CN86103461A - 培养原生质体的方法 - Google Patents

Abstract

本文叙述了一种在液体介质中培养原生质体的方法。按照本发明方法，培养原生质体用的液体介质的pH被调节到不高于5.2。

Description

培养原生质体的方法

本发明是关于培养原生质体的方法;进一步说来，本发明是关于在液体介质中培养原生质体的方法，借以从这种原生质体中产生细胞群或愈伤组织（Callus）。

原生质体是除去细胞壁的植物、细菌、真菌等等的细胞。由于原生质体没有细胞壁，所以它容易受到例如细胞融合、基因操纵和人工体细胞突变等人工操纵。因此，如果能够从某种受操纵的原生质体再生完全的植物，那么就可以获得具有某种野生植物所不具备的优良特性的植物。对于许多植物来说，已知可以从愈伤组织或细胞群再生完全的植物;因此，如果能够从原生质体产生出愈伤组织，那么就有可能由该愈伤组织再生出某种完全的植物，依次从这种原生质体再生出完全的植物。

对于例如烟草等双子叶植物，已知一些能够从原生质体再生出完全植物的方法。但是，对于诸如稻、麦和玉米等属于禾本科的植物来说，仅仅报导有玉米和牧草的完全植物被再生出来的方法。正如下面将要提到的那样，对于稻子来说，报导过的方法却极为稀少。原生质体的传统培养方法包括：利用将原生质体包埋在半固态琼脂介质中培养原生质体，将原生质体悬浮在液体介质中，以及利用喂养细胞培养原生质体等方法。然而已经发现，这些方法对于培养其它植物来说，例如对于包括稻、麦和玉米的属于禾本科植物来说，常常是无效的。例如，假如用这些方法之一来培养稻子的原生质体，则该原生质体死亡或不能生长。

对于稻子原生质体的培养方法，已经报导了由某种原生质体产出了一种愈伤组织，而该原生质体是从缺少硝酸盐还原酶的某种细胞获得的（Wakasa等人，J.Plant    Physiol.，117，223-231页，1984），另外还报导了由某种花粉的愈伤组织得到了某种原生质体，进而由此原生质体衍生出某种愈伤组织，再由其产出幼芽（Ohno等，Japanese    Journal    of    Breeding，35，54-55页，1985）。但是，这些方法利用的是由特定的愈伤组织释放出的原生质体，而且对于由各种愈伤组织或组织中释放出来的各类原生质体来说不能全部适用。换句话说，这些方法对于绝大多数原生质体来说不能再现。

另一方面，许多研究者报导过由培养的稻细胞再生完全的植物（Nishi等，Nature，219，508-509页，（1968））。但是这些方法並不利用原生质体。而且发现，由这些方法中使用的、具有高度分化能力的细胞，很难得到原生质体，而且该原生质体也难于培养。

因此，需要建立一种培养原生质体的方法，利用这个方法可以从该原生质体中衍生出某种愈伤组织或细胞群，该方法可以再现而且可以用于起源於普通植物细胞或非特定植物细胞的原生质体。

本发明目的在于提出一种培养原生质体的方法，利用此方法可以从该原生质体衍生出细胞群或愈伤组织，该方法可以再现並且可以用于那些来源于普通植物细胞或非特定植物细胞的原生质体。

按照本发明方法，在PH不高于5.2的液体介质中培养原生质体。在传统的培养原生质体的方法中，将培养介质的PH调节到5.5-6.0。本发明基于本发明人等的意外发现，即培养介质的PH被调节到5.2或更低，则原生质体生长良好而且形成细胞群。

按照本发明方法，不仅双子叶植物的原生质体，而且甚至于单子叶植物的原生质体也可以很好地生长，形成愈伤组织或细胞群。

正如上述的那样，在本发明方法中，于PH不高于5.2的液体介质中培养原生质体。液体培养介质的PH，优选值为3.5-5.2，更优选4.0-4.7。可以用加入酸（在某些情况下加入碱）的方法调节PH。调节PH时可以使用任何酸（或碱），只要它不产生对原生质体生长的不利影响就可以使用，为此通常使用HCl和KOH。

通常用于培养原生质体的任何介质，当PH调节到5.2或更低后，均可用于本发明方法。例如，如果欲培养的原生质体是稻子（属于稻属的植物，例如Oryza    Sativa、Oryza    qlaberrima、Oryza    Perennis等等）的原生质体，则作为培养介质可以使用MS介质（Murashige和Skoog，Physiol.Plant，15，473-479页，1962）、B5介质（Gamborg等人，εxp.Cell.Res.，50，151-158页，1968）、N6介质（Chu等，Scientia    Scinica，18，659-663页，1975）和R2介质（Ohira等，Plant    Cell    Physiol.，14，1113-1121页，1973）。同样，如果欲培养的原生质体是矮牵牛属的原生质体，则可以使用NT介质（Nagata和Takebe，Planta，99，12-20页，1971）。此介质可以含有植物激素〔例如2，4-二氯苯氧基乙酸（以下称作2，4-D）、吲哚乙酸、萘乙酸、苄基腺嘌呤、激动素、玉米素、赤霉素和脱落酸〕;维生素〔例如烟酸、硫胺素和吡哆素〕;糖和糖醇（例如蔗糖和甘露醇）;以及其它营养物，这些物质是常规地加入到培养原生质体的培养介质中的。可以根据欲培养原生质体的性质，来适当选择这些添加剂的浓度，例如除糖和糖醇之外，其它浓度可以为0.1-100mg/l，而糖和糖醇可以为1-30%（重量）。

本发明人等发现，如果所用的介质是条件介质，则原生质体的生长得到进一步促进。在这里使用的“条件介质”是指这样一种介质，即某种植物细胞或原生质体曾经在其中培养过的介质（以下称作“用过的介质”），而且是这种用过的介质与新鲜介质的混合物。优选的条件介质至少含有25%（重量）的用过的介质，更优选至少含有80%（重量）用过的介质的条件介质。此外还优选已用于培养过与欲培养的原生质体同种细胞的介质，但是也可以使用用于培养不同种植物的那些用过的介质。

培养条件本身可以与传统的条件相同。因此，可以根据欲培养的原生质体性质来适当选择培养条件。例如，如果欲培养的原生质体是稻子的原生质体，则培养温度可以为20-30℃，优选约26℃，液体介质中原生质体的粒子数密度可以为10⁴-10⁷/ml，优选10⁵～5×10⁶/ml。而且发现，在厚度为100-400μm，特别是200-300μm的液体介质中培养原生质体，可以得到更好的结果。

本发明方法可以用于培养用任何方法制备的原生质体。对于各种植物来说，已知许多释放原生质体的方法。如果欲培养的原生质体是稻子的原生质体，则该原生质体例如可以由稻子的愈伤组织，通过用某种酶溶液处理该愈伤组织的方法得到，所说的酶溶液中含有0.1-10（优选1-5）%（重量）纤维素酶、0.1-5（优选0.5-2）%（重量）浸解酶（macerating    enzyme）、0-5（优选0.1-1）%（重量）氯化钙和0-5（优选0.1-1）%（重量）-葡聚糖硫酸酯的钾盐。

通过参照下列实施例将更容易理解本发明。值得注意的是，下列实施例只为说明目的而提供的，决不是用来限制本发明范围的。

原生质体的制备

在70%乙醇水溶液中将稻种（Nihonbare稻栽培品种）浸1分钟，然后于次氯酸钠水溶液（含5%（重量）氯）中浸15分钟。用灭菌蒸馏水将此种子洗涤3次，然后播种在N6琼脂介质中，此介质含有0.3%（重量）酪蛋白水解产物、2ppm2，4-D和1ppm苄基腺嘌呤。26℃下培养三周之后，从种子的盾片中形成了愈伤组织。在同样条件下将这些愈伤组织每四周传代培养一次。

将这样制得的愈伤组织悬浮于含有0.3%（重量）的酪蛋白水解产物和1ppm2，4-D的R2液体介质中。将这些细胞每周传代培养一次。使用传代培养后5-7天得到的这些细胞群，在下一步骤中制备原生质体。

使用某种溶液处理按此法制得的细胞群，该溶液中含有4.0%（重量）的Onozuka    RS纤维素酶（yakult药物公司的商业产品）、1.0%（重量）R-10浸解酶（yakult药物公司的商业产品）、0.5%（重量）氯化钙、0.5%（重量）葡聚糖硫酸酯的钾盐和0.4M甘露醇作为渗压剂。然后于27℃下于此溶液中将此细胞轻轻摇动6小时，以便得到原生质体。然后过滤含有原生质体的酶溶液，除去未消化的细胞群，在50g下将滤液离心5分钟，以便沉淀这些原生质体。用0.4M葡萄糖水溶液将沉淀的原生质体洗涤三次，然后于下一步骤之中加以培养。

原生质体的培养（实施例1）

使用含有1ppm2，4-D和0.4M蔗糖並且具有表中所列不同PH值的R2介值，来培养在上述步骤中得到的原生质体。各取200微升此介质，置于直径为35mm陪氏塑料培养皿中，在皿底表面事先涂有一薄层琼脂，然后于其中加入30微升含有10⁶原生质体/ml的原生质体悬浮液，使此悬浮液均匀分布。将这些陪氏培养皿密封后，在26℃下于暗处培养30天。用倒置显微镜观察形成的细胞群。结果示于表中。

原生质体的培养（实施例2）

按上述的同样方式，由稻Oryza    Sativa（Nihonbare稻栽培品种）的盾片制备原生质体。过滤上步骤中用于培养稻子愈伤组织的R2-基本介质，制得滤液（用过的介质）。在10ml这种滤液中，加入50μl2，4-D（浓度为100ppm）和1.37克蔗糖。按照4∶1（W/W）（用过的介质4∶新鲜介质1）的比例，在此用过的介质中补充新鲜的R2介质以便得到条件介质。然后经膜滤器过滤此介质使之灭菌。

将用此方法得到的条件介质分成几份，用0.1N    HCL将每份介质的PH调到表中所示的某值，按照与实施例1相同的方式在每份条件介质中培养原生质体，用倒置的显微镜观察形成的细胞群，结果示于表中。

-：未形成细胞群

±：形成几个细胞群

+：形成几十个细胞群

++：形成几百个细胞群

正如表中所显示的那样，使用PH为3.5-5.2的介质时，由原生质体形成一些细胞群;而使用PH为5.5或6.0的介质时，不形成细胞群，已知最好PH为4.0至4.7。此外，还可以看出，使用条件介质时所得到的结果，比使用新鲜介质时更好。

原生质体的培养（实施例3）

除了用过的介质与新鲜介质之比（W/W）为1∶4之外，其余按实施例2的方法操作，得到了与实施例1相同的结果。因此可以看出，使用含80%（重量）用过的介质的条件介质（实施例2）时得到的结果比使用含20%（重量）用过的介质的条件介质（实施例3）时得到的结果好。

Claims (12)

1、一种培养原生质体的方法，特征在于其中包括在PH不大于5.2的液体介质中培养所说的原生质体。

2、按权利要求1的方法，其中所说介质的PH为3.5-5.2。

3、按权利要求2的方法，其中所说介质的PH为4.0-4.7。

4、按权利要求1的方法，其中所说的介质是一种条件介质，在此介质中至少含有25%（重量）已用于培养过某种细胞的介质。

5、按权利要求1的方法，其中所说的条件介质至少含有80%（重量）的用过的介质。

6、按权利要求4的方法，其中在所说条件介质中所含用过的介质里培养过的细胞，是与在条件介质中欲加培养的原生质体种类相同的细胞。

7、按权利要求1的方法，其中所说的原生质体是稻子的原生质体。

8、按权利要求4的方法，其中所说的原生质体是稻子的原生质体。

9、按权利要求7的方法，其中所说的稻子是稻（Oryza  Sativa）。

10、按权利要求4的方法，其中所说的稻子是稻（Oryza  Sativa）。

11、按权利要求7的方法，其中所说的介质含有R2、N6、B5或MS介质作为其基本介质。

12、按权利要求9的方法，其中所说的介质还含有0.1-10mg/l  2，4-D。