WO2020203947A1 - 有用物質を蓄積する植物体 - Google Patents

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WO2020203947A1
WO2020203947A1 PCT/JP2020/014455 JP2020014455W WO2020203947A1 WO 2020203947 A1 WO2020203947 A1 WO 2020203947A1 JP 2020014455 W JP2020014455 W JP 2020014455W WO 2020203947 A1 WO2020203947 A1 WO 2020203947A1
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plant
gene
medium
treatment
tomato
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PCT/JP2020/014455
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English (en)
French (fr)
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大策 太田
敦司 岡澤
昇 大西
Original Assignee
キリンホールディングス株式会社
公立大学法人大阪
株式会社竹中工務店
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/20—Brassicaceae, e.g. canola, broccoli or rucola
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant

Definitions

  • the present invention relates to a plant carbon metabolism gene.
  • the present invention also relates to genes involved in the storage of photosynthetic products in plants.
  • the present invention further relates to a plant modification method using the gene, a plant obtained by the method or treatment with a specific medium, a method for producing a useful substance including cultivating the plant, and the like.
  • Plants store photosynthetic products as carbohydrates and lipids, respectively. Genes for these stores have been isolated and detailed properties have been reported. However, the mechanism that regulates the storage balance between lipids and carbohydrates has not yet been clarified. In the production of useful substances using plants, it is required to develop a technique for controlling the metabolic flux of plants and intentionally modifying the storage amount of sugars or lipids.
  • starch is composed of amylose having a linear structure and amylopectin having a linear structure and a branched structure.
  • the linear structure consists of ⁇ -1,4 bonds of glucose
  • the branched structure consists of ⁇ -1,6 bonds of glucose.
  • Amylose has no branched structure
  • amylopectin has a branched structure at a rate of 1 for every 25 ⁇ -glucose residues on average.
  • the linear structure portion of starch has a spiral structure of about 1 roll per 6 ⁇ -glucose residues. Purple coloring due to the iodine-starch reaction occurs due to the incorporation of iodine molecules into the spiral structure, and is not colored without the spiral structure.
  • Starch is biosynthesized in intracellular organelles called plastids such as amyloplast or chloroplast.
  • the starch synthesis precursors glucose-1-phosphate and glucose-6-phosphate are supplied by transport from the cytoplasm or photosynthetic carbon dioxide fixation. These precursors are converted to ADP-glucose in plastids.
  • the glucose residue of ADP-glucose is added by starch synthase to the 4-hydroxyl group of the ⁇ -glucose residue at the non-reducing end of amylose or amylopectin with a new ⁇ -1,4 glucoside bond (Fig. 1). ..
  • Starch synthase in plastids is roughly classified into starch grain-bound starch synthase (GBSS) and soluble starch synthase (SSS).
  • GBSS starch grain-bound starch synthase
  • SSS soluble starch synthase
  • the content of amylose and amylopectin is controlled by the activity of GBSS and SSS. Plants lacking GBSS activity are motivated to store only amylopectin. On the other hand, plants with reduced or deleted SSS activity have the property of high amylose content.
  • GBSS is involved in the biosynthesis of amylose that adds ⁇ -1,4 glucoside bonds using ADP-glucose as a substrate.
  • SSS is involved in the biosynthesis of amylopectin that adds ⁇ -1,4 glucoside bonds using ADP-glucose as a substrate.
  • a branching enzyme cleaves a part of the linear structure extended by ⁇ -1,4 glucoside bond by SSS.
  • a new ⁇ -1,6 glucoside bond is formed between the 1-position hydroxyl group of the glucose residue at the reducing end of the cleavage site and the 6-position hydroxyl group of the glucose residue located in the middle of the linear moiety.
  • the plurality of non-reducing ends existing in the generated molecule are further extended by SSS, and new side chains of non-reducing ends are formed one after another by SBE.
  • the side chain of the excess ⁇ -1,6 glucoside binding portion is trimmed by the debranching enzyme, and amylopectin having a branched structure is biosynthesized.
  • LD Lipid storage organelles
  • LD is an organelle that stores lipids such as triglycerides or sterols, and is widely present in eukaryotes including plants. LD does not exist as a mere lipid storage site, but has an essential function in controlling the balance between intracellular lipid storage and lipid metabolism. LD is derived from the endoplasmic reticulum (ER) in response to various environmental factors and has a structure surrounded by a phospholipid monolayer. Many genes involved in LD budding from the endoplasmic reticulum have been reported in plants (Non-Patent Document 1).
  • the present invention relates to a method for producing a useful substance from a plant in which a useful substance is accumulated, a plant in which the useful substance can be accumulated, a method for enhancing the induction of a lipid storage organella in the plant, and a useful substance to be accumulated in the plant. It is an object of the present invention to provide a method of increasing the amount of a useful substance, a method of accumulating a useful substance in the plant, or the use of the plant for producing a useful substance.
  • GBSS or SBE is an enzyme that converts sugar, which is a photosynthetic product, into starch, which is a storage substance, in Arabidopsis thaliana, which is a dicotyledonous plant of the Brassicaceae family.
  • the present inventors have found that in the knockout lineage of these genes, the induction of LD in cells is enhanced and the content of useful substances is increased.
  • the present inventors presumed that this phenomenon found was a phenomenon that occurred as a result of the metabolic flux being directed to lipid storage due to inhibition of the metabolic biosynthetic pathway that stores photosynthetic products as starch.
  • GBSS1 Solyc08g083320.2
  • SBE2.2 Solyc09g009190.2
  • untreated plants are treated with a medium prepared in advance at pH 4 to 5, a medium containing no iron and iron ions, or a medium containing no magnesium and magnesium ions. Proliferation of LD was confirmed in all of the treatment groups.
  • tomatoes by treating untreated plants with a medium containing tolnaftate, terbinafine, or salts or hydrates thereof, which are sterol synthesis inhibitors, before cultivation, all of them are LD as compared with the untreated group. Proliferation was confirmed.
  • the present inventors have introduced plants or plants having a deletion mutation in the GBSS gene and / or the SBE gene involved in starch storage in two types of plants, white inuna and tomato, and plants that have not been treated before cultivation.
  • Plants or plants treated with a medium containing an inhibitor were produced, and it was found that each plant or plant brought about LD enhancement, and the present invention was completed.
  • Oils and fats are produced by cultivating plants in which the expression of GBSS (Granule Bound Starch Synthase) gene and SBE (Starch Branching Enzyme) gene, which are genes involved in starch synthesis, is suppressed and inducing lipid storage organelles in cells. How to make.
  • GBSS Gramule Bound Starch Synthase
  • SBE Starch Branching Enzyme
  • Gene expression is suppressed by a method selected from the group consisting of genome editing, homologous recombination, RNA interference, antisense, gene insertion, PTGS and artificial mutation. 1] method.
  • [4] The method according to any one of [1] to [3], which accumulates fats and oils in plant seeds.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the plant is a plant of the Solanaceae family or the Brassicaceae family.
  • [6] A plant in which the expression of GBSS (Granule Bound Starch Synthase) gene and SBE (Starch Branching Enzyme) gene, which are genes involved in starch synthesis, is suppressed, and fats and oils can be accumulated in the plant body.
  • Gene expression is suppressed by a method selected from the group consisting of genome editing, homologous recombination, RNA interference, antisense, gene insertion, PTGS and artificial mutation.
  • [1] A method for producing a useful substance by extracting a useful substance from a plant obtained by using the methods (A) and / or (B) below;
  • (A) A method for cultivating a plant in which the expression of the Granule Bound Starch Synthase (GBSS) gene and / or the Starch Branching Enzyme (SBE) gene is suppressed or deleted;
  • (B) A method for cultivating a plant treated with a medium prepared in advance at pH 4 to 5, a medium containing no iron and iron ions, or a medium containing no magnesium and magnesium ions.
  • the methods for suppressing or deleting the expression of the GBSS gene and / or the SBE gene in (A) are genome editing method, homologous recombination method, RNA interference method, antisense method, gene insertion method, PTGS method and The method of [1], which is a method selected from the group consisting of artificial mutation methods.
  • the method of [1] or [2], wherein the method of suppressing or deleting the expression of the GBSS gene and / or SBE of (A) is a genome editing method.
  • the methods for suppressing or deleting the expression of GBSS gene and / or SBE gene are genome editing method, homologous recombination method, RNA interference method, antisense method, gene insertion method, PTGS method and artificial mutation method.
  • the plant of [12] which is a method selected from the group consisting of.
  • the plant according to [12] or [13], wherein the method for suppressing or deleting the expression of the GBSS gene and / or SBE is a genome editing method.
  • the plant of [15], wherein the useful substance is a fat or oil-soluble physiologically active substance.
  • the fat-soluble bioactive substance is vitamin D3, sitosterol, stigmasterol, campesterol or cholesterol.
  • [37] A plant that has been previously treated with a medium containing the sterol synthesis inhibitors tolnaftate, terbinafine, econazole or salts or hydrates thereof before cultivation.
  • the plant of [37] wherein the final concentration of the sterol synthesis inhibitor in the medium upon treatment is 1-1000 ⁇ M.
  • the plant of [37] or [38] which can accumulate useful substances in the seeds, leaves, stems or roots of the plant.
  • the useful substance is a fat or oil-soluble physiologically active substance.
  • the plant of [40] wherein the fat-soluble bioactive substance is vitamin D3, sitosterol, stigmasterol, campesterol or cholesterol.
  • a method of enhancing the induction of lipid storage organelles into cells of a plant by performing the following treatments (A2), (B2) and / or (C2) on the plant as compared with before the treatment; (A2) Treatment in which the expression of the Granule Bound Starch Synthase (GBSS) gene and / or the Starch Branching Enzyme (SBE) gene is suppressed or deleted; (B2) Treatment with a medium prepared at pH 4 to 5, a medium containing no iron and iron ions, or a medium containing no magnesium and magnesium ions; (C2) Treatment with a medium containing tolnaftate, terbinafine, econazole or salts or hydrates thereof.
  • A2 Treatment in which the expression of the Granule Bound Starch Synthase (GBSS) gene and / or the Starch Branching Enzyme (SBE) gene is suppressed or deleted
  • B2 Treatment with a medium prepared at pH 4 to 5, a medium containing no iron and iron ions
  • a method for producing a useful substance from a plant in which a useful substance is accumulated a plant in which the useful substance can be accumulated, a method for enhancing the induction of a lipid storage organella in the plant, and a useful substance in the plant.
  • a method of increasing the amount of a useful substance, a method of accumulating a useful substance in the plant body, or a method of using the plant body for producing a useful substance can be provided. As a result, the amount of useful substances obtained from the plant body per unit area of cultivated land is increased, and the production cost for producing the useful substances can be reduced.
  • WT is a wild type
  • I and K lines are SBE-deficient mutant lines
  • M and N lines are GBSS-deficient mutant lines.
  • WT is a wild type
  • I and K lines are SBE-deficient mutant lines
  • M and N lines are GBSS-deficient mutant lines.
  • WT is a wild type
  • I and K lines are SBE-deficient mutant lines
  • M and N lines are GBSS-deficient mutant lines.
  • WT is a wild type
  • I and K strains are SBE-deficient mutant strains, respectively.
  • WT indicates the wild type
  • M and N strains indicate GBSS-deficient mutant strains, respectively.
  • WT indicates the wild type
  • M and N strains indicate GBSS-deficient mutant strains, respectively.
  • WT shows the analysis result of the kind and amount of phospholipid in the deficient mutant line of Arabidopsis thaliana.
  • WT is a wild type
  • sbe2.2-1 and sbe2.2-2 are SBE2-deficient mutant lines
  • gbss1-1 and gbss1-2 are GBSS-deficient mutant lines.
  • WT is a wild type
  • sbe2.2-1 and sbe2.2-2 are SBE2-deficient mutant lines
  • gbss1-1 and gbss1-2 are GBSS-deficient mutant lines.
  • WT is a wild type
  • Vector control is a control group in which genome editing does not occur
  • sbe2.2-2 # 10 is a mutant strain lacking SBE2 gene exon 8
  • sbe2.2-3 # 6 is a defect of SBE2 gene exon 9.
  • the mutant strains are shown respectively. It is a figure which shows the expression of GBSS1 (NP_001311458.1) Solyc08g083320.2 gene in each tissue of tomato. It is a figure which shows the outline of the method of disruption of GBSS1 (NP_001311458.1) Solyc08g083320.2 gene by genome editing of tomato.
  • WT is a wild type
  • Vector control is a control group in which genome editing does not occur
  • double4 # 8 is a double mutant strain in which both gbss1-2 and sbe2.2-1 are defective
  • double5 # 17 is gbss1.
  • the double mutant lines into which both -2 and sbe2.2-2 defective mutations have been introduced are shown, respectively.
  • the scale bar is 50 ⁇ m. It is a figure which shows the LD observation result of the tomato root culture cell which performed 10 ⁇ M treatment for 24 hours with various sterol synthesis inhibitors. In the figure, the scale bar is 50 ⁇ m. It is a figure which shows the LD observation result of the tomato root culture cell which performed 100 ⁇ M treatment for 48 hours with various sterol synthesis inhibitors. In the figure, the scale bar is 50 ⁇ m. It is a figure which shows the LD observation result of the tomato root culture cell which performed 10 ⁇ M treatment for 48 hours with various sterol synthesis inhibitors.
  • the scale bar is 50 ⁇ m. It is a figure which shows the total sterol analysis result of the tomato root culture cell which performed 100 ⁇ M treatment for 24 hours with various sterol synthesis inhibitors. It is a figure which shows the total sterol analysis result of the tomato root culture cell which performed 10 ⁇ M treatment for 24 hours with various sterol synthesis inhibitors. It is a figure which shows the total sterol analysis result of the tomato root culture cell which performed 100 ⁇ M treatment for 48 hours with various sterol synthesis inhibitors. It is a figure which shows the total sterol analysis result of the tomato root culture cell which performed 10 ⁇ M treatment for 48 hours with various sterol synthesis inhibitors.
  • MS indicates MS agar medium
  • -Fe indicates iron and iron ion-free
  • -Mg indicates magnesium and magnesium ion-free.
  • A is the wild type
  • B is gbss1-2 # 2
  • C is gbss1-2sbe2.2 # 3
  • D is gbss1-2sbe2.2 # 4.
  • -Fe indicates an iron and iron ion-free medium condition
  • -Mg indicates a magnesium and magnesium ion-free medium condition.
  • the scale bar indicates 1 cm.
  • the present invention extracts useful substances from plants obtained by cultivating plants in which expression of the Granule Bound Starch Synthase (GBSS) gene and / or Starch Branching Enzyme (SBE) gene is suppressed or deleted. It relates to a method of producing a useful substance by doing so.
  • the present invention also produces a plant in which the expression of the GBSS gene and / or the SBE gene is suppressed or deleted, a method for cultivating the plant and accumulating a useful substance in the plant, and a useful substance. With respect to the use of the plant for.
  • the present invention performs a treatment in which the expression of the GBSS gene and / or the SBE gene is suppressed or deleted in the plant, and induces the lipid storage organelle into the cells of the plant as compared with the treatment before the treatment. It relates to a method of enhancing or increasing the amount of useful substances accumulated in the plant.
  • plants and plants are not particularly limited, but seed plants are preferable from the viewpoint of growth rate and amount of plants.
  • angiosperms include, for example, angiosperms, abranas, kikus, legumes, uris, roses, yanagis, sesames, mokuseis, aois, umbellifers, mint or akaza Dicotyledonous plants belonging to the above, or monocotyledonous plants belonging to the Umbelliferae or Labiatae, etc. can be used.
  • the gymnosperm for example, a plant belonging to the family Pinaceae or Ginkgoaceae can be used.
  • plant species include widely cultivated plant species, plant species whose seeds are used for food, plant species used for producing useful substances in the past, and plant species for which genetic analysis has been advanced.
  • Plants belonging to the family Nasalidae such as tomatoes, potatoes, eggplants or tobacco; plants belonging to the family Abrana such as abrana, nanohana, cabbage, hakusai, rapeseed, daikon or white-spotted choiruna; Plants belonging to the family Mame; plants belonging to the family Kiku such as kiku, sunflower or Benibana; plants belonging to the family Uri such as pumpkin or cucumber; plants belonging to the family rose such as almonds, ume, apples or peaches; plants such as yanagi or poplar Plants belonging to the family Yanagi; plants belonging to the family Goma such as sesame; plants belonging to the family Mokusei such as olives; plants belonging to the family Aoi such as cotton or cacao; plants belonging to the family Seri such as carrots or parsley; perilla, basil, Plants belonging
  • examples of the plant include plant-derived grown plant individuals, plant tissues, plant cells, seeds, callus, and the like.
  • GBSS is an enzyme involved in linear elongation at ⁇ -1,4 glucoside bonds using ADP-glucose as a substrate in the biosynthesis of amylose in plants and plants.
  • SBE is a part of the linear structure extended by SSS, which is an enzyme involved in the linear extension of ⁇ -1,4 glucoside bond using ADP-glucose as a substrate in the biosynthesis of amylopectin in plants and plants. It is an enzyme that cleaves.
  • the sequences of the GBSS gene and the SBE gene have been identified in Arabidopsis thaliana.
  • the GBSS gene of Arabidopsis thaliana is At1g32900 (GBSS1)
  • the SBE gene is At5g03650 (SBE2.2).
  • the genome and cDNA base sequences of At1g32900 are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively, and the genome and cDNA base sequences of At5g03650 are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively.
  • the GBSS gene and SBE gene of each plant species can be identified as homologous genes corresponding to the GBSS gene and SBE gene of Arabidopsis thaliana.
  • the genome is extracted from the target plant to identify the homologous gene corresponding to the GBSS gene and SBE gene of the white inunazuna, or the cDNA library of the target plant is constructed to construct the GBSS gene and the SBE gene of the white inunazuna.
  • the homologous gene corresponding to the above can be identified.
  • nucleotide sequences of the GBSS genes of various plants for example, when calculated using a known algorithm for identity search such as BLAST or FASTA using default or default parameters, of the GBSS gene of Shiroinu clawa, At1g32900. It has 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more sequence identity with respect to the base sequence.
  • the nucleotide sequences of the SBE genes of various plants are, for example, when calculated using a known algorithm for homology search such as BLAST or FASTA using default or default parameters, the SBE gene of Shiroinu clawa, At5g03650. It has 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more sequence identity with respect to the base sequence.
  • nucleotide sequence of the GBSS gene or the nucleotide sequence of the SBE gene of various plants can be hybridized with the nucleotide sequence of At1g32900, which is the GBSS gene of Arabidopsis thaliana, or the nucleotide sequence of At5g03650, which is the SBE gene, under stringent conditions.
  • Stringent conditions are conditions under which DNA with high sequence identity hybridizes, and those conditions can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • conditions of 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, and about 37 ° C can be mentioned.
  • Strict, that is, medium stringent conditions include, for example, conditions of about 0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.
  • high stringent conditions include, for example, conditions of 0.1 to 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, and about 65 ° C.
  • an operation of performing washing at 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 55 to 68 ° C. may be included, and this operation can increase stringency.
  • the 1 ⁇ SSC buffer indicates an aqueous solution of 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate, and pH 7.0.
  • GBSS1 Solyc08g083320.2
  • SBE2.2 Solyc09g009190.2
  • SEQ ID NOs: 5 and 6 The nucleotide sequences of the GBSS1 (Solyc08g083320.2) genome and cDNA are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively
  • SBE2.2 Solyc09g009190.2 genome and cDNA are shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively. Shown.
  • suppression or deletion of gene expression means, for example, suppression or deletion of gene expression itself, RNA as a transcript of DNA containing a gene, protein as a translation product, or a function of protein. Examples include a decrease or disappearance of any amount of enzyme activity. Further, even if a gene is expressed, the function of the expression product is reduced as compared with the function of the original gene expression product, or the function of the expression product disappears, which is also the expression of the gene in the present invention. Included in inhibition or deletion.
  • Suppression or deletion of gene expression is obtained by suppressing or deleting all or part of gene expression or function, for example, by mutation, deletion, disruption, knockdown or knockout of the gene.
  • suppression or deletion of all or part of the expression or function of a gene is also referred to as introduction of a deletion mutation into the gene.
  • a plant line into which a defective mutation has been introduced is called a defective mutant line.
  • Introducing a defective mutation into one of the two types of genes is called induction of a single mutation, and introducing a defective mutation into both of the two types of genes is called induction of a double mutation.
  • a plant line in which a defective mutation is introduced into both of the two types of genes is called a double mutant line.
  • Suppression of gene expression can be indicated, for example, by a decrease in the amount of mRNA caused by transcription of the gene.
  • the amount of mRNA is 20% or more, 30% or more or 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 80% or more, 90% or more, or compared with the control source plant. It can be reduced by 95% or more.
  • Deletion of gene expression is a form of suppression of gene expression, but indicates that gene expression is completely deleted.
  • Deletion of gene expression can be obtained, for example, by partially or completely deleting the gene. It can also be obtained by knocking out a gene and completely losing its function.
  • genes corresponding to the GBSS gene or the SBE gene there may be a plurality of genes corresponding to the GBSS gene or the SBE gene, in which case the expression of all genes from 1 may be suppressed or deleted.
  • Examples of the method for suppressing or deleting gene expression include a genome editing method, a homologous recombination method, an RNA interference method, an antisense method, a gene insertion method, an artificial mutation method, and a PTGS method using a viral vector. Can be mentioned.
  • Genome editing is a method of modifying a target gene using a site-specific nuclease.
  • the zinc finger nuclease (ZFN) method (Urnov, Fyodor D. et al., Nature, 2 June 2005, 435, 642-651)
  • the Tale nuclease (TALEN) method (Mahfouz, Magdy M et al., PNAS, February 8, 2011, 108 (6), 2623-2628) or Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / Crispr Associated protein 9 (Cas9) (Jinek, Martin, et al.
  • ZFN zinc finger nuclease
  • TALEN Tale nuclease
  • CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
  • Cas9 Crispr Associated protein 9
  • a method of modifying a nuclease such as a method using a nickase-modified Cas, is also included in the genome editing method of the present invention.
  • the method using the CRISPR / Cas9 system is preferable.
  • any sequence is cleaved by a guide RNA consisting of crRNA and tracrRNA containing a sequence complementary to the target sequence of the gene whose function is to be deleted by cleaving, and Cas9, which is a nuclease.
  • HDR homologous recombination repair
  • GBSS gene and / or the SBE gene When disrupting the GBSS gene and / or the SBE gene by genome editing using the CRISPR / Cas9 system, select the target sequence in the gene and design a guide RNA sequence containing a sequence complementary to the sequence. .. Guide RNA preferably has a base length of 20 or more.
  • the GBSS gene and / or the SBE gene can be disrupted by co-expressing the guide RNA and Cas9 protein in a plant by introducing a vector that co-expresses both the obtained guide RNA and Cas9 protein into cells.
  • Genome editing with CRISPR / Cas9 can be performed using a commercially available CRISPR / Cas9 tool.
  • the homologous recombination method utilizes the phenomenon that two DNA molecules recombined with each other via the same base sequence in a cell, and is often used for recombination of an organism having a huge genomic DNA.
  • a plasmid in which other DNA is linked (hereinafter referred to as a transfer vector) is constructed by dividing the sequence of the target gene site in the center, and this is introduced into the cell to transfer the DNA in the cell. Swapping with the same sequence portion on the vector causes other sandwiched DNA to integrate into the cell's target gene, which lacks function.
  • RNA interference (RNAi) method is a method of suppressing expression by utilizing the phenomenon that mRNA is cleaved in a sequence-specific manner by double-stranded RNA (dsRNA), and as a result, gene expression is suppressed.
  • Gene expression can be suppressed by introducing a double-stranded RNA containing RNA having a sequence complementary to the mRNA of the gene to be deleted.
  • the double-stranded RNA includes, for example, an antisense strand containing a sequence complementary to a part of the mRNA of the target gene as a target sequence and a sense strand complementary to the antisense strand, for example, a siRNA molecule or shRNA.
  • Examples include molecules.
  • the number of bases in the target sequence is not particularly limited, but is 15 to 50, 15 to 45, 15 to 40, 15 to 35 or 15 to 30 bases, preferably 20 to 35 bases, and more preferably 21 to 35, 21 to 25. Alternatively, it is 21 to 23 bases, particularly preferably 21 bases.
  • Double-stranded RNAs may be administered to plants, and administration of the double-stranded RNA includes, for example, a method of administering a vector capable of expressing the double-stranded RNA.
  • Double-stranded RNA suppresses the expression of target genes in cells.
  • the antisense method suppresses gene expression using a single-stranded RNA (hereinafter referred to as antisense RNA) or DNA (hereinafter referred to as antisense DNA) that is complementary to a part of the target gene and can be hybridized.
  • the number of bases of the antisense RNA or DNA may be 11 or more, 12 or more, 13 or more, 14 or more or 15, for example, 11 to 30, preferably 15 to 21 consecutive nucleic acid bases. It may consist of an array.
  • These antisense RNAs or antisense DNAs may be administered to plants, and examples thereof include a method of administering a vector capable of producing antisense RNAs or antisense DNAs.
  • the gene insertion method is, for example, a method of inserting a transposon or T-DNA into a gene to destroy the gene.
  • the method of using a transposon is a method of utilizing a gene insertion mechanism of a transposon into the genome, and for example, an endogenous transposon or the like can be used.
  • the method using T-DNA is, for example, a method of inserting T-DNA into the T-DNA region target gene on the Ti plasmid by the Agrobacterium transformation method using a T-DNA vector or the like. Mutants lacking the target gene may be selected from a population of random mutants produced by these gene insertion methods.
  • Examples of the artificial mutation method include a method of treating with radiation such as X-ray or gamma ray or a mutagenic chemical substance such as an alkylating agent or a nitro compound to mutate a gene and delete a function. Mutations lacking the target gene may be selected from a population of random mutants generated by these artificial mutation methods.
  • the Post-transcriptional gene silencing (PTGS) method is a method that utilizes the phenomenon in which gene expression is negatively regulated in the process from gene transcription to protein translation.
  • a specific sequence in the target gene can be used as a direct mutation introduction site.
  • the entire region of the target gene can be deleted by specifying the sequence of a region close to the sequence of the target gene from genomic information or the like and using the sequence of the close region.
  • a genome editing method capable of knocking out the gene and completely losing its function is preferable.
  • the expression of either the GBSS gene or the SBE gene is suppressed or deleted, or the expression of both the GBSS gene and the SBE gene is suppressed or deleted. Can be done.
  • it is preferable to suppress or delete the expression of both the GBSS gene and the SBE gene and it is particularly preferable to delete the expression of both the GBSS gene and the SBE gene.
  • Select mutant plants in which the expression of GBSS gene and / or SBE gene obtained by the above-mentioned method is suppressed or deleted are suppressed or deleted.
  • the selection method is not limited, and examples thereof include a method of selecting using the suppression or deletion of the expression of the GBSS gene and / or the SBE gene, or the suppression or deletion of the function of the GBSS gene and / or the SBE gene as an index.
  • mutant plants in which the expression of GBSS gene and / or SBE gene is suppressed or deleted can be selected by using, for example, the production amount of useful substances in seeds, leaves, stems or roots as an index.
  • a target plant can be obtained by selecting a plant having an improved production of the useful substance as compared with the production of the useful substance in the stem or root.
  • useful substances in the present invention include fats and oils or physiologically active substances.
  • fats and oils examples include sesame oil, soybean oil, olive oil, palm oil, coconut oil, sunflower oil, corn oil, rapeseed oil, rice oil, safflower oil and the like.
  • the bioactive substance is not particularly limited as long as it is a substance whose production increases in plant tissues such as plant cells, plants, plants or seeds, leaves, stems or roots as the induction of LD is enhanced.
  • a fat-soluble physiologically active substance or a hydrophilic physiologically active substance can be mentioned.
  • a fat-soluble physiologically active substance is preferable.
  • fat-soluble physiologically active substances include phospholipids, triacylglycerols and sterols.
  • Vitamin D3 Cholecalciphenol, 25-Hydroxycolecalciferol), Calcitriol, Calcitronic acid, D4 (Dihydroergocalciferol), D5, Dihydrotaxterol, Calcivotriol, Tacalcitol, Varicalcitol (above, Vitamin D) , Tocopherol, tocotrienol, tocophersolan (above, vitamin E), phylloquinone, menaquinone, menadion (above, vitamin K), fat-soluble vitamins of vitamin F sugar; actinioerythritol, cantaxanthin, capsorbin, kukurubitaxanthin A, Xanthophiles or carotenoids such as cryptocapsin, astaxanthin, fucoxanthin, lutein, lycopene, zeaxanthin, capsantin, ⁇ -cryptoxanthin, violaxanthin; bixin, ⁇ -8'-apocarotenal (
  • the mutant plant obtained by the above method can be cultivated to grow an individual plant.
  • mutant plants may be crossed with each other, or mutant plants having mutations at different sites of the same target gene may be crossed with each other.
  • a desired plant can be cultivated and mass-produced from the cells, seeds, callus, etc. of the progeny of the plant thus obtained.
  • Cultivation of plants may be carried out using, for example, soil or a culture solution.
  • the temperature, humidity, pH and light irradiation conditions at the time of cultivation can be appropriately determined.
  • a useful substance can be produced by extracting a useful substance from an individual plant obtained by cultivation by a known method and purifying the useful substance by an appropriate known method.
  • fats and oils or fat-soluble physiologically active substances mainly accumulate in lipid storage organelles in plant cells. Therefore, for example, by using a method such as squeezing, extracting or squeezing, fats and oils or fat-soluble physiologically active substances can be obtained from plant cells, plants, plants, individual plants or plant tissues such as seeds, leaves, stems or roots. Can be extracted. Especially in plants, a large amount of fat or fat-soluble physiologically active substance is accumulated in seeds. Therefore, for example, by collecting seeds and extracting fat or fat-soluble physiologically active substance from the seed, a large amount of fat or fat-soluble physiologically active substance can be obtained. You can get it. In addition, some physiologically active substances may be toxic to plants at high concentrations. For example, by accumulating them in fats and oils in seeds, the physiologically active substances are isolated without showing toxicity to plants. Can be produced.
  • the present invention is a plant obtained by cultivating a plant treated with a medium prepared in advance at pH 4 to 5, a medium containing no iron and iron ions, or a medium containing no magnesium and magnesium ions. It relates to a method for producing a useful substance by extracting a more useful substance. Further, the present invention is a plant body which is previously treated with a medium prepared at pH 4 to 5, a medium containing no iron and iron ions, or a medium containing no magnesium and magnesium ions before cultivation. The present invention relates to a method for cultivating a plant and accumulating a useful substance in the plant, and a method for producing the useful substance.
  • the present invention performs treatment using a medium prepared in advance at pH 4 to 5 in a plant, a medium containing no iron and iron ions, or a medium containing no magnesium and magnesium ions, as compared with before the treatment.
  • the present invention relates to a method for enhancing the induction of lipid storage organelles into cells of the plant or a method for increasing the amount of useful substances accumulated in the plant.
  • Plants, cultivation of plants, useful substances and production of useful substances are the same as described above.
  • examples of the treatment with a medium include a method of culturing the plant in the medium, a method of immersing the plant in the medium, a method of spraying the medium on the plant, and the like.
  • the time for culturing or immersing in the medium is usually 1 to 100 hours, preferably 10 to 60 hours, and more preferably 24 to 48 hours.
  • the medium is not particularly limited as long as it is a medium normally used for culturing plants.
  • MS agar medium, B5 agar medium, White agar medium and the like can be mentioned.
  • the medium may be a liquid medium.
  • the pH of the iron and iron ion-free medium, or the magnesium and magnesium ion-free medium is usually 3 to 8, preferably 4 to 7, particularly preferably 4.5 to 6, and most preferably 4 to 4. It is 5.
  • the medium has a pH of 4 to 5, a medium containing no iron and iron ions, a medium containing no magnesium and magnesium ions, a medium having a pH of 4 to 5 and containing no iron and iron ions, and a medium having a pH of 4 to 5.
  • examples thereof include a medium containing no magnesium and magnesium ions, a medium containing no iron, iron ions, magnesium and magnesium ions, or a medium having a pH of 4 to 5 and containing no iron, iron ions, magnesium and magnesium ions.
  • the plant body to be treated with a medium prepared at pH 4 to 5, a medium containing no iron and iron ions, or a medium containing no magnesium and magnesium ions is the same as described above, and there are restrictions on the presence or absence of genetic modification.
  • a plant that has not been genetically modified, or a plant in which the expression of genes such as the GBSS gene and / or the SBE gene is suppressed or deleted is preferable.
  • Induction of LD in plant cells can be achieved by treating the plant with a medium prepared in advance to pH 4 to 5, a medium containing no iron and iron ions, or a medium containing no magnesium and magnesium ions before cultivation. It is enhanced and increases the amount of useful substances that accumulate in the plant.
  • plants with enhanced LD induction in plant cells can be selected using, for example, the amount of useful substances produced in seeds, leaves, stems or roots as an index.
  • the useful substances are compared with the production amount of useful substances in seeds, leaves, stems or roots of untreated plants.
  • the desired plant can be obtained by selecting the plant with improved production.
  • the plant body treated with a medium containing no sterol can be further treated with a medium containing a sterol inhibitor before cultivation.
  • the type of sterol synthesis inhibitor is not limited, and examples thereof include tolnaftate, terbinafine, econazole, or salts or hydrates thereof.
  • the sterol synthesis inhibitor may be one type or a combination of a plurality of types. A combination consisting only of tolnaftate or a salt or hydrate thereof and terbinafine or a salt or hydrate thereof may be used.
  • the medium and the treatment with the medium are the same as above.
  • the final concentration of the sterol synthesis inhibitor added to the medium is usually 1 to 1000 ⁇ M, preferably 10 to 100 ⁇ M.
  • tolnaftate or a salt or hydrate thereof is used, it is preferably 10 ⁇ M.
  • terbinafine or a salt or hydrate thereof is used, it is preferably 10 to 100 ⁇ M.
  • the time for culturing or immersing in the medium is usually 1 to 100 hours, preferably 10 to 60 hours, and more preferably 24 to 48 hours.
  • tolnaftate or a salt or hydrate thereof is used, it is preferably 24 to 48 hours.
  • terbinafine or a salt or hydrate thereof is used, it is preferably 24 hours.
  • the induction of LD in plant cells is further enhanced as compared with before treatment, and the amount of useful substances accumulated in the plant body is increased. ..
  • plants with enhanced LD induction in plant cells can be selected using, for example, the amount of useful substances produced in seeds, leaves, stems or roots as an index.
  • the useful substances are compared with the production amount of useful substances in seeds, leaves, stems or roots of untreated plants.
  • the desired plant can be obtained by selecting the plant with improved production.
  • the present invention provides a useful substance by extracting a useful substance from a plant obtained by cultivating a plant previously treated with a medium containing tolnaftate, terbinafine, econazole or a salt or hydrate thereof. Regarding the method of manufacturing. Further, the present invention cultivates a plant that is previously treated with a medium containing tornafate, terbinafine, econazole or a salt or hydrate thereof before cultivation, and a useful substance in the plant. And the use of the plant to produce useful substances.
  • a plant is previously treated with a medium containing tornafate, terbinafine, econazole or a salt or hydrate thereof, and lipid storage in the cells of the plant is compared with that before the treatment. It relates to a method of enhancing the induction of an organelle or a method of increasing the amount of useful substances accumulated in the plant.
  • Plants, cultivation of plants, useful substances, production of useful substances, medium and treatment with medium are the same as above.
  • the final concentration of tolnaftate, terbinafine, econazole or salts or hydrates thereof is usually 1 to 1000 ⁇ M, preferably 10 to 100 ⁇ M. When tolnaftate or a salt or hydrate thereof is used, it is preferably 10 ⁇ M. When terbinafine or a salt or hydrate thereof is used, it is preferably 10 to 100 ⁇ M.
  • the time for culturing or immersing in the medium is usually 1 to 100 hours, preferably 10 to 60 hours, and more preferably 24 to 48 hours.
  • tolnaftate or a salt or hydrate thereof is used, it is preferably 24 to 48 hours.
  • terbinafine or a salt or hydrate thereof is used, it is preferably 24 hours.
  • the induction of LD in the plant cells is enhanced as compared with before the treatment, and the induction of LD in the plant cells is enhanced. Increase the amount of useful substances that accumulate.
  • plants with enhanced LD induction in plant cells can be selected using, for example, the amount of useful substances produced in seeds, leaves, stems or roots as an index.
  • the useful substances are compared with the production amount of useful substances in seeds, leaves, stems or roots of untreated plants.
  • the desired plant can be obtained by selecting the plant with improved production.
  • fats and oils can be widely used for industrial purposes such as biofuels or household uses such as cooking oil.
  • physiologically active substances such as fat-soluble physiologically active substances can be widely used in pharmaceutical applications.
  • GC-MS analysis conditions GC: 6890N (G1540) (Agilent Technologies, USA) MS: GCT Premier (Waters Micromass, USA) Autosampler: PAL GC-xt (PAL system, USA) Column: HP-5MS (Agilent Technologies, USA) Carrier gas: Helium gas (1.0 ml / min) Injector temperature: 230 ° C Column oven: The temperature was raised from 0 ° C. to 76 ° C. at 1 ° C./min, the temperature was raised from 76 ° C. to 320 ° C. at 6 ° C./min, and the temperature was further maintained at 320 ° C. for 10 min.
  • the GC-MS transfer line was 250 ° C, and the MS ion source temperature was 250 ° C. Ionization was performed in electron-ionization (EI) mode (70 eV) and the scan range was m / z 40-650. MassLynx (Waters) was used for peak extraction and calculation of peak area value from the obtained mass chromatogram.
  • EI electron-ionization
  • MSLynx Waters
  • Triglyceride extraction and analysis procedure (1) Plant seeds (5.0 mg dry weight) were crushed with Bead beating (30 Hrz, 2 min). (2) 1000 ⁇ l of Chloroform / Methanol (1: 2, v / v) was added, and the mixture was stirred with vortex. (3) RT, 1400 rpm, and 60 min were stirred using ThermoMixer. (4) 500 ⁇ l of 0.9% KCl was added. (5) After stirring with vortex, the mixture was centrifuged at room temperature for 5 minutes at 13000 rpm. (6) The lower layer was spotted on a Silica G60 plate, and triglycerides were separated by TLC.
  • Petroleum ether: ester ether: acetic acid (80: 20: 1) was used as the developing solution. (7) After deployment, 0.005% Primulin (in 80% acetone) was sprayed and UV (365 nm) was irradiated to detect a lipid band. (8) The obtained triglyceride band was scraped off into an Eppendorf tube. (9) 500 ⁇ l of Chloroform was added. (10) After stirring with vortex, the mixture was centrifuged at room temperature for 5 minutes at 14000 rpm. (11) The supernatant was taken in another Eppendorf tube and dried under nitrogen gas. (12) 500 ⁇ l of 0.5 M sodium methoxide in methanol was added, and the mixture was stirred with vortex.
  • GC-MS analysis conditions GC: 6890N (G1540) (Agilent Technologies, USA) MS: GCT Premier (Waters Micromass, USA) Autosampler: PAL GC-xt (PAL system, USA) Column: HP-5MS (Agilent Technologies, USA) Carrier gas: Helium gas (1.0 ml / min) Injector temperature: 230 ° C Column oven: The temperature was raised from 70 ° C to 76 ° C at 1 ° C / min, the temperature was raised from 76 ° C to 350 ° C at 6 ° C / min, and the temperature was further maintained at 350 ° C for 1 min.
  • the GC-MS transfer line was 250 ° C, and the MS ion source temperature was 250 ° C. Ionization was performed in electron-ionization (EI) mode (70 eV) and the scan range was m / z 40-650. MassLynx (Waters) was used for peak extraction and calculation of peak area value from the obtained mass chromatogram.
  • EI electron-ionization
  • MSLynx Waters
  • Example 1 Experiment using Arabidopsis Arabidopsis In Arabidopsis thaliana, a plant having a deletion mutation in the GBSS gene or SBE gene involved in starch storage was prepared, and the LD number and lipid content were measured.
  • FIG. 2 shows an outline of the correlation between starch synthesis and gene expression in metabolic pathways in Arabidopsis thaliana.
  • the Arabidopsis deficient mutant strains used were as follows. All mutants have been confirmed to be T-DNA insertion homozygous.
  • At5g03650 (SBE2.2) gene-deficient mutant strain ⁇ Sbe2.2 (CS25147) (hereinafter referred to as I system) ⁇ Sbe2.2 (SALK_034880) (hereinafter referred to as K system)
  • At1g32900 (GBSS1) gene-deficient mutant strain At1g32900 (GBSS1) gene-deficient mutant strain;
  • ⁇ Gbss1 (CS487721) hereinafter referred to as M system
  • M system ⁇ Gbss1 (SALK_208999)
  • FIG. 3 shows the mutation site due to T-DNA insertion into the At5g03650 (SBE2.2) gene.
  • FIG. 4 shows the mutation site due to T-DNA insertion into the At1g32900 (GBSS1) gene.
  • FIG. 6-1 shows photographs of seeds of wild type (WT), SBE-deficient mutant lines (I and K lines) and GBSS-deficient mutant lines (M and N lines).
  • 6-2A and 6-2B show the vertical and horizontal lengths of the seeds, respectively. As shown in FIGS.
  • the number of granules showing LD was increased overall, and the LD was increased especially in the roots, as compared with the wild type (WT). That is, both the I and K strains of the SBE-deficient mutant strain were found to have enhanced LD compared to the wild type (WT). LD was significantly enhanced, especially in the roots. In FIG. 7, the red-colored granules that appear as dark gray lumps indicate chloroplasts.
  • M line CS487721
  • N line SALK_208999.
  • WT wild type
  • Phospholipid analysis methods include Takumi Ogawa et al., Scientific Reports, 7, 5196 (2017); Adchara Padermshoke et al., PLOS ONE, 11 (9), e0162827; Takeshi Furuhashi et al., Metabolomics, 11 (1). ), 175-183; Takumi Ogawa et al. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 78 (1), (2014) using GC-MS according to the method described.
  • the substances to be analyzed include PC (34: 1), PC (34: 2), PC (34: 6), PC (36: 2), PC (36: 3), PC (36: 4), PC (36).
  • Phosphadylcholine which has a different number of carbon atoms and degree of unsaturation of the acyl group, shown in: 5), PC (36: 6) and PC (38: 3) was selected.
  • Figure 9 shows the analysis results by GC-MS.
  • the substances to be analyzed are represented by C16: 0 FAME, C18: 0 FAME, C18: 2 FAME, C20: 0 FAME, C20: 1 FAME, C22: 0 FAME and C22: 1 FAME, respectively, of carbon number and degree of unsaturation. Different fatty acid methyl esters were selected.
  • FIG. 10 shows the analysis result of fatty acid content by GS-MS analysis.
  • the content of C20: 0 FAME which is a fatty acid of C20 (carbon chain 20)
  • SALK_034880 SALK_034880
  • FIG. 11 shows an outline of a transformation (hairy root induction) method using Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 strain.
  • the hypocotyl of aseptically germinated tomato seedlings was excised and infected by contacting with an Agrobacterium colony having a target transformation vector (pMgP237-2A-gfp).
  • a section was taken from the cotyledons of aseptically germinated tomato seedlings and suspended in an Agrobacterium solution for 15 minutes for infection treatment.
  • Infected hypocotyls and cotyledon sections were cultured in a transformation medium consisting of MS agar medium containing 250 ⁇ g / mL of Cefotaxime.
  • the method was as follows. Unless otherwise specified, the reagents used in this example were products of Wako Pure Chemical Industries, Ltd. or Nacalai Tesque, Inc. 1. 1. The test plant tomato (Solanum lycopersicum Micro Tom) was used. 2. The compositions of the LB medium, YEB medium, B5 medium and MS medium used as the medium are shown in Table 1, Table 2, Table 3 and Table 4, respectively. Kanamycin was added to the medium at 50 ⁇ g / ml or 250 ⁇ g / mL cefotaxime as needed.
  • a co-culture medium, a callus induction medium, a shoot extension medium, and a rooting induction medium were prepared.
  • the compositions of the co-culture medium, callus-inducing medium, shoot elongation medium and rooting-inducing medium are shown in Tables 5, 6, 7 and 8, respectively.
  • GBSS1 (gene ID: Solyc08g083320.2) was identified as a homologue of the GBSS gene in tomato.
  • SBE2.2 (gene ID: Solyc09g009190.2) was identified as a homologue of the SBE gene in tomato.
  • genome editing was performed by CRISPR / Cas9 targeting both GBSS and SBE genes.
  • Tomato SBE Gene In the Arabidopsis experiment described in Example 1, it was confirmed that LD was enhanced by gene disruption related to starch accumulation. Therefore, in order to carry out a similar test on tomato, the tomato SBE2.2 gene (Soly09g009190.2), which has the highest sequence homology with the Arabidopsis thaliana SBE gene, was identified.
  • To identify the tomato SBE2.2 gene use the base sequence from the amino acid sequence of BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) provided by the National Center for Biotechnologuy Information (NCBI). A tblastn having a search function was used.
  • FIG. 17 shows the expression of SBE2.2 (XP_004246561.1) Solyc09g009190.2 in each tissue using an eFP browser (http://bar.utoronto.ca/efp_tomato/cgi-bin/efpWeb.cgi). This gene was found to be the most highly expressed in the leaves.
  • Tomato GBSS1 gene Similar to Example 3-1 the tomato GBSS1 gene (Soly08g083320.2), which has the highest sequence homology with the GBSS1 gene of Arabidopsis thaliana, was identified. The identification of the tomato GBSS1 gene was carried out in the same manner as the identification of the tomato SBE2.2 gene of 3-1. The amino acid sequence of the GBSS1 gene of Arabidopsis thaliana was used as a search query, and the search was performed with the default parameters. The tomato GBSS1 identified as a result of the search consists of 3373 base pairs in total length.
  • FIG. 20 shows the expression of GBSS1 (NP_001311458.1) Solyc08g083320.2 in each tissue using an eFP browser. This gene was found to be the most highly expressed in the leaves.
  • Two defective mutant lines of tomato GBSS1 gene and / and SBE2.2 gene were prepared by deleting different parts of exon 2 of the tomato GBSS1 gene.
  • a defective mutant line sbe2.2-1 in which a part of exon 2 of the tomato SBE2.2 gene was deleted
  • sbe2.2-2 a defective mutant line in which a part of exon 8 was deleted
  • an exon 9 A defective mutant system (sbe2.2-3) in which a part of the above was deleted was prepared.
  • Double mutant strain in which both gbss1-1 and sbe2.2-2 deletion mutations were introduced, and a double mutation strain (double3) in which both gbss1-1 and sbe2.2-3 deletion mutations were introduced.
  • Double mutant line with both gbss1-2 and sbe2.2-1 missing mutations double4
  • FIG. 18 shows an outline of the method of disrupting the SBE2.2 (XP_004246561.1) Solyc09g009190.2 gene by genome editing
  • FIG. 21 shows an outline of the method of disrupting the GBSS1 (NP_001311458.1) Solyc08g083320.2 gene by genome editing
  • FIG. 23 Outline of the method of disruption of GBSS1 (NP_001311458.1) Solyc08g083320.2 gene and SBE2.2 (XP_004246561.1) Solyc09g009190.2 gene by genome editing
  • Fig. 25 shows GBSS1 (NP_001311458.1) Solyc08g083320.2 gene by genome editing.
  • SBE2.2 (XP_004246561.1) Solyc09g009190.2
  • SBE2.2 (XP_004246561.1) Solyc09g009190.2
  • SBE2.2 (XP_004246561.1) Solyc09g009190.2 The outline of the method of gene disruption
  • the vector used is pMgP237-2A-gfp, and genome editing at multiple locations is possible.
  • the outline of editing the pMgP237-2A-gfp vector is shown in FIG. In FIG. 13, the outline of vector preparation for introducing a mutation into either the GBSS1 gene or the SBE2.2 gene is shown as a single knockout, and the outline of vector preparation for introducing a mutation into both the GBSS1 gene and the SBE2.2 gene is shown as a double knockout. Shown as.
  • the pMgP237-2A-gfp vector contains a BsaI recognition site.
  • T1-gRNA-tRNA-T2 are target sequences of about 18 to 20 bp, respectively.
  • RNA design for the target gene sequence, the cDNA sequence and genome sequence of each gene were obtained using the Sol genomics network.
  • the genome and cDNA base sequences of the GBSS1 gene (Solyc08g083320.2) are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, respectively.
  • the genome and cDNA base sequences of the SBE2.2 gene (Solyc09g009190.2) are shown in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively.
  • the target sequence candidate including the PAM sequence was identified by SgRNA designer (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
  • CRISPR / Cas9 has a high risk of off-target action in which guide RNA recognizes and cleaves a sequence similar to the target sequence.
  • Cas-OT Bioinformatics, 15 April 2014, 30 (8), 1180-1182
  • FIG. 14-1 and 14-2 show the sequences of the primers (forward and reverse primers) used to amplify the insert.
  • FIG. 15 shows an outline of amplification of the insert by the primer.
  • the Fw (forward) primer has a sequence in which the sequence of the BsaI recognition sequence, the target sequence, and the gRNA sequence are linked.
  • the Rv (reverse) primer has a BsaI recognition sequence site sequence, a target sequence, and a tRNA sequence.
  • Transformation to E. coli Competent cell DH5 ⁇ was used to transform the vector into E. coli.
  • the operation was performed in the clean bench according to the following procedure. Transformation procedure for E. coli; (1) To 50 ⁇ l of competent cells, 5 ⁇ l of the solution containing the vector obtained in 4-3-2 above was added, and the mixture was gently stirred and then allowed to stand on ice for 30 minutes. (2) Heat shock was performed at 42 ° C for 45 seconds, and the mixture was immediately allowed to stand on ice for 2 minutes. (3) 450 ⁇ l of antibiotic-free LB medium was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. (4) The mixture was applied to LB agar medium (including kanamycin) and cultured at 37 ° C. for 16 hours.
  • LB agar medium including kanamycin
  • DNA sequence analysis procedure (1) 10 ⁇ l of DW, 2 ⁇ l of 125 mM EDTA, 2 ⁇ l of 3 M sodium acetate, 50 ⁇ l of 100% ethanol, and 10 ⁇ l of PCR-reacted sample were added to a 1.5 ml tube and mixed by tapping. (2) It was left at room temperature in a dark place for 15 minutes. (3) Centrifuged at 4 ° C. and 15,000 rpm for 30 minutes. (4) The supernatant was removed by pipetting, 70 ⁇ l of 70% ethanol was added, and the mixture was centrifuged at 4 ° C. and 15,000 rpm for 5 minutes. (5) The supernatant was removed as much as possible and dried in a decompressor. (6) 15 ⁇ l of Hi-Di formamide was added, the sample was dissolved by tapping, transferred to a 96-plate for sequencing, covered, and set in a sample tray for sequence analysis.
  • Agrobacterium transformation 5-1 Competence cell preparation Using the Agrobacterium rhizogenes 15834 strain as Agrobacterium, competent cells were prepared by the following procedure.
  • Colony selection 5-3-1 Colony selection 5-3-1.
  • Colony PCR Takara Ex Taq registered trademark (Takara Bio Inc.) was used for the PCR reaction.
  • a reaction solution was prepared with a composition shown in Table 19 using a 0.5 ml Eppendorf tube, and a PCR reaction was carried out under the reaction conditions shown in Table 20.
  • the nucleotide sequences of the primers used in PCR (SEQ ID NOs: 58 and 59) are shown in Table 21.
  • Plasmid extraction A plasmid was extracted from Agrobacterium by the following procedure, and it was confirmed by agarose gel electrophoresis that the target vector was introduced into Agrobacterium.
  • Plasmid extraction and agarose gel electrophoresis procedures (1) An Agrobacterium solution was collected from the colonies formed after the culture of 5-2. Agrobacterium solution was added to a 2.0 ml tube, and the mixture was centrifuged at 4 ° C. and 10000 rpm for 3 minutes to remove the supernatant. (2) It was sufficiently suspended in TEG (25 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 50 mM glucose) containing lysozyme (4 mg / mL) and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. (3) 0.2 ml of alkaline solution (1% SDS, 0.2N NaOH) was added, mixed by inversion, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • TEG 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 50 mM glucose
  • Plant transformation (preparation of hairy roots derived from Agrobacterium rhizogenes 15834 strain) 6-1. Infection of tomatoes Tomatoes were infected with Agrobacterium into which the vector obtained in 5-2 was introduced by the following procedure.
  • FIG. 16 shows an example of the state of hairy roots in the medium for 1 week after passage.
  • the left is a wild-type (WT) hairy root
  • the right is a hairy root in which GBSS1 exon 2-2 is partially deleted by genome editing.
  • Genomic DNA extraction procedure (1) 300 ⁇ l of extraction buffer was added to a plant sample that was freeze-ground using a mixer mill (MM400, RETSCH, Tokyo Japan). (2) The mixture was stirred with a vortex and allowed to stand on ice for 5 minutes. (3) 300 ⁇ l of a phenol / chloroform solution was added, the mixture was stirred, and the mixture was centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes at 15000 rpm. (4) The upper layer was placed in another Eppendorf tube, the same amount of chloroform as the upper layer was added, and the mixture was centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes at 15000 rpm.
  • the upper layer was taken in another Eppendorf tube, 1000 ⁇ l of 99.9% ethanol was added, and the mixture was centrifuged at 4 ° C. for 20 minutes at 15000 rpm. (6) The upper layer was discarded by decantation and dried on a Kimwipe. (7) 1000 ⁇ l of 70% ethanol was added, and the mixture was centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. (8) 70% ethanol was removed, and the pellet was dried under reduced pressure. 10 ⁇ l TE buffer + 0.05 ⁇ l RNase was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 30 minutes to 1 hour.
  • DNA sequence analysis procedure (1) The entire amount of the PCR reaction solution obtained in 6-2-2 was transferred to a 1.5 mL tube. (2) 10 ⁇ L of distilled water, 2 ⁇ L of 125 mM EDTA, 2 ⁇ L of 3 M sodium acetate, and 50 ⁇ L of ethanol were added. (3) Mixed by tapping. (4) Shielded with aluminum foil and left at room temperature for 15 minutes. (5) Centrifuge at 4 ° C., 15000 rpm for 30 minutes. (6) The supernatant was removed by pipetting. (7) 70 ⁇ L of 70% ethanol was added. (8) Centrifuge at 4 ° C., 15000 rpm for 5 minutes. (9) The supernatant was removed by pipetting.
  • Example 2-2 Observation of transformant 1. Observation with a confocal laser scanning microscope The hairy roots were observed with a confocal laser scanning microscope using Nile Red, a neutral lipid staining reagent, according to the following procedure.
  • Hairy root observation procedure (1) Hairy roots were cut to a length of about 5 mm. (2) After fixing with 4% paraformaldehyde (PFA) / MTSB on ice and under reduced pressure for 20 minutes, it was fixed at room temperature for 40 minutes. (3) Washing was performed twice with MTSB for 5 minutes. (4) Staining with 10 ⁇ g / ml Nile Red for 10 minutes. (5) Observation was performed using a confocal laser scanning microscope (LSM700). A 20x lens and a 40x oil-immersed lens were used for shooting.
  • PFA paraformaldehyde
  • MTSB preparation method 1.5 g PIPES, 0.19 g EGTA, was dissolved 0.13g MgSO 4 ⁇ 7H 2 O and 0.5 g KOH in about 800 ml of distilled water, the pH was adjusted to 7.0 with KOH, and the 1000 ml with distilled water.
  • Tomato SBE gene-deficient mutant line Figure 19 shows the results of an experiment in which lipid accumulation was measured in a tomato SBE gene-deficient mutant line whose genome was edited.
  • Vector control shows a control group in which genome editing has not occurred but only transformation with a genome editing vector.
  • sbe2.2-2 shows a defective mutant line of the tomato SBE2.2 gene exon 8
  • sbe2.2-3 shows a defective mutant line of the tomato SBE2.2 gene exon 9.
  • LD enhancement was verified by Nile Red staining and confocal laser scanning microscopy.
  • the sbe2.2-2 # 10 strain shown in FIG. 19 is a defective mutant strain of exon 8, and the sbe2.2-3 # 6 strain is a defective mutant strain of exon 9.
  • LD enhancement was observed in both lines, and in particular, remarkable LD enhancement was observed in sbe2.2-3 # 6 line.
  • FIG. 22 shows the results of an experiment in which lipid accumulation was measured in a tomato GBSS1 gene-deficient mutant strain whose genome was edited.
  • Vector control shows a control group in which genome editing has not occurred but only transformation with a genome editing vector.
  • the gbss1-1 # 10 line and the gbss1-2 # 19 line shown in FIG. 22 both show a defective mutant line of the tomato GBSS1 gene exon 2.
  • LD enhancement was verified by Nile Red staining and confocal laser scanning microscopy. As shown in FIG. 22, significant LD enhancement was observed in both strains.
  • Figures 24 and 26 show the results of experiments in which lipid accumulation was measured in the genome-edited double mutant strains of the tomato SBE2.2 gene and GBSS1 gene. ..
  • Vector control shows a control experimental group in which genome editing has not occurred but only transformation with a genome editing vector.
  • the # 1 strain of double2 shows a strain into which both gbss1-1 and sbe2.2-2 have defective mutations.
  • Double3 # 2 strains indicate strains into which both gbss1-1 and sbe2.2-3 deletion mutations have been introduced. As shown in FIG. 24, enhancement of LD was observed in both strains.
  • the # 8 strain of double4 shows the results of strains into which both gbss1-2 and sbe2.2-1 deletion mutations have been introduced.
  • the # 17 strain of double5 shows the results of strains into which both gbss1-2 and sbe2.2-2 deletion mutations have been introduced.
  • enhancement of LD was observed in both strains.
  • Example 3 Experiments using tomato leaves Using tomato leaves, genome editing was performed by CRISPR / Cas9 targeting the GBSS1 gene and / or the SBE2.2 gene in the same manner as in Example 2.
  • Agrobacterium into which the target vector was introduced for infecting tomato leaves was prepared by the same method as described in Examples 2-1 to 1 to 5. However, for Agrobacterium, the Agrobacterium u tumefaciens GV3103 strain was used instead of the Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 strain used in Example 2.
  • Example 3-1 Plant transformation (preparation of individual plant derived from Agrobacterium u tumefaciens GV3103 strain) 1. 1. Infection of tomatoes Tomatoes were infected with Agrobacterium into which the vector obtained in 5-2 of Example 2-1 above was introduced by the following procedure.
  • Tomato leaves 7 to 10 days after germination were cut into 1 cm squares.
  • excess water was removed with a Kim towel, transplanted to a co-culture medium, and cultured at 25 ° C. in a dark place.
  • the leaf pieces were subcultured into a callus-inducing medium and cultured at 25 ° C. for 16 hours in a bright place / 8 hours in a dark place.
  • shoot formation was observed, the cells were subcultured in shoot elongation medium and cultured at 25 ° C. for 16 hours in a bright place / 8 hours in a dark place.
  • the elongated shoots were cut from callus, subcultured into rooting medium, and cultured at 25 ° C. for 16 hours in a bright place / 8 hours in a dark place. (6) After confirming rooting, the plants were potted and cultured at 25 ° C for 16 hours in a bright place / 8 hours in a dark place. (7) The prepared individual plants were designated as T 0 generation, and the seeds collected from T 0 generation were designated as T 1 generation.
  • DNA sequence analysis (sequencing) The DNA amplified by the PCR reaction in 2-2 above was subjected to sequence analysis in the same procedure as 6-2-3 of Example 2-1.
  • Example 3-2 Observation of transformant 1. Observation by iodine-starch reaction
  • the first leaf is the leaf at the tip after branching
  • the third leaf which is the third from the tip, is used, and the procedure is as follows. went.
  • the composition of the reaction solution used for the iodine-starch reaction is shown in Table 27.
  • Iodine-starch reaction procedure (1) The third leaf was added to ethanol at 80 ° C. and left at room temperature for 30 minutes. (2) Ethanol was removed, distilled water was added, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes. (3) Distilled water was removed, an aqueous potassium iodide solution was added, and the mixture was left at room temperature for 5 minutes. (4) The aqueous potassium iodide solution was removed, and the mixture was washed with distilled water before observation.
  • FIG. 39 The leaves after the iodine-starch reaction are shown in FIG. 39.
  • WT is a wild type
  • gbss1-2 # 2 is a GBSS1 gene-deficient mutant line
  • sbe2.2 # 3 is a SBE2.2 gene-deficient mutant line
  • gbss1-2sbe2.2 is a GBSS1 gene and SBE2.2 gene.
  • the leaves of the double mutant strain of are shown respectively.
  • the scale bar indicates 1 cm.
  • the leaves of sbe2.2 # 3 are bluish-purple (appearing as dark gray in Fig. 39, the same applies hereinafter), and there is almost no brown stain (appearing as light gray in Fig. 39, the same applies hereinafter).
  • Fig. 28 shows an outline of the method for observing leaf LD.
  • Leaves were used for observing individual plants using a confocal laser scanning microscope, and in order to match the conditions of the leaves to be observed, the leaf at the tip after branching was used as the first leaf, and the third leaf from the tip was used.
  • BODIPY boron-dipyrromethene 493/503 (Thermo Fisher Scientific) was used as a neutral lipid-labeled fluorescent dye for LD observation.
  • the experimental method was examined with reference to (James et al., Proceedings of the National Academy of Sciences (2010) 107: 17833-17838), and the procedure was as follows.
  • Leaf observation procedure (1) A leaf disc with a diameter of 5 mm was prepared using the third leaf. (2) The sample was fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) / MTSB on ice and under reduced pressure for 30 minutes, and then fixed at room temperature for 40 minutes. (3) Washing was performed twice with MTSB for 5 minutes. (4) Staining with 100 ⁇ g / ml BODIPY 493/503 / MTSB for 10 minutes. (5) Observation was performed using a confocal laser scanning microscope (LSM700). A 20x lens and a 40x oil-immersed lens were used for shooting. The number of LDs in the leaves was calculated.
  • PFA paraformaldehyde
  • FIG. 29 shows the strain name and defective gene of the transformed tomato obtained.
  • the gbss1-2 # 2 (1) line (in the figure, (1) is a circled number, the same applies hereinafter) is a GBSS1 gene-deficient mutant line.
  • gbss1-2sbe2.2 # 2 (2), gbss1-2sbe2.2 # 3 (3), and gbss1-2sbe2.2 # 3 (2) are deficient mutant lines of the SBE2.2 gene.
  • gbss1-2sbe2.2 # 4 (3) is a double mutant line of GBSS1 gene and SBE2.2 gene.
  • the number of LDs in the leaves is shown in FIG. A indicates the number at the end of the dark period, and B indicates the number at the end of the light period.
  • the number of LDs increased in the genome editing strain at both the end of the dark period and the end of the light period as compared with the wild type (WT).
  • WT wild type
  • FIG. 31 shows a comparison of the number of LDs at the end of the dark period and the end of the light period.
  • the number of LDs increased at the end of the dark period as compared with the end of the light period.
  • the number of LDs increased at the end of the light period in the double mutant line of the GBSS1 gene and the SBE2.2 gene compared with the end of the dark period.
  • the largest number of LDs were confirmed in the double mutant line of GBSS1 gene and SBE2.2 gene at both the end of the dark period and the end of the light period.
  • Example 4 Enhancement of lipid accumulation by treatment of tomatoes (Micro-Tom hairy roots) with low-molecular-weight compounds 1.
  • Tomato hairy root culture and sterol synthesis inhibitor treatment Micro-Tom hairy root (induced by infection with Agrobacterium rhyzogenes 15834 strain) uses 1/2 MS liquid medium containing 250 mg / L cefotaxime and 1.5% Sucrose. There was. Micro-Tom hairy roots were added to a 100 ml Erlenmeyer flask containing 25 ml of the medium, and the cells were swirled and cultured at 25 ° C. in the dark at 80 rpm. The passage was done weekly.
  • Table 28 shows the low molecular weight compounds used to inhibit sterol synthesis.
  • Dimethyl sulfoxide (DMSO) was used as the solvent for the low molecular weight compounds.
  • FIG. 32 shows the observation results.
  • Each panel of FIG. 32 is treated with 1: DMSO, 2: terbinafine hydrochloride, 3: tolnaftate, 4: econazole nitrate, 5: tebuconazole, 6: ketoconazole, 7: tridemorph, 8: both econazole nitrate and tolnaftate, respectively.
  • the result final concentration 50 ⁇ M is shown.
  • LD proliferates remarkably by treatment with three sterol synthesis inhibitors: terbinafine and tornaftate, which inhibit the action of squalene epoxidase, which catalyzes the reaction from squalene to squalene 2,3-epoxide, and econazole, which inhibits cytochrome P450.
  • terbinafine and tornaftate which inhibit the action of squalene epoxidase, which catalyzes the reaction from squalene to squalene 2,3-epoxide
  • econazole which inhibits cytochrome P450.
  • FIGS. 33-1 to 33-4 show the treatments of both 1: DMSO, 2: tolnaftate, 3: terbinafine hydrochloride, 4: econazole nitrate, and 5: econazole nitrate and tolnaftate, respectively.
  • FIGS. 33-1 and 33-3 have a final concentration of 100 ⁇ M
  • FIGS. 33-2 and 33-4 have a final concentration of 10 ⁇ M
  • FIGS. 33-1 and 33-2 have a processing time of 24 hours.
  • 33-4 show the results of the processing time of 48 hours, respectively.
  • LD tended to be induced as compared with DMSO, and the tendency was particularly strong at the time of 100 ⁇ M treatment (FIGS. 33-1 and 33-3).
  • LD induction was remarkable 24 hours after the treatment (Fig. 33-1 and 33-2) as compared with 48 hours after the treatment (FIGS. 33-3 and 33-4).
  • FIGS. 34-1 to 34-4 show the analysis results of cytosterol, stigmasterol, campesterol and cholesterol, respectively. From this result, it is clear that long-term, high-concentration inhibitor treatment reduces total sterols (Fig. 34-3), while short-term, low-concentration treatment of terbinafine or tolnaftate increases total sterol content. (Fig. 34-2).
  • Fig. 34-3 long-term, high-concentration inhibitor treatment reduces total sterols
  • terbinafine or tolnaftate increases total sterol content.
  • terbinafine hydrochloride the increase in total sterol content was remarkable under the conditions of a final concentration of 10 or 100 ⁇ M and a treatment time of 24 hours.
  • Example 5 Enhancement of lipid accumulation by treatment with low molecular weight compound of GBSS1 gene and / and SBE2.2 gene-deficient mutant tomato gbss1-2sbe2.2 # 2 (2), gbss1-2sbe2.2 # 3 obtained in Example 3 (3), gbss1-2sbe2.2 # 3 (2), gbss1-2sbe2.2 # 4 (3) and wild-type tomatoes were treated with a sterol synthesis inhibitor in the same manner as described in Example 4. However, both tolnaftate and terbinafine hydrochloride were added simultaneously as sterol synthesis inhibitors at each final concentration of 50 ⁇ M. After treatment for 24 hours and staining with a neutral lipid-labeled fluorescent dye BODIPY 493/503, LD was observed using a confocal laser scanning microscope.
  • FIG. 35 shows the results of staining neutral lipids with Bodipy 493/503 for LD of leaves at the end of the light period.
  • FIG. 36 shows the number of LDs when treated with both tolnaftate and terbinafine hydrochloride.
  • the number of LDs was higher when the gene mutant line was treated with both tolnaftate and terbinafine hydrochloride than when the wild type was treated with both tolnaftate and terbinafine hydrochloride.
  • GBSS1 gene and / and SBE2.2 gene mutation and terbinafine synthesis inhibitor treatment were found to have a synergistic lipid accumulation enhancing effect.
  • EXAMPLE 6 Wild-type, as shown in GBSS1 gene or / and LD proliferation experiments view 37B by modification of the medium composition using SBE2.2 gene deletion mutant lines tomatoes, from MS medium, FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, MgSO 4 -A liquid medium from which 7H 2 O and both were removed was prepared. In addition, a liquid medium was prepared in which the pH of the MS medium was adjusted to 4.6.
  • a leaf disk having a diameter of 5 mm was prepared using the third leaf of a plant individual which is a deficient mutant line of the wild type, GBSS1 gene or / and SBE2.2 gene obtained in Example 3. did.
  • the leaf disc was treated with the MS agar medium shown in FIG. 37 or the prepared liquid medium for 24 hours, and the presence or absence of LD proliferation was examined by the same method as in Example 3.
  • the number of LDs in the leaves is shown in FIG. 38.
  • A is the wild type
  • B is gbss1-2 # 2
  • C is gbss1-2sbe2.2 # 3
  • D is gbss1-2sbe2.2 # 4.
  • Control is 1 ⁇ MS medium, pH 4.6
  • the medium was adjusted to 4.6 pH
  • medium -Fe is removal of FeSO 4 ⁇ 7H 2 O
  • medium -Mg the removal of the MgSO 4 ⁇ 7H 2 O
  • pH4 .6 -Fe -Mg was adjusted to 4.6 pH, and show the results in the medium to remove the FeSO 4 ⁇ 7H 2 O and MgSO 4 ⁇ 7H 2 O.
  • the number of LDs increased in the plants treated with each medium of pH 4.6, -Fe, -Mg and pH 4.6 -Fe-Mg as compared with the control.
  • the increase in the number of LDs was remarkable in the plants treated with each medium of -Mg and pH 4.6-Fe-Mg.
  • the number of LDs was increased by treating the plant with a medium prepared at pH 4 to 5, a medium containing no iron and iron ions, or a medium containing no magnesium and magnesium ions. ..

Abstract

本発明は、有用物質の生産量が向上した植物体の提供を目的とする。本発明は、デンプン合成に関わる遺伝子であるGBSS（Granule Bound Starch Synthase）遺伝子及び／又はSBE（Starch Branching Enzyme）遺伝子の発現が抑制された植物体等を栽培し細胞内に脂質貯蔵オルガネラを誘導することにより有用物質を製造する方法である。

Description

有用物質を蓄積する植物体
　本発明は植物の炭素代謝遺伝子に関する。本発明はまた、植物における光合成産物の貯蔵に関わる遺伝子に関する。本発明は更に、該遺伝子を用いた植物改変方法、該方法又は特定の培地での処理によって得られた植物体、及び該植物体を栽培することを含む有用物質を製造する方法等に関する。
　植物は、光合成産物を糖質及び脂質としてそれぞれ貯蔵する。これらの貯蔵に関する遺伝子が単離され、詳細な特性が報告されている。しかし、脂質と糖質との貯蔵バランスを調節する仕組みは未だに明らかにはなっていない。植物を用いた有用物質の生産において、植物の代謝フラックスを制御し、糖質又は脂質の貯蔵量を意図的に改変する技術開発が求められている。
　糖質のうち、デンプンは、直鎖構造を持つアミロース及び直鎖構造と分岐構造とを持つアミロペクチンによって構成される。直鎖構造はグルコースのα-1, 4結合からなり、分岐構造はグルコースのα-1, 6結合からなる。アミロースには分岐構造が無く、アミロペクチンには平均でα-グルコース残基約25個あたり、1個の割合で分枝構造がある。デンプンの直鎖構造部分は、α-グルコース残基6個あたり、約1巻きのラセン構造を取る。ヨウ素デンプン反応による紫色の着色は、ラセン構造にヨウ素分子が取り込まれることによって起こり、ラセン構造が無いと着色しない。
　デンプンは、アミロプラスト又はクロロプラスト等のプラスチドと呼ばれる細胞内小器官で生合成される。デンプン合成前駆体であるグルコース-1-リン酸及びグルコース-6-リン酸は、細胞質からの輸送又は光合成炭酸固定から供給される。これらの前駆体はプラスチド内でADP-グルコースに変換される。ADP-グルコースのグルコース残基は、デンプン合成酵素によって、アミロース又はアミロペクチンの非還元末端にあるα-グルコース残基の4位水酸基と新たなα-1, 4グルコシド結合で付加される（図１）。
　プラスチド中のデンプン合成酵素は、デンプン粒結合型デンプン合成酵素（GBSS）及び可溶性デンプン合成酵素（SSS）に大別される。アミロース及びアミロペクチンの含量はGBSS及びSSSの活性によって制御される。GBSSの活性が欠失した植物はアミロペクチンだけが貯蔵されるモチ性となる。一方、SSSの活性が低下又は欠失した植物は高アミロース含量の性質を有する。
　GBSSは、ADP-グルコースを基質としたα-1, 4グルコシド結合を付加するアミロースの生合成に関与する。一方、SSSはADP-グルコースを基質としたα-1, 4グルコシド結合を付加するアミロペクチンの生合成に関与する。
　SSSによってα-1, 4グルコシド結合にて伸長した直鎖構造の一部を、枝分かれ酵素（SBE）が切断する。切断箇所の還元末端のグルコース残基の1位水酸基と直鎖部分の中間に位置するグルコース残基の6位水酸基との間で新たなα-1, 6グルコシド結合が生じる。生じた分子中に存在する複数の非還元末端は、更にSSSによって伸長が継続するとともに、SBEによって更に新たな非還元末端の側鎖が次々と形成される。余分なα-1, 6グルコシド結合部分はdebranching enzymeによって側鎖がトリミングされ、分岐構造を有するアミロペクチンが生合成される。
　脂質貯蔵オルガネラ（Lipid droplets）（以下、LDという）は、lipid bodies、oil bodies又はadiposomesとも呼ばれる。LDは、中性脂質又はステロール等の脂質を貯蔵する細胞内器官であり、植物を含む真核生物に広く存在する。LDは単なる脂質貯蔵部位として存在するのではなく、細胞内の脂質貯蔵と脂質代謝とのバランス制御において必須の機能を有する。LDは、様々な環境要因に応答して小胞体（ER）から誘導され、リン脂質一重層によって取り囲まれた構造を持つ。植物において、小胞体からのLDの出芽に関わる遺伝子は多数報告されている（非特許文献１）。
Anthony H.C. Huang、Plant Physiol, 2018 Mar; 176（3）:1894-1918.
　本発明は、有用物質を蓄積させた植物体から有用物質を製造する方法、有用物質を蓄積し得る植物体、植物体の脂質貯蔵オルガネラの誘導を増強する方法、植物体中に蓄積する有用物質の量を増やす方法、植物体中に有用物質を蓄積する方法、又は有用物質を製造する為の植物体の使用を提供することを目的とする。
　アブラナ科の双子葉植物であるシロイヌナズナにおいて、GBSS又はSBEは光合成産物である糖を貯蔵物質であるデンプンに変換する酵素である。本発明者らは、これらの遺伝子のノックアウト系統において、細胞内のLDの誘導が増強され、有用物質の含量が増加することを見出した。
　これらのノックアウト系統は、ゲノムへのT-DNA挿入によって得られるT-DNA挿入欠損変異系統を管理する公知のリソース（Arabidopsis Biological Resource Center；ABRC；https://abrc.osu.edu）から入手した。
　本発明者らは、見出したこの現象を、光合成産物をデンプンとして貯蔵する代謝生合成経路の阻害によって代謝フラックスが脂質貯蔵に向けられた結果生じた現象であると推定した。
　これまでに、植物種を問わず、GBSS又はSBEの遺伝子破壊/ノックアウトによってLDが誘導されるという報告はなかった。そこで、この現象が他の植物においても見られ、一般化しうるかを検証するため、ナス科植物であるトマトを用いて、同様の遺伝子破壊を試みた。トマトの遺伝子破壊には、ゲノム編集技術を用いた。
　まず、シロイヌナズナのGBSS及びSBEに対応するトマト遺伝子としてGBSS1（Solyc08g083320.2）及びSBE2.2（Solyc09g009190.2）を同定した。両遺伝子の片方及び両方について、ゲノム編集法による欠損変異を誘導した。得られた3種類の形質転換系統のトマト毛状根培養において、無処理群に比べていずれもLDの増殖を確認した。
　また、トマトにおいて、栽培前に無処理の植物体を予めpH 4～5に調製した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地にて処理することで、無処理群と比べていずれもLDの増殖を確認した。
　更に、トマトにおいて、栽培前に無処理の植物体を予めステロール合成阻害剤であるトルナフタート、テルビナフィン又はそれらの塩若しくは水和物を含む培地で処理することで、無処理群と比べていずれもLDの増殖を確認した。
　このように、本発明者らは、シロイヌナズナ及びトマトの2種類の植物において、デンプン貯蔵に関わるGBSS遺伝子及び/又はSBE遺伝子に欠損変異を有する植物又は植物体、栽培前に無処理の植物体を予めpH 4～5に調製した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地にて処理した植物又は植物体、及び栽培前に無処理の植物体を予めステロール合成阻害剤を含む培地で処理した植物又は植物体を作出し、それぞれの植物又は植物体がLD増強をもたらすこと等を見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　デンプン合成に関わる遺伝子であるGBSS（Granule Bound Starch Synthase）遺伝子及びSBE（Starch Branching Enzyme）遺伝子の発現が抑制された植物体を栽培し細胞内に脂質貯蔵オルガネラを誘導することにより油脂を製造する方法。
[２]　遺伝子の発現が、ゲノム編集、相同組換え法、RNA干渉法、アンチセンス法、遺伝子挿入法、PTGS法及び人為的突然変異法からなる群より選択される方法により抑制される、[１]の方法。
[３]　ゲノム編集による遺伝子破壊により遺伝子の発現が抑制される、[１]又は[２]の方法。
[４]　植物の種子に油脂を蓄積させる、[１]～[３]のいずれかの方法。
[５]　植物がナス科又はアブラナ科の植物である、[１]～[４]のいずれかの方法。
[６]　デンプン合成に関わる遺伝子であるGBSS（Granule Bound Starch Synthase）遺伝子及びSBE（Starch Branching Enzyme）遺伝子の発現を抑制された植物であって、植物体内に油脂を蓄積し得る植物体。
[７]　遺伝子の発現が、ゲノム編集、相同組換え法、RNA干渉法、アンチセンス法、遺伝子挿入法、PTGS法及び人為的突然変異法からなる群より選択される方法により抑制される、[６]の植物体。
[８]　ゲノム編集による遺伝子破壊により遺伝子の発現が抑制される、[６]又は[７]の植物体。
[９]　種子に油脂を蓄積し得る、[６]～[８]のいずれかの植物体。
[１０]　ナス科又はアブラナ科の植物体である、[６]～[９]のいずれかの植物体。
[１１]　[６]～[１０]のいずれかの植物体を栽培することにより、植物体中に油脂を蓄積させる方法。
　更に、本発明は以下のとおりである。
[１]　以下（A）及び／又は（B）の方法を用いて得られた植物体より有用物質を抽出することによる有用物質を製造する方法；
（A）Granule Bound Starch Synthase（GBSS）遺伝子及び/又はStarch Branching Enzyme（SBE）遺伝子の発現が抑制され又は欠失した植物体を栽培する方法；
（B）予めpH 4～5に調製した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地にて処理した植物体を栽培する方法。
[２]　前記（A）のGBSS遺伝子及び/又はSBE遺伝子の発現を抑制又は欠失する方法が、ゲノム編集法、相同組換え法、RNA干渉法、アンチセンス法、遺伝子挿入法、PTGS法及び人為的突然変異法からなる群より選択される方法である、[１]の方法。
[３]　前記（A）のGBSS遺伝子及び/又はSBEの発現を抑制又は欠失する方法が、ゲノム編集法である、[１]又は[２]の方法。
[４]　更に栽培する植物体を予めステロール合成阻害剤を含む培地で処理することを含む、[１]～[３]のいずれかの方法。
[５]　ステロール合成阻害剤が、トルナフタート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物である、[４]の方法。
[６]　処理する際の培地におけるステロール合成阻害剤の最終濃度が1～1000μMである、[４]又は[５]の方法。
[７]　有用物質が油脂又は脂溶性生理活性物質である、[１]～[６]のいずれかの方法。
[８]　脂溶性生理活性物質がビタミンD3、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール又はコレステロールである、[７]の方法。
[９]　有用物質が、植物体の種子、葉、茎又は根に蓄積する、[１]～[８]のいずれかの方法。
[１０]　植物体が、ナス科又はアブラナ科の植物である、[１]～[９]のいずれかの方法。
[１１]　植物体が、シロイヌナズナ又はトマトである、[１]～[１０]のいずれかの方法。
[１２]　Granule Bound Starch Synthase（GBSS）遺伝子及び/又はStarch Branching Enzyme（SBE）遺伝子の発現が抑制され又は欠失した植物体。
[１３]　GBSS遺伝子及び/又はSBE遺伝子の発現を抑制又は欠失する方法が、ゲノム編集法、相同組換え法、RNA干渉法、アンチセンス法、遺伝子挿入法、PTGS法及び人為的突然変異法からなる群より選択される方法である、[１２]の植物体。
[１４]　GBSS遺伝子及び/又はSBEの発現を抑制又は欠失する方法が、ゲノム編集法である、[１２]又は[１３]の植物体。
[１５]　種子、葉、茎又は根に有用物質を蓄積し得る、[１２]～[１４]のいずれかの植物体。
[１６]　有用物質が油脂又は脂溶性生理活性物質である、[１５]の植物体。
[１７]　脂溶性生理活性物質がビタミンD3、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール又はコレステロールである、[１６]の植物体。
[１８]　植物体が、ナス科又はアブラナ科の植物である、[１２]～[１７]のいずれかの植物体。
[１９]　植物体が、シロイヌナズナ又はトマトである、[１２]～[１８]のいずれかの植物体。
[２０]　[１２]～[１９]のいずれかの植物体を栽培し、該植物体中に有用物質を蓄積する方法。
[２１]　栽培する植物体に、更に以下（B1）及び／又は（C1）のいずれか１の処理を予め行う、［１２］～[１９]の該植物体内に有用物質を蓄積する方法；
（B1）pH 4～5に調製した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地での処理；
（C1）ステロール合成阻害剤を含む培地での処理。
[２２]　前記（C1）における、ステロール合成阻害剤が、トルナフタート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物である、[２１]の方法。
[２３]　前記（C1）における、処理する際の培地におけるステロール合成阻害剤の最終濃度が1～1000μMである、[２１]又は[２２]の方法。
[２４]　栽培する前に、pH 4～5に調製した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地での処理を予め行う植物体。
[２５]　種子、葉、茎又は根に有用物質を蓄積し得る、[２４]の植物体。
[２６]　有用物質が油脂又は脂溶性生理活性物質である、[２５]の植物体。
[２７]　脂溶性生理活性物質がビタミンD3、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール又はコレステロールである、[２６]の植物体。
[２８]　植物体が、ナス科又はアブラナ科の植物である、[２４]～[２７]のいずれかの植物体。
[２９]　植物体が、シロイヌナズナ又はトマトである、[２４]～[２７]のいずれかの植物体。
[３０]　予めステロール合成阻害剤であるトルナフタート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物を含む培地で処理した植物体を栽培して得られた植物体より有用物質を抽出することによる有用物質を製造する方法。
[３１]　処理する際の培地におけるステロール合成阻害剤の最終濃度が1～1000μMである、[３０]の方法。
[３２]　有用物質が油脂又は脂溶性生理活性物質である、[３０]又は[３１]の方法。
[３３]　脂溶性生理活性物質がビタミンD3、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール又はコレステロールである、[３２]の方法。
[３４]　有用物質が、植物体の種子、葉、茎又は根に蓄積する、[３０]～[３３]のいずれかの方法。
[３５]　植物体が、ナス科又はアブラナ科の植物である、[３０]～[３４]のいずれかの方法。
[３６]　植物体が、シロイヌナズナ又はトマトである、[３０]～[３５]のいずれかの方法。
[３７]　栽培する前に、ステロール合成阻害剤であるトルナフタート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物を含む培地での処理を予め行った植物体。
[３８]　処理する際の培地におけるステロール合成阻害剤の最終濃度が1～1000μMである、[３７]の植物体。
[３９]　植物体の種子、葉、茎又は根に有用物質を蓄積し得る、[３７]又は[３８]の植物体。
[４０]　有用物質が油脂又は脂溶性生理活性物質である、[３９]の植物体。
[４１]　脂溶性生理活性物質がビタミンD3、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール又はコレステロールである、[４０]の植物体。
[４２]　植物体が、ナス科又はアブラナ科の植物である、[３７]～［４１]のいずれかの植物体。
[４３]　植物体が、シロイヌナズナ又はトマトである、[３７]～[４１]のいずれかの植物体。
[４４]　[２４]～[２９]及び［３７]～[４３］のいずれかの植物体を栽培し、該植物体中に有用物質を蓄積する方法。
[４５]　有用物質を製造する為の、[１２]～[１９]、［２４]～[２９]及び［３７］～［４３］のいずれかの植物体の使用。
[４６]　植物体において以下（A2）、（B2）及び／又は（C2）の処理を行う、処理する前に比べて、該植物体の細胞内への脂質貯蔵オルガネラの誘導を増強する方法；
（A2）Granule Bound Starch Synthase（GBSS）遺伝子及び/又はStarch Branching Enzyme（SBE）遺伝子の発現が抑制され又は欠失する処理；
（B2）pH 4～5に調製した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地を用いた処理；
（C2）トルナフタート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物を含む培地を用いた処理。
[４７]　植物体が、ナス科又はアブラナ科の植物である、[４６]の方法。
[４８]　植物体が、シロイヌナズナ又はトマトである、[４６]の方法。
[４９]　植物体において、以下（A3）、（B3）及び／又は（C3）の処理を行う、処理する前に比べて、該植物体中に蓄積する有用物質の量を増加する方法；
（A3）Granule Bound Starch Synthase（GBSS）遺伝子及び/又はStarch Branching Enzyme（SBE）遺伝子の発現が抑制され又は欠失する処理；
（B3）予めpH 4～5に調製した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地を用いた処理；
（C3）トルナフタート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物を含む培地を用いた処理。
[５０]　有用物質が油脂又は脂溶性生理活性物質である、[４９]の方法。
[５１]　脂溶性生理活性物質がビタミンD3、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール又はコレステロールである、[５０]の方法。
[５２]　植物体が、ナス科又はアブラナ科の植物である、[４９]～[５１]のいずれかの方法。
[５３]　植物体が、シロイヌナズナ又はトマトである、[４９]～[５１]のいずれかの方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-066955号の開示内容を包含する。
　本発明により、有用物質を蓄積させた植物体から有用物質を製造する方法、有用物質を蓄積し得る植物体、植物体の脂質貯蔵オルガネラの誘導を増強する方法、植物体中に蓄積する有用物質の量を増やす方法、植物体中に有用物質を蓄積する方法、又は有用物質を製造する為の植物体の使用を提供することができる。結果として、耕地単位面積あたりの植物体から得られる有用物質の量が多くなり、有用物質の生産にかかる製造コストを削減することが出来る。
緑色植物におけるデンプン及び脂質の合成経路を示す図である。 シロイヌナズナにおけるデンプン合成及び代謝経路に関する遺伝子発現の相関の概略を示す図である。 T-DNA挿入によるAt5g03650（SBE2.2）遺伝子の変異箇所を示す図である。 T-DNA挿入によるAt1g32900（GBSS1）遺伝子の変異箇所を示す図である。 RT-PCRによるSBE遺伝子（Ａ）及びGBSS遺伝子（Ｂ）の発現消失の確認の結果を示す図である。 シロイヌナズナの欠損変異系統における種子サイズを示す図である。図中、WTは野生型、I系統及びK系統はSBE欠損変異系統、M系統及びN系統はGBSS欠損変異系統をそれぞれ示す。 シロイヌナズナの欠損変異系統における種子サイズ（Ａ：種子の縦の長さ、Ｂ：種子の横の長さ）を示す図である。図中、WTは野生型、I系統及びK系統はSBE欠損変異系統、M系統及びN系統はGBSS欠損変異系統をそれぞれ示す。 シロイヌナズナのSBE欠損変異系統における種子未熟胚中のLD数の変化を示す図である。図中、WTは野生型、I系統及びK系統はSBE欠損変異系統をそれぞれ示す。 シロイヌナズナのGBSS欠損変異系統における種子未熟胚中のLD数の変化を示す図である。図中、WTは野生型、M系統及びN系統はGBSS欠損変異系統をそれぞれ示す。 シロイヌナズナの欠損変異系統における、リン脂質の種類及び量の分析結果を示す図である。図中、WTは野生型、sbe2.2-1及びsbe2.2-2はSBE2欠損変異系統、gbss1-1及びgbss1-2はGBSS欠損変異系統をそれぞれ示す。 GC-MSによるシロイヌナズナの欠損変異系統における脂肪酸の種類及び量の分析結果を示す図である。図中、WTは野生型、sbe2.2-1及びsbe2.2-2はSBE2欠損変異系統、gbss1-1及びgbss1-2はGBSS欠損変異系統をそれぞれ示す。 Agrobacterium rhizogenes ATCC15834株を用いたトマトの形質転換方法の概略を示す図である。 トマトを用いた実験におけるゲノム編集箇所を示す図である。 トマトを用いた実験において使用したベクターpMgP237-2A-gfpの構造を示す図である。 トマトを用いた実験において使用したプライマーの配列を示す図である（その１）。 トマトを用いた実験において使用したプライマーの配列を示す図である（その２）。 プライマーを用いたダブルノックアウトの方法の概要を示す図である。 カナマイシン25μg/mLを含む1/2MS寒天培地で継代後１週間のトマトの毛状根の状態を示す図である。 SBE2.2（XP_004246561.1）Solyc09g009190.2遺伝子のトマトの各組織での発現を示す図である。 トマトのゲノム編集によるSBE2.2（XP_004246561.1）Solyc09g009190.2遺伝子の破壊の方法の概略を示す図である。 ゲノム編集によりSBE2.2（XP_004246561.1）Solyc09g009190.2遺伝子の破壊を行ったトマトの根端部における脂質の蓄積を測定した実験の結果を示す図である。図中、WTは野生型、Vector controlはゲノム編集が起きない対照群、sbe2.2-2 #10はSBE2遺伝子エクソン8の欠損変異系統、sbe2.2-3 #6はSBE2遺伝子エクソン9の欠損変異系統をそれぞれ示す。 GBSS1（NP_001311458.1）Solyc08g083320.2遺伝子のトマトの各組織での発現を示す図である。 トマトのゲノム編集によるGBSS1（NP_001311458.1）Solyc08g083320.2遺伝子の破壊の方法の概略を示す図である。 ゲノム編集によりGBSS1（NP_001311458.1）Solyc08g083320.2遺伝子の破壊を行ったトマトの根端部における脂質の蓄積を測定した実験の結果を示す図である。図中、WTは野生型、Vector controlはゲノム編集が起きない対照群、gbss1-1 #10及びgbss1-2 #19はGBSS遺伝子エクソン2の欠損変異系統をそれぞれ示す。 トマトのゲノム編集によるGBSS1（NP_001311458.1）Solyc08g083320.2遺伝子及びSBE2.2（XP_004246561.1）Solyc09g009190.2遺伝子の破壊（double2及びdouble3）の方法の概略を示す図である。 ゲノム編集によるGBSS1（NP_001311458.1）Solyc08g083320.2遺伝子及びSBE2.2（XP_004246561.1）Solyc09g009190.2遺伝子の破壊（double2及びdouble3）を行ったトマトの根端部における脂質の蓄積を測定した実験の結果を示す図である。図中、WTは野生型、Vector controlはゲノム編集が起きない対照群、double2 #1はgbss1-1及びsbe2.2-2の両方の欠損変異を導入した二重変異系統、double3 #2はgbss1-1及びsbe2.2-3の両方の欠損変異を導入した二重変異系統をそれぞれ示す。 トマトのゲノム編集によるGBSS1（NP_001311458.1）Solyc08g083320.2遺伝子及びSBE2.2（XP_004246561.1）Solyc09g009190.2遺伝子の破壊（double4及びdouble5）の方法の概略を示す図である。 ゲノム編集によるGBSS1（NP_001311458.1）Solyc08g083320.2遺伝子及びSBE2.2（XP_004246561.1）Solyc09g009190.2遺伝子の破壊（double4及びdouble5）を行ったトマトにおける脂質の蓄積を測定した実験の結果を示す図である。図中、WTは野生型、Vector controlはゲノム編集が起きない対照群、double4 #8はgbss1-2及びsbe2.2-1の両方の欠損変異を導入した二重変異系統、double5 #17はgbss1-2及びsbe2.2-2の両方の欠損変異を導入した二重変異系統をそれぞれ示す。 WTで示される野生型、VCで示されるゲノム編集が起きない対照群及び各遺伝子欠損変異系統の脂質蓄積量を単位面積あたりの蛍光面積値としてソフトウェアImageJを用いて算出した結果を示す図である。 トマトの葉を用いた実験におけるLDの観察方法の概要を示す図である。 トマトの葉を用いた実験において得られた形質転換トマトの系統名と欠損遺伝子との対比を示す図である。 WTで示される野生型及び各形質転換トマトの葉における単位面積当りのLD数を示す図である。Ａは暗期終了時の数、Ｂは明期終了時の数を示す。 暗期終了時及び明期終了時における、WTで示される野生型及び各形質転換トマトの葉におけるそれぞれの単位面積当りのLD数の比較を示す図である。 各種ステロール合成阻害剤で処理したトマト根培養細胞のLD観察結果を示す図である。図中、スケールバーは20μmである。 各種ステロール合成阻害剤で24時間100μM処理を行ったトマト根培養細胞のLD観察結果を示す図である。図中、スケールバーは50μmである。 各種ステロール合成阻害剤で24時間10μM処理を行ったトマト根培養細胞のLD観察結果を示す図である。図中、スケールバーは50μmである。 各種ステロール合成阻害剤で48時間100μM処理を行ったトマト根培養細胞のLD観察結果を示す図である。図中、スケールバーは50μmである。 各種ステロール合成阻害剤で48時間10μM処理を行ったトマト根培養細胞のLD観察結果を示す図である。図中、スケールバーは50μmである。 各種ステロール合成阻害剤で24時間100μM処理を行ったトマト根培養細胞の総ステロール分析結果を示す図である。 各種ステロール合成阻害剤で24時間10μM処理を行ったトマト根培養細胞の総ステロール分析結果を示す図である。 各種ステロール合成阻害剤で48時間100μM処理を行ったトマト根培養細胞の総ステロール分析結果を示す図である。 各種ステロール合成阻害剤で48時間10μM処理を行ったトマト根培養細胞の総ステロール分析結果を示す図である。 野生型及び形質転換トマトにおけるステロール合成阻害剤（トルナフタート及びテルビナフィン塩酸塩)処理時のBodipy493/503染色による観察結果を示す図である。図中、スケールバーは20μmである。 野生型及び形質転換トマトにおけるステロール合成阻害剤（トルナフタート及びテルビナフィン塩酸塩)処理時の葉における単位面積当りのLD数の比較を示す図である。 培地組成を変更した実験における、LDの観察方法の概要（A）及び用いた培地条件（B）を示す図である。図中、MSはMS寒天培地、-Feは鉄及び鉄イオン不含、-Mgはマグネシウム及びマグネシウムイオン不含であることをそれぞれ示す。 培地組成を変更した実験における形質転換トマトの葉における単位面積当りのLD数を示す図である。Aは野生型、Bはgbss1-2#2、Cはgbss1-2sbe2.2#3、Dはgbss1-2sbe2.2#4の結果をそれぞれ示す。図中、-Feは鉄及び鉄イオン不含の培地条件、-Mgはマグネシウム及びマグネシウムイオン不含の培地条件であることをそれぞれ示す。 ヨウ素デンプン反応後における野生型及び形質転換トマトの葉の観察結果を示す図である。図中、スケールバーは1ｃｍを示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、Granule Bound Starch Synthase（GBSS）遺伝子及び/又はStarch Branching Enzyme（SBE）遺伝子の発現が抑制され又は欠失した植物体を栽培する方法を用いて得られた植物体より有用物質を抽出することによる有用物質を製造する方法に関する。また、本発明は、GBSS遺伝子及び/又はSBE遺伝子の発現が抑制され又は欠失した植物体、該植物体を栽培し、該植物体中に有用物質を蓄積する方法、並びに有用物質を製造する為の該植物体の使用に関する。更に、本発明は、植物体においてGBSS遺伝子及び/又はSBE遺伝子の発現が抑制され又は欠失する処理を行う、処理する前に比べて、該植物体の細胞内への脂質貯蔵オルガネラの誘導を増強する方法又は該植物体中に蓄積する有用物質の量を増加する方法に関する。
　本発明において、植物及び植物体は特に限定されないが、生育速度や植物体の量から、種子植物が好ましい。
　種子植物のうち、被子植物としては、例えば、ナス科、アブラナ科、キク科、マメ科、ウリ科、バラ科、ヤナギ科、ゴマ科、モクセイ科、アオイ科、セリ科、シソ科若しくはアカザ科等に属する双子葉植物又はイネ科若しくはヤシ科等に属する単子葉植物等を用いることが出来る。また、裸子植物として、例えば、マツ科又はイチョウ科等に属する植物を用いることが出来る。
　植物の種としては、広く栽培されている植物種、種子を食用として利用される植物種、従来有用物質の製造に用いられる植物種又は遺伝子解析が進んでいる植物種等が挙げられ、具体的には、トマト、ジャガイモ、ナス又はタバコ等のナス科に属する植物；アブラナ、ナノハナ、キャベツ、ハクサイ、ナタネ、ダイコン又はシロイヌナズナ等のアブラナ科に属する植物；ダイズ、エンドウ、ラッカセイ、インゲンマメ又はアズキ等のマメ科に属する植物；キク、ヒマワリ又はベニバナ等のキク科に属する植物；カボチャ又はキュウリ等のウリ科に属する植物；アーモンド、ウメ、リンゴ又はモモ等のバラ科に属する植物；ヤナギ又はポプラ等のヤナギ科に属する植物；ゴマ等のゴマ科に属する植物；オリーブ等のモクセイ科に属する植物；ワタ又はカカオ等のアオイ科に属する植物；ニンジン又はパセリ等のセリ科に属する植物；シソ、バジル、ミント又はセージ等のシソ科に属する植物；アカザ、テンサイ又はホウレンソウ等のアカザ科に属する植物；イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、キビ、アワ、ヒエ、サトウキビ、タケ、ササ又はハトムギ等のイネ科に属する植物；ココヤシ、アブラヤシ又はロウヤシ等のヤシ科に属する植物；マツ又はモミ等のマツ科に属する植物；イチョウ等のイチョウ科に属する植物等が挙げられる。
　本発明において、植物体としては、例えば、植物由来の生育した植物個体、植物組織、植物細胞、種子又はカルス等が挙げられる。
　GBSSは、植物及び植物体におけるアミロースの生合成において、ADP-グルコースを基質としたα-1, 4グルコシド結合での直鎖の伸張に関与する酵素である。
　SBEは、植物及び植物体におけるアミロペクチンの生合成において、ADP-グルコースを基質としたα-1, 4グルコシド結合での直鎖の伸張に関与する酵素であるSSSによって伸長した直鎖構造の一部を切断する酵素である。
　例えば、アブラナ科のシロイヌナズナにおいて、GBSS遺伝子及びSBE遺伝子の配列は同定されている。シロイヌナズナのGBSS遺伝子はAt1g32900（GBSS1）であり、SBE遺伝子はAt5g03650(SBE2.2)である。At1g32900のゲノム及びcDNAの塩基配列を、それぞれ、配列番号１及び２に示し、At5g03650のゲノム及びcDNAの塩基配列を、それぞれ、配列番号３及び４に示す。
　本発明の各種植物において、シロイヌナズナのGBSS遺伝子及びSBE遺伝子に対応する相同遺伝子として、それぞれの植物種のGBSS遺伝子及びSBE遺伝子を同定することが出来る。
　具体的には、対象の植物からゲノムを抽出し、シロイヌナズナのGBSS遺伝子及びSBE遺伝子に対応する相同遺伝子を同定するか、又は対象の植物のcDNAライブラリーを構築し、シロイヌナズナのGBSS遺伝子及びSBE遺伝子に対応する相同遺伝子を同定すればよい。
　各種植物のGBSS遺伝子の塩基配列は、例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを使用したBLAST又はFASTA等の同一性検索のための公知のアルゴリズムを用いて計算した時に、シロイヌナズナのGBSS遺伝子であるAt1g32900の塩基配列に対して80％以上、好ましくは85％以上、更に好ましくは90％以上の配列同一性を有する。
　各種植物のSBE遺伝子の塩基配列は、例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを使用したBLAST又はFASTA等の相同性検索のための公知のアルゴリズムを用いて計算した時に、シロイヌナズナのSBE遺伝子であるAt5g03650の塩基配列に対して80％以上、好ましくは85％以上、更に好ましくは90％以上の配列同一性を有する。
　また、各種植物のGBSS遺伝子の塩基配列又はSBE遺伝子の塩基配列は、シロイヌナズナのGBSS遺伝子であるAt1g32900の塩基配列又はSBE遺伝子であるAt5g03650の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることが出来る。
　ストリンジェントな条件とは、配列同一性の高いDNAがハイブリダイズする条件であり、その条件は当業者ならば適宜決定することが出来る。例えば1×SSC、0.1％ SDS、37℃程度の条件が挙げられる。より厳しい、即ち中ストリンジェントな条件としては、例えば0.5×SSC、0.1％ SDS、42℃、程度の条件が挙げられる。更に厳しい、即ち高ストリンジェントな条件としては、例えば0.1～0.2×SSC、0.1％ SDS、65℃程度の条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションの後で更に、例えば0.1×SSC、0.1% SDS、55～68℃で洗浄を行う操作等を含んでもよく、この操作によってストリンジェンシーを高めることが出来る。ここで、1×SSCバッファーは、150 mM塩化ナトリウム、15 mMクエン酸ナトリウム、pH7.0の水溶液を示す。
　例えば、ナス科のトマトの場合、GBSS遺伝子としてGBSS1（Solyc08g083320.2）が、SBE遺伝子としてSBE2.2 （Solyc09g009190.2）がそれぞれ本発明において初めて同定された。GBSS1（Solyc08g083320.2）のゲノム及びcDNAの塩基配列を、それぞれ、配列番号５及び６に示し、SBE2.2 （Solyc09g009190.2）のゲノム及びcDNAの塩基配列を、それぞれ、配列番号７及び８に示す。
　本発明において、遺伝子の発現の抑制又は欠失とは、例えば、遺伝子の発現自体の抑制若しくは欠失、又は遺伝子を含むDNAの転写産物としてのRNA、翻訳産物としてのタンパク質若しくはタンパク質の機能としての酵素活性のいずれかの量の低下若しくは消失等が挙げられる。また、遺伝子が発現しても、その発現産物が有する機能が元の遺伝子発現産物が有する機能と比べて低下すること又はその発現産物が有する機能が消失することも、本発明における遺伝子の発現の抑制又は欠失に含まれる。
　遺伝子の発現の抑制又は欠失は、例えば遺伝子の変異、欠失、破壊、ノックダウン又はノックアウト等により、遺伝子の発現又は機能の全部又は一部を抑制又は欠失させることにより得られる。
　本発明において、遺伝子の発現又は機能の全部又は一部の抑制又は欠失を遺伝子への欠損変異の導入ともいう。また、欠損変異が導入された植物の系統を欠損変異系統という。
　２種類の遺伝子の一方の遺伝子に欠損変異を導入する場合は一重変異の誘導といい、２種類の遺伝子の両方に欠損変異を導入する場合は二重変異の誘導という。また、２種類の遺伝子の両方に欠損変異が導入された植物の系統を二重変異系統という。
　遺伝子の発現の抑制は、例えば遺伝子の転写によって生じるmRNA量の低下等により示すことが出来る。具体的には、対照である元となる植物体と比較して、mRNA量が20％以上、30％以上若しくは40％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは80％以上、90％以上又は95％以上低下することが挙げられる。
　遺伝子の発現の欠失は、遺伝子の発現の抑制の１つの形態であるが、遺伝子の発現が完全に欠失することを示す。
　遺伝子の発現の欠失は、例えば、遺伝子を部分的に又は完全に欠失させることにより得ることが出来る。また、遺伝子をノックアウトし、その機能を完全に失わせることにより得ることも出来る。
　各種植物において、GBSS遺伝子又はSBE遺伝子に対応する遺伝子が複数存在する場合があり、その場合には１から全部の遺伝子の発現を抑制又は欠失すればよい。
　遺伝子の発現の抑制又は欠失方法としては、例えば、ゲノム編集法、相同組換え法、RNA干渉法、アンチセンス法、遺伝子挿入法、人為的突然変異法又はウイルスベクターを利用したPTGS法等が挙げられる。
　ゲノム編集法は、部位特異的なヌクレアーゼを利用して標的遺伝子を改変する方法である。ゲノム編集法として、用いるヌクレアーゼにより、例えば、zinc finger nuclease（ZFN）法（Urnov, Fyodor D. et al., Nature, 2 June 2005, 435, 642-651）、Tale nuclease（TALEN）法（Mahfouz, Magdy M et al., PNAS, February 8, 2011, 108（6）, 2623-2628）又はClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）/Crispr Associated protein 9（Cas9）（Jinek, Martin, et al., Science, 17 August 2012, 337, 816-821）若しくはCRISPR/Cas3等のCRISPR/Casシステムによる方法等が挙げられる。ニッカーゼ改変型Casを用いた方法等のヌクレアーゼを改変した方法も本発明のゲノム編集法に含まれる。本発明において、このうちCRISPR/Cas9システムによる方法が好ましい。CRISPR/Cas9システムにおいては、切断することにより機能を欠失させたい遺伝子の標的配列に相補的な配列を含むcrRNA及びtracrRNAからなるguide RNA並びにヌクレアーゼであるCas9により任意の配列を切断する。ゲノムの切断後に非相同性末端結合（NHEJ）により修復が起こり、塩基の欠失等が誘導され、遺伝子をノックアウトすることが出来る。また、ゲノム切断後に相同組換え型修復（HDR）により、標的遺伝子に相同組換えにより変異を誘導することが出来る。
　CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集法によりGBSS遺伝子及び／又はSBE遺伝子を破壊する場合は、該遺伝子中の標的配列を選択し、該配列に相補的な配列を含むguide RNAの配列を設計する。Guide RNAの塩基長は、20以上が好ましい。例えば、得られたguide RNA 及びCas9タンパク質の両方を共発現させるベクターを細胞中に導入する等によりguide RNA及びCas9タンパク質を植物中で共発現させればGBSS遺伝子及び／又はSBE遺伝子を破壊出来る。CRISPR/Cas9によるゲノム編集は、市販のCRISPR/Cas9ツールを用いて行うことが出来る。
　相同組換え法とは、細胞内で２つのDNA分子が同じ塩基配列を介して相互に組換えを起こす現象を利用したものであり、巨大なゲノムDNAを持つ生物の組換えにしばしば用いられる方法である。標的とする遺伝子部位の配列を中央で分断する形で、他のDNAを連結したプラスミド（以下、トランスファーベクターという）を構築し、これを、細胞に導入することにより、該細胞内のDNAとトランスファーベクター上の同じ配列部分との間で入れ換えが起こり、挟み込まれた他のDNAが細胞の標的遺伝子中に組み込まれ、該遺伝子は機能を欠失する。
　RNA干渉（RNAi）法は、２本鎖RNA（dsRNA）によって、その配列特異的にmRNAが切断され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象を利用して発現を抑制する方法である。欠失させようとする遺伝子のmRNAに対して相補的な配列を有するRNAを含む２本鎖RNAを導入することにより遺伝子の発現を抑制することが出来る。
　２本鎖RNAとしては、標的となる遺伝子のmRNAの一部配列に相補的な配列を標的配列として含むアンチセンス鎖及び該アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含む、例えば、siRNA分子又はshRNA分子等が挙げられる。標的配列の塩基数は、特に限定されないが、15～50、15～45、15～40、15～35若しくは15～30塩基、好ましくは20～35塩基、更に好ましくは21～35、21～25若しくは21～23塩基、特に好ましくは21塩基である。これらの２本鎖RNAを植物に投与すればよく、２本鎖RNAの投与は、例えば、２本鎖RNAを発現し得るベクターを投与する方法が挙げられる。２本鎖RNAにより細胞中で標的遺伝子の発現が抑制される。
　アンチセンス法は、標的遺伝子の一部に対して相補的でハイブリダイズし得る１本鎖RNA（以下、アンチセンスRNAという）又はDNA（以下、アンチセンスDNAという）を用いて遺伝子発現を抑制する方法である。アンチセンスRNA又はDNAの塩基数は、11個以上、12個以上、13個以上、14個以上又は15個であればよく、例えば11～30個、好ましくは15～21個の連続した核酸塩基配列からなってもよい。これらのアンチセンスRNA又はアンチセンスDNAを植物に投与すればよく、例えば、アンチセンスRNA又はアンチセンスDNAを産生し得るベクターを投与する方法が挙げられる。
　遺伝子挿入法は、例えば、トランスポゾン又はT-DNA等を遺伝子に挿入し、遺伝子を破壊する方法である。トランスポゾンを利用する方法は、トランスポゾンのゲノムへの遺伝子挿入機構を利用する方法であり、例えば、内在性のトランスポゾン等を用いることが出来る。T-DNAを利用する方法は、例えば、T-DNAベクター等を用い、アグロバクテリウム形質転換法によるTiプラスミド上のT-DNA領域標的遺伝子にT-DNAを挿入する方法等である。これらの遺伝子挿入法により生じたランダムな変異体の集団から、標的の遺伝子が欠失した変異体を選抜すればよい。
　人為的突然変異法は、例えば、Ｘ線若しくはガンマ線等の放射線又はアルキル化剤若しくはニトロ化合物等の変異原性化学物質で処理し、遺伝子を変異させ、機能を欠失させる方法が挙げられる。これらの人為的突然変異法により生じたランダムな変異体の集団から、標的の遺伝子の欠失した変異体を選抜すればよい。
　Post transcriptional gene silencing（PTGS）法は、遺伝子が転写された後にタンパク質に翻訳されるまでの過程で遺伝子発現が負に制御される現象を利用した方法である。
　上述の遺伝子の発現の抑制又は欠失方法において、標的遺伝子における特定の配列を直接変異の導入部位として利用出来る。また、ゲノム情報等から標的遺伝子の配列と近接する領域の配列を特定し、当該近接領域の配列を利用することにより、標的の遺伝子の全領域を欠失させることも出来る。
　上術の遺伝子の発現の抑制又は欠失方法の中でも、遺伝子をノックアウトし、機能を完全に失わせることが出来るゲノム編集法が好ましい。
　本発明において、植物はGBSS遺伝子及びSBE遺伝子を有することから、GBSS遺伝子又はSBE遺伝子のいずれかの発現を抑制又は欠失するか、GBSS遺伝子及びSBE遺伝子の両方の遺伝子の発現を抑制又は欠失することが出来る。このうち、GBSS遺伝子及びSBE遺伝子の両方の遺伝子の発現を抑制又は欠失するのが好ましく、GBSS遺伝子及びSBE遺伝子の両方の遺伝子の発現を欠失するのが特に好ましい。また、GBSS遺伝子及びSBE遺伝子の両方の遺伝子について、二重変異を誘導し、GBSS遺伝子及びSBE遺伝子の両方の遺伝子の機能を欠失することが好ましい。
　上術の方法により得られたGBSS遺伝子及び／又はSBE遺伝子の発現が抑制され又は欠失した変異植物体を選抜する。選抜の方法は限定されないが、例えば、GBSS遺伝子及び／若しくはSBE遺伝子の発現の抑制若しくは欠失、又はGBSS遺伝子及び／若しくはSBE遺伝子の機能の抑制若しくは欠失を指標に選抜する方法が挙げられる。
　GBSS遺伝子及び／又はSBE遺伝子の発現の抑制又は欠失により、植物細胞中のLDの誘導が増強され、該植物体中に蓄積する有用物質の量が増加する。従って、GBSS遺伝子及び／又はSBE遺伝子の発現が抑制され又は欠失した変異植物体は、例えば、種子、葉、茎又は根の中における有用物質の生産量を指標に選抜することも出来る。種子、葉、茎又は根の中における有用物質の生産量を指標に選抜する場合、例えば、GBSS遺伝子及び／又はSBE遺伝子の発現が抑制され又は欠失していない元の植物の種子、葉、茎又は根中における有用物質の生産量と比較し、該有用物質の生産量が向上した植物体を選抜することで目的の植物体を得ることが出来る。
　本発明において有用物質としては、例えば、油脂または生理活性物質が挙げられる。
　油脂としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油、オリーブ油、パーム油、ヤシ油、ヒマワリ油、トウモロコシ油、ナタネ油、コメ油又はベニバナ油等が挙げられる。
　生理活性物質としては、LDの誘導の増強に伴い植物細胞、植物、植物体又は種子、葉、茎若しくは根等の植物組織の中において生産が増加する物質であれば、特に制限はないが、例えば、脂溶性生理活性物質又は親水性生理活性物質が挙げられる。好ましくは脂溶性生理活性物質が挙げられる。
　脂溶性生理活性物質としては、例えば、リン脂質、トリアシルグリセロール又はステロールが挙げられる。具体的には、レチノール、αカロテン、βカロテン、γカロテン、リコペン、クリプトキサンチン、トレチノイン（以上、ビタミンＡ）、ビタミンD2（エルゴステロール、エルゴカルシフェノール９）、ビタミンD3（7-デヒドロコレステロール、プレビタミンＤ３、コレカルシフェノール、25-ヒドロキシコレカルシフェロール）、カルシトリオール、カルシトロン酸、D4（ジヒドロエルゴカルシフェロール）、D5、ジヒドロタキステロール、カルシボトリオール、タカルシトール、バリカルシトール（以上、ビタミンD）、トコフェロール、トコトリエノール、トコフェルソラン（以上、ビタミンＥ）、フィロキノン、メナキノン、メナジオン（以上、ビタミンＫ）、ビタミンＦ糖の脂溶性ビタミン類；アクチニオエリスリトール、カンタキサンチン、カプソルビン、ククルビタキサンチンＡ、クリプトカプシン、アスタキサンチン、フコキサンチン、ルテイン、リコピン、ゼアキサンチン、カプサンチン、β－クリプトキサンチン、ビオラキサンチン等のキサントフィル又はカロテノイド類；ビキシン、β－８'－アポ－カロテナール（アポカロテナール）、β－１２'－アポ－カロテナール等のアポカルテノイド類；シトスタノール、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、ブラシカステロール、ブラシカステロール、イソフコステロール、７－スチグマステノール、イソフコスタノール、スチグマスタノール、７－スチグマスタノール、カンペスタノール、シクロアルテノール、アベナステロール等の植物ステロール類；ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、リノール酸、リノレン酸等の炭素数１２～３０の高級脂肪酸；クルクミン、バラポリフェノール、フェルラ酸、ケルセチン又はカカオマスのいずれかから選ばれるポリフェノール類；イソフラボン、イソフラボンアグリコン、フラバノン、アントシアニジン、カテキン、カルコン、ノビレチン等のフラボノイド類；トコトリエノール、γ－トコトリエノール、トコフェロール、α－トコフェロール、トコフェロールアセテート、トコフェリルリノール酸、トコフェリルニコチネート等のトコフェロール類；レチノール、レチニルアセテート、レチニルパルミテート等のレチノール類；フィロキノン、メナキノン、メナジオン等のメナキノン類；フィトール、アビエチン酸、レボビマル酸、ジベレリン等のジテルペン類；コーヒー酸フェネチルエステル、アルテピリンＣ、クマル酸等の桂皮酸誘導体又はプロポリス；スクアレン、ラノステロール、ククルビタシン、リモニン等のトリテルペン類；メントール、シオネール、ローズ油等の着香料；ペパーミント油、スペアミント油、ベルガモット油、ウイキョウ油、ハッカ油、レモン果皮油等の精油；コエンザイムＱ１０；ポリコサノ－ル；セサミン；αリポ酸やこれらの誘導体等が挙げられる。好ましくは、ビタミンD3、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール又はコレステロールが挙げられる。
　上述の方法にて得られた変異植物体を栽培し、植物個体を生育することが出来る。
　更に、上述の変異植物体を母本として、有用物質の生産能が増強された植物体を後代として作出することも出来る。変異植物体を母本とする場合は、当該変異植物体同士を交配するか、目的とする同じ遺伝子の異なる部位に変異を有する変異植物体同士を交配すればよい。このようにして得られた植物体の子孫の細胞、種子又はカルス等より、所望の植物体を栽培し量産することが出来る。
　植物体の栽培は、例えば、土壌又は培養液等を用いて行えばよい。栽培時の温度、湿度、pH及び光照射の条件は適宜決定することが出来る。
　栽培して得られた植物個体より、公知の方法で有用物質を抽出し、適宜公知の方法で有用物質を精製することで、有用物質を製造することが出来る。
　有用物質のうち、油脂又は脂溶性生理活性物質は、主に植物細胞中の脂質貯蔵オルガネラに蓄積する。従って、例えば、圧搾、抽出又は圧出等の方法を用いることで、植物細胞、植物、植物体、植物個体又は種子、葉、茎若しくは根等の植物組織から、油脂又は脂溶性生理活性物質を抽出出来る。特に植物において種子に多量の油脂又は脂溶性生理活性物質が蓄積する為、例えば、種子を採取し、そこから油脂又は脂溶性生理活性物質を抽出することで大量の油脂又は脂溶性生理活性物質を得ることが出来る。また、生理活性物質の中には高濃度で植物体に毒性を示すことがあり、例えば、種子中の油脂中に蓄積させることにより、植物体に毒性を示すことなく隔離した状態で生理活性物質を生産することが出来る。
　本発明は、予めpH 4～5に調製した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地にて処理した植物体を栽培する方法を用いて得られた植物体より有用物質を抽出することによる有用物質を製造する方法に関する。また、本発明は、栽培する前に、pH 4～5に調製した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地での処理を予め行う植物体、該植物体を栽培し、該植物体中に有用物質を蓄積する方法、及び有用物質を製造する為の該植物体の使用に関する。更に、本発明は、植物体において予めpH 4～5に調製した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地を用いた処理を行う、処理する前に比べて、該植物体の細胞内への脂質貯蔵オルガネラの誘導を増強する方法又は該植物体中に蓄積する有用物質の量を増加する方法に関する。
　植物体、植物体の栽培、有用物質及び有用物質の製造は上述と同様である。
　本発明において、培地での処理としては、例えば、植物体を培地で培養する方法、植物体を培地に浸す方法又は当該培地を植物体に噴霧する方法等が挙げられる。培養又は培地への浸漬の時間は、通常1～100時間であり、好ましくは10～60時間、更に好ましくは24～48時間である。
　培地は、通常植物の培養に用いる培地であれば特に制限はない。例えば、MS寒天培地、B5寒天培地又はWhite寒天培地等が挙げられる。培地は、液体培地でも良い。鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地のpHは通常3～8であり、好ましくは4～7であり、特に好ましくは4.5～6であり、最も好ましくは4～5である。
　具体的には、pH 4～5の培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、マグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地、pH 4～5且つ鉄及び鉄イオンを含まない培地、pH 4～5であり且つマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地、鉄、鉄イオン、マグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地、又はpH 4～5且つ鉄、鉄イオン、マグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地が挙げられる。
　pH 4～5に調製した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地にて処理する植物体としては、上述と同様であり、遺伝子改変の有無等の制限は特にないが、遺伝子改変されていない植物体、又はGBSS遺伝子及び／若しくはSBE遺伝子等の遺伝子の発現が抑制若しくは欠失した植物体が好ましい。
　栽培する前に、予め植物体をpH 4～5に調製した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地で処理することにより、植物細胞中のLDの誘導が増強され、該植物体中に蓄積する有用物質の量を増加する。
　従って、植物細胞中のLDの誘導が増強された植物体は、例えば、種子、葉、茎又は根の中における有用物質の生産量を指標に選抜することも出来る。種子、葉、茎又は根の中における有用物質の生産量を指標に選抜する場合、例えば、無処理の植物の種子、葉、茎又は根中における有用物質の生産量と比較し、該有用物質の生産量が向上した植物体を選抜することで目的の植物体を得ることが出来る。
　上述のGBSS遺伝子及び／若しくはSBE遺伝子等の遺伝子の発現が抑制若しくは欠失した植物体、又は／及び予めpH 4～5に調製した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地若しくはマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地にて処理した植物体は、栽培前に更に予めステロール阻害剤を含む培地にて処理することも出来る。
　本発明において、ステロール合成阻害剤の種類は限定されないが、例えば、トルナフテート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物が挙げられる。ステロール合成阻害剤は1種類でも複数の種類を組合せても良い。トルナフテート又はその塩若しくは水和物、及びテルビナフィン又はその塩若しくは水和物のみからなる組合せを用いてもよい。
　培地及び培地での処理は上述と同様である。
　培地に添加するステロール合成阻害剤の最終濃度は、通常1～1000μMであり、好ましくは10～100μMである。トルナフテート又はその塩若しくは水和物を用いる場合には、好ましくは10μMである。テルビナフィン又はその塩若しくは水和物を用いる場合には、好ましくは10～100μMである。
　培養又は培地への浸漬の時間は、通常1～100時間であり、好ましくは10～60時間、更に好ましくは24～48時間である。トルナフテート又はその塩若しくは水和物を用いる場合には、好ましくは24～48時間である。テルビナフィン又はその塩若しくは水和物を用いる場合には、好ましくは24時間である。
　栽培前に更に予めステロール阻害剤を含む培地にて処理することにより、処理前に比べて更に、植物細胞中のLDの誘導が増強され、該植物体中に蓄積する有用物質の量を増加する。
　従って、植物細胞中のLDの誘導が増強された植物体は、例えば、種子、葉、茎又は根の中における有用物質の生産量を指標に選抜することも出来る。種子、葉、茎又は根の中における有用物質の生産量を指標に選抜する場合、例えば、無処理の植物の種子、葉、茎又は根中における有用物質の生産量と比較し、該有用物質の生産量が向上した植物体を選抜することで目的の植物体を得ることが出来る。
　本発明は、予めトルナフテート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物を含む培地にて処理した植物体を栽培する方法を用いて得られた植物体より有用物質を抽出することによる有用物質を製造する方法に関する。また、本発明は、栽培する前に、トルナフテート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物を含む培地での処理を予め行う植物体、該植物体を栽培し、該植物体中に有用物質を蓄積する方法、及び有用物質を製造する為の該植物体の使用に関する。更に、本発明は、植物体において予めトルナフテート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物を含む培地を用いた処理を行う、処理する前に比べて、該植物体の細胞内への脂質貯蔵オルガネラの誘導を増強する方法又は該植物体中に蓄積する有用物質の量を増加する方法に関する。
　植物体、植物体の栽培、有用物質、有用物質の製造、培地及び培地での処理は上述と同様である。
　トルナフテート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物の最終濃度は、通常1～1000μMであり、好ましくは10～100μMである。トルナフテート又はその塩若しくは水和物を用いる場合には、好ましくは10μMである。テルビナフィン又はその塩若しくは水和物を用いる場合には、好ましくは10～100μMである。
　培養又は培地への浸漬の時間は、通常1～100時間であり、好ましくは10～60時間、更に好ましくは24～48時間である。トルナフテート又はその塩若しくは水和物を用いる場合には、好ましくは24～48時間である。テルビナフィン又はその塩若しくは水和物を用いる場合には、好ましくは24時間である。
　栽培前に、予めトルナフテート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物を含む培地にて処理することにより、処理前に比べて、植物細胞中のLDの誘導が増強され、該植物体中に蓄積する有用物質の量を増加する。
　従って、植物細胞中のLDの誘導が増強された植物体は、例えば、種子、葉、茎又は根の中における有用物質の生産量を指標に選抜することも出来る。種子、葉、茎又は根の中における有用物質の生産量を指標に選抜する場合、例えば、無処理の植物の種子、葉、茎又は根中における有用物質の生産量と比較し、該有用物質の生産量が向上した植物体を選抜することで目的の植物体を得ることが出来る。
　製造した有用物質のうち、油脂はバイオ燃料等の工業用途又は食用油等の家庭用途に広く利用することが出来る。
　また、脂溶性生理活性物質等の生理活性物質は医薬品等の用途に広く使用することが出来る。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　以下の実施例において、植物種子中の有用物質であるステロール及び中性脂質の分析は以下のプロトコールにより行った。ステロール及び中性脂質の分析は他の方法によっても可能である。
１．ステロール分析
　全ステロールの抽出及び分析は、R.G. Dyer et al., Journal of Chromatography B, 663: 1-7に記載の方法を一部改変して以下の手順にて行った。
　全ステロールの抽出及び分析手順；
（1）　植物種子（10.0 mg dry weight）を乳鉢と乳棒を用いて、液体窒素中で破砕した。
（2）　クロロホルム／メタノール（1：2）を5ml、内部標準物質（62.5μg/ml 5α-cholestane）を50μl加え，試験管に移した。
（3）　ボルテックスで撹拌し、室温で30分間静置した。
（4）　1%（w/v）KCl水溶液を2ml、クロロホルムを1ml加え、ボルテックスで撹拌した。
（5）　室温、10分間、3000rpmで遠心した。
（6）　下層を別の試験管に移し、メタノール／水（10:9）を2ml加えた。
（7）　ボルテックスで撹拌後、室温、10分間、3000rpmで遠心した。
（8）　下層を別の試験管に移し、窒素ガス下で乾固させた。
（9）　1M KOHメタノールを2.5ml加え、ボルテックスで撹拌した。
（10）　一晩暗所に静置した。
（11）　クロロホルムを2ml、超純水を2.5ml加え、ボルテックスで撹拌した。
（12）　室温、5分間、3000rpmで遠心した。
（13）　下層を別の試験管に移した。
（14）　上層にクロロホルムを1ml加え、ボルテックスで撹拌後、室温、5分間、3000rpmで遠心し、下層を（13）で移した下層と合わせた。
（15）　合わせた有機層に0.5M KOH水溶液を1.25ml加えた。
（16）　ボルテックスで撹拌後、室温、5分間、3000rpmで遠心した。
（17）　下層を別の試験管に移し、超純水を6ml加えた。
（18）　ボルテックスで撹拌後、室温、15分間、3000rpmで遠心した。
（19）　下層を別の試験管に移し、窒素ガス下で乾固させた。
（20）　一晩凍結乾燥させた。
（21）　ピリジンを20μl、BSTFA + 1% TMCS を20μl加え、70℃で30分間トリメチルシリル化（誘導体化）した。
（22）　ピリジンを60μl加えて撹拌し、更にピリジンで5倍に希釈した後、GC-MSを用いて以下条件にて分析を行った。
GC-MS分析条件；
GC：6890N （G1540） （Agilent Technologies, USA）
MS : GCT Premier （Waters Micromass, USA）
オートサンプラー:PAL GC-xt （PAL system, USA）
カラム :HP-5MS （Agilent Technologies, USA）
キャリアーガス :ヘリウムガス （1.0 ml/min）
インジェクター温度:230℃
カラムオーブン :0℃から76℃まで1℃/minで上昇させ、76℃から320℃まで6℃/minで上昇させて、更に320℃で10min保持した。GC-MSトランスファーラインは250℃、MSイオン源温度は250℃とした。イオン化はelectron-ionization （EI）モード（70 eV）で行い、スキャン範囲はm/z 40-650とした。得られたマスクロマトグラムからのピーク抽出及びピーク面積値の算出はMassLynx（Waters 社）を用いた。
２．中性脂質分析
　中性脂質の抽出は、Chia-Hong Tsai et al., The Plant Journal, 83: 650-660に記載の方法を一部改変し、脂肪酸のメチルエステル化及び分析は、Takeshi et al., Metabolomicsに記載の方法を一部改変し以下の手順にて行った。
　中性脂質の抽出及び分析手順；
（1）　植物種子（5.0 mg dry weight）をBead beating（30 Hrz, 2 min）で破砕した。
（2）　Chloroform / Methanol（1 : 2, v/v）を1000μl加え、ボルテックスで撹拌した。（3）　ThermoMixerを用いてRT、1400rpm、60min撹拌した。
（4）　0.9% KClを500μl加えた。
（5）　ボルテックスで撹拌後、室温、5分間、13000rpmで遠心した。
（6）　下層をSilica G60 plateにスポットし、TLC で中性脂質を分離した。展開溶液にはPetroleum ether : diethyl ether : acetic acid （80 : 20 : 1）を使用した。
（7）　展開後、0.005% Primulin（in 80% acetone）を吹き付け、UV（365 nm）を照射し脂質のバンドを検出した。
（8）　得られた中性脂質のバンドをエッペンドルフチューブに削り取った。
（9）　Chloroformを500μl加えた。
（10）　ボルテックスで撹拌後、室温、5分間、14000rpmで遠心した。
（11）　上清を別のエッペンドルフチューブに取り、窒素ガス下で乾固させた。
（12）　0.5 M sodium methoxide in methanolを500μl加え、ボルテックスで撹拌した。
（13）　ThermoMixerを用いて55℃、1000rpm、90min撹拌した。
（14）　5分間室温で静置した。
（15）　1% acetic acidを500μl、chloroformを400μl加えた。
（16）　ボルテックスで撹拌後、室温、3分間、14000rpmで遠心した。
（17）　下層を別のエッペンドルフチューブに取り、超純水を1000μl加えた。
（18）　ボルテックスで撹拌後、室温、3分間、14000rpmで遠心した。
（19）　下層を別のエッペンドルフチューブに取り、窒素ガス下で乾固させた。
（20）　ピリジン100μlに溶解させ、GC-MSを用いて以下条件にて分析を行った。
GC-MS分析条件；
GC：6890N （G1540） （Agilent Technologies, USA）
MS :GCT Premier （Waters Micromass, USA）
オートサンプラー:PAL GC-xt （PAL system, USA）
カラム :HP-5MS （Agilent Technologies, USA）
キャリアーガス :ヘリウムガス （1.0 ml/min）
インジェクター温度:230℃
カラムオーブン :70℃から76℃まで1℃/minで上昇させ、76℃から350℃まで6℃/minで上昇させて、更に350℃で1min保持した。GC-MSトランスファーラインは250℃、MSイオン源温度は250℃とした。イオン化はelectron-ionization （EI）モード（70 eV）で行い、スキャン範囲はm/z 40-650とした。得られたマスクロマトグラムからのピーク抽出及びピーク面積値の算出はMassLynx（Waters 社）を用いた。
実施例１　シロイヌナズナを用いた実験
　シロイヌナズナにおいて、デンプン貯蔵に関わるGBSS遺伝子又はSBE遺伝子に欠損変異を有する植物を作製し、LD数及び脂質含量を測定した。
　図２にシロイヌナズナにおけるデンプン合成及び代謝経路の遺伝子発現の相関の概略を示す。
（０）シロイヌナズナ欠損変異系統の取得
　GBSS遺伝子又はSBE遺伝子に欠損変異を有するシロイヌナズナは、T-DNA挿入によるGBSS遺伝子又はSBE遺伝子の破壊によって作製した。T-DNA挿入による変異株は、The Arabidopsis Information Resource（TAIR）（https://www.arabidopsis.org/）から入手した。すなわち、SIGnAL Salk Institute Genomic Analysis Laboratoryが提供するT-DNA express Arabidopsis Gene mapping tool（http://signal.salk.edu/cgibin/tdnaexpress）を用いてT-DNA挿入欠損変異系統を探索し、種子をTAIRから購入した。
　用いたシロイヌナズナ欠損変異系統は以下のとおりであった。いずれの変異体もT-DNA挿入ホモであることを確認している。
　At5g03650（SBE2.2）遺伝子欠損変異系統；
・sbe2.2 （CS25147） （以下、I系統という。）
・sbe2.2 （SALK_034880） （以下、K系統という。）
　At1g32900（GBSS1）遺伝子欠損変異系統；
・gbss1 （CS487721） （以下、M系統という。）
・gbss1 （SALK_208999） （以下、N系統という。）
　図３にAt5g03650（SBE2.2）遺伝子へのT-DNA挿入による変異箇所を示す。図４にAt1g32900（GBSS1）遺伝子へのT-DNA挿入による変異箇所を示す。
（１）GBSS及びSBE遺伝子の発現消失の確認
　シロイヌナズナの野生型、SBE欠損変異系統の2系統［I系統＝CS25147（sbe2.2-1）、K系統＝SALK_034880（sbe2.2-2）］及びGBSS欠損変異系統の2系統［M系統＝CS467721（gbss1-1）、N系統＝SALK_208999（gbss1-2）］について、RT-PCRによりGBSS遺伝子及びSBE遺伝子の発現消失を確認した。
　結果を図５に示す。図５に示すように、SBE欠損変異系統の2系統（I系統＝CS25147、K系統＝SALK_034880）及びGBSS欠損変異系統の2系統（M系統＝CS487721、N系統＝SALK_208999）について、野生型（WT）に比べて、それぞれの遺伝子の転写産物（mRNA）蓄積が消失又は抑制されていた。
（２）種子サイズの変化
　シロイヌナズナの野生型、SBE欠損変異系統の2系統［I系統＝CS25147（sbe2.2-1）、K系統＝SALK_034880（sbe2.2-2）］及びGBSS欠損変異系統の2系統［M系統＝CS467721（gbss1-1）、N系統＝SALK_208999（gbss1-2）］について、種子サイズを確認した。結果を図６－１及び６－２に示す。図６－１は野生型（WT）、SBE欠損変異系統（I系統及びK系統）及びGBSS欠損変異系統（M系統及びN系統）の種子の写真を示す。図６－２Ａ及び図６－２Ｂは、それぞれ、種子の縦の長さ及び横の長さを示す。図６－１及び６－２に示すように、シロイヌナズナのSBE欠損変異系統の2系統（I系統＝CS25147、K系統＝SALK_034880）及びGBSS欠損変異系統の2系統（M系統＝CS487721、N系統＝SALK_208999）はそれぞれ種子サイズが野生型(WT)に比べて増大した。
（３）種子未熟胚中のLD数の変化
　シロイヌナズナの野生型、SBE欠損変異系統の2系統［I系統＝CS25147（sbe2.2-1）、K系統＝SALK_034880（sbe2.2-2）］及びGBSS欠損変異系統の2系統［M系統＝CS467721（gbss1-1）、N系統＝SALK_208999（gbss1-2）］について、種子未熟胚中のLD数を調べた。
　LDに蓄積する脂質をBodipy493/503蛍光試薬で染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。Bodipy493/503を用いた計測は、Bio Protoo., 2016 Sep 5; 6（17）: e1912の記載に従い行った。
　図７に、シロイヌナズナSBE欠損変異系統の2系統（I系統＝CS25147、K系統＝SALK_034880）由来の種子未熟胚中のLDを示す。図７では薄いグレーの小さい円として見える緑色に発色した顆粒がLDを示す。I系統及びK系統において、野生型（WT）に比べ、LDを示す顆粒が全体的に増加しており、特に根でLDが増加していた。すなわち、SBE欠損変異系統のI系統及びK系統、ともに野生型（WT）に比べてLDの増強が認められた。特に根でLDが著しく増強されていた。なお、図７において、濃いグレーの塊として見える赤色に発色した顆粒は葉緑体を示す。
　図７と同様に、図８に、GBSS欠損変異系統の2系統（M系統＝CS487721、N系統＝SALK_208999）由来の種子未熟胚中のLDを示す。
　M系統及びN系統で野生型（WT）に比べ、LDを示す顆粒が全体的に増加しており、特に根で増加していた。すなわち、GBSS欠損変異系統のM系統及びN系統、ともにLDの増強が認められた。特に根でLDが著しく増強されていた。
（４）リン脂質の分析
　シロイヌナズナの野生型、SBE欠損変異系統の2系統［I系統＝CS25147（sbe2.2-1）、K系統＝SALK_034880（sbe2.2-2）］及びGBSS欠損変異系統の2系統［M系統＝CS467721（gbss1-1）、N系統＝SALK_208999（gbss1-2）］について、種子中のリン脂質の種類及び量を分析した。
　リン脂質の分析方法は、Takumi Ogawa et al., Scientific Reports, 7, 5196（2017）; Adchara Padermshoke et al., PLOS ONE, 11(9), e0162827; Takeshi Furuhashi et al., Metabolomics, 11(1), 175-183; Takumi Ogawa et al. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 78(1), (2014)に記載の方法に従ってGC-MSを用いて行った。分析対象物質として、PC(34:1)、PC(34:2)、PC(34:6)、PC(36:2)、PC(36:3)、PC(36:4)、PC(36:5)、PC(36:6)及びPC(38:3)で示される、それぞれアシル基の炭素数及び不飽和度の異なるホスファジルコリンを選択した。
　図９にGC-MSによる分析結果を示す。図９に示すように、リン脂質であるホスファジルコリンの含量が、野生型と比較して、SBE欠損変異系統の2系統（I系統＝CS25147、K系統＝SALK_034880）及びGBSS欠損変異系統の2系統（M系統＝CS487721、N系統＝SALK_208999）のいずれも増大した。
（５）脂肪酸の分析
　シロイヌナズナの野生型、SBE欠損変異系統の2系統［I系統＝CS25147（sbe2.2-1）、K系統＝SALK_034880（sbe2.2-2）］及びGBSS欠損変異系統の2系統[M系統＝CS487721（gbss1-1）、N系統＝SALK_208999（gbss1-2）]について、種子中の脂肪酸の種類及び量を分析した。分析は上述の（４）リン脂質の分析中の文献に記載の方法に従ってGS-MSを用いて行った。分析対象物質としてC16:0 FAME、C18:0 FAME、C18:2 FAME、C20:0 FAME、C20:1 FAME、C22:0 FAME及びC22:1 FAMEで示される、それぞれ炭素数及び不飽和度の異なる脂肪酸メチルエステルを選択した。
　図１０に、GS-MS分析による脂肪酸含量の分析結果を示す。図１０の矢印が示すように、C20（炭素鎖20）の脂肪酸であるC20:0 FAMEの含量が、野生型と比較して、SBE欠損変異系統の2系統（I系統＝CS25147、K系統＝SALK_034880）及びGBSS欠損変異系統の2系統（M系統＝CS487721、N系統＝SALK_208999）のいずれも増大し、特にM系統で増大した。
　以上のように、シロイヌナズナでは、GBSS1 （At1g32900）の欠損変異の導入及びSBE2.2（At5g03650）の欠損変異の導入がLD増強をもたらした。
実施例２　トマトの根を用いた実験
実施例２－１　Agrobacterium rhizogenes ATCC15834株を用いた形質転換
　図１１にAgrobacterium rhizogenes ATCC15834株を用いた形質転換（毛状根誘導）方法の概略を示す。図１１に示すように、無菌発芽させたトマト幼苗の胚軸を切除し、目的形質転換ベクター（pMgP237-2A-gfp）を有するアグロバクテリウムのコロニーに触れさせることで感染処理をした。また、無菌発芽させたトマト幼苗の子葉から切片を取り、アグロバクテリウム菌液に１５分間浮遊させることで感染処理をした。感染処理した胚軸及び子葉切片は、Cefotaxime 250μg/mLを含むMS寒天培地からなる形質転換用培地で培養した。
　具体的には以下の方法で行った。
　特に記載のない限り、本実施例で用いた試薬は、和光純薬工業株式会社又はナカライテスク株式会社の製品を使用した。
１．供試植物
　トマト（Solanum lycopersicum Micro Tom）を用いた。
２．培地
　用いたLB培地、YEB培地、B5培地及びMS培地の組成を、それぞれ、表１、表２、表３及び表４に示す。
　培地には必要に応じてカナマイシンを50μg/ml又は250μg/mLセフォタキシムを添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４のMS培地を基にして共培養培地、カルス誘導培地、シュート伸長培地及び発根誘導培地をそれぞれ調製した。共培養培地、カルス誘導培地、シュート伸長培地及び発根誘導培地の組成を、それぞれ、表５、表６、表７及び表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
３．トマト遺伝子の同定と破壊
　実施例１記載のシロイヌナズナT-DNA挿入欠損変異系統においてLDが誘導される系統であるSBE遺伝子の欠損変異系統及びGBSS遺伝子の欠損変異系統を見出した。
　GBSS遺伝子のトマトにおけるホモログとしてGBSS1（遺伝子ID：Solyc08g083320.2）を同定した。また、SBE遺伝子のトマトにおけるホモログとしてSBE2.2（遺伝子ID：Solyc09g009190.2）を同定した。
　図１２に示すように、GBSS及びSBEの両遺伝子を標的として、CRISPR/Cas9によるゲノム編集を行った。
３－１．トマトSBE遺伝子
　実施例１記載のシロイヌナズナの実験により、デンプン蓄積に関わる遺伝子破壊によってLDが増強されることを確認した。そこで、トマトでも同様の試験を行うため、シロイヌナズナのSBE遺伝子と最も高い配列相同性を持つ、トマトSBE2.2遺伝子（Soly09g009190.2）を同定した。トマトSBE2.2遺伝子の同定には、National Center for Biotechnologuy Information（NCBI）が提供するBLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）のうち、アミノ酸配列から塩基配列を検索する機能を有するtblastnを用いた。tblastnにて、シロイヌナズナSBE2.2（At5g03650）のアミノ酸配列を検索クエリとし、初期設定のパラメータを用いて検索を実行した。検索の結果同定されたトマトSBE2.2遺伝子は全長18230塩基対からなる。図１７に、eFP browser（http://bar.utoronto.ca/efp_tomato/cgi-bin/efpWeb.cgi）を用いたSBE2.2(XP_004246561.1)Solyc09g009190.2の各組織での発現を示す。この遺伝子は、葉で最も高い発現を示すことが明らかとなった。
３－２．トマトGBSS1遺伝子
　実施例３－１と同様に、シロイヌナズナのGBSS1遺伝子と最も高い配列相同性を持つ、トマトGBSS1遺伝子（Soly08g083320.2）を同定した。トマトGBSS1遺伝子の同定は、３－１のトマトSBE2.2遺伝子の同定と同様に行った。シロイヌナズナのGBSS1遺伝子のアミノ酸配列を検索クエリとし、初期設定のパラメータで検索を実行した。検索の結果同定されたトマトGBSS1は全長3373塩基対からなる。図２０に、eFP browserを用いたGBSS1(NP_001311458.1)Solyc08g083320.2の各組織での発現を示す。この遺伝子は、葉で最も高い発現を示すことが明らかとなった。
３－３．トマトGBSS1遺伝子又は/及びSBE2.2遺伝子の欠損変異系統
　トマトGBSS1遺伝子のエクソン2の異なる箇所を欠損させた２つの欠損変異系統(gbss1-1及びgbss1-2)をそれぞれ作製した。また、トマトSBE2.2遺伝子のエクソン2の一部を欠損させた欠損変異系統（sbe2.2-1）、エクソン8の一部を欠損させた欠損変異系統（sbe2.2-2）及びエクソン9の一部を欠損させた欠損変異系（sbe2.2-3）をそれぞれ作製した。更に、gbss1-1及びsbe2.2-2の両方の欠損変異を導入した二重変異系統(double2)、gbss1-1及びsbe2.2-3の両方の欠損変異を導入した二重変異系統(double3)、gbss1-2及びsbe2.2-1の両方の欠損変異を導入した二重変異系統(double4)、並びにgbss1-2及びsbe2.2-2の２か所に変異を導入した二重変異系統(double5)をそれぞれ作製した。
　図１８にゲノム編集によるSBE2.2（XP_004246561.1）Solyc09g009190.2遺伝子の破壊の方法の概略、図２１にゲノム編集によるGBSS1（NP_001311458.1）Solyc08g083320.2遺伝子の破壊の方法の概略、図２３にゲノム編集によるGBSS1(NP_001311458.1)Solyc08g083320.2遺伝子及びSBE2.2(XP_004246561.1)Solyc09g009190.2遺伝子の破壊の方法の概略、図２５にゲノム編集によるGBSS1(NP_001311458.1)Solyc08g083320.2遺伝子及びSBE2.2(XP_004246561.1)Solyc09g009190.2遺伝子の破壊の方法の概略をそれぞれ示す。
４．ゲノム編集による遺伝子破壊：Multiplex-gRNA vector tRNA-gRNAシステムの構築
　ゲノム編集は公知の方法（Plant Physiol Biochem., 2018 Oct; 131: 70-77）に基づき実施した。
　使用したベクターはpMgP237-2A-gfpであり複数箇所のゲノム編集が可能である。pMgP237-2A-gfpベクターの編集の概要を図１３に示す。図１３において、GBSS1遺伝子又はSBE2.2遺伝子のいずれかに変異を導入するベクター作製の概要をSingle knockoutとして示し、GBSS1遺伝子及びSBE2.2遺伝子の両方に変異を導入するベクター作製の概要をDouble knockoutとして示した。pMgP237-2A-gfpベクターにはBsaI認識サイトが含まれる。制限酵素であるBsaIを用いてpMgP237-2A-gfpベクターをBsaI認識サイトにて切断し、そこへPCRで増幅したインサート（T1-gRNA-tRNA-T2）をライゲーションした。T1～4はそれぞれ１８～２０ｂｐ程度のターゲット配列である。
４－１．guide RNAの設計
　まず、標的遺伝子配列はSol genomics networkを用いてそれぞれの遺伝子のcDNA配列及びgenome配列を入手した。GBSS1遺伝子（Solyc08g083320.2）のゲノム及びcDNAの塩基配列を、それぞれ、配列番号５及び６に表す。SBE2.2 遺伝子（Solyc09g009190.2）のゲノム及びcDNAの塩基配列を、それぞれ、配列番号７及び８に表す。
　得られた遺伝子のエキソン情報をもとに、Sg RNA designer（https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design）によりPAM配列を含むターゲット配列候補を特定した。 CRISPR/Cas9はguide RNAが標的とする配列と似た配列を認識し切断してしまうオフターゲット作用のリスクが高い。オフターゲットを防ぐため、Cas-OT（Bioinformatics, 15 April 2014, 30(8), 1180-1182）によってオフターゲット作用が低いと予想される配列を検索した。オフターゲット作用が低いと予測された配列から、それぞれの遺伝子上で約50塩基対離れた場所にある配列を2つ選抜してゲノム編集部位とし、guide RNAの設計を行った。
４－２．ゲノム編集のターゲット配列を含むgRNA+tRNA配列断片の増幅
４－２－１．使用したプライマー
　図１４－１及び図１４－２にインサートを増幅させるために使用したプライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマー）の配列を示す。
　また、図１５にプライマーによるインサートの増幅の概要を示す。Fw（フォワード）プライマーは、BsaI認識配サイトの配列、ターゲット配列、gRNA配列を連結した配列を有する。また、Rv（リバース）プライマーは、BsaI認識配サイトの配列、ターゲット配列、tRNA配列を有する。
４－２－２．インサートの増幅
　断片の増幅にはKOD-Plus Neoを用いた。0.5mlのエッペンドルフチューブを用いて表９に示した組成で反応液を調製し、表１０の反応条件でPCR反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
４－２－３．アガロース電気泳動
　アガロースゲル電気泳動は、マーカーとして100-bp DNA Ladder H3 RTU （Gene DireX）を用い、ゲル濃度は1.5％のものを用いた。ゲルには、0.3μg/mlとなるようにエチジウムブロマイドを加えた。上記４－２－２で得られたPCR反応後の溶液に、当該溶液の1/9量の10×Loading Buffer（タカラバイオ株式会社）を加え、ウェルにアプライし、100Vで20分間泳動した。泳動の結果、上記４－２－２で増幅させたインサートの配列に相当するパターンを確認した。
４－２－４．ゲル抽出
　フォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて増幅させたインサートを上記４－２－３で得られたアガロースゲルから抽出した。ゲル抽出は Mag Extractor（登録商標）（TOYOBO）を用いた。
４－３．ベクタークローニング
４－３－１．ライゲーション
　pMgP237-2A-gfpベクターに、上記４－２－４でアガロースゲルから抽出したインサートをライゲーションした。0.5 mlのエッペンドルフチューブで表１１に示した組成で反応液を調製し、表１２の反応条件でライゲーション反応を行った。表１１において、PCR productとは、上記４－２－４のアガロースゲルからの抽出で得られた溶液である。また、PCR product2及び3は、GBSS1遺伝子及びSBE2.2遺伝子の両方に変異を導入するdouble1～6の実験系でのみ反応液の組成に加えた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
４－３－２．ベクターの切れ残りの消化
　ライゲーション反応後の溶液を更にBsaIで処理することで、BsaIサイトで切断されずに残っているベクターをBsaIで切断した。ライゲーションを行った0.5mlのエッペンドルフチューブにBsaIを0.5μl加え、表１３の反応条件でベクターの切れ残りを完全に消化した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
４－３－３．大腸菌への形質転換
　ベクターの大腸菌への形質転換には、コンピテントセルDH5αを用いた。操作は以下の手順にてクリーンベンチ内で行った。
大腸菌への形質転換手順；
（1）コンピテントセル50μlに、上記４－３－２で得られたベクターを含む溶液を5μl加え、軽く撹拌後、氷上で30分静置した。
（2）42℃で45秒間ヒートショックし、直ちに2分氷上で静置した。
（3）抗生物質を含まないLB培地を450μl加え、37℃で１時間インキュベートした。
（4）LB寒天培地（カナマイシン含む）に塗布し、37℃で16時間培養した。
４－３－４．ベクターの抽出
　上記４－３－３で培養した大腸菌を含む溶液からベクターを抽出した。ベクターの抽出は以下の手順で示すアルカリプレップ法を用いた。使用した試薬は表１４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
ベクターの抽出手順；
（1）2.0 mlチューブに大腸菌培養液を加え、4℃、3,000 rpm、5分で遠心し集菌した。
（2）上清を捨て、100μlのSol Iを加えてボルテックスでよく撹拌した。
（3）200μlのSol IIを加え数回、転倒混和した。
（4）5分室温で静置し、150μlのSol IIIを加え数回、転倒混和した。
（5）4℃、15,000 rpm、10分遠心し上清を新しい1.5 mlのエッペンドルフチューブに移し、100％エタノールを1 ml加え、4℃、15,000 rpm、20分遠心した。
（6）上清を取り除き、70%エタノールを1 ml加え、4℃、15,000 rpm、5分遠心した。
（7）エタノールを乾燥させた後、TEバッファー50μl、RNase 0.25μlを加え、37℃で1時間インキュベート後、-20℃で保存した（以下、プラスミド溶液という）。
４－３－５．制限酵素処理
　上記４－３－５で大腸菌から抽出したベクターを制限酵素処理した。制限酵素処理は、1.5 mlのエッペンドルフチューブを用いて行った。制限酵素はXbaIとHindIIIを使用した。制限酵素0.2μl、適したバッファー及びプラスミド溶液3μlを加え、Distilled Water （DW）を全量が10μlとなるように加えた。37℃で一晩インキュベートしたのちアガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動のパターンより、pMgP237-2A-gfpベクターにインサートが挿入された目的のベクターの存在を確認した。
４－３－６．DNA配列解析（シーケンシング）
　プラスミド溶液に含まれるベクターのDNA配列を以下の手順にてシーケンス解析した。シーケンス解析に用いたプライマーの塩基配列（配列番号５５～５７）、PCR反応液の組成、PCR反応条件を表１５、表１６及び表１７に示した。シーケンス解析の結果、pMgP237-2A-gfpベクターの配列にインサートの配列が挿入されていること、及び、配列に変異が生じていないことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　DNA配列解析手順；
（1）1.5 mlチューブにDW 10μl、125 mM EDTA 2μl、3 M酢酸ナトリウム2μl、100％エタノール50μl、ＰＣＲ反応済みサンプル10μlを加え、タッピングにより混和した。
（2）15分間暗所で室温放置した。
（3）4℃、15,000 rpmで30分間遠心した。
（4）上清をピペッティングで除き、70％エタノールを70μl加え、4℃、15,000 rpmで5分間遠心した。
（5）上清をなるべく除去し、減圧器で乾燥させた。
（6）Hi-Diホルムアミド15μl加え、タッピングによりサンプルを溶解し、シーケンス用の96プレートに移し、フタをし、サンプルトレイにセットしてシーケンス解析を行った。
５．アグロバクテリウム形質転換
５－１．コンピテントセル作成
　アグロバクテリウムとしてAgrobacterium rhizogenes 15834株を用い、以下の手順でコンピテントセルを作成した。
　コンピテントセル作成手順；
（1）5mLのYEB液体培地を加えた試験管でアグロバクテリウムを28℃一晩浸透培養した。
（2）一晩浸透培養した菌液を200mlのYEB液体培地の入った1Lフラスコに加え28℃で浸透培養した。
（3）菌液のOD=600の数値が0.4～0.6になった段階で50mlのファルコンチューブに分注し、4℃、5000rpmで10分遠心、集菌した。
（4）上清を取り除き、氷冷しておいた1mM HEPES 20mlで洗浄した。
（5）もう一度遠心し、洗浄を行った。
（6）10％グリセロールを20 ml加えピペッティングを行った。
（7）4℃、5000 rpm、10分で遠心し上清を取り除き、2mlの10％グリセロールを加え1.5 mlチューブに分注し-80℃で保存した。
５－２．エレクトロポレーション
　上記４－３－４で得られた大腸菌で増幅したベクター（プラスミド溶液）をアグロバクテリウムに導入した。アグロバクテリウムの形質転換には、上記５－１で得られたAgrobacterium rhizogenes 15834株のコンピテントセルを使用した。操作は以下の手順にてガスバーナー下で行った。装置はGene Pilser Xcellエレクトロポレーションシステム（Bio-Lad）を使用した。電圧条件は表１８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　エレクトロポレーション手順；
（1）コンピテントセルを氷上で溶かした。
（2）5μlのプラスミド溶液（＞5ng/μl）を加え、優しく混和した。
（3）氷上で5分以上静置した。
（4）1.5mlチューブに抗生物質を含まないLB培地を1ml、各サンプルずつ用意した。
（5）-20℃で冷却していたキュベットに（4）で調整した溶液（コンピテントセル+プラスミド溶液）を全量加え、装置にセットし、電圧をかけた。
（6）直ぐに用意していたLB培地を全量キュベットに加え、ゆっくりピペッティングした。
（7）28℃で1時間インキュベートした。
（8）YEB寒天培地（カナマイシン含む）に塗布し、28℃で48時間培養した。
５－３．コロニーの選抜
５－３－１．コロニーPCR
　PCR反応にはTakara Ex Taq（登録商標）（タカラバイオ株式会社）を用いた。0.5mlのエッペンドルフチューブで表１９に示した組成で反応液を調製し、表２０の反応条件でPCR反応を行った。また、PCRに用いたプライマーの塩基配列（配列番号５８及び５９）を表２１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
５－３－２．プラスミド抽出
　以下の手順により、アグロバクテリウムよりプラスミドを抽出し、アガロース電気泳動により、アグロバクテリウムに目的のベクターが導入されていることを確認した。
　プラスミド抽出及びアガロース電気泳動手順；
（1）上記５－２の培養後に形成されたコロニーからアグロバクテリウム菌液を採取した。2.0mlチューブにアグロバクテリウム菌液を加え4℃、10000rpmで3分間遠心し上清を取り除いた。
（2）リゾチーム（4mg/mL）を含むTEG（25mM Tris-HCl pH 8.0、10mM EDTA、50mM glucose）で十分に懸濁し室温で20分間静置した。
（3）0.2mlのアルカリ液（1％ SDS、0.2N NaOH）を加えて転倒混和し、10分間室温で静置した。
（4）二倍量のアルカリ液で飽和させた30μlのフェノール溶液を加え、転倒混和で十分に混合した。
（5）150μlの3M酢酸ナトリウム（pH 4.8）を加えて転倒混和し、15分間、-20℃で静置した。
（6）15000 rpm、15分間、4℃で遠心し上清を新しいチューブへ移した。
（7）等量のイソプロパノールを加え転倒混和し10分間静置し、15000rpm、10分間、4℃で遠心し上清を除去した。
（8）100μlのTris/EDTA（TE）バッファーに溶解して6 M LiClを50μl加え-20℃で1時間静置した。
（9）15000 rpm、10分間、4℃で遠心し上清を除去し、100％エタノールを1 ml加え、4℃、15,000 rpm、20分遠心した。
（10）上清を取り除き、70%エタノールを1 ml加え、4℃、15,000 rpm、5分遠心した。エタノールを乾燥させた後、TEバッファー 50μlを加えた。
（11）制限酵素（Xba、HindIII）で処理し、アガロース電気泳動を行った。泳動の結果、pMgP237-2A-gfpベクターの配列にインサートの配列を足した配列の長さに相当するバンドを確認し、アグロバクテリウムに目的のベクターが導入されていることを確認した。
６．植物形質転換（Agrobacterium rhizogenes 15834株由来毛状根の作製）
６－１.トマトへの感染
　以下の手順により、上記５－２で得られたベクターが導入されたアグロバクテリウムをトマトに感染させた。
　トマトへの感染手順；
（1）発芽後7日～10日後のトマトの胚軸及び葉を1cm角に切断した。
（2）葉は菌懸濁液に浸し15分後、キムタオルで余分な水分を取り除きB5寒天培地へ移植した。
（3）胚軸は根側の切断部位を、上記５－２の培養によって形成されたアグロバクテリウムのコロニーに触れさせ、コロニーと触れさせた反対側をB5培地に挿し培養した。
（4）20日間、暗所、25℃で培養後、胚軸と葉をMS（セフォタキシム含む）培地へと移植した。
（5）7日後、形成された毛状根を一本ずつMS（セフォタキシム含む）培地へ継代した。
（6）1週間ごとにMS（セフォタキシム含む）培地での継代を3～4度繰り返したものをMS（セフォタキシム、カナマイシン含む）へ継代した。
６－２．形質転換体（毛状根）の選抜及び分析
　形質転換によって得られた植物組織及び毛状根は（カナマイシン25μg/mLを含む1/2MS寒天培地）で増殖させ、毛状根を選抜した。
　図１６に前記培地で継代後１週間の毛状根の状態の一例を示す。左が野生型（WT）の毛状根であり、右がゲノム編集によってGBSS1のエクソン2-2を部分的に欠失させた毛状根を示す。
６－２－１．ゲノミックDNA抽出
　以下の手順で、アグロバクテリウムを感染させたトマト毛状根からゲノミックDNAを抽出した。ゲノミックDNA抽出に使用した抽出バッファーの組成を表２２及び表２３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　ゲノミックDNAの抽出手順；
（1）抽出バッファー300μlをミキサーミル（MM400、RETSCH、Tokyo Japan）を用いて凍結粉砕した植物サンプルに加えた。
（2）ボルテックスで撹拌し、氷上で5分間静置した。
（3）フェノール・クロロホルム溶液を300μl加えて撹拌し、4℃、10分間、15000rpmで遠心した。
（4）上層を別のエッペンドルフチューブに取り、クロロホルムを上層と等量加え，4℃、10分間、15000rpmで遠心した。
（5）上層を別のエッペンドルフチューブに取り、99.9％エタノールを1000μl加え、4℃、20分間、15000rpmで遠心した。
（6）上層をデカンテーションで捨て、キムワイプ上で乾燥させた。
（7）70％エタノールを1000μl加え、4℃、5分間、15000rpmで遠心した。
（8）70％エタノールを除去し、ペレットを減圧乾燥した。
10μl TEバッファー + 0.05μl RNaseを加え、37℃で30分から1時間反応させた。
６－２－２．PCR増幅
　上記６－２－１でゲノミック抽出により取得されたDNAをPCRにより増幅させた。PCRに用いたプライマーの塩基配列（配列番号６０～６８）を表２４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
６－２－３．DNA配列解析（シーケンシング）
　上記６－２－２でPCR反応にて増幅したDNAを以下手順にてシーケンス解析に供した。シーケンス解析に使用した反応液の組成及びPCR反応条件を表２５、表２６に示した。なお、表２５に示すPCR産物は６－２－２のPCR反応後の溶液を示す。
　DNA配列解析の結果、目的のゲノム編集が施され、トマトSBE2.2遺伝子Solyc09g009190及び/又はトマトGBSS1遺伝子Solyc08g083320の発現が抑制され又は欠失した植物体をそれぞれ同定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　DNA配列解析手順；
（1）６－２－２で得られたPCR反応液全量を1.5mLチューブに移した。 
（2）蒸留水10μL、125mM EDTA 2μL、3 M酢酸ナトリウム2μL、エタノール50μLを加えた。
（3）タッピングにより混和した。 
（4）アルミホイルで遮光し、室温で15分間置いた。 
（5）4℃、15000rpm、30分間遠心分離した。 
（6）上清をピペッティングで取り除いた。 
（7）70％エタノールを70μL加えた。 
（8）4℃、15000rpm、5分間遠心分離した。 
（9）上清をピペッティングで取り除いた。 
（10）チューブの蓋を開けて乾燥させた。 
（11）Hi-Di Formamideを15μL加えた。
（12）タッピングによりサンプルを溶解しスピンダウンした。 
（13）サンプルを96-wellプレートに移し、サンプルトレイにセットし、applied biosystems 3130 and 3130xl genetic analyzers操作ガイドの手順に従ってシーケンス解析を行った。
実施例２－２　形質転換体の観察
１．共焦点レーザー顕微鏡による観察
　共焦点レーザー顕微鏡を用いた毛状根の観察では、中性脂質の染色試薬であるNile Redを使用し、以下の手順にて行った。
　毛状根の観察手順；
（1）毛状根を長さ5mm程の長さで切断した。
（2）4％paraformaldehyde（PFA）/MTSBで氷上、減圧下で20分間固定した後、室温で40分間固定した。
（3）MTSBで5分間、2回洗浄を行った。
（4）10μg/ml Nile Redで10分間染色した。
（5）共焦点レーザー顕微鏡（LSM700）を用いて観察を行なった。撮影には20倍レンズ、40倍油浸レンズを用いた。
　MTSBの調製方法；
　1.5g PIPES、0.19g EGTA、0.13g MgSO4・7H2O及び0.5g KOHを約800 mlの蒸留水に溶解した後、KOHでpHを7.0に調整し、蒸留水で1000 mlにした。
２．観察結果
２－１．トマトSBE遺伝子欠損変異系統
　図１９に、ゲノム編集を行ったトマトSBE遺伝子欠損変異系統における脂質の蓄積を測定した実験の結果を示す。
　図１９中、Vector controlは、ゲノム編集用ベクターによる形質転換だけで、ゲノム編集が起きていない対照群を示す。sbe2.2-2はトマトSBE2.2遺伝子エクソン8の欠損変異系統を示し、sbe2.2-3はトマトSBE2.2遺伝子エクソン9の欠損変異系統を示す。Nile Red染色と共焦点レーザー顕微鏡によって、LD増強を検証した。図１９に示すsbe2.2-2 #10系統はエクソン8の欠損変異系統であり、sbe2.2-3 #6系統はエクソン9の欠損変異系統である。図１９に示すように、両系統共にLD増強が認められ、特にsbe2.2-3 #6系統で著しいLD増強が認められた。
２－２．トマトGBSS1遺伝子欠損変異系統
　図２２に、ゲノム編集を行ったトマトGBSS1遺伝子欠損変異系統における脂質の蓄積を測定した実験の結果を示す。
　図２２中、Vector controlは、ゲノム編集用ベクターによる形質転換だけで、ゲノム編集が起きていない対照群を示す。図２２に示すgbss1-1 #10系統及びgbss1-2 #19系統は，ともにトマトGBSS1遺伝子エクソン2の欠損変異系統を示す。Nile Red染色と共焦点レーザー顕微鏡によって、LD増強を検証した。図２２に示すように、両系統で著しいLD増強が認められた。
２－３．トマトSBE2.2遺伝子及びGBSS1遺伝子の二重変異系統
　図２４及び図２６に、ゲノム編集を行ったトマトSBE2.2遺伝子及びGBSS1遺伝子の二重変異系統における脂質の蓄積を測定した実験の結果を示す。図２４及び図２６中、Vector controlは、ゲノム編集用ベクターによる形質転換だけで、ゲノム編集が起きていない対照実験群を示す。
　図２４中、double2の#1系統はgbss1-1及びsbe2.2-2の両方の欠損変異を導入した系統を示す。double3の#2系統は、gbss1-1及びsbe2.2-3の両方の欠損変異を導入した系統を示す。図２４で示すように、両系統でLDの増強が認められた。
　図２６中、double4の#8系統は、gbss1-2及びsbe2.2-1の両方の欠損変異を導入した系統の結果を示す。double5の#17系統は gbss1-2及びsbe2.2-2の両方の欠損変異を導入した系統の結果を示す。図２６で示すように、両系統でLDの増強が認められた。
３．脂質蓄積量の定量
　各系統（gbss1-1 #10系統、gbss1-2 #19系統、sbe2.2-2 #10系統、sbe2.2-3 #6系統、double2 #1系統、double3#2系統、double4#8系統、double5#17系統）の脂質蓄積量（単位面積あたりの蛍光面積値を、ソフトウェアImageJを用いて算出した結果）を図２７に示す。全ての欠損変異系統において、野生型（WT）及びVector control（VC）に比べて単位面積あたりの蛍光面積値が増加した。
実施例３　トマトの葉を用いた実験
　トマトの葉を用いて、実施例２と同様に、GBSS1遺伝子及び／又はSBE2.2遺伝子を標的とした、CRISPR/Cas9によるゲノム編集を行った。実施例２－１の１～５に記載の方法と同様の方法で、トマトの葉への感染を行う為の、目的のベクターが導入されたアグロバクテリウムを作製した。ただし、アグロバクテリウムについては、実施例２で用いたAgrobacterium rhizogenes ATCC15834株の代わりにAgrobacteriumu tumefaciens GV3103株を用いた。
実施例３－１　植物形質転換（Agrobacteriumu tumefaciens GV3103株由来植物個体の作製）
１．トマトへの感染
　以下の手順により、上記実施例２－１の５－２で得られたベクターが導入されたアグロバクテリウムをトマトに感染させた。
　トマトへの感染手順；
（1）発芽後7日～10日後のトマトの葉を1cm角に切断した。
（2）菌懸濁液に浸し10分後、キムタオルで余分な水分を取り除き共培養培地へ移植し25℃、暗所で培養した。
（3）3日後、葉片をカルス誘導培地へと継代し、25℃、16時間明所/8時間暗所で培養した。
（4）シュートの形成が見られたら、シュート伸長培地へと継代し、25℃、16時間明所/8時間暗所で培養した。
（5）伸長したシュートをカルスから切断後、発根培地へと継代し、25℃、16時間明所/8時間暗所で培養した。
（6）発根確認後、鉢上げを行い、25℃、16時間明所/8時間暗所で培養した。
（7）作製した植物個体をT0世代としT0世代から採れた種子をT1世代とした。
２.形質転換体（植物個体）の選抜及び分析
　植物個体の選抜は葉を用いて行った。
２－１.ゲノミックDNA抽出
　実施例２－１の６－２－１と同手順でアグロバクテリウムを感染させたトマト葉からゲノミックDNA抽出を行った。
２－２．PCR増幅
　実施例２－１の６－２－２と同手順で、上記２－１でゲノミック抽出により取得されたDNAをPCRにより増幅させた。
２－３．DNA配列解析（シーケンシング）
　実施例２－１の６－２－３と同手順で、上記２－２でPCR反応にて増幅したDNAをシーケンス解析に供した。
　DNA配列解析の結果、目的のゲノム編集が施され、トマトSBE2.2遺伝子Solyc09g009190及び/又はトマトGBSS1遺伝子Solyc08g08332の発現が抑制され又は欠失した植物体をそれぞれ同定した。
実施例３－２　形質転換体の観察
１．ヨウ素デンプン反応による観察
　ヨウ素デンプン反応は、植物において観察する葉の条件をそろえるため、枝分かれ後先端部の葉を第一葉とし、先端部から三番目の第三葉を使用し、以下の手順で行った。
　また、ヨウ素デンプン反応に用いた反応液の組成は表２７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　ヨウ化カリウムを蒸留水に溶かしてからヨウ素を加え、反応液とした。
　ヨウ素デンプン反応手順；
（1）第三葉を80℃のエタノールへ加え、室温で30分間置いた。
（2）エタノールを取り除き、蒸留水を加え、室温で5分間置いた。
（3）蒸留水を取り除き、ヨウ素ヨウ化カリウム水溶液を加え、室温で5分間置いた。
（4）ヨウ素ヨウ化カリウム水溶液を取り除き、蒸留水で洗浄したのちに観察を行った。
　ヨウ素デンプン反応後の葉を図３９に示す。図３９において、WTは野生型、gbss1-2#2はGBSS1遺伝子の欠損変異系統、sbe2.2#3はSBE2.2遺伝子の欠損変異系統、gbss1-2sbe2.2は GBSS1遺伝子及びSBE2.2遺伝子の二重変異系統の葉をそれぞれ示す。図３９中、スケールバーは1cmを示す。sbe2.2#3の葉では青紫色（図３９では濃いグレーとして見える、以下同様。）を呈しており、茶褐色の染色（図３９では薄いグレーとして見える、以下同様。）がほとんど見られないことから、本実施例で同定したトマトSBE2.2遺伝子（Soly09g009190.2）の発現の抑制又は欠失によりアミロペクチンの蓄積量が低下又は欠失していることを確認した。また、gbss1-2#2の葉では茶褐色を呈し、青紫色がほとんど見られないことから、本実施例で同定したトマトGBSS1遺伝子（Soly08g083320.2）の発現の抑制又は欠失によりアミロースの蓄積量が低下又は欠失していることを確認した。さらに、gbss1-2sbe2.2の葉では染色がほとんど認められないことから、トマトSBE2.2遺伝子（Soly09g009190.2）及びトマトGBSS1遺伝子（Soly08g083320.2）の発現の抑制又は欠失により、アミロペクチン及びアミロースの蓄積量がともに低下又は欠失していることを確認した。
２.共焦点レーザー顕微鏡による観察
　図２８に葉のLDの観察方法の概要を示す。共焦点レーザー顕微鏡を用いた植物個体の観察は葉を用い、観察する葉の条件をそろえるため、枝分かれ後先端部の葉を第一葉とし、先端部から三番目の第三葉を使用した。またLD観察には中性脂質の標識蛍光色素としてBODIPY （boron-dipyrromethene）493/503（Thermo Fisher Scientific）を使用した。実験方法は（James et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences (2010) 107:17833-17838）を参考に条件検討を行い、以下の手順で行った。
　葉の観察手順；
（1）第三葉を用いて直径5mmのリーフディスクを作成した。
（2）サンプルを4％paraformaldehyde（PFA）/MTSBで氷上、減圧下で30分間固定した後、室温で40分間固定した。
（3）MTSBで5分間、2回洗浄を行った。
（4）100μg/ml BODIPY 493/503/MTSBで10分間染色した。
（5）共焦点レーザー顕微鏡（LSM700）を用いて観察を行なった。撮影には20倍レンズ、40倍油浸レンズを用いた。葉のLD数を算出した。
３．観察結果
　図２９に得られた形質転換トマトの系統名と欠損遺伝子を示す。gbss1-2#2(1)(図では、(1)は丸数字、以下同様）系統はGBSS1遺伝子の欠損変異系統である。gbss1-2sbe2.2#2(2)、gbss1-2sbe2.2#3(3)、及び、gbss1-2sbe2.2#3(2)は SBE2.2遺伝子の欠損変異系統である。gbss1-2sbe2.2#4(3)は、GBSS1遺伝子及びSBE2.2遺伝子の二重変異系統である。
　葉のLD数を、図３０に示す。Ａは暗期終了時の数、Ｂは明期終了時の数を示す。
　図３０に示すように暗期終了時、明期終了時共に、野生型（WT）と比較してゲノム編集系統でLD数が増加した。また、暗期終了時、明期終了時共に、GBSS1遺伝子の欠損変異系統と比較してSBE2.2遺伝子の欠損変異系統において多数のLD数を確認した。
　図３１に、暗期終了時と明期終了時のLD数の比較を示す。
　図３１に示すように、野生型（WT）において明期終了時と比較して暗期終了時においてLD数が増加した。また、GBSS1遺伝子及びSBE2.2遺伝子の二重変異系統において暗期終了時と比較して明期終了時においてLD数が増加した。さらに、暗期終了時、明期終了時共に、GBSS1遺伝子及びSBE2.2遺伝子の二重変異系統において最も多数のLDを確認した。
実施例４　トマト（Micro-Tom 毛状根）への低分子化合物処理による脂質蓄積増強
１．トマトの毛状根の培養及びステロール合成阻害剤処理
　Micro-Tom 毛状根（Agrobacterium rhyzogenes 15834株感染によって誘導）の培養には250mg/Lセフォタキシム及び1.5% Sucroseを含む1/2 MS液体培地を用いた。100ml三角フラスコに当該培地を25 ml入れたものにMicro-Tom毛状根を加え、25℃、暗所にて80rpmで旋回培養した。継代は1週間ごとに行った。
　ステロール合成阻害のために使用した低分子化合物を表２８に示す。低分子化合物の溶媒にはdimethyl sulfoxide（DMSO）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　上記6つのステロール合成阻害剤と、コントロールとして薬剤の溶媒であるDMSOを毛状根に24時間処理した。具体的には、IWAKI MICROPLATE 6wellに終濃度50μMの低分子化合物、250mg/Lセフォタキシム及び1.5% Sucorseを含む1/2 MS液体培地を5mlずつ入れ、そこに増殖したMicro-Tom毛状根を分けて入れ、24時間処理した。なお、継代後1週間のMicro-Tom毛状根を使用した。
　中性脂質の標識蛍光色素BODIPY 493/503で染色後、共焦点レーザー顕微鏡を用いてLDの観察を行った。図３２に観察結果を示す。図３２の各パネルは、1：DMSO、2：テルビナフィン塩酸塩、3：トルナフテート、4：エコナゾール硝酸塩、5：テブコナゾール、6：ケトコナゾール、7：トリデモルフ、8：エコナゾール硝酸塩とトルナフテートの両方、でそれぞれ処理（終濃度50μM）した結果を示す。
　その結果、squaleneからsqualene 2, 3-epoxideへの反応を触媒するsqualene epoxidaseの働きを阻害するテルビナフィン及びトルナフテート、シトクロムP450を阻害するエコナゾールの3つのステロール合成阻害剤処理によってLDが顕著に増殖することが確認された。更に、エコナゾールとトルナフテートとを同時に処理した際も、LD存在量は顕著に増加することが示された。
２．低分子化合物処理濃度及び処理時間の検討
　上記１にてLD誘導効果が見られたステロール合成阻害剤であるテルビナフィン、トルナフテート又はエコナゾールを処理することによる植物根のステロール含有量への影響を調べた。また、LD存在量及びステロール含有量を最も増加させるステロール合成阻害剤の処理濃度及び処理時間を検討するため、薬剤の処理濃度を終濃度で10μM又は100μM、処理時間を24時間又は48時間にそれぞれ処理条件を変えた。具体的には、IWAKI MICROPLATE 6wellに終濃度10μM又は100μMの低分子化合物、250mg/Lセフォタキシム、及び1.5% Sucorseを含む1/2 MS液体培地を5mlずつ入れ、そこに上記１と同様に増殖したMicro-Tom毛状根を分けて入れ、24時間又は48時間処理した。それぞれの条件で処理した植物根について、共焦点レーザー顕微鏡によるLDの観察と、総ステロールの分析を行った。
　共焦点レーザー顕微鏡を用いた根の培養細胞のLD観察結果を図３３－１～図３３－４に示す。図３３－１～図３３－４は、それぞれ1：DMSO、2：トルナフテート、3：テルビナフィン塩酸塩、4：エコナゾール硝酸塩、5：エコナゾール硝酸塩とトルナフテートの両方の処理を示す。また、図３３－１及び図３３－３は終濃度100μM、図３３－２及び３３－４は終濃度10μM、図３３－１及び図３３－２は処理時間24時間、図３３－３及び図３３－４は処理時間48時間の結果をそれぞれ示す。いずれの阻害剤処理に関しても、DMSOと比較してLDが誘導される傾向が見られ、特に100μM処理時（図３３－１、図３３－３）にその傾向は強く見られた。また処理48時間後（図３３－３、図３３－４）と比較し、処理24時間後（図３３－１、図３３－２）においてLD誘導は顕著であった。
　更にこれらのステロール合成阻害剤処理をした根の総ステロールを分析した結果を図３４－１～３４－４に示す。図３４－１～図３４－４には、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール及びコレステロールのそれぞれの分析結果を示す。この結果から長時間かつ高濃度の阻害剤処理により総ステロールは減少し（図３４－３）、一方短時間かつ低濃度でテルビナフィンもしくはトルナフタートを処理すると、総ステロール含有量が増加することが明らかとなった（図３４－２）。特にトルナフテートにおいては終濃度10μM、処理時間24又は48時間において総ステロール含有量の増加が顕著であった。テルビナフィン塩酸塩においては終濃度10又は100μM、処理時間24時間の条件において総ステロール含有量の増加が顕著であった。
実施例５　GBSS1遺伝子又は/及びSBE2.2遺伝子欠損変異系統トマトの低分子化合物処理による脂質蓄積増強
　実施例３で得られたgbss1-2sbe2.2#2(2)、gbss1-2sbe2.2#3(3)、gbss1-2sbe2.2#3(2)及びgbss1-2sbe2.2#4(3)及び野生型トマトを実施例４に記載と同様の方法でステロール合成阻害剤処理を行った。ただし、ステロール合成阻害剤としてトルナフタート及びテルビナフィン塩酸塩の両方を各終濃度50μMにて同時に添加した。24時間処理し中性脂質の標識蛍光色素BODIPY 493/503で染色後、共焦点レーザー顕微鏡を用いてLDの観察を行った。
　図３５に、明期終了時の葉のLDについて、Bodipy493/503による中性脂質の染色結果を示す。図３６に、トルナフタート及びテルビナフィン塩酸塩の両方により処理した場合のLD数を示す。
　図３５及び３６に示すように、野生型をトルナフタートとテルビナフィン塩酸塩の両方で処理した場合に比べて、遺伝子変異系統をトルナフタート及びテルビナフィン塩酸塩の両方で処理した場合の方が、LD数が多く、GBSS1遺伝子又は/及びSBE2.2遺伝子変異及びステロール合成阻害剤処理による相乗的な脂質蓄積増強効果が見出された。
実施例６　野生型、GBSS1遺伝子又は/及びSBE2.2遺伝子欠損変異系統トマトを用いた培地組成の改変によるLD増殖実験
　図３７Ｂに示すように、MS培地から、FeSO4・7H2O、MgSO4・7H2O、及びその両方を除去した液体培地を調製した。また、MS培地のpHを4.6に調整した液体培地を調製した。
　図３７Ａに示した方法にて、実施例３で得られた野生型、GBSS1遺伝子又は/及びSBE2.2遺伝子の欠損変異系統である植物個体の第三葉を用いて直径5mmのリーフディスクを作成した。図３７に示すMS寒天培地又は調製した液体培地でリーフディスクを24時間処理し、実施例３と同様の方法にてLD増殖の有無を調べた。
　葉のLD数を、図３８に示す。Ａは野生型、Ｂはgbss1-2#2、Ｃはgbss1-2sbe2.2#3、Ｄはgbss1-2sbe2.2#４の結果を示す。また、controlは１×MS培地、pH4.6はpHを4.6に調整した培地、-FeはFeSO4・7H2Oを除去した培地、-MgはMgSO4・7H2Oを除去した培地、pH4.6 -Fe -MgはpHを4.6に調整し、かつ、FeSO4・7H2O及びMgSO4・7H2Oを除去した培地での結果を示す。
　図３８に示すように、controlに比べ、pH4.6、-Fe、-Mg及びpH4.6 -Fe -Mgの各培地での処理を行った植物において、LD数が増えた。特に-Mg及びpH4.6 -Fe -Mgの各培地での処理を行った植物でLD数の増加が顕著であった。この結果、pH 4～5に調製した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地にて植物体を処理することによりLD数が増加することが見出された。
　本発明の方法は、植物を用いた有用物質の生産量の向上に利用出来る。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (53)

  1. 　以下（A）及び／又は（B）の方法を用いて得られた植物体より有用物質を抽出することによる有用物質を製造する方法；
    （A）Granule Bound Starch Synthase（GBSS）遺伝子及び/又はStarch Branching Enzyme（SBE）遺伝子の発現が抑制され又は欠失した植物体を栽培する方法；
    （B）予めpH 4～5に調整した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地にて処理した植物体を栽培する方法。
  2. 　前記（A）の、GBSS遺伝子及び/又はSBE遺伝子の発現を抑制又は欠失する方法が、ゲノム編集法、相同組換え法、RNA干渉法、アンチセンス法、遺伝子挿入法、PTGS法及び人為的突然変異法からなる群より選択される方法である、請求項１記載の方法。
  3. 　前記（A）のGBSS遺伝子及び/又はSBEの発現を抑制又は欠失する方法が、ゲノム編集法である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　更に栽培する植物体を予めステロール合成阻害剤を含む培地で処理することを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　ステロール合成阻害剤が、トルナフタート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物である、請求項４に記載の方法。
  6. 　処理する際の培地におけるステロール合成阻害剤の最終濃度が1～1000μMである、請求項４又は５に記載の方法。
  7. 　有用物質が油脂又は脂溶性生理活性物質である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　脂溶性生理活性物質がビタミンD3、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール又はコレステロールである、請求項７に記載の方法。
  9. 　有用物質が、植物体の種子、葉、茎又は根に蓄積する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　植物体が、ナス科又はアブラナ科の植物である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　植物体が、シロイヌナズナ又はトマトである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　Granule Bound Starch Synthase（GBSS）遺伝子及び/又はStarch Branching Enzyme（SBE）遺伝子の発現が抑制され又は欠失した植物体。
  13. 　GBSS遺伝子及び/又はSBE遺伝子の発現を抑制又は欠失する方法が、ゲノム編集法、相同組換え法、RNA干渉法、アンチセンス法、遺伝子挿入法、PTGS法及び人為的突然変異法からなる群より選択される方法である、請求項１２記載の植物体。
  14. 　GBSS遺伝子及び/又はSBEの発現を抑制又は欠失する方法が、ゲノム編集法である、請求項１２又は１３に記載の植物体。
  15. 　種子、葉、茎又は根に有用物質を蓄積し得る、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の植物体。
  16. 　有用物質が油脂又は脂溶性生理活性物質である、請求項１５に記載の植物体。
  17. 　脂溶性生理活性物質がビタミンD3、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール又はコレステロールである、請求項１６に記載の植物体。
  18. 　植物体が、ナス科又はアブラナ科の植物である、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の植物体。
  19. 　植物体が、シロイヌナズナ又はトマトである、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の植物体。
  20. 　請求項１２～１９のいずれか１項に記載の植物体を栽培し、該植物体中に有用物質を蓄積する方法。
  21. 　栽培する植物体に、更に以下（B1）及び／又は（C1）のいずれか１の処理を予め行う、請求項２０に記載の該植物体内に有用物質を蓄積する方法；
    （B1）pH 4～5に調整した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地での処理；
    （C1）ステロール合成阻害剤を含む培地での処理。
  22. 　前記（C1）における、ステロール合成阻害剤が、トルナフタート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物である、請求項２１に記載の方法。
  23. 　前記（C1）における、処理する際の培地におけるステロール合成阻害剤の最終濃度が1～1000μMである、請求項２１又は２２に記載の方法。
  24. 　栽培する前に、pH 4～5に調整した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地での処理を予め行う植物体。
  25. 　種子、葉、茎又は根に有用物質を蓄積し得る、請求項２４に記載の植物体。
  26. 　有用物質が油脂又は脂溶性生理活性物質である、請求項２５に記載の植物体。
  27. 　脂溶性生理活性物質がビタミンD3、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール又はコレステロールである、請求項２６に記載の植物体。
  28. 　植物体が、ナス科又はアブラナ科の植物である、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の植物体。
  29. 　植物体が、シロイヌナズナ又はトマトである、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の植物体。
  30. 　予めステロール合成阻害剤であるトルナフタート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物を含む培地で処理した植物体を栽培して得られた植物体より有用物質を抽出することによる有用物質を製造する方法。
  31. 　処理する際の培地におけるステロール合成阻害剤の最終濃度が1～1000μMである、請求項３０に記載の方法。
  32. 　有用物質が油脂又は脂溶性生理活性物質である、請求項３０又は３１に記載の方法。
  33. 　脂溶性生理活性物質がビタミンD3、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール又はコレステロールである、請求項３２に記載の方法。
  34. 　有用物質が、植物体の種子、葉、茎又は根に蓄積する、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 　植物体が、ナス科又はアブラナ科の植物である、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 　植物体が、シロイヌナズナ又はトマトである、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 　栽培する前に、ステロール合成阻害剤であるトルナフタート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物を含む培地での処理を予め行った植物体。
  38. 　処理する際の培地におけるステロール合成阻害剤の最終濃度が1～1000μMである、請求項３７に記載の植物体。
  39. 　植物体の種子、葉、茎又は根に有用物質を蓄積し得る、請求項３７又は３８に記載の植物体。
  40. 　有用物質が油脂又は脂溶性生理活性物質である、請求項３９に記載の植物体。
  41. 　脂溶性生理活性物質がビタミンD3、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール又はコレステロールである、請求項４０に記載の植物体。
  42. 　植物体が、ナス科又はアブラナ科の植物である、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の植物体。
  43. 　植物体が、シロイヌナズナ又はトマトである、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の植物体。
  44. 　請求項２４～２９及び請求項３７～４３のいずれか１項に記載の植物体を栽培し、該植物体中に有用物質を蓄積する方法。
  45. 　有用物質を製造する為の、請求項１２～１９、２４～２９及び３７～４３のいずれか１項に記載の植物体の使用。
  46. 　植物体において以下（A2）、（B2）及び／又は（C2）の処理を行う、処理する前に比べて、該植物体の細胞内への脂質貯蔵オルガネラの誘導を増強する方法；
    （A2）Granule Bound Starch Synthase（GBSS）遺伝子及び/又はStarch Branching Enzyme（SBE）遺伝子の発現が抑制され又は欠失する処理；
    （B2）予めpH 4～5に調整した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地を用いた処理；
    （C2）トルナフタート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物を含む培地を用いた処理。
  47. 　植物体が、ナス科又はアブラナ科の植物である、請求項４６に記載の方法。
  48. 　植物体が、シロイヌナズナ又はトマトである、請求項４６に記載の方法。
  49. 　植物体において、以下（A3）、（B3）及び／又は（C3）の処理を行う、処理する前に比べて、該植物体中に蓄積する有用物質の量を増やす方法；
    （A3）Granule Bound Starch Synthase（GBSS）遺伝子及び/又はStarch Branching Enzyme（SBE）遺伝子の発現が抑制され又は欠失する処理；
    （B3）予めpH 4～5に調整した培地、鉄及び鉄イオンを含まない培地、又はマグネシウム及びマグネシウムイオンを含まない培地を用いた処理；
    （C3）トルナフタート、テルビナフィン、エコナゾール又はそれらの塩若しくは水和物を含む培地を用いた処理。
  50. 　有用物質が油脂又は脂溶性生理活性物質である、請求項４９に記載の方法。
  51. 　脂溶性生理活性物質がビタミンD3、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール又はコレステロールである、請求項５０に記載の方法。
  52. 　植物体が、ナス科又はアブラナ科の植物である、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 　植物体が、シロイヌナズナ又はトマトである、請求項４９～５１のいずれか１項に記載の方法。
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