KR890004024B1

KR890004024B1 - 원형질체로 부터 벼 식물체의 재생방법

Info

Publication number: KR890004024B1
Application number: KR1019860003908A
Authority: KR
Inventors: 다쓰히또 후지무라; 모또이 사꾸라이; 히로모리 아까기; 도모꼬 네기시; 아끼라 히로세
Original assignee: 미쓰이도오아쓰가가꾸 가부시끼가이샤; 도즈까 야스아끼
Priority date: 1985-05-21
Filing date: 1986-05-20
Publication date: 1989-10-16
Also published as: EP0202667A3; CN86103448A; KR860009122A; CA1288713C; EP0202667A2; JPH0459855B2; CN86103448B; JPS61265022A

Abstract

내용 없음.

Description

원형질체로 부터 벼 식물체의 재생방법

본 발명은 소위 원형질체(protoplast)방법을 사용 하여 벼 식물을 형성하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특별하게는, 본 발명은 벼의 종자의 배, 배반(胚盤 ; scutellum) 또는 어린뿌리로 부터 유래된 칼루스(callus)으로부터 유도된 원형질체로부터 유도된 유합조직으로 부터의 벼 식물체의 재생방법에 관한 것이다.

원형질체는 식물, 박테리아, 진균 등의 세포에서 세포벽을 제거한 것이다. 원형질체는 세포벽을 갖지 않기 때문에, 세포융합, 유전자 조작 및 인공 체세포 돌연변이와 같은 인공적 조작이 용이하다. 그러므로, 조작된 원형질체로 부터 완전한 식물체가 재생될 수 있다면, 야생 식물이 갖고 있지 않은 특징적인 이점을 갖는 식물체를 얻을 수가 있다. 이런 종류의 소위 원형질체 방법을 개발하는 첫째 단계로, 원하는 특정 생물체를 위해 기술을 개발 함으로써 원형질체로 부터 완전한 식물체를 재생할 필요가 있다.

원형질체로 부터 완전한 식물체를 재생할 수 있는 담배와같은 쌍자엽 식물을 위한 몇가지 기술이 공지되어 있다.

이 분야의 공지기술은 반 고체 한천 배지에 원형질체를 파묻는 방법, 액체 배지에 원형질체를 현탁 시키는 방법 및 급식 세포를 사용한 원형질체의 배양 방법과 같은 원형질체의 배양방법이다. 그러나, 이들 기술은 벼의 원형질체를 배양하는 데는 효과적이 아니며, 벼의 원형질체를 이들 공지방법중의 하나로 배양 한다면 원형질체가 죽거나 성장할 수 없다는 것을 발견하였다.

벼의 원형질체의 배양방법으로는, 질산염 환원 효소가 부족한 세포로 부터 수득된 원형질체로 부터 칼루스를 유도 하는 방법(Wakasa et al.,J.Plant physiol, 117 : pp. 223∼231, 1984) 및 꽃가루의 칼루스로 부터 수득된 원형질체로 부터 유도된 칼루스로 부터 슈트(shoot)를 재생시키는 방법(ohno et al.,Japanese Journal of Breeding 35 : pp.54∼55, 1985)이 보고 되었다. 그러나, 벼의 원형질 체로 부터 벼의 완전한 식물체를 재생하는 것은 아직 보고되지 않고 있다.

한편, 벼의 배양된 세포로 부터 완전한 식물체를 재생하는 많은 방법이 보고 되었다(Nishi et al,.Nature 219 : pp.508∼509, 1968). 그러나, 이들 기술은 원형질체를 이용하지 않는다. 더우기, 이들 기술에 사용되는 높은 분화력을 갖는 세포로 부터 원형질체를 수득하는 것은 곤란하며 원형질체의 배양 또한 곤란 한다는 것이 발견되었다.

그러므로, 원현질체로 부터 벼의 완전한 식물을 재생 할수 있는 기술이 개발된다면, 특징적인 이점을 갖는 각종 벼의 생산연구가 상당히 진전될 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 벼의 완전한 식물체[오리자 사티바(Oryza sativa), 오리자 글라베리마(Oryza glaberrima), 오리자 페레니스(Oriza perennis)등과 같은 오리자속에 속하는 식물체]을 원형질체로 부터 재생할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 방법에서, 제 1 칼루스를 벼 종자의 배, 배반 또는 어린 뿌리로 부터 유도하고 제 1 칼루스를 액체 배지에서 배양하여 원형질체를 형성할 수 있는 세포 송이를 형성한다. 세포 송이를 원형질체-형성 효소용액으로 처리하여 원형질체를 형성한다. 원형질체를 배양하여 제 2 칼루스를 형성하고, 제 2 칼루스를 분화배지 에서 배양함으로써 제 2 칼루스로 부터 완전한 식물체를 재생한다.

본 발명에 의해, 벼의 완전한 식물체[오리자 사티바(Oryza sativa), 오리자 그라베리마(Oryza glaberima), 오리자 페레니스(Oryza perennis)등과 같은 오리자속에 속하는 식물체]을 원형질체로 부터 재생한다.

본 발명의 방법의 제 1 단계에서, 높은 분화력을 갖는 칼루스를 벼의 종자의 배, 배반 또는 어린뿌리로 부터 유도한다.

이것은 벼의 종자의 배, 배반 또는 어린 뿌리를 각각 1) 0.01∼1중량 %의 효모 추출물, 0.01∼1중량 %의 맥아 추출물, 0.01∼1중량 %의 카제인 가수분해물 또는 5∼20중량 %의 감자 추출물, 2) 식물 호르몬인 0.1∼10mg/l의 2,4-티클로로페녹시아세트산(이후 2,4-D로 약칭), 및 3) 0∼5mg/l의 벤질 아데닌 또는 0∼5mg/l의 키네틴을 함유하는 MS 배지(Murashige and skoog, physiol.plant, 15,pp473∼479(1962)), B5배지(Gamborg et al,.Exp.Cell Res.50,pp151∼158(1968)) 또는 N6 배지(Chu et al., Scientia Scinica 18, pp.659∼663),R2 배지(Ohira et al.,Plant Cell Physiol.14,pp.1113∼1121)의 한천 배지에서 배양함으로서 수행될 수 있다. 배양온도는 약 20∼30℃, 바람직하게는 약 26℃이다. 배양은 계대 배양의 형태로 수행될 수 있으며, 칼루스는 계대 배양액으로 부터 수득한다. 계대 배양은 예를들면 칼루스가 수득될때까지 매 4주에 한번씩 수행될 수 있다.

이렇게 수득된 칼루스는 높은 분화력을 갖는다.

그러나, 이 칼루스로 부터 원형질체를 직접 수득하는 것은 곤란하다. 그러므로, 본 발명에서, 쉽게 원형질체를 형성하는 높은 분화력을 갖는 작은 세포송이를 먼저 칼루스로 부터 수득하고, 원형질체를 세포송이로 부터 수득한다.

따라서, 본 발명의 제 2 단계는 상술한 제 1 단계에서 수득된 칼루스로 부터, 쉽게 원형질체를 형성하는 높은 분화력을 갖는 세포송이를 형성하는 것이다. 이 단계는 칼루스를 각각 1) 0.1∼1중량 %의 효모 추출물, 0.1∼1중량 %의 맥아 추출물, 0.1∼1중량%카제인 가수분해물 또는 5∼20중량 %의 감자 추출물. 2)0.1∼10mg/l의 2,4D 및 3) 0∼5mg/l의 벤질아데닌 또는 0∼5mg/l의 키네틴을 함유한 MS,N6 또는 R2 배지의 액체 배지에서 배양함으로써 수행될 수 있다. 배양 배지에서 세포의 군집밀도는 0.3∼3중량 %가 바람직하다.

배양온도는 약 20∼30℃이다. 배양은 계대 배양의 형태로 수행할 수 있으며, 세포 송이는 계대 배양액으로 부터 수득된다. 계대 배양은 예를들면 일주일에 한 번 수행할 수 있다. 배양은 액체 배지의 용기를 예를들면 70rpm의 회전 속도로 수평으로 회전시키는 회전 배양의 형태로 수행할 수 있다. 이 배양에 의해, 높은 분화력을 갖는 직경 1∼3mm의 세포송이를 수득할수 있다.

본 발명의 제 3 단계는 제 2 단계에서 수득된 세포송이로 부터 원형질체를 수득하는 것이다. 이것은 세포송이를 원형질체-형성효소 용액으로 처리함으로써 수행될 수 있다. 이 용액은 0.1∼10중량 %, 바람직하게는 1∼5중량 %의 셀룰라제, 0.1∼5중량 %, 바람직하게는 0.5∼2중량 %의 조직해리 효소(macerating enzyme), 0∼5중량 %, 바람직하게는 0.1∼1중량 %의 염화칼슘 및 0∼5중량 %, 바람직하게는 0.1∼1중량 %의 텍스트란 설페이트의 포타슘염을 함유할 수 있다. 이 용액은 삼투압을 조절하기 위해 삼투제로 3∼15중량 %의 만니톨을 더 함유 할 수있다. 이 용액의 pH는 예를들면 5.5일 수 있다. 세포송이는 예를들면 효소용액중에서 20∼30℃의 온도로 4∼8시간 동안 진탕 배양될 수 있다. 이 처리에 의해, 세포 송이는 대량의 원형질체를 형성할 수있다. 원형질체를 함유한 효소 용액을 여과하여 분해되지 않은 세포송이를 제거하고, 여과액을 예를들면 50g에서 원심분리함으로써 원형질체를 수거할 수있다.

본 발명의 방법은 제 4 단계에는 수득된 원형질체를 배양하여 칼루스를 재생하는 것이다. 칼루스를 연속해서 계대 배양할때 칼루스의 분화력이 현저하게 감소한다는 것은 공지이다. 칼루스의 분화력이 낮다면, 칼루스로 부터 완전한 식물체를 얻을 수가 없다. 그러므로, 이 단계에서 배양될 세포의 높은 분화력을 유지하는 것이 중요하다. 이런 과업은 본 발명에 따라 원형질체를 각각 1) 0.1∼1중량 %의 효모 추출물, 0.1∼1중량 %의 맥아 추출물, 0.1∼1중량 %의 카제인 가수분해물 또는 5∼20중량 %의 감자 추출물, 2) 0.1∼10mg/l의 2,4D 및 3) 0∼5mg/l의 벤질아데닌 또는 0∼5mg/l의 키네틴을 함유한 N6, B5 또는 R2 배지의 조정 배지(conditioned medium)에서 배양함으로써 성취된다. 상술할 제 2 단계에 사용된 배양 배지의 여과액은 조정 배지로서 일반적으로 사용될 수 있다. 이 경우, 신선한 배지를 여과액에 보출할 수 있다. 더우기, 본 발명자들에 의해 만니톨 또는 만니톨과 슈크로오즈의 혼합물과 같은 공지의 삼투제 대신 슈크로오즈에 의해 배지의 삼투압을 조절함으로써 원형질체의 분화가 촉진될 수 있다는 것이 발견되었다. 그러므로, 조정 배지는 예를 들면 0.4M의 슈크로오즈를 함유할 수 있다. 배양배지의 pH는 예를들면 염산에 의해 5.2이하로 조절하는 것이 바람직하다. 또한, 조정 배지를 2,4-D로 보충하여 원형질체의 증식력을 촉진 시키는 것이 바람직하다. 더우기, 배양 배지의 용기가 삼투제를 함유한 반고체 하천 배지, 알긴산, 젤라틴 등과 같은 친수성 지지체로 피복되고, 배양배지가 배양배지의 두께가 100∼400㎛, 바람직하게는 200∼300㎛가 되도록 친수성 지지체충에 놓이는 것이 바람직하다.

그렇게 함으로써, 배지가 한천으로 피복되지 않은 용기에 놓이는 경우보다 더 많은 정도로 공기 또는 산소에 노출된다. 이것은 한천 피복이 없으면, 배지가 그의 표면 장력에 의해 구형 물방울이 되어 단위 부피당의 공기와의 접촉 면적이 감소되는 반면, 배지를 한천층에 놓으면, 배지의 표면 장력이 한천층에 의해 감소되어 공기와의 접촉 면적이 더 큰 200∼300㎛두께의 배지층이 수득될 수 있다. 본 발명자들에 의해, 호기성 조건의 배양이 원형질체의 성장에 중요하다는 것이 발견되었다.한천층의 바람직한 두께는 1mm이하, 더 바람직하게는 200㎛이하이다. 배양이 진행됨에 따라, 글루코오즈와 같은 더 낮은 농도의 삼투제를 함유한 신선한 배지를 보충함으로써 뱅양배지를 희석할 수 있다. 배양은 칼루스가 수득될때까지 약 20∼30℃, 바람직하게는 약 27℃의 온도에서 수행될 수 있다. 원형질체의 바람직한 군집밀도는 10⁴∼10⁷원형질체/ml, 더 바람직하게는 10⁵∼5x10⁶원형질체/ml이다.

본 발명의 방법의 제 5 단계에서, 벼의 완전한 식물체는 분화 배지에서 칼루스를 배양함으로써 제 4 단계에서 수득된 칼루스로부터 재생된다. 이 단계에 사용된 분화배지는 1) 0.1∼1중량 %의 효모 추출물, 0.1∼1중량 %의 맥아 추출물, 0.1∼1중량 %의 카제인 가수분해물, 또는 5∼20중량 %의 감자 추출물, 및 2) 0∼10 mg/l의 벤질아데닌 또는 0∼10mg/l의 키네틴을 함유한 MS 배지일 수 있다. 배양온도는 약 20∼30℃이다. 칼루스를 분화배지에서 배양 시키기 전에 성장 배지에서 배양 시키는 것이 바람직하다. 성장 배지는 각각 1) 0.1∼1중량 %의 효모추출물, 0.1∼1중량 %맥아 추출물, 0.1∼1중량 %의 카제인 가수분해물 또는 5∼20중량 %의 감자 추출물, 2) 0.1∼10mg/l의 2,4-D 및 3) 0∼5mg/l의 벤질아데닌 또는 0∼5mg/l의 키네틴을 함유한 R2, N6 또는 MS배지일 수 있다. 배양온도는 약 20∼30℃이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더 쉽게 이해될 것이다. 하기의 실시예는 단지 본 발명을 설명하는데 그 목적이 있으며, 본 발명을 제한 하는 것은 아니다.

[실시예 1]-Ⅰ

높은 분화력을 갖는 칼루스의 유도 및 그의 계대배양

벼의 종자[오리자 사티바 쿨티바르(Oryza sativa cultivar), 변종 : 니혼바레(Nihonbare)]를 70%엔탄올 수용액에 1분 동안 침지 시키고, 차아 염소산 나트륨 수용액(염소 함량 5중량 %)에 15분간 침지시킨다. 종자를 멸균 증류수로 3번 세척하고, 0.3중량 %의 카제인 가수분해물, 2ppm의 2, 4-D 및 1ppm의 벤질아데닌을 함유한 N6 한천 배지에 파종한다. 26℃에서 3주 동안 배양한 후, 종자의 배반으로 부터 칼루스를 형성한다.

이들 칼루스를 같은 조건에서 매 4주에 한번씩 계대 배양한다.

[실시예 1]-Ⅱ

높은 분화력을 갖는 칼루스의 유도 및 계대배양

벼의 미성숙 종자[오리자 사티바 쿨티바르(Oryza sativa cultivar), 변종 : 사사니시끼(Sasanishiki)]를 70%에탄올 수용액에 1분동안 침지시켜 그의 겉표면을 멸균하고, 멸균수로 세척한다. 현미 종자로 부터 미성숙배를 제거하고, 배를 0.3중량 %의 효모 추출물 및 2ppm의 2,4-D를 함유한 MS한천 배지에 파종한다.26℃에서 3주간 배양 후, 칼루스가 재생된다. 이들 칼루스를 같은 조건에서 매 4주에 한번 계대 배양한다.

[실시예1]-Ⅲ

높은 분화력을 갖는 칼루스의 유도 및 계대배양

벼의 멸균된 종자[오리자 사티바 쿨티바르(Oryza sativa cultivar), 변종 : 고시히까리(Koshihikari)]를 한천을 함유한 배지에 파종한다. 1주후, 성장된 어린뿌리를 절단하여 2ppm의 2,4-D를 함유한 B5배지에 이식한다.

26℃에서 3주간 배양후, 칼루스가 재생된다. 이들 칼루스를 같은 조건에서 매 4주에 한번 계대배양한다.

[실시예 2]

유도된 칼루스의 액체배지에서 배양

실시예 1-Ⅰ,1-Ⅱ 및 1-Ⅲ의 계대배양으로 부터 수득된 칼루스를 표1에 나타낸 액체 배지에 옮기고 계대 배양한다. 각 액체배지 30ml를 100ml플라스크에 넣고, 플라스크를 26℃에서 70rpm으로 회전 시키면서 세포를 배지에서 배양한다. 계대 배양을 일주일에 1번 수행한다. 배지의 세포함량은 배양 초기에는 약 0.3중량 %이고, 배양 말기에는 약 3중량 %이다.

[표 1] 액체 배지의 조성

CH : 카제인 가수분해물

YE : 효모 추출물

PE : 감자 추출물

BA : 벤질 아데닌

[실시예 3]

원형질체의 분리

계대배양 후 7일동안 배양된 세포를 이 단계의 출발 물질로 사용한다. 원형질체-형성 효소 용액은 4.0중량 %의 셀룰라제 오노즈까 알에스(야쿠르트 제약의 상품명), 1.0중량 %의 미세로자임 R-10(야쿠르트 제약의 상품명), 0.5중량 %의 염화칼슘, 0.5중량 %의텍스트란 설페이트의 포타슘염 및 0.4M 만니톨을 함유한 수용액이다. 세포를 이 용액에서 27℃로 6시간동안 서서히 진탕하여 원형질체를 수득한다. 원형질체를 함유한 효소용액을 여과하여 미분해된 세포 송이를 제거하고, 여과액을 50g에서 5분간 원심분리하여 원형질체를 침전시킨다. 침전된 원형질체를 글루코오즈의 0.4M 수용액으로 3번 세척하고, 다음 단계에서 배양한다.

[실시예 4]

원형질체를 위한 배양 배지의 제조(조정배지)

상기 실시예 2의 배양배지를 여과하여 세포를 제거한다. 배양액의 여과액 10ml에, 50㎕의 100ppm 2,4-D용액 및 0.4M슈크로오즈를 가하고, 0.1N HCl에 의해 용액의 pH를 4.5로 조절한다. 이 배지에 0.4M슈크로오즈를 함유한 같은 새로운 기본배지(즉, R2 배지가 실시예 2에 사용되는 경우 R2 배지)를 전자의 배지의 1/4부피의 양으로 가한다.

[실시예 5]

원형질체의 배양

상기에서 제조된 조정배지 200㎕를 그의 표면 바닥이 얇은 한천층으로 피복된 35mm직경의 플라스틱 페트리디시 넣고, 10⁶원형질체/ml를 함유한 원형질체의 현탁액 30㎕를 가한후, 혼합물을 균일하게 편다. 페트리디시를 밀봉한 후, 27℃의 암소에서 배양을 수행한다.

약 1 주일후, 첫번째 분할이 관찰되며, 약 1개월 후 약 100㎛직경의 작은 세포송이가 형성된다(표 2참고).이 시점에서, 슈크로오즈의 양이 3중량 %로 감소된 같은 새로운 기본 배지 200㎕를 배양액에 가한다. 첨가로부터 2주 후에, 같은 공정을 반복한다. 원형질체의 최초 배양으로 부터 2개월 후에, 1mm직경의 작은 칼루스가 형성된다.

[표 2] 1주일 배양후 페트리디시 당의 작은 세포송이의 수

[실시예 6]

칼루스의 성장

원형질체로 부터 유도된 칼루스를 칼루스 성장 배지에 옮기고, 칼루스를 26℃에서 약 2주일동안 성장 시킨다. 성장배지(한천)의 조성 및 칼루스의 성장속도는 표 3에 나타낸다.

[표 3] 성장배지의 조성 및 성장속도

BM : 기본배지

GR : 성장속도

* +++ : 매우높음

++ : 높음

+ : 중간

: 거의 성장하지 않음

[실시예 7]

전체 식물체의 재생

성장 배지에서 성장된 칼루스를 26℃로 표 4에 나타낸 분화배지(한천)에서 전체 식물체로 분화 시킨다. 이식 후 1 주일째에 푸른 반점이 형성되며, 이식 후 1개월째에 작은 전체 식물체가 재생된다. 작은 전체 식물체를 넓은 시험관에 담긴 한천에 이식하여, 중간크기의 전체 식물체를 수득한다.

[표 4] 분화배지의 조성 및 전체 식물체의 재생

*GM : 성장 배지(컬럼에서 수치는 표3의 배지번호를 나타낸다)

**재분화 : 전체 식물체로 재분화

Claims

벼의 종자의 배, 배반 또는 어린뿌리로 부터 제 1 칼루스를 유도하는 제 1 단계 ; 제 1 칼루스를 액체 배지에서 배양하여 원형질체를 쉽게 형성하는 세포송이를 형성하는 제 2 단계 ; 세포 송이를 원형질체 - 형성 효소 용액으로 처리하여 원형질체를 형성하는 제 3 단계 ; 원형질체를 배양하여 제 2 칼루스를 형성하는 제 4 단계 ; 제 2 칼루스로 부터 벼의 식물체를 재생하는 제 5 단계를 순서대로 수행함을 특징으로 하는 벼 식물체의 형성방법.
제 1 항에 있어서, 각각 1) 0.01∼1중량 %의 효모 추출물, 0.01∼1중량 %의 맥아 추출물, 0.01∼1중량 %의 카제인 가수분해물 또는 5∼20중량 %의 감자 추출물, 2) 0.1∼10mg/l의 2,4-D, 및 3)0∼5mg/l의 벤질아데닌 또는 0∼5mg/l의 키네틴을 함유한 MS, B5, N6 또는 R2한천 배지에서 배, 배반 또는 어린뿌리를 배양 함으로써 제 1 단계를 수행하는 방법.
제 2 항에 있어서, 배, 배반 또는 어린뿌리의 배양을 계대배양의 형태로 수행하는 방법.
제 1 항에 있어서, 각각 1) 0.01∼1중량 %의 효모 추출물, 0.01∼1중량 %의 맥아 추출물, 0.01∼1중량 %의 카제인 가수분해물 또는 5∼20중량 %의 감자 추출물, 2) 0.1∼10mg/l의 2,4-D, 및 3)0∼5mg/l의 벤질아데닌 또는 0∼5mg/l의 키네틴을 함유한 R2,N6 또는 MS 배지에서 제 1 칼루스를 배지의 세포 농도가 0.3∼3중량 %가 되도록 배양함으로써 제 2 단계를 수행하는 방법.
제 4 항에 있어서, 제 1 칼루스의 배양을 계대 배양의 형태로 수행하는 방법.
제 1 항에 있어서, 원형질체-형성 효소 용액이 0.1∼10중량 %의 셀룰라제, 0.1∼5중량 %의 조직 해리 효소, 0∼5중량 %의 염화칼슘, 0∼5중량 %의 덱스트란 설페이트의 포타슘염 및 3∼15중량 %의 만니톨을 함유한 수용액인 방법.
제 1 항에 있어서, 삼투제를 함유한 친수성 지지체층 위에 200∼300㎛ 두께로 넣은 단계2에서 사용된 배지로부터 유도된 조정 배지에서 원형질체를 배양함으로써 제 4 단계를 수행하는 방법.
제 7 항에 있어서, 조정 배지의 삼투현상을 슈크로오즈에 의해 조절하며, 조정 배지의 pH가 5.2이하가 되도록 조절하는 방법.
제 7 항에 있어서, 친수성 지지체가 한천, 알긴산 또는 젤라틴으로 만들어지는 방법.
제 1 항에 있어서, 1) 0.01∼1중량 %의 효모 추출물, 0.01∼1중량 %의 맥아 추출물, 0.01∼1중량 %의 카제인 가수분해물 또는 5∼20중량 %의 감자 추출물, 및 2) 0.5mg/l의 벤질 아데닌 또는 0.5mg/l의 키네틴을 함유한 MS배지인 분화 배지에서 제 2 칼루스를 배양함으로써 제 5 단계를 수행하는 방법.
제 1 항에 있어서, 벼가 오리자 사티바(Oryza satuva)인 방법.
제10항에 있어서, 제 5 단계가 분화 배지에서 배양하기 전에, 각각 1)0.01∼1중량 %의 이스트 추출물, 0.01∼1중량 %의 맥아 추출물, 0.01∼1중량 %의 카제인 가수분해물 또는 5∼20중량 %의 감자 추출물, 2)0.01~10㎎/1의 2,4-D 및 3) 0~5㎎/1의 벤질아데닌 또는 0~5㎎/1의 키네틴을 함유한 MS,B5,N6 또는 R2 배지에서 제 2 칼루스를 성장시키는 단계를 더 포함하는 방법.
벼의 종자의 배, 배반 또는 어린 뿌리를 각각 1) 0.01∼1중량 %의 효모 추출물, 0.01∼1중량 %의 맥아 추출물, 0.01∼1중량 %의 카제인 가수분해물 또는 5∼20중량 %의 감자 추출물, 2) 0.1mg/l의 2,4-D 및 3)0∼5mg/l의 벤질 아데닌 또는 0∼5mg/l의 키네틴을 함유한 MS, B5, N6 또는 R2한천 배지에서 배양하여 제 1 칼루스를 형성하고 ; 제 1 칼루스를 각각 1) 0.01∼1중량 %의 효모 추출물, 0.01∼1중량 %의 맥아 추출물, 0.01∼1중량 %의 카제인 가수분해물 또는 5∼20중량 %의 감자 추출물, 2) 0.1∼10mg/l의 2,4-D 및 3)0~5mg/1의 벤질아데닌 또는 0~5mg/1의 키네틴을 함유한 R2,N6또는 MS맥체 배지에서 배양하여 원형질체를 쉽게 형성하는 세포송이를 배지에서의 세포농도가 0.3~3중량%가 되도록 형성하고 : 세포송이를 0.1∼10 중량 %의 셀룰라제, 0.1∼5중량 %의 조직해리 효소, 0∼5중량 %의 염화칼슘, 0∼5중량 %의 덱스트란 설페이트의 포타슘염 및 3∼15중량 %의 만니톨을 함유한 원형질체-형성 효소 수용액으로 처리하여 벼의 원형질체를 형성하고 ; 원형질체를 친수성 지지체층 위에 200∼300㎛두께로 넣은 제 2 단계에서 사용된 배지로 부터 유도된 조정 배지에서 배양하여 제 2 칼루스를 형성하고 ; 제 2 칼루스를 2)1) 0.01∼1중량 %의 효모 추출물, 0.01∼1중량 %의 맥아 추출물, 0.01∼1중량 %의 카제인 가수분해물 또는 5∼20중량 %의 감자 추출물, 및 2) 0∼5mg/l 의 벤질아데닌 또는 0∼5mg/l이 키네틴을 함유한 MS배지인 분화배지에서 배양하여 벼의 식물체를 형성하는 단계를 순서대로 수행함을 특징으로 하는 벼 식물체의 형성방법.
제13항에 있어서, 벼가 오리자 사티바(Oryza sativa)인 방법.