CN107667867B - 一种用于药用野生稻保护繁育的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于药用野生稻保护繁育的方法，属植物组织培养技术领域。该药用野生稻保护繁育方法包括：外植体选择、种子处理、种子灭菌处理、种子催芽处理、种子芽愈伤诱导、愈伤材料处理、愈伤诱导培养和愈伤继代培养、分化培养、一次继代分化培养、二次继代分化培养、分化增殖培养、壮苗培养、生根培养、苗的锻炼培养、苗的温室移栽及苗的田间移栽和田间秧苗管理步骤。本发明解决了药用野生稻种子愈伤诱导和分化成苗困难的问题，且诱导出愈伤率和分化率较高，经组培快繁得到的药用野生稻植株长势较好，该方法为药用野生稻及其他组培困难的稻属品种通过种子组培快繁进而分化成苗提供了有力的技术支持，也为药用野生稻的保护和利用提供了行之有效的方法。
Description
技术领域：
本发明涉及一种药用野生稻保护繁育的方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术：
野生稻是栽培稻的原始祖先，其长期生长在野外经受了各种逆境胁迫的选择，遗传多样性丰富，保存有大量栽培稻不具有或已经消失了的优异基因，具有重要的学术价值和经济价值。
中国有普通野生稻、药用野生稻和疣粒野生稻。其中药用野生稻(Oryzaofficinalis Wall)是最具有研究价值的资源，在稻属22个种中生长势最强，是普通栽培水稻的20倍以上，具有超大穗、超宽叶片、超粗茎秆等性状，抗逆能力非常强，其基因组、基因型和栽培稻、普通野生稻的差异很大，一旦发掘利用，将会对水稻育种和生产带来突破进展。然而，由于垦荒、养殖、放牧、修建基础设施、设立旅游点以及环境污染、环境恶化等多种因素的影响，我国药用野生稻的自然群落正在迅速减少，有些分布点已绝迹或濒临灭绝，如何保护、研究、利用我国宝贵的药用野生稻资源，是我国水稻育种工作者亟待解决的问题。
药用野生稻为多年生禾本科植物，由于其特殊性，种子保存不是其适合的资源保存方式，药用野生稻的种子在经过一段时间的保存后，几乎没有活力，无法通过常规栽培方法长成植株，而利用药用野生稻种子通过常规组培快繁的方法得到愈伤，进而分化成苗得到药用野生稻植株的过程也极为艰难，目前有关药用野生稻种子诱导愈伤和分化成苗的文献报道极少且均未提及药用野生稻的出愈伤率和分化率。近年来，一些学者采取稻属带节茎段扦插的方法来实现野生稻种质资源保存和复壮快繁，并取得了较好的效果。但药用野生稻长年生存在野外，经多代自然繁殖以后，常积累了大量的病毒。利用组织培养技术，能够快速去除病毒，加快药用野生稻的繁殖速度和繁殖量，缩短了药用野生稻的育种周期，可在短期内实现遗传背景一致的药用野生稻材料规模化生产，满足有些以大量遗传背景一致的药用野生稻为实验材料进行抗性基因和新种质育种研究的需要。因此，寻找一种通过药用野生稻组培快繁获得遗传背景一致的药用野生稻材料是本领域科技人员长期想探索的技术问题。
本发明提供的一种药用野生稻保护繁育的方法，经文献检索，未见与本发明相同技术的公开报道。
发明内容：
本发明目的在于克服了药用野生稻成熟种子很难诱导出愈伤、分化出组培苗的棘手问题，从实践中解决和提供了一种用于药用野生稻成熟种子快速繁殖的培养方法。
本发明的药用野生稻成熟种子保护繁育的快速繁殖培养方法，具体步骤：
a.外植体选择：外植体选择当年收获的成熟种子，用纸袋装好，备用；
b.种子处理：将纸袋装好备用的种子取出，弃壳，剥离出完整的米粒，再用小型三角锉刀将米粒表面挫出浅凹或用细砂纸将种子的表皮磨干净并用无菌水洗4遍，用滤纸吸干水份，将处理后的米粒放入已灭菌的三角瓶中，待用；
c.种子灭菌处理：将装有带凹面米粒的三角瓶置于无菌台中，用无菌水清洗种子2遍，再用体积百分比为75％酒精表面消毒1分钟，摇动三角瓶，倒掉，用体积百分比为0.1％的氯化汞灭菌15分钟，摇动三角瓶，倒掉，再用体积百分比为0.1％的氯化汞灭菌5分钟，摇动三角瓶，倒掉，用无菌水清洗6遍，无菌种子待用；
d.种子催芽处理：将灭菌处理后的种子置于铺有无菌滤纸直径为50毫米的培养皿上，在培养皿中加入15mL无菌水后将其放置在温度为28℃的人工气候箱中进行暗培养，培养4天后种子露白，6天后种子长出小芽；
e.种子芽愈伤诱导：将催芽处理后出芽的种子接入诱导培养基上，放置于温度为28℃的人工气候箱中进行暗培养；种子芽愈伤诱导培养基配方为：MS基本培养基+2,4-D5mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
f.愈伤材料处理：出芽的种子在28℃人工气候箱中暗培养16天后长出愈伤，按此条件继续培养10天，待愈伤长至0.1厘米，将愈伤用无菌手术刀切下，弃掉芽和胚只留下透明紧实的愈伤；
g.愈伤诱导培养和愈伤继代培养：将透明紧实的愈伤接入愈伤诱导培养基上，放置于温度为28℃的人工气候箱中暗培养30天后，愈伤长至0.5厘米，将其转接入愈伤继代培养基上进行继代培养，经过30天的继代培养，待其长至0.8厘米、紧实、透明、颗粒饱满的愈伤时，即可进行分化培养；愈伤诱导培养基和愈伤继代培养基配方为：MS基本培养基+2,4-D5mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
h.分化培养：将上述诱导继代得到的0.8厘米紧实透明的愈伤整棵挑出，接入分化培养基中，放置在温度为28℃，光照强度为4000Lux的人工气候箱中进行光照分化培养；分化培养基配方为：MS基本培养基+6-BA 4mg/L+ZT2mg/L+NAA 0.3mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
i.一次继代分化培养：分化培养30天后，愈伤长至1厘米，此时愈伤的形态为：透明，表面微小膨松，出现细微淡绿；将愈伤中细微淡绿的部分转接到一次继代分化培养基中，放置在温度为28℃，光照强度4000Lux的人工气候箱中进行一次继代分化培养；一次继代分化培养基配方为：MS基本培养基+6-BA3mg/L+ZT 2mg/L+NAA 0.25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
j.二次继代分化培养：一次继代分化培养30天后，愈伤表面的绿色加深并出现绿色分化凸起点，将一次继代分化的绿色凸起愈伤转接到二次继代分化培养基中，放置在人工气候箱中进行二次继代分化培养，二次继代分化培养的人工气候箱条件与一次继代分化培养的相同；二次继代分化培养基为：MS基本培养基+6-BA 3mg/L+ZT 2mg/L+NAA 0.25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
k.分化增殖培养：二次继代分化培养5天后，绿色分化凸起的愈伤分化成苗，此时将人工气候箱的光照强度由4000Lux降至2500Lux，进行弱光培养，其他条件不变，培养14天后，整块愈伤中的分化苗伸长，此时分化苗纤细，略显黄，愈伤组织颜色加深，将整块愈伤和分化苗接入分化增殖培养基中，放置在温度为28℃，光照强度2500Lux的人工气候箱中进行光照分化增殖培养；分化增殖培养基配方为：MS基本培养基+6-BA 4mg/L+NAA0.2mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
l.壮苗培养：分化增殖培养20天后，经过两次继代分化培养和分化增殖培养的愈伤和分化苗同时生长出少许丛苗，此时分化苗和丛生苗细长，茎纤细，茎节略大，叶片修长，叶片表面有绒毛，须根伸长，发达，已经展现出药用野生稻的外部特征；把细长分化苗和丛生苗切成独立苗，弃掉须根，接入壮苗培养基中，进行壮苗生长培养，培养条件与分化增殖培养一致；壮苗培养基配方为：MS基本培养基+TDZ 2mg/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
m.生根培养：壮苗培养20天后，经过壮苗培养的独立苗茎秆变粗，叶片加宽，叶片表面绒毛挺立，植株颜色深绿，组培瓶中的整株单苗矮壮，将壮苗培养的独立单苗接入生根培养基中，放置在温度为28℃，光照强度3000Lux的人工气候箱中进行光照生根培养；生根培养基配方为：MS基本培养基+NAA0.25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖20g/L，pH＝5.8；
n.苗的锻炼培养：生根培养5天后，矮壮单苗根芽露白，根芽露白后2天，根芽长出，继续此条件培养4天后，主根长至1.2厘米，须根长出，5天后主根长至3厘米-4厘米，此时将生根苗从培养基中取出，用自来水将生根苗上的培养基冲洗干净后置于试管中，加入自来水后在温度为28℃，光照强度为3000Lux的光照培养箱中进行炼苗培养，加入自来水的量以淹没根部为宜；
o.苗的温室移栽：苗锻炼培养7天后，将光照培养箱中的锻炼苗取出，单苗移栽种植在事先准备好的水盆中进行生长培养；
p.苗的田间移栽和田间秧苗管理：移栽入水盆中的苗在温室中生长30天后，将秧苗移栽至田间，田间苗前期和中期保证水和肥的充足，生长中后期进行追肥，直到后期种子成熟收获。
本发明的优点在于：
解决了长期以来药用野生稻愈伤诱导和分化出苗艰难的问题。药用野生稻种子的愈伤诱导率在40％以上，由愈伤分化成苗的分化率为20％以上。该方法在短期内能够获得大量遗传背景一致的药用野生稻植株，满足有些以大量遗传背景一致的药用野生稻为实验材料进行抗性基因和新种质育种研究的需要，同时也为药用野生稻及其他种子组培快繁困难的稀有稻属品种通过种子组培快繁进而分化成苗提供了有力的技术支持，为药用野生稻的保护和利用提供了行之有效的科学实验依据。
具体实施方案：
实施例一：云南景洪药用野生稻成熟种子快速繁殖培养
本实施例一用云南景洪药用野生稻成熟种子为实验材料，采用本方法获得了药用野生稻的再生植株。实施具体方法如下：
1)外植体选择：外植体选择当年收获的成熟种子，用纸袋装好，存放于阴凉干燥处备用；
2)种子处理：将纸袋装好备用的种子取出，剥去其颖壳，留下完整的米粒，用小型三角锉刀将米粒表面挫出浅凹，将带凹面的米粒放入无菌的50mL三角瓶中，待用；
3)种子灭菌处理：将装有带凹面米粒的50mL三角瓶置于无菌台中，用无菌水清洗种子2遍，再用体积百分比为75％酒精浸泡1分钟进行表面消毒，摇动三角瓶，倒掉，用体积百分比为0.1％氯化汞灭菌15分钟，摇动三角瓶，倒掉，再用体积百分比为0.1％氯化汞灭菌5分钟，摇动三角瓶，倒掉，灭菌后用无菌水清洗6遍，无菌种子待用；
4)种子催芽处理：将灭菌处理后的无菌种子置于铺有无菌滤纸的直径为50毫米的培养皿上，在培养皿中加入15mL无菌水后将其放置在温度为28℃的人工气候箱中进行暗培养，培养4天后种子露白，6天后种子长出小芽；
5)种子芽愈伤诱导：将出芽的种子接入诱导培养基上，放置于温度为28℃人工气候箱中进行暗培养；种子芽愈伤诱导培养基的配方为：MS基本培养基+2,4-D 5mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
6)愈伤材料处理：出芽的种子诱导培养16天后长出愈伤，按此条件继续培养10天，待愈伤长至0.1厘米大小，将愈伤用无菌手术刀切下，弃掉芽和胚只留下透明紧实的愈伤；
7)愈伤诱导培养和愈伤继代培养：将透明紧实的愈伤接入愈伤诱导培养基上，放置于温度为28℃的人工气候箱中进行暗培养，30天后，愈伤长至0.5厘米，将其转接入愈伤继代诱导培养基上进行继代培养，经过30天的继代培养，待其长至0.8厘米、紧实、透明、颗粒饱满的愈伤时，即可进行分化培养；愈伤诱导培养基和愈伤继代培养基的配方为：MS基本培养基+2,4-D 5mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
8)分化培养：将上述诱导继代得到的0.8厘米紧实透明的愈伤整棵挑出，接入分化培养基中，放置在温度为28℃，光照强度为4000Lux的人工气候箱中进行光照分化培养；分化培养基的配方为：MS基本培养基+6-BA 4mg/L+ZT2mg/L+NAA 0.3mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
9)一次继代分化培养：分化培养30天后，愈伤长至1厘米，此时愈伤的形态为透明，表面微小膨松，出现细微淡绿，将愈伤中细微淡绿的部分转接到一次继代分化培养基中，放置在温度为28℃，光照强度为4000Lux的人工气候箱中进行一次继代分化培养；一次继代分化培养基的配方为：MS基本培养基+6-BA3mg/L+ZT 2mg/L+NAA 0.25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
10)二次继代分化培养：一次继代分化培养30天后，愈伤表面的绿色加深并出现绿色分化凸起点，将一次继代分化绿色凸起愈伤转接到二次继代分化培养基中，放置在人工气候箱中进行二次继代分化培养，二次继代分化培养的人工气候箱条件与一次继代分化培养的相同；二次继代分化培养基的配方为：MS基本培养基+6-BA 3mg/L+ZT 2mg/L+NAA0.25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
11)分化增殖培养：经二次继代分化培养5天后，绿色分化凸起的愈伤分化成苗，此时将人工气候箱的光照强度由4000Lux降至2500Lux，进行弱光培养，其它条件不变，培养14天后，整块愈伤中的分化苗伸长，此时分化苗纤细，略显黄，愈伤组织颜色加深，将整块愈伤和分化苗接入分化增殖培养基中，放置在温度为28℃，光照强度2500Lux的人工气候箱中进行光照分化增殖培养；分化增殖培养基的配方为：MS基本培养基+6-BA 4mg/L+NAA0.2mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
12)壮苗培养：分化增殖培养20天后，经过两次继代分化培养和分化增殖培养的愈伤和分化苗同时生长出少许丛苗，此时分化苗和丛生苗细长，茎纤细，茎节略大，叶片修长，叶片表面有绒毛，须根伸长，发达，已经展现出药野的外部特征；把细长分化苗和丛生苗切成独立苗，弃掉须根，接入壮苗培养基中进行壮苗生长培养，培养条件与分化增殖培养一致；壮苗培养基的配方为：MS基本培养基+TDZ 2mg/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
13)生根培养：壮苗培养20天后，经过壮苗培养的独立苗茎秆变粗，叶片加宽，叶片表面绒毛挺立，植株颜色深绿，组培瓶中的整株单苗矮壮，将独立单苗壮苗接入生根培养基中，放置在温度为28℃，光照强度3000Lux的人工气候箱中进行光照生根培养。生根培养基的配方为：MS基本培养基+NAA 0.25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖20g/L，pH＝5.8；
14)苗的锻炼培养：生根培养5天后，矮壮单苗根芽露白，根芽露白后2天，根芽长出，按此条件继续培养4天后，主根长1.2厘米，须根长出，5天后主根长至3厘米-4厘米，此时将生根苗从培养基中取出，用自来水将生根苗上的培养基冲洗干净后置于试管中，加入自来水后在温度为28℃，光照强度为3000Lux的光照培养箱中进行炼苗培养，加入自来水的量以淹没根部为宜；
15)苗的移栽：苗锻炼培养7天后，将光照培养箱中的锻炼苗取出，单苗移栽种植在事先准备好的水盆中进行生长培养；
16)苗的田间移栽和田间秧苗管理：移栽入水盆中的苗在温室中生长30天后，将秧苗移栽至田间，田间苗前期和中期保证水和肥的充足，生长中后期进行追肥，直到后期种子成熟收获。
在该实施例中云南景洪药用野生稻成熟种子的出愈伤率为30％，愈伤分化率在15％以上。
实施例二：云南临沧药用野生稻成熟种子快速繁殖培养
本实施例二用云南临沧药用野生稻成熟种子为实验材料，采用本方法获得了药用野生稻的再生植株。本实施例与实施例一基本相同，不同之处在于：
1)种子处理：将纸袋装好备用的种子取出，剥去其颖壳，留下完整的米粒，米粒用细砂纸将表皮磨干净，无菌水洗4遍，用滤纸吸干水份，放入三角瓶中，待用；
2)愈伤诱导培养：将待用表皮磨干净的种子无菌处理后，直接接入愈伤诱导培养基上，放置在温度为28℃的人工气候箱中进行愈伤诱导暗培养，愈伤诱导培养基的配方为：MS基本培养基+2,4-D 5mg/L+GA3 4mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
3)分化培养：将紧实透明愈伤整棵挑出，接入分化培养基中，放置在温度为28℃，光照强度4000Lux的人工气候箱中进行光照分化培养，分化培养基的配方为：MS基本培养基+6-BA 4mg/L+GA3 4mg/L+ZT 2mg/L+NAA 0.3mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
4)分化增殖培养：将分化培养的愈伤挑出，接入分化增殖培养基中，放置在温度为28℃，光照强度为4000Lux的人工气候箱中进行光照分化增殖培养，分化增殖培养基的配方为：MS基本培养基+6-BA 4mg/L+GA3 4mg/L+NAA0.3mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH＝5.8；
5)生根培养：将独立单苗壮苗接入生根培养基中，在温度为28℃，2500Lux光照培养箱中进行生根培养；生根培养基：MS基本培养基+NAA 0.25mg/L+活性炭3g/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖20g/L，pH＝5.8。
在该实施例中，云南临沧药用野生稻成熟种子诱导出愈伤率为20％，愈伤分化率在5.5％以上。
Claims (1)
1.一种用于药用野生稻保护繁育的方法，其特征在于具体步骤如下：
a. 外植体选择：外植体选择当年收获的成熟种子，用纸袋装好，备用；
b. 种子处理：将纸袋装好备用的种子取出，弃壳，剥离出完整的米粒，再用小型三角锉刀将米粒表面挫出浅凹或用细砂纸将种子的表皮磨干净并用无菌水洗4遍，用滤纸吸干水份，将处理后的米粒放入已灭菌的三角瓶中，待用；
c. 种子灭菌处理：将装有带凹面米粒的三角瓶置于无菌台中，用无菌水清洗种子2遍，再用体积百分比为75%酒精表面消毒1分钟，摇动三角瓶，倒掉，用体积百分比为0.1%的氯化汞灭菌15分钟，摇动三角瓶，倒掉，再用体积百分比为0.1%的氯化汞灭菌5分钟，摇动三角瓶，倒掉，用无菌水清洗6遍，无菌种子待用；
d. 种子催芽处理：将灭菌处理后的种子置于铺有无菌滤纸直径为50毫米的培养皿上，在培养皿中加入15mL无菌水后将其放置在温度为28℃的人工气候箱中进行暗培养，培养4天后种子露白，6天后种子长出小芽；
e. 种子芽愈伤诱导：将催芽处理后出芽的种子接入诱导培养基上，放置于温度为28℃的人工气候箱中进行暗培养；种子芽愈伤诱导培养基配方为：MS基本培养基+2,4-D 5mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8；
f. 愈伤材料处理：出芽的种子在28℃人工气候箱中暗培养16天后长出愈伤，按此条件继续培养10天，待愈伤长至0.1厘米，将愈伤用无菌手术刀切下，弃掉芽和胚只留下透明紧实的愈伤；
g. 愈伤诱导培养和愈伤继代培养：将透明紧实的愈伤接入愈伤诱导培养基上，放置于温度为28℃的人工气候箱中暗培养30天后，愈伤长至0.5厘米，将其转接入愈伤继代培养基上进行继代培养，经过30天的继代培养，待其长至0.8厘米、紧实、透明、颗粒饱满的愈伤时，即进行分化培养；愈伤诱导培养基和愈伤继代培养基配方为：MS基本培养基+2,4-D 5mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8；
h. 分化培养：将上述诱导继代得到的0 .8厘米紧实透明的愈伤整棵挑出，接入分化培养基中，放置在温度为28℃，光照强度为4000Lux的人工气候箱中进行光照分化培养；分化培养基配方为：MS基本培养基+6-BA 4mg/L+ZT2mg/L+NAA 0 .3mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8；
i. 一次继代分化培养：分化培养30天后，愈伤长至1厘米，此时愈伤的形态为：透明，表面微小膨松，出现细微淡绿；将愈伤中细微淡绿的部分转接到一次继代分化培养基中，放置在温度为28℃，光照强度4000Lux的人工气候箱中进行一次继代分化培养；一次继代分化培养基配方为：MS基本培养基+6-BA 3mg/L+ZT 2mg/L+NAA 0 .25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8；
j. 二次继代分化培养：一次继代分化培养30天后，愈伤表面的绿色加深并出现绿色分化凸起点，将一次继代分化的绿色凸起愈伤转接到二次继代分化培养基中，放置在人工气候箱中进行二次继代分化培养，二次继代分化培养的人工气候箱条件与一次继代分化培养的相同；二次继代分化培养基为：MS基本培养基+6-BA 3mg/L+ZT 2mg/L+NAA 0.25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8；
k. 分化增殖培养：二次继代分化培养5天后，绿色分化凸起的愈伤分化成苗，此时将人工气候箱的光照强度由4000Lux降至2500Lux，进行弱光培养，其他条件不变，培养14天后，整块愈伤中的分化苗伸长，此时分化苗纤细，略显黄，愈伤组织颜色加深，将整块愈伤和分化苗接入分化增殖培养基中，放置在温度为28℃，光照强度2500Lux的人工气候箱中进行光照分化增殖培养；分化增殖培养基配方为：MS基本培养基+6-BA 4mg/L+NAA 0.2mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8；
l. 壮苗培养：分化增殖培养20天后，经过两次继代分化培养和分化增殖培养的愈伤和分化苗同时生长出少许丛苗，此时分化苗和丛生苗细长，茎纤细，茎节略大，叶片修长，叶片表面有绒毛，须根伸长，发达，已经展现出药用野生稻的外部特征；把细长分化苗和丛生苗切成独立苗，弃掉须根，接入壮苗培养基中，进行壮苗生长培养，培养条件与分化增殖培养一致；壮苗培养基配方为：MS基本培养基+TDZ 2mg/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖30g/L，pH=5.8；
m. 生根培养：壮苗培养20天后，经过壮苗培养的独立苗茎秆变粗，叶片加宽，叶片表面绒毛挺立，植株颜色深绿，组培瓶中的整株单苗矮壮，将壮苗培养的独立单苗接入生根培养基中，放置在温度为28℃，光照强度3000Lux的人工气候箱中进行光照生根培养；生根培养基配方为：MS基本培养基+NAA 0.25mg/L+植物凝胶2.8g/L+蔗糖20g/L，pH=5.8；
n. 苗的锻炼培养：生根培养5天后，矮壮单苗根芽露白，根芽露白后2天，根芽长出，继续此条件培养4天后，主根长至1.2厘米，须根长出，5天后主根长至3厘米~4厘米，此时将生根苗从培养基中取出，用自来水将生根苗上的培养基冲洗干净后置于试管中，加入自来水后在温度为28℃，光照强度为3000Lux的光照培养箱中进行炼苗培养，加入自来水的量以淹没根部为宜；
o. 苗的温室移栽：苗锻炼培养7天后，将光照培养箱中的锻炼苗取出，单苗移栽种植在事先准备好的水盆中进行生长培养；
p. 苗的田间移栽和田间秧苗管理：移栽入水盆中的苗在温室中生长30天后，将秧苗移栽至田间，田间苗前期和中期保证水和肥的充足，生长中后期进行追肥，直到后期种子成熟收获。
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