HYBRIDS. |
NL194904C (en) * | 1993-07-14 | 2003-07-04 | Sakata Seed Corp | Male sterile plant. |
GB9318429D0 (en) * | 1993-09-06 | 1993-10-20 | Zaadunic B V | Improvements in or relating to organic compounds |
DE69518679T2 (en) * | 1994-03-10 | 2001-04-12 | Takii Shubyo K.K., Kyoto | Hybrid breeding method for cultivated plants of the Brassicaceae family |
WO1996021010A1 (en) * | 1994-12-30 | 1996-07-11 | Asgrow Seed Company | Male sterile brassica oleracea plants |
DE69507146T3 (en) * | 1995-11-02 | 2007-05-10 | Enza Zaden Beheer B.V. | Cytoplasmic male-sterile plant cell of the Compositae family and method for producing the plant |
NL1003239C2 (en) * | 1996-05-31 | 1997-12-03 | Bejo Zaden Bv | Cytoplasmic male sterile Brassica oleracea plant, as well as a method for obtaining such a plant. |
FR2749321B1 (en) * | 1996-05-31 | 1998-08-21 | Florimond Desprez Veuve Et Fil | RECOMBINANT PLANT GENOME, MITOCHONDRIA AND CELL CONTAINING THE SAME, AND METHOD FOR SELECTING MALE CYTOPLASMIC STERILITY IN A CICHORIUM PLANT |
DE10136378C2 (en) * | 2001-07-26 | 2003-07-31 | Norddeutsche Pflanzenzucht Han | Male sterility in grasses of the genus Lolium |
EP2061303A2 (en) * | 2006-09-13 | 2009-05-27 | Syngeta Participations AG | Novel rucola plants with cytoplasmic male sterility (cms) |
EP2111748A1 (en) * | 2008-04-24 | 2009-10-28 | Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel B.V. | Cytoplasmic male sterile rucola |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2542569B1 (en) * | 1983-03-16 | 1986-01-24 | Agronomique Inst Nat Rech | PROCESS FOR SOMATIC HYBRIDIZED COLZA AND HYBRID COLZA OBTAINED |
EP0214601A3 (en) * | 1985-09-04 | 1988-08-31 | DNA PLANT TECHNOLOGY CORPORATION (under the laws of the state of Delaware) | Creation of cytoplasmic male sterility maintainer line trough protoplast fusion |
US4751347A (en) * | 1986-11-07 | 1988-06-14 | Allelix, Inc. | Process for transferring cytoplasmic elements in Brassica, and products thereof |
-
1988
- 1988-12-02 HU HU886163A patent/HU204561B/en unknown
- 1988-12-14 GB GB8829201A patent/GB2211205B/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-15 FR FR888816571A patent/FR2628601B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-16 DE DE3842473A patent/DE3842473C2/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-12-16 IT IT8822978A patent/IT1233373B/en active
- 1988-12-16 NL NL8803089A patent/NL195093C/en active Search and Examination
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NL8803089A (en) | 1989-07-17 |
GB2211205A (en) | 1989-06-28 |
FR2628601B1 (en) | 1994-09-09 |
DE3842473A1 (en) | 1989-06-29 |
GB8829201D0 (en) | 1989-01-25 |
FR2628601A1 (en) | 1989-09-22 |
NL195093C (en) | 2003-12-16 |
GB2211205B (en) | 1992-06-10 |
DE3842473C2 (en) | 1995-07-27 |
HUT52665A (en) | 1990-08-28 |
IT1233373B (en) | 1992-03-27 |
IT8822978A0 (en) | 1988-12-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5254802A (en) | Male sterile brassica plants | |
Sacristan | Resistance responses to Phoma lingam of plants regenerated from selected cell and embryogenic cultures of haploid Brassica napus | |
Steinitz et al. | Pepper (Capsicum annuum L.) regenerants obtained by direct somatic embryogenesis fail to develop a shoot | |
Espinasse et al. | Shoot regeneration of callus derived from globular to torpedo embryos from 59 sunflower genotypes | |
HU204561B (en) | Process for producing hybrid brassicaceae with citoplasmic male sterility | |
US6046383A (en) | Cytoplasmic male sterile Brassica oleracea plants which contain the polima CMS cytoplasm and are male sterile at high and low temperatures | |
Heath-Pagliuso et al. | Somaclonal variation in celery: screening for resistance to Fusarium oxysporum f. sp. apii | |
EP0771523B2 (en) | A cytoplasmic male sterile vegetable plant cell of the compositae family and also a method for obtaining such a plant | |
EP0132360A2 (en) | Plant growth medium | |
JP3095242B2 (en) | Method for producing and growing hybrid plant of onion and garlic or chive | |
Hymowitz et al. | Plant regeneration from leaf explants of Glycine clandestina Wendl | |
DE69019034T2 (en) | Process for the production of hybrid plants of allium. | |
Kao et al. | Efficient plant regeneration from hypocotyl protoplasts of broccoli (Brassica oleracea L. ssp. italica Plenck) | |
AU716124B2 (en) | Cytoplasmic male sterile brassica oleracea plants which contain the polima CMS cytoplasm and are male sterile at high and low temperatures | |
Shao et al. | Production of primary triticale from calluses of immature abnormal hybrid embryos between Triticum durum and Secale cereale | |
AU633108B2 (en) | Method for the suspension culture of haploid maize male gametophytes and products therefrom | |
Geerts et al. | Development of an in vitro pod culture technique for young pods of Phaseolus vulgaris L. | |
US4795705A (en) | Methods of producing herbicide resistant plant varieties and plants produced thereby | |
EP0327970A2 (en) | Method of producing rice cybrid cells | |
US4900676A (en) | Method of producing herbicide resistant plant varieties and plants produced thereby | |
FR2695798A1 (en) | Male-sterile Brassica oleracea plants | |
RU2265319C2 (en) | Meristem regeneration method | |
WO2002001940A2 (en) | A method of generating fertile plants from isolated microspores | |
Taski-Ajdukovic et al. | Shoot development from hypocotyl protoplasts of sunflower (Helianthus annuus L.) | |
EP0585275A1 (en) | Improvements in or relating to organic compounds |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: SANDOZ AG., CH |
|
HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: NOVARTIS AG (NOVARTIS SA, NOVARTIS INC.), CH |
|
HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: SYNGENTA PARTICIPATIONS AG, CH |