KR890004025B1 - 원형질체의 배양방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

원형질체의 배양방법
본 발명은 원형질체(protoplast)의 배양방법의 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 원형질체를 액체 배지에서 배양 함으로써 원형질체로 부터 칼루스(callus) 또는 세포 송이(cell cluster)를 유도하는 방법에 관한 것이다.
원형질체는 식물, 박테리아, 진균 등으로부터 세포벽을 제거한 세포이다. 원형질체는 세포벽을 갖지 않기 때문에, 세포융합, 유전자조작 및 인공적 체세포 돌연변이와 같은 인공적 조작이 용이하다. 그러므로, 조작된 원형질체로 부터 완전한 식물이 재생될 수 있다면, 야생형 식물이 갖지 않는 특징적 이점을 갖는 식물체를 수득할 수 있다. 칼루스 또는 세포 송이로 부터 완전한 식물체가 재생될 수 있다는 보고가 많은 식물에 대해 공지되어 있다.
그러므로, 칼루스를 원형질체로 부터 유도할 수 있다면, 완전한 식물체가 마찬가지로 칼루스 및 원형질체로 부터 재생된다. 담배와 같은 쌍자엽 식물에 대해 원형질체로 부터 완전한 식물체를 재생할 수 있는 몇가지 기술이 공지되어 있다. 그러나, 벼. 밀 옥수수와 같은 포아풀과의 식물에 대해서는, 옥수수 및 목초에 대해서만 완전한 식물체가 재생될 수 있다는 것이 보고되었다. 벼에 대해서는 극소수의 기술만이 하기와 같이 보고되었다. 원형질체의 공지의 배양방법은 원형질체를 반고체 한천 배지에 파묻는 방법, 원형질체를 액체 배지에 현탁시키는 방법 및 급식 세포를 사용하여 원형질체를 배양한는 방법과 같은 원형질체의 배양 방법이다. 그러나, 이들 기술의 벼, 밀 및 옥수수를 포함안 포아폴 식물과 같은 다른 식물을 배양하는 데는 효과적이 아니다. 예를들어, 벼의 원형질체의 이들 공지 방법 중의 하나로 배양한다면 워형질체가 죽거나 성장할 수 없다.
벼의 원형질체의 배양방법으로는, 질산염 환원 효소가 부족한 세포로부터 수득된 원형질체로 부터 칼루스를 유도하는 방법(Wakasa et al., J. plant Physiol. 117 : pp223∼231(1984)) 및 꽃가루의 칼루스로 부터 수득된 원형질체로부터 유도된 칼루스로부터 어린가지를 재생시키는 방법(Ohno et al., Japanese Journal of Breeding 35 : pp 54∼55(1985))이 보고되었다. 그러나, 이들 기술은 특정 칼루스로부터 형성된 원형질체를 이용하며, 각종 칼루스 또는 조직으로 부터 형성된 모든 종류의 원형질체에 적용되는 것은 아니다. 즉, 이들 기술이 대부분의 종류의 원형질체를 재생할 수는 없다.
한편, 벼의 배양된 세포로부터 완전한 식물체를 재생하는 많은 연구가 보고 되었다 (Nishi et al., Nature 219 : pp 508∼509(1968)). 그러나, 이들 기술은 원형질체를 이용하지 않는다. 더욱이 이들 기술에 사용되는 높은 분화력을 갖는 세포로 부터 원형질체를 수득하는 것은 곤란하며, 원형질체의 배양 또한 곤란하다는 것이 발견 되었다.
그러므로, 원형질체로부터 칼루스 또는 세포 송이를 유도하고, 식물체의 일반적 또는 비-특정 세포로 부터 유래된 원형질체에 적용되어 재생할 수 있는 원형질체의 배양방법의 개발이 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 원형질체로 부터 세포 송이 또는 칼루스를 유도하고, 식물체의 일반적 또는 비-특정세포로 부터 유래된 원형질체를 재생 및 적용할 수 있는 원형질체의 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 방법에서, 원형질체를 100∼400㎛, 바람직하게는 200∼300㎛인 액체 배지 층에서 배양한다. 본 발명의 방법에 의해, 원형질체는 어느 정도 호기성 조건에서 뱅오딘다. 본 발명자들에 의해 호기서 조건이 원형질체의 성장을 촉진시킬 수 있다는 것이 발견 되었다.
본 발명의 방법에 의해, 쌍자엽 식물의 원형질체 뿐만 아니라 단자엽 식물의 원형질체의 성장을 촉진시킬 수 있다는 것이 발견 되었다.
본 발명의 방법에 의해, 쌍자엽 식물의 원형질체 뿐만 아니라 단자엽 식불의 원형질체도 잘 성장되어 칼루스 또는 세포 송이를 형성할 수 있다.
상술한 바와같이, 본 발명의 방법에 따라, 원형질체를 두께가 약 100~400μm, 바람직하게는 200~300μm인 액체 배지 층에서 배양한다. 본 발명의 방법에 따라, 원형질체를 어느 정도 호기성 조건에서 배양하며,이 호기성 조건은 원형질체의 성장을 촉진한다. 액체 배지의 두깨가 약 400㎛ 이상이면, 원형질체에 공급되는 산소가 불충분하게 되며, 약 100㎛ 이하이면, 원형질체가 액체-공기 접촉면에 의해 역효과를 받게 된다.
액체의 표면 장력 때문에 이런 박층의 액체 배지를 형성하는 것은 곤란하다. 즉, 소량의 액체 배지를 플라스틱 페트리디시 등에 넣으면, 액체 배지는 그의 표면 장력으로 인해 구형물방울이 된다. 본 발명자들은 친수성 지지체 위에 액체 배지를 넣어 액체 배지를 넣어 액체 배지의 표면장력을 감소 시킴으로써 액체 배지의 얇은 층을 만들었다. 바람직한 친수성지지체는 한천, 알긴산 및 그의 염, 및 젤라틴이다. 그러므로, 액체 배지의 얇은 막은 액체 배지를 바닥표면이 친수성 지지체로 피복된 페트리디시에 넣음으로써 형성될 수 있다. 친수성 지지체는 원형질체 뿐만 아니라 배양 배지를 흡수하기 때문에, 친수성 지지체의 두께를 가능한한 얇게 하는 것이 바람직하다. 그러므로, 친수성 지지체의 바람직한 두께는 1mm 이하, 더 바람직하게는 200㎛ 이하이다. 또한, 친수성 지지체는 슈크로오즈, 만니톨 및 글루코오즈와 같은 삼투제를 함유하는 것이 바람직하다. 더우기, 친수성 지지체는 하기에 설명하는 액체 배지에 가해질 수 있는 식물 호르몬, 비타민 및 기타 영양제를 함유할 수 있다.
원형질체를 배양하는데 사용되는 공지의 어떤 배지도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 예를들어, 배양된 원형질체가 벼[오리자 사티바(oryza satuva), 오리자 글라베리마(oryza glaberrima) 및 오리지 페레니스(oryza perennis)등과 같이 오리자 속에 속하는 식물]의 원형질체이면, MS 배지 (Murashige and Skoog, Physiol. Plant. 15, pp 473∼479(1962)), B5 배지 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50, pp151∼158(1968)), N6 배지 (Chu et al., Scientia Scinica 18, pp 659∼663(1975)) 및 R2 배지 (Ohira et al., Plant Cell Physiol., 14, pp 1113∼1121(1973))가 배양 배지로 사용될 수 있다. 마찬가지로, 배양될 원형질체가 피튜우니어(petunia)의 원형질체이면, NT 배지(Nagata and Takebe, Plante 99, pp12∼20(1971))가 사용될 수 있다. 배지는 원형질체 배양시 배지에 통상적으로 가해지는 2, 4-디클로로페녹시 아세트산(이후2.4-D로 약칭), 벤질아데닌, 키네틴, 제아틴, 지베렐린 및 아브시스산과 같은 식물 호르몬; 니코틴산, 티아민 및 피리독신과 같은 비타민 ; 슈크로오즈 및 만니톨과 같은 당 및 당 알콜 ; 및 기타 영양제를 함유 할 수 있다. 이들 첨가제의 농도는 배양될 원형질체의 특성, 첨가제의 종류에 따라 적당히 선택될 수 있으며, 예를들면 0.1∼10㎎/l 이다.
또한, 본 발명자들은 배지가 식물세포 또는 원형질체를 이전에 배양 하는데 사용된 배지를 함유 한다면, 원형질체의 성장에 더 촉진 된다는 것을 발견하였다. 더욱이, 배지의 pH를 5.2이하, 바람직하게는 3.5∼5.2로 조절하는 것이 바람직하다.
배양 조건 그 자체는 공지이다. 그러므로, 배양 조건은 배양될 원형질체의 특성이 따라 적당히 선택될 수 있다. 예를들어, 배양될 원형질체가 벼의 원형질체이면, 배양온도는 20∼30℃, 바람직하게는 약 26℃이고, 액체 배지에서 원형질체의 세포 농도는 104∼107, 세포/ml, 바람직하게는 105∼5x106세포/ml 이다.
본 발명의 방법은 어떤 방법에 의해 제조된 원형질체의 배양에도 적용될 수 있다. 원형질체를 형성하는 여러 가지 방법이 각종 식물에 대해 공지되어 있다. 배양될 원형질체가 벼의 원형질체이면, 원형질체는 예를들면 칼루스를 0.1∼10 중량%, 바람직하게는 1∼5중량%의 셀룰라제, 0.1∼5중량%, 바람직하게는 0.5∼2 중량%의 조직해리 효소(macerating enzyme), 0∼5 중량%, 바람직하게는 0.1∼1 중량%의 염화 칼슘 및 0∼5중량%, 바람직하게는 0.1∼1 중량%의 덱스트란 셀페이트의 포타슘여을 함유한 효소 용액으로 처리함으로써 벼의 칼루스로 부터 수득될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 쉽게 이해될 것이다. 하기의 실시예는 단지 본 발명을 설명하는데 그 목적이 있으며, 본 발명을 제한 하는 것은 아니다.
[실시예 1] - 벼의 원형질체의 배양
원형질체의 제조
벼의 종자 오리자 사티바 클티바르(oryza sativa cultivar), 변종 : 니혼바레(Nihonbare)]를 70% 에탄올 수용액에 1분 동안 침지 시키고, 차아 염소산 나트륨 수용액(염소 함량 5 중량%)에 15분간 침지 시킨다. 종자를 멸균 증류수로 3번 세척하고, 0.3 중량%의 카제인 가수분해물, 2ppm의 2, 4-D 및 1ppm의 벤질 아데닌을 함유한 N6 한천 배지에 파종한다. 26℃에서 3주일 동안 배양한 후, 종자의 배반(scutella)으로부터 칼루스가 형성된다. 이들 칼루스를 같은 조건에서 매4주마다 한번씩 계대 배양한다.
이렇게 수득된 칼루스를 0.3 중량%의 카제인 가수분해물 및 1ppm의 2, 4-D를 함유한 R2 액체 배지에 현탁 시킨다. 세포를 일주일에 한번 계대 배양한다. 계대 배양후 5∼7일에 수득된 세포 송이를 다음 단계에서 원형질체를 제조하는데 사용한다.
이렇게 수득된 세포 송이를 4.0 중량%의 셀룰라제 오느즈까 RS (야쿠르트 제약의 상품명), 1.0 중량%의 마세로 자임 R-10 (야쿠르트 제약의 상품명), 0.5 중량%의 염화 칼슘, 0.5 중량%의 덱스트란 설페이트의 포타슘염, 및 삼투제로 0.4M 만니톨을 함유한 용액으로 처리한다. 세포를 이 용액에서 27℃로 6시간동안 서서히 진탕하여 원형질체를 수득한다. 원형질체를 함유한 효소 용액을 여과하여 미분해된 세포 송이를 제거하고, 여과액을 50g에서 5분간 원심 분리하여 원형질체를 침전시킨다. 침전된 원형질체를 0.4M 글루코오즈 수용액으로 3번 세척하고, 다음 단계에서 배양한다.
친수성 지지체로 용기의 바닥 표면 피복
직경 35mm의 플라스틱 페트리디시를 배양 배지의 용기로 사용한다. 각 페트리디시의 바닥 표면을 그의 기본 배지로 R2 배지, B5 배지의 비타민 및 0.4M 슈크로오즈를 함유한 0.8% 한천(Difco) 약 100㎕로 피복하여 약 100㎛ 두께의 한천층을 형성한다.
벼의 원형질체 배양을 위한 배양 배지의 제조
벼의 종자[오리자 사티바 쿨리바르(oryza sativa cultivar) 변종 : 사사니시끼(Sasanishiki)]의 미성숙 배로부터 유도된 칼루스를 0.3 중량%의 카제인 가수분해물 및 1ppm의 2, 4-D를 함유한 R2액체 배지에서 배양한다. 이 배양액을 같은 조성의 신선한 배지 20ml에 10ml의 배양액을 가함으로써 일주일에 한번 게속해서 계대 배양한다.
계대 배양후 4∼7 일째의 계대 배양액을 여과하여 세포를 제거한다. 이렇게 수득된 여과엑 10ml에, 50㎕의 100ppm 2, 4-D, 1.37g의 당 및 미량의 비타민을 가한다. 이 여과액의 pH를 0.1 N HCl에 의해 4.5로 조절한다. 이 배지를 막 필터에 여과시켜 멸균하고, 다음 단계의 원형질체 배양용 배지로 사용한다.
바닥 표면을 상술한 바와같은 한천으로 피복한 각 페트리디시에, 106원형질체/ml를 함유한 상기에서 수둑된 배지 40∼400㎕를 가하고, 균일하게 펴 바름으로써 50∼500㎛ 두께의 액체 배지층을 형성한다. 페트리디시를 밀봉한 후, 26℃의 암소에서 30일간 배양한다. 세포 송이의 형성을 전도 현민경을 사용하여 관찰한다.
결과는 표 1에 나타낸다.
[표 1]
세포 송이의 형성
Figure kpo00001
- : 세포 송이가 형성되지 않는다.
+ : 약간의 세포 송이가 형성된다.
++ : 수백개의 세포 송이가 형성된다.
표 1에 나타낸 바와같이, 액체 배지의 두깨가 100∼400㎛일 때 세포 송이의 형성이 관찰되며, 특히 200∼300㎛ 두께의 액체 배지를 사용함으로써 양호한 결과가 수득된다.
[실시예 2]-당근의 원형질체의 배양
0.1ppm의 2, 4-D를 함유한 액체 배지에서 배양된 당근 배축(hypocotyls)으로부터 유도된 칼루스를 2 중량%에 셀룰라제오노즈까 R-10, 1 중량%의 마세로 자임R-10,2 중량%의 드리셀라제(교와 학꾜의 상품명), 0.5 중량%의 염화 칼슘 및 0.7M의 만니톨의 함유한 용액으로 처리한다. 이 혼합물을 26℃에서 3시간동안 서서히 진탕하여 원형질체를 형성한 후, 혼합물을 300 메시 나일론 시브에 여과하여 미 분해된 세포 송이를 제거한다. 여과액을 100g에서 5분동안 원심 분리하여 원형질체를 침전 시킨다. 침전된 원형질체를 0.5M 만니톨로 3번 세척한다.
이렇게 수득된 원형질체를 1ppm의 2, 4-D 및 0.5M 만니톨을 함유한 MS액체 배지에 105세포/ml의 세포농도로 현탁시킨다. 직경 35mm의 플라스틱 페트리디시를 실시예 1과 같은 방법으로 MS 배지 성분 및 0.5M 만니톨을 함유한 0.8% 한천으로 피복한다. 이 페트리디시에, 300㎕의 상기 현탁액을 가하고, 균일하게 편다. 26℃의암소에서 20일간 배양을 수행한다. 형성된 세포 송이의 수를 센다. 대조로서, 상기의 현탁액을 한천으로 피복되지 않은 같은 페트리디시에 가하고, 원형 질체를 갇은 방법으로 배양한다. 이 경우, 현탁액을 균일하게 펴지지 않고 그의 표면 장력으로 인해 작은 방울이 된다. 형성된 세포송이의 수를 센다.
결과는 표 2에 나타낸다.
[표 2]
당근의 작은 세포 송이의 형성
Figure kpo00002
+ : 수십개의 세포 송이가 형성된다.
++ : 수백개의 세포 송이가 형성된다.
표 2에 나타낸 바와같이, 세포 현탁액을 한천 피복위에 균일하게 펴 바름으로써, 현탁액이 작은 방울로 되는 피복하지 않은 페트리디시에 세포 현탁액을 가함으로써 형성된 것 보다 더욱 많은 세포 송이가 형성된다.
[실시예 3]-피튜우니어의 원형질체의 배양
온실에서 성장된 피튜우니어의 성숙된 잎을 70%에탄올 수용액에 10초간 침지 시킨다. 이 이잎은 0.5% 차아 염소산 나트륨 수용액(염소 함량 0.5 중량%)에 10분간 침지 시켜 멸균 시킨다. 잎을 멸균 증류수로 3번 세척한 후, 잎은 1mm 너비의 조작으로 절단한다. 1 중량%의 셀룰라제오노즈까 R-10, 0.3 중량%의 마세로자임 R-10 및 0.4M의 만니톨을 함유한 용액에 상기에서 수득된 절단편 0.5g을 가하고, 혼합물을 26℃에서 5시간동안 서서히 진탕하여 원형질체를 형성한다. 혼합물을 250메시 나일론 시이브에 여과하여 미 분해된 세포 송이를 제거한다.
여과액을 100g에서5분간 원심분리하여 원형질체를 침전 시킨다. 침전된 원형질체를 0.4M 만니톨로 3번 세척한다.
이렇게 수득된 원형질체를 1ppm의 2, 4-D 0.4 ppm의 벤질 아데닌, 50mM의 서당 및 0.3M의 만니톨을 함유한 NT 배지에 105세포/ml의 세포 농도로 현탁시킨다. 직경 35mm의 플라스틱 페트리디시를 실시예 1과 같은 방법으로 NT 배지의 성분을 함유한 0.8% 한천으로 피복한다. 이 페트리디시에, 300㎕의 상기 현탁액을 가하고, 균일하게 편다. 26℃의 암소에서 20일간 배양한다. 형성된 세포 송이의 수를 센다. 대조로서, 상기의 현탁액을 한천으로 피복되지 않은 같은 페트리디시에 가하고, 원형질체를 같은 방법으로 배양한다. 이 경우, 현탁액은 균일하게 펴지지 않고, 그의 표면 장력으로 인해 작은 방울이 된다. 형성된 세포송이의 수를 센다. 결과는 표 3에 나타낸다.
[표 3]
피튜우니어의 작은 세포 송이의 형성
Figure kpo00003
+ : 수십개의 세포 송이가 형성된다.
++ : 수백개의 세포 송이가 형성된다.
표 3에 나타낸 바와같이, 한천 피복 위에 세포 현탁액을 균일하게 펴 바름으로써, 현탁액의 작은 방울이 되는 피복되지 않은 페트리디시에 세포 현탁액을 가함으로써 형성된 것 보다 더 많은 세포 송이가 형성된다.

Claims (11)

  1. 원형질체를 약 100∼400㎛의 두께의 액체 배지층에서 배양함을 특징으로 하는 원형질체의 배양방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 액체 배지층의 두께의 약 200∼300㎛인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 액체 배지층을 친수성 지지체 위에 놓는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 친수성 지지체가 한천, 알긴산 및 그의 염, 및 젤라틴의 군에서 선택된 것인 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 친수성 지지체의 두께가 1mm 이하인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 친수성 지지체의 두께가 200㎛ 이하인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 원형질체가 벼, 당근 또는 피튜우니어의 원형질체인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 원형질체가 벼의 원형질체인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 벼가 오리자 사티바(oryza sative)인 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 배지가 그의 기본 배지로 R2, N6, MS 또는 B5 배지의 함유하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 배지가 0.1~10mg/l의 2, 4-D를 더 함유하는 방법.
KR1019860003909A 1985-05-21 1986-05-20 원형질체의 배양방법 KR890004025B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP60106885A JPS61265086A (ja) 1985-05-21 1985-05-21 プロトプラストの培養法
JP106885 1985-05-21

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KR860009123A KR860009123A (ko) 1986-12-20
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US (1) US5166068A (ko)
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