KR890004026B1 - 원형질체의 배양방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

원형질체의 배양방법
본 발명은 원형질체(protoplast)의 배양방법의 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 원형질체를 액체 배지에서 배양함으로써 원형질체로 부터 세포 송이(cell cluster)또는 칼루스(callus)를 유도하는 방법에 관한 것이다.
원형질체는 식물, 박테리아, 진균 등으로부터 세포벽을 제거한 세포이다. 원형질체는 세포벽을 갖지 않기 때문에, 세포융합, 유전자 조작 및 인공적 체세포 돌연변이와 같은 인공적 조작이 용이하다. 그러므로, 조작된 원형질체로 부터 완전한 식물이 재생될 수 있다면, 야생형 식물이 갖지 않는 특징적 이점을 갖는 식물체를 수득할 수 있다. 칼루스 또는 세포 송이로 부터 완전한 식물체가 재생될 수 있다는 보고가 많은 식물에 대해 공지되어 있다.
그러므로, 칼루스 원형질체로 부터 유도할 수 있다면, 완전한 식물체가 마찬가지로 칼루스 및 원형질체로 부터 재생된다. 담배와 같은 쌍자엽 식물에 대해 원형질체로 부터 완전한 식물체를 재생할 수 있는 몇가지 기술이 공지되어 있다. 그러나, 벼. 밀 옥수수와 같은 포아풀과의 식물에 대해서는, 옥수수 및 목초에 대해서만 완전한 식물체가 재생될 수 있다는 것이 보고되었다. 벼에 대해서는 극소수의 기술만이 하기와 같이 보고되었다. 원형질체의 공지의 배양방법은 원형질체를 반고체 한천 배지에 파묻는 방법, 원형질체를 액체 배지에 현탁시키는 방법 및 급식 세포를 사용하여 원형질체를 배양한는 방법과 같은 원형질체의 배양방법이다. 그러나, 이들 기술의 벼, 밀 및 옥수수를 포함한 포아폴 식물과 같은 다른 식물을 배양하는 데는 효과적이 아니다. 예를들어, 벼의 원형질체를 이들 공지 방법 중의 하나로 배양한다면 원형질체가 죽거나 성장할 수 없다.
벼의 원형질체의 배양방법으로는, 질산염 환원 효소가 부족한 세포로 부터 수득된 원형질체로 부터 칼루스를 유도하는 방법(Wakasa et al., J. plant Physiol. 117 : pp.223∼231(1984)) 및 꽃가루의 칼루스로부터 수득된 원형질체로부터 유도된 칼루스로부터 어린가지를 재생시키는 방법(Ohnh et al., Japanese Journal of Breeding 35 : pp 54∼55(1985))이 보고되었다. 그러나, 이들 기술은 특정, 칼루스로부터 형성된 원형질체를 이용하며, 각종 칼루스 또는 조직으로 부터 형성된 모든 종류의 원형질체에 적용되는 것은 아니다. 즉, 이들 기술이 대부분의 종류의 원형질체를 재생할 수는 없다.
한편, 벼의 배양된 세포로부터 완전한 식물체를 재생하는 많은 연구가 보고 되었다 (Nishi et al., Nature 219 : pp 508∼509(1968)). 그러나, 이들 기술은 원형질체를 이용하지 않는다. 더우기, 이들 기술에 사용되는 높은 분화력을 갖는 세포로 부터 원형질체를 수득하는 것은 곤란하며, 원형질체의 배양 또한 곤란하다는 것이 발견 되었다.
그러므로, 원형질체로부터 칼루스 또는 세포 송이를 유도하고, 식물체의 일반적 또는 비-특정 세포로 부터 유래된 원형질체에 적용되어 재생할 수 있는 원형질체의 배양방법의 개발이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 원형질체로 부터 세포 송이 또는 칼루스를 유도하고, 식물체의 일반적 또는 비-특정 세포로 부터 유래된 원형질체를 재생 및 적용 할 수 있는 원형질체의 배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 방법에 따라, 원형질체를 pH가 5.2 이하인 액체 배지에서 배양한다. 원형질체를 배양하는 공지방법에서, 배양 배지의 pH는 5.5∼6.0으로 조절된다.
본 발명은 배양 배지의 pH를 5.2 이하로 조절하면, 원형질체가 잘 성장하고 세포 송이를 형성한다는 본 발명자들의 놀라운 발견을 기초로 한 것이다.
본 발명의 방법에 의해, 쌍자엽 식물의 원형질체 뿐만 아니라 단자엽 식물의 원형질체도 잘 성장되여 칼루스 또는 세포 송이를 형성할 수 있다.
상술한 바와같이, 본 발명의 방법에 따라, 원형질체를 pH가 5.2 이하인 액체 배지에서배양한다. 액체 배양 배지의 바람직한 pH는 3.5∼5.2, 더 바람직하게는 4.0∼4.7 이다. pH의 조절은 산(또는 어떤 경우에 염기)을 가함으로써 수행될 수 있다. 원형질체의 성장이 역 효과를 받지 않는 어떤 산(또는 염기)도 pH 조절을 위해 사용될 수 있으며, 이런 목적을 위해 HCl 및 KOH가 편리하게 사용될 수 있다.
원형질체의 배양을 위해 통상적으로 사용되는 어떤 배지도 pH를 5.2 이하로 조절한후 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 예를들어, 배양될 원형질체가 벼[오리자 사티바(Oryza sativa), 오리자 글라베리마(Oryza glaberrima) 및 오리자 페레니스(Oryza perennis)등과 같이 오리자 속에 속하는 식물], B5 배지 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50, pp151∼158(1968)), N6 배지 (Chu et al., Scientia Scinica 18, pp 659∼663(1975)) 및 R2 배지(Ohira et al., Plant Cell Physiol., 14, pp 1113∼1121(1973))가 배양 배지로 사용될 수 있다.마찬가지로, 배양될 원형질체가 피튜우니어의 원형질체이면, NT 배지(Nagata and Takebe, Planta 99, pp12∼20(1971))가 사용될 수 있다. 배지는 2, 4-디클로로페녹시아세트산(이후 2, 4-D로 약칭함), 인돌 아세트산, 나프탈렌 아세트산, 벤질아데닌, 키네틴, 제아틴, 지베렐린 및 아브시스산과 같은 식물 호르몬 ; 니코틴산, 티아민 및 피리독신과 같은 비타민 ; 슈크로오즈 및 만니톨과 같은 당 및 당 알콜 ; 및 기타 원형질체를 배양하는 배양배지에 통상적으로 가해지는 영양제를 함유할 수 있다. 이들 첨가제의 농도는 배양될 원형질체의 특성에 따라 적당히 선택될 수 있으며, 예를들면 당 및 당 알콜 이외의 첨가제는 0.1∼100mg/l이고, 당 및 당 알콜은 1∼30 중량%이다.
배지가 조정 배지이면, 원형질체의 성장이 촉진된다는 것이 본 발명자들에 의해 이미 발견되었다. 여기서 사용된 "조정 배지(conditioned medium)"는 식물 세포 또는 원형질체가 이미 배양된 배지(이후 "사용배지"로 약칭함), 및 사용 배지와 신선한 배지의 혼합물을 의미한다.
조정 배지는 25 중량% 이상의 사용 배지, 더 바람직하게는 80 중량% 이상의 사용 배지를 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 사용 배지는 이 배지가 다른 종류의 식물을 배양하는데 사용되었다 하더라도 배양될 원형질체와 같은 세포를 배양하는데 사용하는 것이 바람직하다.
배양 조건 그 자체는 공지이다. 그러므로, 배양 조건은 배양될 원형질체의 종류에 따라 적당히 선택될 수 있다. 예를들어, 배양될 원형질체가 벼의 원형질체이면, 배양온도는 20∼30℃, 바람직하게는 약 26℃이고, 액채 배지에서 원형질체의 군집 밀도는 104∼107ml, 바람직하게는 105∼5x106ml 이다. 더우기, 원형질체를 100∼400㎛, 특히200∼300㎛ 두께의 액체 배지에서 배양함으로써 더 좋은 결과가 수득될 수 있다는 것이 발견되었다.
본 발명의 방법은 어떤 방법으로 제조된 원형질체의 배양에도 적용될 수 있다. 원형질체를 형성하는 다수의 방법이 각종 식물에 대해 공지이다.
배양될 원형질체가 벼의 원형질체이면, 원형질체는 예를들면 칼루스를 0.1∼10 중량%, 바람직하게는 1∼5 중량%의 셀룰라제, 0.1∼5 중량%, 바람직하게는 0.5∼2 중량%의 조직해리 효소(macerating enzyme), 0∼5 중량%, 바람직하게는 0.1∼1 중량%의 염화칼슘 및 0∼5중량%, 바람직하게는 0.1∼1 중량%의 덱스트란 셀페이트의 포타슘 염을 함유한 효소 용액으로 처리함으로써 벼의 칼루스로 부터 수득될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 쉽게 이해될 것이다. 하기의 실시예는 단지 본 발명을 설명하는 것을 그 목적으로 하고 있으며, 본 발명의 범위를 제한 하는 것은 아니다.
[원형질체의 제조]
벼의 종자 [오리자 사티바 쿨티바르(Oryza sativa cultivar), 변종 : 니혼바레(Nihonbare)]를 70% 에탄올 수용액에 1분간 침지시키고, 차아염소산나트륨 수용액(염소 함량 5중량%)에 15분간 침지 시킨다. 종자를 멸균 증류수로 3번 세척하고, 0.3 중량%의 카제인 가수분해물, 2ppm의 2, 4-D 및 1ppm의 벤질 아데닌을 함유한 N6 한천 배지에 파조한다. 26℃에서 3주 동안 배양 후, 종자의 배반으로 부터 칼루스 형성된다. 이들 칼루스를 같은 조건에서 매4주 마다 한번 계대 배양한다.
이렇게 수득된 칼루스를 0.3 중량%의 카제인 가수분해물 및 1ppm의 2,4-D를 함유한 R2 액체 배지에 현탁 시킨다. 세포를 일주일에 한번 계대 배양한다. 계대 배양후 5∼7일째에 수득된 세포 송이를 다음 단계에서 원형질체를 제조하는데 사용한다.
이렇게 수득된 세포 송이를 4.0 중량%의 셀룰라제 오느즈까 RS (야쿠르트 제약의 상품명), 1.0 중량%의 마세로 자임 R-10 (야쿠르트 제약의 상품명), 0.5 중량%의 염화칼슘, 0.5 중량%의 덱스트란 설페이트의 포타슘염, 및 삼투제로 0.4M 만니톨을 함유한 용액으로 처리한다. 세포를 이 용액에서 27℃로 6시간 동안 서서히 진탕하여 원형질체를 수득한다. 원형질체를 함유한 효소 용액을 여과하여 미분해된 세포 송이를 제거하고 여과액을 50g에서 5분간 원심분리하여 원형질체를 침전시킨다. 침전된 원형질체를 0.4M 글루코오즈 수용액으로 3번세척하고, 다음 단계에서 배양한다.
[실시예 1]
[원형질체의 배양]
1ppm의 2, 4-D 및 0.4M의 슈크로오즈를 함유하여 표에 나타낸 바와같이 각종 pH를 갖는 R2 배지를 상기단계에서 수득된 원형질체의 배양에 사용한다. 각 배지 200㎕를 그의 바닥 표면에 얇은 한천 층으로 피복된 직경35mm의 플라스틱 페트리 디시에 넣고, 105 원형질체/ml를 함유한 원형질체의 현탁액 30㎕를 가한후, 현탁액을 균일하게 편다. 페트리디시를 봉합한 후, 26℃의 암소에서 30일간 배양한다. 세포송이의 형성을 전도 현미경을 사용하여 관찰한다. 결과는 표에 나타낸다.
[실시예 2]
[원형질체의 배양]
벼의 종자[오리자 사티바 쿨티바르(Oryza sativa cultivar), 변종 : 니혼바레(Nihonbare)]의 배반으로 부터 상술한 것과 같은 방법으로 원형질체를 제조한다. 벼의 칼루스의 배양을 위해 상기 단게에서 사용된 R2-기재의 배지를 여과하여 여과액(사용배지)을 수득한다. 이 여과액 10ml에 100ppm 농도의 2, 4-D 50㎕ 및 1.37g의 슈크로오즈를 가한다. 신선한 R2 배지를 4 : 1(W/W)(사용 배지 4 : 신선한 배지 1)의 비로 이 사용 배지에 보충하여 조정 배지를 수득한다. 이 배지를 막 필터에 여과하여 멸균시킨다.
이렇게 수득된 조정배지를 여러 분획으로 나누고, 이들 각각을 0.1N HCl에 의해 표에 나타낸 바와같이 pH를 조절한다. 원형절체를 실시예 1과 같은 방법으로 각 조정 배지에서 배양한다. 세포 송이의 형성을 전도 현미경으로 관찰한다. 결과는 표에 나타낸다.
[표]
작은 세포 송이의 형성
Figure kpo00001
작은 세포 송이의 형성
- : 세포 송이가 형성되지 않는다.
Figure kpo00002
: 몇 개의 세포 송이가 형성된다.
+ : 수십개의 세포 송이가 형성된다.
++ : 수백개의 세포 송이가 형성된다.
표에 나타낸 바와같이, pH가 3.5∼5.2인 배지를 사용함으로써 원형질체로부터 세포 송이를 형성할 수 있으나, pH가 5.5 또는 6.0인 배지를 사용하면 세포 송이가 형성되지 않는다. 또한 pH 4.0∼4.7이 특히 바람직하다는 것을 알 수 있다. 더욱이, 조정배지를 사용함으로써, 신선한 배지를 사용하여 얻은 것보다 좋은 결과를 얻을 수 있다.
[실시예 3]
원형질체의 배양
사용 배지와 신선한 배지의 비(W/W)가 1 : 4인 것을 제외하고는 실시예 2와 같은 공정을 반복한다. 실시예 1과 같은 결과가 수득된다. 그러므로, 80중량%의 사용된 배지를 함유한 조정 배지(실시예 2)를 사용함으로써, 20 중량%의 사용된 배지를 함유한 조정 배지(실시예 3)를 사용한 것보다 월등한 효과가 수득된다.

Claims (12)

  1. 원형질체를 pH가 5.2 이하인 액체 배지에서 배양함을 특징으로 하는 원형질체의 배양방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 배지의 pH가 3.5∼5.2인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 배지의 pH가 4.0∼4.7인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 배지가 세포를 배양하는데 사용되었던 사용 배지 25 중량% 이상을 함유하는 조정 배지(conditioned medium)인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 조정 배지가 80 중량%이상의 사용 배지를 함유하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 조정 배지가 포함되어 있는 사용 배지에서 배양되었던 세포가, 조정 배지에서 배양될 원형질체와 같은 종류인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 원형질체가 벼의 원형질체인 방법.
  8. 제 4 항에 있어서, 원형질체가 벼의 원형질체인 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 벼가 오리자 사티바(Oryza sativa)인 방법.
  10. 제 4 항에 있어서, 벼가 오리자 사티바(Oryza sativa)인 방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 배지가 그의 기본 배지로 R2, M6 B5 또는 MS 배지를 함유하는 방법.
  12. 제 4 항에 있어서, 배지가 0.1∼10mg/l의 2, 4-D를 더 함유하는 방법.
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