CN112470929A - 大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法,属于植物离体培养技术领域。大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法,具体方法为:a、取大花红景天种子,经消毒后,培养获得无菌苗;b、选择无菌苗的根颈顶端组织为外植体进行培养,获得愈伤组织;c、选取继代培养的愈伤组织进行诱导分化,获得丛生芽;d选取继代培养的丛生芽,将丛生芽从基部切开,将带有芽点的组织转接到生根培养基培养,得到生根无菌苗;e、将生根无菌苗培养至幼苗长出2~4片新叶,进行移栽,得到再生植株。本专利利用大花红景天种子培育无菌苗,以植株地上根颈顶端组织为外植体进行诱导,不需二次消毒,减少外植体损伤,提高了愈伤组织诱导率和增殖率。
Description
技术领域
本发明涉及大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法,属于植物离体培养技术领域。
背景技术
大花红景天(Rhodiola crenulata(Hook.f.et Thoms.)H.Ohba.)是红景天属植物中的珍品,被誉为“高原人参”,为《中国药典》收录的唯一基原植物,野生资源主要生长于川西高原、西藏和滇西北海拔4000m以上高海拔山区的流石滩上或石缝中,其生境特殊、生长缓慢、繁殖困难、更新周期漫长。近年来,随着国内外市场需求量增加,红景天野生资源遭到掠夺式采挖,资源面临枯竭,大花红景天等红景天属多种植物已被列为国家Ⅱ级濒危保护植物,因此,急需开展大花红景天的人工快速繁育工作。其中,通过愈伤组织诱导再分化可产生大量可分化的愈伤组织,是快速、大量繁育大花红景天的理想方案。
目前,利用愈伤组织途径进行大花红景天的再生,普遍存在愈伤组织诱导率低、培养基成本高等问题,比如申请号为201710671226.8的专利《一种大花红景天的离体培养联合用培养基及离体培养方法》公开了一种采用大花红景天的离体培养方法。其采用叶片培养愈伤组织,而叶片需要在灭菌后进行培养,从而影响了其愈伤组织的诱导率和增值率,造成愈伤组织诱导率低的问题。本专利为经过种子培育无菌苗,优化后诱导愈伤组织的外植体为植株根颈顶端组织,不需二次消毒,减少外植体损伤,提高了愈伤组织诱导率、增殖率;本专利优化了愈伤组织诱导、生芽、生根的培养基及激素,形成了大花红景天根颈顶端组织再生植株技术,可快速实现工厂化种苗生产,降低种苗繁育成本。
发明内容
针对大花红景天的离体培养方法,本发明解决的第一个技术问题是提供一种愈伤组织诱导率高且分化、增殖率高的离体培养方法。
大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法,按以下步骤进行:
a、取大花红景天种子,经消毒后,接种至无菌苗培养基中进行培养,获得无菌苗;
b、选择无菌苗的根颈顶端组织为外植体,接种于愈伤组织诱导培养基中培养,获得愈伤组织,再将愈伤组织转移至增殖培养基中进行继代培养;所述根颈顶端组织为根颈靠近芽端0.5~2cm的组织;
c、选取继代培养的愈伤组织在分化培养基中进行诱导分化,获得丛生芽;并进行继代培养;
d选取继代培养的丛生芽,将丛生芽从基部切开,将带有芽点的组织转接到生根培养基培养,得到生根无菌苗;
e、将生根无菌苗培养至幼苗长出2~4片新叶,进行移栽,得到再生植株。
在一种实施方式中,无菌苗培养基的配制方法为:以1/2MS培养基为基底,添加蔗糖和琼脂,再调整pH为5~6,即得;蔗糖添加量为1/2MS培养基总量的2.5~3.5wt%,琼脂添加量为1/2MS培养基总量的0.5~1.5wt%;
愈伤组织诱导培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、2,4-D、6-BA、KT和IAA,再调整pH至5.5~6,即得;蔗糖添加量为MS培养基总量的2.5~3.5wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.5~1.5wt%;配制好的愈伤组织诱导培养基中,2,4-D的浓度为0.5~3.5mg·L-1、6-BA的浓度为1.0~3.5mg·L-1、KT的浓度为0.1~1mg·L-1、IAA的浓度为0.2~1mg·L-1;优选的,配制好的愈伤组织诱导培养基中,2,4-D的浓度为1.0~2.0mg·L-1、6-BA的浓度为1.0~2.0mg·L-1、KT的浓度为0.2~0.8mg·L-1、IAA的浓度为0.2~1.0mg·L-1;
所述愈伤组织诱导培养基与增殖培养基相同;
分化培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、6-BA和IAA,再调整pH至5.5~6;蔗糖添加量为MS培养基总量的2.5~3.5wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.8~1.0wt%;分化培养基中,6-BA的浓度为2.0~3.0mg·L-1、IAA的浓度为0.1~0.5mg·L-1;
生根培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、IBA、NAA和IAA,再调整pH至5.5~6;蔗糖添加量为MS培养基总量的2.5~3.5wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.5~1.0wt%;生根培养基中,IBA的浓度为0.5~1.5mg·L-1、NAA的浓度为0.1~1.0mg·L-1、IAA的浓度为0.1~1.0mg·L-1。
在一种具体的实施方式中:
无菌苗培养基的配制方法为:以1/2MS培养基为基底,添加蔗糖和琼脂,再调整pH为5.4,即得;蔗糖添加量为1/2MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为1/2MS培养基总量的0.9wt%;
愈伤组织诱导培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、2,4-D、6-BA、KT和IAA,再调整pH至5.8,即得;蔗糖添加量为MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.9wt%;配制好的愈伤组织诱导培养基中,2,4-D的浓度为1.5mg·L-1、6-BA的浓度为1.5mg·L-1、KT的浓度为0.5mg·L-1、IAA的浓度为0.20mg·L-1;
分化培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、6-BA和IAA,再调整pH至5.8;蔗糖添加量为MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.9wt%;分化培养基中,6-BA的浓度为2.5mg·L-1、IAA的浓度为0.25mg·L-1;
生根培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、IBA、NAA和IAA,再调整pH至5.8;蔗糖添加量为MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.8wt%;生根培养基中,IBA的浓度为1.00mg·L-1、NAA的浓度为0.20mg·L-1、IAA的浓度为0.50mg·L-1。
在一种实施方式中:
步骤a中,无菌苗培养条件为:湿度为70~80%;每天置于光照下10~14h,黑暗下10~14h;优选的,无菌苗培养条件为:每天置于光照下12h,黑暗下12h;
步骤b中,愈伤组织培养条件为:湿度70~80%,每天置于光照下6~10h、黑暗下14~18h;所述愈伤组织的继代培养条件与愈伤组织培养条件相同;优选的,愈伤组织培养条件为:每天置于光照下8h、黑暗下16h;
步骤c中,丛生芽培养条件为:湿度70~80%、每天置于光照下14~18h、黑暗下6~10h;所述丛生芽的继代培养条件与丛生芽培养条件相同;优选的,丛生芽培养条件为:每天置于光照下16h、黑暗下8h;
步骤d中,生根无菌苗培养条件为:湿度70~80%、每天置于光照下10~14h、黑暗下10~14h;优选的,生根无菌苗培养条件为:每天置于光照下12h、黑暗下12h;
其中,所述光照时,光照强度2000~2500lx,环境温度为20±1℃;黑暗时,环境温度为10±1℃。
在一种实施方式中:
步骤a中,种子消毒方法为:取大花红景天种子,用灭菌的水浸湿后,流水冲洗,再吸干种子表面水分;再在无菌条件下,用酒精浸泡20~30s,无菌水冲洗5~6次,吸干种子表面水分,用HgCl溶液浸泡6~8min,无菌水冲洗5~6次,吸干种子表面水分,在超净工作台接种至无菌苗培养基;优选的,酒精浓度为75%;HgCl溶液的浓度为0.1wt%。
在一种实施方式中:步骤b中,种子播种后,选择生长25~30d的无菌苗的根颈顶端组织用于诱导愈伤组织;将愈伤组织转移至增殖培养基中进行继代增殖时,选取根颈顶端组织诱导18~25d的愈伤组织;优选诱导时间为20~22d的愈伤组织。
在一种实施方式中:步骤c中,选择疏松颗粒状的愈伤组织诱导丛生芽;优选的,选取继代次数为3代的继代培养的愈伤组织诱导丛生芽,以20~22d为一代。
在一种实施方式中:步骤c中,丛生芽继代培养的方法为:按照丛生芽的培养方法,30d后进行继代培养,以25~30d为一代,继代2次,获得植株健壮、基生叶多的大花红景天丛生芽。
在一种实施方式中:步骤d中,选择植株健壮、基生叶多的丛生芽用来培养生根无菌苗;优选的,选择继代2次的丛生芽用来培养生根无菌苗。
在一种实施方式中:步骤e中,将生根无菌苗转瓶培养20~25d得到加强生根苗,待苗高2~3cm时打开瓶口在大花红景天适宜区域,室温下炼苗7~14d后,然后用蒸馏水清洗根部,移入盛有基质的穴盘中,在湿度65~75%的条件下,遮阳度为60~65%条件下培养,待幼苗长出2~4片新叶,移栽至大田;其中,转瓶培养的培养基与生根培养基一致。
本发明的有益效果:
1、本专利为经过种子培育无菌苗,筛选并优化无菌苗外植体,优化后外植体为植株地上根颈顶端组织,不需二次消毒,减少外植体损伤,提高了愈伤组织诱导率和增殖率。
2、本专利采用根茎顶端作为外植体诱导愈伤组织,出愈率高达98%,诱导成的愈伤组织增殖率可达到40倍。
3、本发明整个培养的不同阶段的培养基,选用特定的诱导激素,成本低,培养效果好。
4、本发明的方法可以快速获得大花红景天再生植株,实现工厂化种苗生产。
附图说明
图1为采用大花红景天的根茎顶端为外植体诱导愈伤组织实物图;
图2为采用大花红景天的叶片为外植体诱导愈伤组织实物图;
图3为采用大花红景天的茎段为外植体诱导愈伤组织实物图;
图4为大花红景天不同外植体诱导愈伤组织比较(a为茎、b为根颈顶端组织、c为叶);
图5为大花红景天丛生芽诱导过程图;其中a为愈伤组织,b为丛生芽诱导,c为丛生芽的继代培养;
图6为大花红景天生根诱导实物图。
具体实施方式
大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法,按以下步骤进行:
a、取大花红景天种子,经消毒后,接种至无菌苗培养基中进行培养,获得无菌苗;
b、选择无菌苗的根颈顶端组织为外植体,接种于愈伤组织诱导培养基中培养,获得愈伤组织,再将愈伤组织转移至增殖培养基中进行继代培养;所述根颈顶端组织为根颈靠近芽端0.5~2cm的组织;
c、选取继代培养的愈伤组织在分化培养基中进行诱导分化,获得丛生芽;并进行继代培养;
d选取继代培养的丛生芽,将丛生芽从基部切开,将带有芽点的组织转接到生根培养基培养,得到生根无菌苗;
e、将生根无菌苗培养至幼苗长出2~4片新叶,进行移栽,得到再生植株。
其中,本发明所述的大花红景天种子为:8~9月采集的成熟种子,并于室内自然干燥,阴凉保存。
本发明经过种子培育无菌苗,筛选无菌苗外植体,优化后外植体为植株根颈顶端组织,不需二次消毒,减少外植体损伤,提高愈伤组织诱导率和增殖率。选用植株根颈顶端组织进行诱导,相比于叶片和茎段,其诱导率更高。
在一种实施方式中:
无菌苗培养基的配制方法为:以1/2MS培养基为基底,添加蔗糖和琼脂,再调整pH为5~6,即得;蔗糖添加量为1/2MS培养基总量的2.5~3.5wt%,琼脂添加量为1/2MS培养基总量的0.5~1.5wt%;
愈伤组织诱导培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、2,4-D、6-BA、KT和IAA,再调整pH至5.5~6,即得;蔗糖添加量为MS培养基总量的2.5~3.5wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.5~1.5wt%;配制好的愈伤组织诱导培养基中,2,4-D的浓度为0.5~3.5mg·L-1、6-BA的浓度为1.0~3.5mg·L-1、KT的浓度为0.1~1.0mg·L-1、IAA的浓度为0.2~1.0mg·L-1;优选的,配制好的愈伤组织诱导培养基中,2,4-D的浓度为1.0~2.0mg·L-1、6-BA的浓度为1.0~2.0mg·L-1、KT的浓度为0.2~0.8mg·L-1、IAA的浓度为0.2~1.0mg·L-1;
所述愈伤组织诱导培养基与增殖培养基相同;
分化培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、6-BA和IAA,再调整pH至5.5~6;蔗糖添加量为MS培养基总量的2.5~3.5wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.8~1.0wt%;分化培养基中,6-BA的浓度为2.0~3.0mg·L-1、IAA的浓度为0.1~0.5mg·L-1;
所述丛生芽的继代培养基与分化培养基相同。
生根培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、IBA、NAA和IAA,再调整pH至5.5~6;蔗糖添加量为MS培养基总量的2.5~3.5wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.5~1.0wt%;生根培养基中,IBA的浓度为0.5~1.5mg·L-1、NAA的浓度为0.1~1.0mg·L-1、IAA的浓度为0.1~1.0mg·L-1。
在一种具体的实施方式中:
为了提高出芽率,无菌苗培养基的配制方法为:以1/2MS培养基为基底,添加蔗糖和琼脂,再调整pH为5.4,即得;蔗糖添加量为1/2MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为1/2MS培养基总量的0.9wt%;
为了提高诱导率,愈伤组织诱导培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、2,4-D、6-BA、KT和IAA,再调整pH至5.8,即得;蔗糖添加量为MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.9wt%;配制好的愈伤组织诱导培养基中,2,4-D的浓度为1.5mg·L-1、6-BA的浓度为1.5mg·L-1、KT的浓度为0.5mg·L-1、IAA的浓度为0.20mg·L-1;
分化培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、6-BA和IAA,再调整pH至5.8;蔗糖添加量为MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.9wt%;分化培养基中,6-BA的浓度为2.5mg·L-1、IAA的浓度为0.25mg·L-1;
生根培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、IBA、NAA和IAA,再调整pH至5.8;蔗糖添加量为MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.8wt%;生根培养基中,IBA的浓度为1.00mg·L-1、NAA的浓度为0.20mg·L-1、IAA的浓度为0.50mg·L-1。
其中,2,4-D具体指生长素2,4-二氯苯氧乙酸;6-BA具体指6-苄基嘌呤;KT具体指激动素;IAA具体指吲哚乙酸;IBA具体指吲哚丁酸;NAA具体指萘乙酸。
所述1/2MS、MS培养基配方见表1、表2所示:
表1 1/2MS培养基配方
表2 MS培养基配方
在一种实施方式中:
步骤a中,无菌苗培养条件为:湿度为70~80%;每天置于光照下10~14h,黑暗下10~14h;优选的,无菌苗培养条件为:每天置于光照下12h,黑暗下12h;
步骤b中,愈伤组织培养条件为:湿度70~80%,每天置于光照下6~10h、黑暗下14~18h;优选的,愈伤组织培养条件为:每天置于光照下8h、黑暗下16h;
所述愈伤组织的继代培养条件与愈伤组织培养条件相同;
步骤c中,丛生芽培养条件为:湿度70~80%、每天置于光照下14~18h、黑暗下6~10h;优选的,丛生芽培养条件为:每天置于光照下16h、黑暗下8h;
所述丛生芽的继代培养条件与丛生芽培养条件相同;
步骤d中,生根无菌苗培养条件为:湿度70~80%、每天置于光照下10~14h、黑暗下10~14h;优选的,生根无菌苗培养条件为:每天置于光照下12h、黑暗下12h;
其中,上述步骤在光照下时,光照强度2000~2500lx,环境温度为20±1℃;黑暗下时,环境温度为10±1℃。
在一种实施方式中,步骤a中,种子消毒方法为:取大花红景天种子,用灭菌的水浸湿后,流水冲洗,再吸干种子表面水分;再在无菌条件下,用酒精浸泡20~30s,无菌水冲洗5~6次,吸干种子表面水分,用HgCl溶液浸泡6~8min,无菌水冲洗5~6次,吸干种子表面水分,在超净工作台接种至无菌苗培养基;优选的,酒精浓度为75%;HgCl溶液的浓度为0.1wt%。
在一种实施方式中:步骤a中,种子播种后,5d后开始发芽,15d后形成无菌苗。选择生长25~30d的无菌苗的根颈顶端组织用于诱导愈伤组织。
步骤b中,无菌苗的根颈顶端组织接种于愈伤组织诱导培养基中培养,9~10d即开始产生愈伤组织,18d后产生的愈伤组织为黄绿色呈颗粒状,增殖迅速,且组织结构比较紧密,有利于进一步分化培养。
将愈伤组织转移至增殖培养基中进行继代培养时,选取根颈顶端组织诱导18~25d的愈伤组织;优选的诱导时间为20~22d的愈伤组织。
以20~22d为一代,愈伤组织连续增殖三代后得到大量的所述的疏松颗粒状愈伤组织。
在一种实施方式中,步骤c中,选择愈伤组织连续增殖三代后的愈伤组织诱导丛生芽,培养18~20d开始出芽,30d左右可获得大花红景天丛生芽。
按照丛生芽的培养方法,30d后进行丛生芽的继代培养,以25~30d为一代,继代2次,获得植株健壮、基生叶多的大花红景天丛生芽。
在一种实施方式中,步骤d中,选取的继代培养次数为2次的丛生芽诱导生根。更优选的,选取继代培养2次中的叶片发育完整、厚实、基生叶多的丛生芽。经过25~30d培养,丛生芽基部开始有根系形成,45d后可形成大花红景天生根无菌苗。
在一种实施方式中,步骤d中,将生根无菌苗转瓶培养20~25d得到加强生根苗,待苗高2~3cm时打开瓶口,在大花红景天适宜区域,室温下炼苗5~14d后,然后用蒸馏水清洗根部,移入盛有基质的穴盘中,在湿度65~75%的条件下,遮阳度为60~65%条件下培养,待幼苗长出2~4片新叶,移栽至大田;其中,转瓶培养的培养基与生根培养基一致。
其中在具体的实施方式中,所述育苗基质可以为:耕作土、腐熟牛粪、蛭石按照4:2:1配置育苗基质。
所述大花红景天适宜区域优选为青藏高原海拔3000~3800m。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述,并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
一、培养基的配制
无菌苗培养基的配制方法为:以1/2MS培养基为基底,添加蔗糖和琼脂,再调整pH为5.4,即得;蔗糖添加量为1/2MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为1/2MS培养基总量的0.9wt%;
愈伤组织诱导培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、2,4-D、6-BA、KT和IAA,再调整pH至5.8,即得;蔗糖添加量为MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.9wt%;配制好的愈伤组织诱导培养基中,2,4-D的浓度为1.5mg·L-1、6-BA的浓度为1.5mg·L-1、KT的浓度为0.5mg·L-1、IAA的浓度为0.20mg·L-1;
所述愈伤组织诱导培养基与增殖培养基相同;
分化培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、6-BA和IAA,再调整pH至5.8;蔗糖添加量为MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.9wt%;分化培养基中,6-BA的浓度为2.5mg·L-1、IAA的浓度为0.25mg·L-1;
生根培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、6-BA和IAA,再调整pH至5.8;蔗糖添加量为MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.8wt%;分化培养基中,IBA的浓度为1.00mg·L-1、NAA的浓度为0.20mg·L-1、IAA的浓度为0.50mg·L-1。
二、培养方法
1、大花红景天种子收集与保存
8月~9月采集大花红景天成熟的种子,室内自然干燥,并阴凉保存。
2、大花红景天种子无菌苗培养
2.1种子消毒
取去除杂质且饱满的红景天种子,用灭菌的蒸馏水浸湿后,流水冲洗30分钟,无菌滤纸吸干种子表面水分。无菌条件下,用75%酒精浸泡30s,无菌水冲洗6次,滤纸擦干,用0.1%HgCl浸泡5min,无菌水冲洗6次,滤纸擦干吸干,在超净工作台接种至培养基。
2.2无菌苗培养
将2.1处理后的种子接种至无菌苗培养基中进行培养。培养条件:湿度75%、每天光照下12h(光照强度为2000lx,环境温度为20±1℃),黑暗下12h(黑暗时:环境温度为10±1℃)。
3、愈伤组织诱导及增殖培养
3.1愈伤组织诱导
选择采用2.2培养方法培养25d的大花红景天无菌苗,取无菌苗的根颈顶端组织为外植体,在愈伤组织诱导培养基中进行培养。培养条件:湿度75%、每天光照下8h(其中,光照时,光照强度2000lx,环境温度为20±1℃)、黑暗下16h(环境温度为10±1℃)。培养9~10d开始产生愈伤组织,18~20d后产生的愈伤组织黄绿色呈颗粒状,增殖迅速,且组织结构比较紧密,有利于进一步分化培养。
3.2愈伤组织的增殖
选择3.1培养的大花红景天根颈顶端组织作为外植体诱导20d左右的愈伤组织,在增殖培养基进行增殖培养;培养条件:湿度75%、每天光照下8h,光照强度2000lx,环境温度为20±1℃、黑暗下16h(环境温度10℃±1℃)。
以20~22d为一代,连续增殖三代得到大量的所述的疏松颗粒状愈伤组织。
4、大花红景天丛生芽分化诱导
4.1丛生芽诱导
以3.2继代培养的愈伤组织,在分化培养基中进行诱导分化。
培养条件:湿度75%、每天光照16h(其中,光照强度2000lx,环境温度:20±1℃)、黑暗8h(环境温度10℃±1℃),培养18~20d开始出芽,30d左右可获得大花红景天丛生芽。
4.2继代培养
按照4.1中培养,30d后应转瓶进行继代培养(继代培养基与分化培养基相同),继代培养30d,以30d为一代,连续继代2次,可诱导获得的丛生芽植株健壮、基生叶多的大花红景天丛生芽。
5、大花红景天丛生芽生根培养
以4.2中分化、继代培养2次丛生芽,选择叶片发育完整、厚实、基生叶多的丛生芽,将丛生芽从基部切开,将带有芽点的组织转接到生根培养基。
培养条件:湿度75%、每天光照12h(其中,光照强度为2000lx,环境温度:20±1℃)、黑暗12h(环境温度:10℃±1℃)。经过25~30d丛生芽基部开始有根系形成,45d后可形成大花红景天生根无菌苗。
6、大花红景天再生苗移栽
将5中无菌苗转瓶培养20d左右得到加强生根苗,待苗高2~3cm时打开瓶口在大花红景天适宜区域(青藏高原海拔3000~3800m)室温下炼苗5~7d后,然后用蒸馏水清洗根部,移入盛有基质的穴盘中,在湿度65~75%,遮阳度为60~65%的条件下散光培养,待幼苗长出3~4片新叶,进行移栽。
对比例1(用叶片培养愈伤组织)
在实施例1的基础上,仅步骤二(培养方法)中的3.1(愈伤组织诱导)步骤不同,其余工艺包括培养基的配制以及培养方法均与实施例1一致。
本对比例愈伤组织诱导步骤为:选择采用2.2培养方法培养25d的大花红景天无菌苗,取大花红景天叶片组织为外植体,在愈伤组织培养基中进行培养,培养条件:湿度75%、每天光照强度2000lx光照8h(20±1℃)、16h黑暗(10℃±1℃)。培养9~10d开始出现愈伤,23~25d后产生的愈伤组织黄绿色呈颗粒状。
对比例2(用茎段培养愈伤组织)
在实施例1的基础上,仅步骤二(培养方法)中3.1(愈伤组织诱导)步骤不同,其余工艺包括培养基的配制以及培养方法均与实施例1一致。
本对比例愈伤组织诱导步骤为:选择采用2.2培养方法培养25d的大花红景天无菌苗,取大花红景天茎段组织为外植体,在愈伤组织培养基中进行培养,培养条件:湿度75%、每天光照强度2000lx光照8h(20±1℃)、16h黑暗(10℃±1℃)。培养12~13d开始出现愈伤,切口处增厚且颗粒状,22~25d后产生的愈伤组织黄绿色呈颗粒状,形态较小。
对比例3(直接取田里的大花红景天的根颈顶端组织进行消毒后,用于培养愈伤组织)
在实施例1的基础上,仅步骤二(培养方法)中的步骤1(大花红景天种子收集与保存)和步骤2(大花红景天种子无菌苗培养)不同,其余工艺包括培养基的配制以及培养方法与实施例1一致。
将实施例1的培养方法中的步骤1和2修改为:取大花红景天地上根颈顶端组织,灭菌后,作为外植体,再按实施例1的步骤二(培养方法)中的步骤3(愈伤组织诱导及增殖培养)进行操作。
选择灭菌后的大花红景天根颈顶端组织为外植体,在愈伤组织诱导培养基中进行培养,培养条件:湿度75%、每天光照强度2000lx,8h(20±1℃)、16h黑暗(10℃±1℃)。培养9~10d开始出现愈伤,切口处增厚且颗粒状,18~20d后产生的愈伤组织黄绿色呈颗粒状,增殖迅速,团块大,且组织结构比较紧密。
试验例1按实施例1、对比例1~2不同外植体诱导愈伤组织的试验方法进行试验,共进行5次重复试验,统计其诱导率如表3所示。
表3不同外植体诱导愈伤组织的诱导率即出愈率
通过试验,由表3可见:大花红景天茎、叶片、根颈顶端3种组织作为外植体诱导愈伤组织,具有显著性差异,愈伤组织平均诱导率以根颈顶端组织最大86.83%、叶片次之61.80%、茎最低56.00%。试验过程中,根颈顶端组织最高可达98%。
愈伤组织转入继代培养基后,继代培养20~22d后,愈伤组织团块以根颈顶端组织外植体为佳,愈伤组织呈颗粒状,分化、增殖速度快,根颈顶端组织诱导的愈伤组织块体积是叶片诱导的2~4倍;是茎诱导的4~6倍。
以大花红景天根颈顶端组织诱导的愈伤组织诱导丛生芽,诱导率为85~90%,丛生芽诱导生根诱导率平均为72.00%,最高可达86%。
试验例2按实施例1、对比例3的方法进行试验,共进行5次重复试验;统计不同处理方法得到的根茎顶端组织诱导愈伤组织的诱导率如表4所示。
表4不同外植体诱导愈伤组织的诱导率即出愈率
外植体 | 出愈率 | 说明 |
田间大花红景天根颈顶端组织 | 46±5.83 | 诱导过程中外植体发霉率较高,诱导率低,增殖速度慢 |
无菌苗根颈顶端组织 | 86.83±8.01 | 发霉率低,诱导率高 |
实施例2不同培养基基底及pH值对无菌苗发芽率的影响
按照下表5配制不同的无菌苗培养基,再取实施例1中步骤2.1(种子消毒)处理后的大花红景天种子按照实施例1中的2.2(无菌苗培养)进行培养。每组试验各使用100颗种子,共进行三次重复试验。
培养5d后,观察不同培养基的发芽率,其中,发芽率=发芽的种子数/播种的种子数*100%。
经统计后,发芽率具体数值如下表5所示。
表5培养基基底、pH值对无菌苗发芽的影响
由表5可见,pH值对大花红景天无菌苗获得具有重要影响,通过试验确定以1/2MS培养基,pH5.4进行种子无菌培养,发芽率最高。
实施例3
按照下表6和表7配制不同的愈伤组织诱导培养基。再选择实施例1中2.2(无菌苗培养)培养25d的大花红景天无菌苗的根颈顶端组织为外植体,在不同的愈伤组织诱导培养基中进行培养,培养条件:湿度75%、每天光照强度2000lx光照8h(20±1℃)、16h黑暗(10℃±1℃)。
愈伤组织诱导培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、2,4-D、6-BA、KT和IAA,再调整pH至5.8,即得;其中,蔗糖添加量为MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.9wt%;2,4-D、6-BA、KT和IAA的浓度如下表6和表7所示。
不同培养基分别进行5次重复试验。培养25d天后,计算不同培养基的诱导率,如下表7所示。
本实验设置4因素4水平试验,如下表6所示;不同培养基的诱导率如表7所示;正交试验极差分析如表8所示。
表6因素水平表
表7不同激素水平对大花红景天愈伤组织诱导率
表8正交试验极差分析
激素筛选结果表明,1)正交试验A11组(A2B3C4D4)优势明显,出愈为95.00%,2)正交试验极差分析表明,最优获得的愈伤组织的激素组合为A2B2C3D2,对愈伤组织诱导影响大小依次:IAA>KT>2,4-D>6-BA,其中IAA对出愈率影响最大。
改变IAA的用量制得3组不同的愈伤组织诱导培养基,再选择实施例1中2.2培养25d的大花红景天无菌苗根颈顶端组织为外植体,在愈伤组织培养基中进行培养,不同培养基分别进行5次重复试验。培养条件:湿度75%、每天光照强度2000lx光照8h(20±1℃)、16h黑暗(10℃±1℃)。对应的出愈率及愈伤组织形态如下表9所示:
表9 IAA浓度对愈伤组织出愈率
优化试验表明,3种浓度的IAA对愈伤组织出愈率无显著差异(p=0.99>0.05);IAA为0.50mg·L-1时愈伤组织诱导后易老化褐变;0.2mg·L-1愈伤组织呈颗粒状、形态小;0.25mg·L-1愈伤组织呈颗粒状,增殖迅速。
Claims (10)
1.大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法,其特征在于,按以下步骤进行:
a、取大花红景天种子,经消毒后,接种至无菌苗培养基中进行培养,获得无菌苗;
b、选择无菌苗的根颈顶端组织为外植体,接种于愈伤组织诱导培养基中培养,获得愈伤组织,再将愈伤组织转移至增殖培养基中进行继代培养;所述根颈顶端组织为根颈靠近芽端0.5~2cm的组织;
c、选取继代培养的愈伤组织在分化培养基中进行诱导分化,获得丛生芽;并进行继代培养;
d选取继代培养的丛生芽,将丛生芽从基部切开,将带有芽点的组织转接到生根培养基培养,得到生根无菌苗;
e、将生根无菌苗培养至幼苗长出2~4片新叶,进行移栽,得到再生植株。
2.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法,其特征在于,
无菌苗培养基的配制方法为:以1/2MS培养基为基底,添加蔗糖和琼脂,再调整pH为5~6,即得;蔗糖添加量为1/2MS培养基总量的2.5~3.5wt%,琼脂添加量为1/2MS培养基总量的0.5~1.5wt%;
愈伤组织诱导培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、2,4-D、6-BA、KT和IAA,再调整pH至5.5~6.0,即得;蔗糖添加量为MS培养基总量的2.5~3.5wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.5~1.5wt%;配制好的愈伤组织诱导培养基中,2,4-D的浓度为0.5~3.5mg·L-1、6-BA的浓度为1.0~3.5mg·L-1、KT的浓度为0.1~1.0mg·L-1、IAA的浓度为0.2~1.0mg·L-1;优选的,配制好的愈伤组织诱导培养基中,2,4-D的浓度为1.0~2.0mg·L-1、6-BA的浓度为1.0~2.0mg·L-1、KT的浓度为0.2~0.8mg·L-1、IAA的浓度为0.2~1.0mg·L-1;
所述愈伤组织诱导培养基与增殖培养基相同;
分化培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、6-BA和IAA,再调整pH至5.5~6;蔗糖添加量为MS培养基总量的2.5~3.5wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.8~1.0wt%;分化培养基中,6-BA的浓度为2.0~3.0mg·L-1、IAA的浓度为0.1~0.5mg·L-1;
生根培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、IBA、NAA和IAA,再调整pH至5.5~6;蔗糖添加量为MS培养基总量的2.5~3.5wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.5~1.0wt%;生根培养基中,IBA的浓度为0.5~1.5mg·L-1、NAA的浓度为0.1~1.0mg·L-1、IAA的浓度为0.1~1.0mg·L-1。
3.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织获得再生植株的方法,其特征在于,
无菌苗培养基的配制方法为:以1/2MS培养基为基底,添加蔗糖和琼脂,再调整pH为5.4,即得;蔗糖添加量为1/2MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为1/2MS培养基总量的0.9wt%;
愈伤组织诱导培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、2,4-D、6-BA、KT和IAA,再调整pH至5.8,即得;蔗糖添加量为MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.9wt%;配制好的愈伤组织诱导培养基中,2,4-D的浓度为1.5mg·L-1、6-BA的浓度为1.5mg·L-1、KT的浓度为0.5mg·L-1、IAA的浓度为0.20mg·L-1;
分化培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、6-BA和IAA,再调整pH至5.8;蔗糖添加量为MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.9wt%;分化培养基中,6-BA的浓度为2.5mg·L-1、IAA的浓度为0.25mg·L-1;
生根培养基的配制方法为:以MS培养基为基底,添加蔗糖、琼脂、IBA、NAA和IAA,再调整pH至5.8;蔗糖添加量为MS培养基总量的3wt%,琼脂添加量为MS培养基总量的0.8wt%;生根培养基中,IBA的浓度为1.00mg·L-1、NAA的浓度为0.20mg·L-1、IAA的浓度为0.50mg·L-1。
4.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织快速获得再生植株的方法,其特征在于:
步骤a中,无菌苗培养条件为:湿度为70~80%;每天置于光照下10~14h,黑暗下10~14h;优选的,无菌苗培养条件为:每天置于光照下12h,黑暗下12h;
步骤b中,愈伤组织培养条件为:湿度70~80%,每天置于光照下6~10h、黑暗下14~18h;所述愈伤组织的继代培养条件与愈伤组织培养条件相同;优选的,愈伤组织培养条件为:每天置于光照下8h、黑暗下16h;
步骤c中,丛生芽培养条件为:湿度70~80%、每天置于光照下14~18h、黑暗下6~10h;所述丛生芽的继代培养条件与丛生芽培养条件相同;优选的,丛生芽培养条件为:每天置于光照下16h、黑暗下8h;
步骤d中,生根无菌苗培养条件为:湿度70~80%、每天置于光照下10~14h、黑暗下10~14h;优选的,生根无菌苗培养条件为:每天置于光照下12h、黑暗下12h;
其中,所述光照时,光照强度2000~2500lx,环境温度为20±1℃;黑暗时,环境温度为10±1℃。
5.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织快速获得再生植株的方法,其特征在于,步骤a中,种子消毒方法为:取大花红景天种子,用灭菌的水浸湿后,流水冲洗,再吸干种子表面水分;再在无菌条件下,用酒精浸泡20~30s,无菌水冲洗5~6次,吸干种子表面水分,用HgCl溶液浸泡6~8min,无菌水冲洗5~6次,吸干种子表面水分,在超净工作台接种至无菌苗培养基;优选的,酒精浓度为75%;HgCl溶液的浓度为0.1wt%。
6.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织快速获得再生植株的方法,其特征在于:
步骤b中,种子播种后,选择生长25~30d的无菌苗的根颈顶端组织用于诱导愈伤组织;
将愈伤组织转移至增殖培养基中进行继代时,选取根颈顶端组织诱导18~25d的愈伤组织;优选诱导时间为20~22d的愈伤组织。
7.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织快速获得再生植株的方法,其特征在于,步骤c中,选择疏松颗粒状的愈伤组织诱导丛生芽;优选的,选取继代次数为3代的继代培养的愈伤组织诱导丛生芽,以20~22d为一代。
8.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织快速获得再生植株的方法,其特征在于,步骤c中,丛生芽继代培养的方法为:按照丛生芽的培养方法,30d后进行继代培养,以25~30d为一代,继代2次,获得植株健壮、基生叶多的大花红景天丛生芽。
9.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织快速获得再生植株的方法,其特征在于,步骤d中,选择植株健壮、基生叶多的丛生芽用来培养生根无菌苗;优选的,选择继代2次的丛生芽用来培养生根无菌苗。
10.根据权利要求1所述的大花红景天根颈顶端组织快速获得再生植株的方法,其特征在于,步骤e中,将生根无菌苗转瓶培养20~25d得到加强生根苗,待苗高2~3cm时打开瓶口在大花红景天适宜区域,室温下炼苗7~14d后,然后用蒸馏水清洗根部,移入盛有基质的穴盘中,在湿度65~75%的条件下,遮阳度为60~65%条件下培养,待幼苗长出2~4片新叶,移栽至大田;其中,转瓶培养的培养基与生根培养基一致。
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