CN112106661A - 颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法，该超低温保存方法包括：挑选颗粒野生稻种子，消毒灭菌后接种到培养基上直接诱导出初生愈伤组织；对于无法直接诱导出愈伤的颗粒野生稻，种子消毒后使其萌发，待胚根生长至1cm左右时切下根段诱导出愈伤；得到颗粒野生稻初生愈伤后，在继代增殖过程中交替使用两种培养基；扩繁后的愈伤进行预培养后收集，放入带有无菌滤纸的培养皿干燥后直接冻存。解冻后将愈伤接种到培养基上恢复培养，待新生愈伤长出后进行分化培养，直至绿苗长出。本发明的颗粒野生稻愈伤超低温保存方法步骤简单易行，且经过超低温保存后，愈伤的存活率高，是一种有效的野生稻资源保存手段。

Description

颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法
技术领域
本发明属于植物细胞工程技术领域，具体地涉及一种颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法。
背景技术
水稻是全球最主要的三大粮食作物之一，也是亚洲最主要的粮食作物。在栽培稻近万年的自然演化、驯化及栽培传播的过程中，积累了丰富的水稻遗传资源。但随着全球工业化背景下迅速恶化的自然环境及不利的气候条件，同时机械化规模化种植方式的推广，以产量为主导的育种策略，使得栽培稻的品种越来越单一化，资源的遗传基础变得狭窄，遗传多样性逐渐丧失，原本资源中的抗逆基因渐渐流失。而作为稻属的重要组成部分，野生稻一直以来生长在野外环境，经受住了各种生物与非生物逆境的自然选择，具有较强的抗逆性，是天然的基因资源宝库，对水稻品种改良具有重要价值。
颗粒野生稻(Oryza granulata)为GG基因型，位于稻属系统进化树的基部，主要分布于南亚与东南亚，具有较强的抗旱性，是一种重要的野生稻类型。随着自然环境改变和人类活动的增加，自然界中的颗粒野生稻资源正在逐渐消失。目前对颗粒野生稻的保存大多以种子的形式在种质库中保存，而野生稻普遍授粉能力低于栽培稻，结实率低，且种子萌发率也较低。由于野生稻的繁种效率较低，无法在短时间内获得大量的野生稻植株，给资源的利用带来了很大的限制。随着生物技术的发展，植物组织与细胞的培养为植物种质保存开辟了新的途径，通过组织培养，可以利用有限的少量植物材料进行快速大量增殖,再生植株可保持原有的遗传特性。而在超低温保存(-196℃)条件下，植物的生物化学活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内，避免了遗传性状变异或污染的危险，被认为是植物遗传资源长期保存的最优选择。
稻属植物的超低温保存研究开展的并不多，水稻的超低温保存最早开始于1979年，Sala等报道的水稻悬浮细胞的超低温保存。此后相关研究也多集中在利用悬浮细胞系的作为超低温保存材料。1996年殷晓辉教授通过程序降温仪对野生稻愈伤进行超低温保存研究，获得冻后再生植株。随后1998年何光存利用疣粒野生稻幼穗诱导出无再生能力的愈伤组织，经过继代培养和超低温保藏后获得了胚性愈伤组织，建立悬浮细胞系分离出原生质体，最后再生出植株。2000年章志宏教授等采用程序降温法对水稻幼穗离体培养诱导的不定芽进行超低温保存，得到再生植株。2016年上海市农业生物基因中心林田等用茎尖玻璃化的方法保存了普通野生稻种质资源。但上述保存方法往往步骤较繁琐，对设备要求(如程序降温仪)或材料要求(如茎尖、幼穗等材料细小幼嫩，取材操作难度大)都比较高，不利于颗粒野生稻的资源保存。因此探索颗粒野生稻的组培快繁体系，采用更简便高效低成本的超低温保存方法是亟需和必要的。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种简便高效的颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法，可以通过组培快繁短时间得到大量野生稻植株，为颗粒野生稻种质资源的长期安全保存提供了一条适用广效率高的途径，也对其他禾本科植物的超低温保存方法有一定指导意义。
本发明提供了一种颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤S1：取若干饱满干净的颗粒野生稻种子，剥去稻壳并消毒灭菌后接种到含有3mg/L 2,4-D的NB培养基上诱导出初生愈伤组织；
步骤S2：将诱导出的初生愈伤组织转接到含有2mg/L 2,4-D的NB培养基上进行继代，增殖培养中交替使用含有1mg/L 2,4-D和3mg/LNAA，3mg/L KT的NM培养基；
步骤S3：将增殖扩繁后的愈伤组织转入含有100g/L蔗糖和2mg/L 2,4-D的NB培养基上预培养6天，再收集放入带有无菌滤纸的培养皿置于19℃干燥1天；
步骤S4：将干燥后的愈伤组织直接装入冻存管，每支冻存管装载量不超过2/3，然后立即投入液氮中保存。
在本发明提供的颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法中，还可以具有这样的特征，其中，在所述步骤S1中，若野生稻种子无法直接诱导出愈伤组织，则该方法还包括如下步骤：
步骤S11，将无法诱导出愈伤组织的野生稻种子剥去稻壳消毒灭菌后接种到含有0.1mg/LNAA的1/2MS培养基上，待胚根生长至1cm左右时切下，切成2-3mm左右转接到含有2mg/L 2,4-D的NB培养基上诱导出初生愈伤组织。
在本发明提供的颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法中，还可以具有这样的特征，其中，在所述步骤S1中，诱导培养条件为28℃恒温暗培养。
在本发明提供的颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法中，还可以具有这样的特征，其中，在所述步骤S11中，种子萌发培养条件为26℃光照培养，强度1000-1200lux；并且，萌发后切下的根诱导培养条件为26-28℃暗培养。
在本发明提供的颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法中，还可以具有这样的特征，其中，在所述步骤S2中，继代增殖需要交替使用两种培养基，培养条件为26-28℃暗培养。
在本发明提供的颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法中，还可以具有这样的特征，其中，在所述步骤S3中，愈伤组织预培养在26-28℃进行，收集之后放置于19℃培养箱中干燥。
其次，本发明还提供了一种颗粒野生稻愈伤组织的恢复培养方法，用于对采用上述任一方案所述的超低温保存方法保存后的愈伤组织进行恢复培养，其特征在于，所述恢复培养方法包括以下步骤：
从液氮中取出冻存管后立即放入39-41℃水浴快速解冻2-4min；
然后接种到含有2mg/L 2,4-D的NB培养基上恢复培养10-14天，恢复培养条件为28-30℃暗培养，直至新生愈伤组织长出。。
另外，本发明还提供了一种颗粒野生稻愈伤组织分化成苗的培养方法，用于对采用上述方案所述的恢复培养方法培养后长出的新生愈伤组织进行分化成苗培养，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：将恢复培养后长出的新生愈伤组织转入含有2.0mg/L 6-BA、2.0mg/L KT、0.2mg/L IAA和0.2mg/LNAA的MS培养基上进行光照分化培养，培养20-30天分化出绿苗。
在本发明提供的颗粒野生稻愈伤组织分化成苗的培养方法，其特征在于，其中，分化培养条件为培养于25℃，光照12h/天，光照强度4000-5000lux。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明中建立了颗粒野生稻的组培快繁体系，通过成熟胚与萌发种子的胚根诱导愈伤，通过NB/NM交替继代培养扩繁愈伤，可较为简便快速的得到用于超低温保存的愈伤组织，且得到的愈伤组织都有很高的分化活性，可以在冻存后快速复苏并得到颗粒野生稻植株，相比茎尖材料或细胞悬浮材料更为高效稳定；
2)本发明操作简便，通过高糖预培养一定时间后，再放置于可以维持愈伤活性的较低温度进行干燥处理，进一步降低含水量，再直接投入液氮保存，省去玻璃化处理或程序降温处理，使操作更简便易行；
3)本发明是首次对颗粒野生稻愈伤进行大范围的超低温保存，其中材料的选取、继代与冻存前的处理使超低温保存效率提升，为其他野生稻材料的超低温保存研究的开展具有很好的参考价值。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
<实施例>
本实施例提供了一种颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法，该超低温保存方法包括以下步骤：
步骤S1：取若干饱满干净的颗粒野生稻种子，剥去稻壳并消毒灭菌后接种到含有3mg/L 2,4-D的NB培养基上诱导出初生愈伤组织。
具体地，从颗粒野生稻成熟胚获得愈伤组织：
挑选饱满无病斑的颗粒野生稻种子，剥去颖壳后进行消毒灭菌，灭菌方法为用70％酒精表面消毒1min,再用10％次氯酸钠浸泡振荡灭菌20min，灭菌水清洗4-5次。消毒后的种子接种到含有3mg/L 2,4-D的NB培养基上诱导初生愈伤组织，诱导培养条件为28℃恒温暗培养。
经试验：诱导培养后得到淡黄色、圆形的愈伤组织。
在步骤S1中所使用的NB固体培养基为1L培养基中含有463mg(NH4)2·SO4，125.33mg CaCl2，90.37mg MgSO4，400mg KH2PO4，2830mg KNO3，3mg H3BO3，0.025mg CoCl2·6H2O，0.025mg CuSO4·5H2O，27.8mg FeSO4·7H2O，37.26mg Na2-EDTA·2H2O，10mg MnSO4·H2O，0.25mg Na2NoO4.2H2O，0.75mg KI,2mg ZnSO4·7H2O，100mg肌醇，1mg烟酸，1mg盐酸吡哆醇，10mg烟酸硫胺素，30g蔗糖，7g琼脂粉，余量为水，调整pH值为5.8。
若野生稻种子采取步骤S1无法直接诱导出愈伤组织，则利用萌发种子的胚根诱导颗粒野生稻愈伤，具体的步骤为：
步骤S11，将无法诱导出愈伤组织的野生稻种子剥去稻壳消毒灭菌后接种到含有0.1mg/LNAA的1/2MS培养基上，待胚根生长至1cm左右时切下，切成2-3mm左右转接到含有2mg/L 2,4-D的NB培养基上诱导出初生愈伤组织。
具体地，利用萌发种子的胚根诱导颗粒野生稻愈伤：
对于一些无法通过NB诱导直接得到愈伤组织的颗粒野生稻品种，挑取成熟干净的种子，消毒灭菌后接种在含有0.1mg/LNAA的1/2MS培养基，待胚根生长至1cm左右时切下，切成2-3mm左右转接到含有2mg/L 2,4-D的NB培养基上诱导出初生愈伤。其中，种子萌发培养条件为26℃光照培养，强度1000-1200lux；并且，萌发后切下的根诱导培养条件为26-28℃暗培养。
在步骤S11中所使用的1/2MS固体培养基为1L培养基中含有950mgKNO3，825mgNH4NO3，85mgKH2PO4，285mgMgSO4·7H2O，220mg CaCl2·2H2O，27.8mg FeSO4·7H2O，37.26mg Na2-EDTA·2H2O，22.3mg MnSO4·4H2O，0.25mg Na2NoO4.2H2O，0.83mg KI，3mgH3BO3，8.6mg ZnSO4·7H2O，100mg肌醇，0.5mg烟酸，0.5mg盐酸吡哆醇，0.1mg烟酸硫胺素，2mg甘氨酸，30g蔗糖，7g琼脂粉，余量为水，调整pH值为5.8。
步骤S2：将诱导出的初生愈伤组织转接到含有2mg/L 2,4-D的NB培养基上进行继代，增殖培养中交替使用含有1mg/L 2,4-D和3mg/L NAA，3mg/L KT的NM培养基；其中，继代增殖需要交替使用两种培养基，培养条件为26-28℃暗培养。
通过步骤S1和步骤S11的两种诱导方式都可以得到颗粒野生稻初生愈伤组织，在得到淡黄色较致密的初生愈伤后，需要继代增殖诱导得到的愈伤。选取两种培养基，一种为含有2mg/L 2,4-D的NB培养基，在水稻的愈伤培养中被广泛使用，另一种为含有1mg/L 2,4-D和3mg/L NAA，3mg/L KT的NM培养基。其配方为1L培养基中含有463mg(NH4)2·SO4，125.33mg CaCl2，90.37mg MgSO4，400mg KH2PO4，2830mg KNO3，3mg H3BO3，22.3mg MnSO4·4H2O，0.25mg Na2NoO4.2H2O，0.83mg KI，8.6mg ZnSO4·7H2O，0.025mg CuSO4·5H2O，27.8mgFeSO4·7H2O，37.26mg Na2-EDTA·2H2O，100mg肌醇，0.5mg烟酸,1mg盐酸吡哆醇，0.1mg烟酸硫胺素，30g麦芽糖，30g山梨醇，7g琼脂粉，余量为水，调整pH值为5.8。
通过对两种培养基的继代培养的试验结果进行观察与数据记录，得到表1所示的继代培养周期数据，从而获得两种培养基交替使用对愈伤生长的影响。
表1不同培养基的继代培养周期
组别 NB培养基 NM培养基
继代培养周期 12-14天 22-25天
通过表1比较发现：不同的培养基对颗粒野生稻愈伤具有不同的增殖效率，在NB培养基上继代增殖速度快，但一直使用会导致愈伤质地疏松，易褐变和玻璃化。使用NM培养基继代颗粒野生稻愈伤，生长速率较慢但愈伤质地致密，但持续使用后会使愈伤组织直接分化出苗，也会使其丧失胚性。因此在本实施例3中，交替使用这两种培养基，使愈伤组织在快速生长的同时保持活性。
步骤S3：将增殖扩繁后的愈伤组织转入含有100g/L蔗糖和2mg/L 2,4-D的NB培养基上预培养6天，再收集放入带有无菌滤纸的培养皿置于19℃干燥1天；其中，愈伤组织预培养在26-28℃进行，收集之后放置于19℃培养箱中干燥。
在预培养之后的颗粒野生稻愈伤，其含水量有所下降。众所周知，冻存时低温对细胞的伤害主要是由胞内自由水结冰产生的冰晶造成的。而愈伤组织相比其他如茎尖等部位的材料，含水量相对较高，因此在保持愈伤活性的同时，尽量降低愈伤含水量是提高超低温冻存成活率的重要手段。经过预培养后将颗粒野生稻愈伤收集，放置于铺有多层无菌滤纸的培养皿中，在19℃放置1天进行干燥处理。
在步骤S3中，通过对不同品种(KL-1、KL-2、KL-3三个品种)的颗粒野生稻的愈伤组织进行干燥处理前后的成活率进行试验与数据记录得到表所示的成活率数据，从而获得干燥处理对颗粒野生稻愈伤冻存的影响。
表2干燥处理对颗粒野生稻愈伤冻存成活率影响
颗粒野生稻品种 干燥处理后 直接冻存后
KL-1 27％ 10％
KL-2 48％ 36％
KL-3 56％ 41％
从表2结果可以看出：经过干燥处理后，不同品种的颗粒野生稻存活率都有明显上升，说明这种干燥的手段可以减少低温冻存给愈伤带来的伤害，是一种有效的提高冻存效率的手段。且恢复培养后的颗粒愈伤组织生长旺盛，具有较强的活性。
步骤S4：将干燥后的愈伤组织直接装入冻存管，每支冻存管装载量不超过2/3，然后立即投入液氮中保存。
其次，本实施例还提供了一种颗粒野生稻愈伤组织的恢复培养方法，用于对采用上述的超低温保存方法保存后的愈伤组织进行恢复培养，该恢复培养方法包括以下步骤：
从液氮中取出冻存管后立即放入39-41℃水浴快速解冻2-4min；
然后接种到含有2mg/L 2,4-D的NB培养基上恢复培养10-14天，恢复培养条件为28-30℃暗培养，直至新生愈伤组织长出。
另外，本实施例还提供了一种颗粒野生稻愈伤组织分化成苗的培养方法，用于对采用上述的恢复培养方法培养后长出的新生愈伤组织进行分化成苗培养，该培养方法包括以下步骤：将恢复培养后长出的新生愈伤组织转入含有2.0mg/L 6-BA、2.0mg/LKT、0.2mg/LIAA和0.2mg/LNAA的MS培养基上进行光照分化培养，培养20-30天分化出绿苗。其中，分化培养条件为培养于25℃，光照12h/天，光照强度4000-5000lux。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤S1：取若干饱满干净的颗粒野生稻种子，剥去稻壳并消毒灭菌后接种到含有3mg/L2,4-D的NB培养基上诱导出初生愈伤组织；
步骤S2：将诱导出的初生愈伤组织转接到含有2mg/L 2,4-D的NB培养基上进行继代，增殖培养中交替使用含有1mg/L 2,4-D和3mg/LNAA，3mg/L KT的NM培养基；
步骤S3：将增殖扩繁后的愈伤组织转入含有100g/L蔗糖和2mg/L 2,4-D的NB培养基上预培养6天，再收集放入带有无菌滤纸的培养皿置于19℃干燥1天；
步骤S4：将干燥后的愈伤组织直接装入冻存管，每支冻存管装载量不超过2/3，然后立即投入液氮中保存。
2.如权利要求1所述的颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，在所述步骤S1中，若野生稻种子无法直接诱导出愈伤组织，则该方法还包括如下步骤：
步骤S11，将无法诱导出愈伤组织的野生稻种子剥去稻壳消毒灭菌后接种到含有0.1mg/LNAA的1/2MS培养基上，待胚根生长至1cm左右时切下，切成2-3mm左右转接到含有2mg/L 2,4-D的NB培养基上诱导出初生愈伤组织。
3.如权利要求1所述的颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，在所述步骤S1中，诱导培养条件为28℃恒温暗培养。
4.如权利要求2所述的颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，在所述步骤S11中，种子萌发培养条件为26℃光照培养，强度1000-1200lux；并且，萌发后切下的根诱导培养条件为26-28℃暗培养。
5.如权利要求1所述的颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，在所述步骤S2中，继代增殖需要交替使用两种培养基，培养条件为26-28℃暗培养。
6.如权利要求1所述的颗粒野生稻愈伤组织的超低温保存方法，其特征在于，在所述步骤S3中，愈伤组织预培养在26-28℃进行，收集之后放置于19℃培养箱中干燥。
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