CN107439376A - 一种大花红景天的离体培养联合用培养基及离体培养方法 - Google Patents
一种大花红景天的离体培养联合用培养基及离体培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种大花红景天的离体培养联合用培养基，它包括愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代培养基、芽分化培养基、芽增殖培养基和生根培养基。本发明还提供一种大花红景天的离体培养方法。本发明的联合用培养基及离体培养方法，能够用于大花红景天高效离体再生，应用前景良好。
Description
技术领域
本发明属于植物离体培养技术领域，具体涉及一种大花红景天的离体培养联合用培养基及离体培养方法。
背景技术
大花红景天Rhodiola crenulata(HK.f.et Thoms.)H.Ohba为景天科红景天属多年生草本植物，主要分布于西藏、云南西北部、四川西部2800-5600米的高山沟坡、草地、灌丛、高山砾石滩及石缝中。其含有丰富的红景天甙、黄酮、多种维生素和微量元素，还含有机体所必需的17种氨基酸，被誉为“高原人参”，是国家2015版药典中唯一收录的红景天类药材。研究表明，大花红景天具有抗缺氧、抗疲劳、抗寒冷、抗病毒、抗肿瘤等多种功效，开发利用前景广阔。
近年来，随着人们对大花红景天药理作用认识的不断深入，对大花红景天的需求量快速增加，市场上的大花红景天主要来源于野生资源，在利益的驱动下，野生资源被大量掠夺式采挖，使得原本稀少的资源量日渐减少，而且自然生长的大花红景天生长缓慢，致使植物濒临灭绝，对红景天产业的发展十分不利。从生物技术入手，通过组织培养建立植株再生体系，不仅可以快速繁育得到大花红景天植株幼苗，而且对大花红景天的保护生物学研究意义重大。
在组织培养过程中，实现植株再生通常有两种途径，分别是器官直接分化途径和通过愈伤组织诱导再分化途径，其中，愈伤组织诱导再分化途径由于可产生大量可分化的愈伤组织，是种质资源保存、良种繁育、有用化合物生产的理想途径。
但目前关于大花红景天组织培养的研究报道中，利用愈伤组织途径进行植物再生普遍存在再生率低、培养时间长、重复性差等问题，例如尹文兵等，大花红景天的组织培养和快速繁殖，植物生理学通讯，2005，41:493提供的大花红景天组织培养方法，其出芽前对愈伤组织培养时间较长、且需多次更换培养基，而且出芽速度慢、生根率低、生根培养过程中需要不断转接种苗以防止褐化，操作较复杂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大花红景天的离体培养联合用培养基及离体培养方法。
本发明提供了一种大花红景天的离体培养联合用培养基，它包括愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代培养基、芽分化培养基、芽增殖培养基和生根培养基，
所述愈伤组织诱导培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为1.0～4.0mg/L的TDZ、0.5-3.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT；
所述愈伤组织继代培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为1.0-2.0mg/L的TDZ、0.5-1.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT；
所述芽分化培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为1.0～4.0mg/L的6-BA、0.02-0.05mg/L的2,4-D；
所述芽增殖培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为0.5～1.0mg/L的6-BA、0.1-0.5mg/L的NAA；
所述生根培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为0.1～0.5mg/L的6-BA、0.5-1.0mg/L的NAA、0.5-1g/L的活性炭。
其中，所述愈伤组织诱导培养基、继代培养基均为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为2.0mg/L的TDZ、1.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT；
所述芽分化培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为1.0mg/L的6-BA、0.02mg/L的2,4-D；
所述芽增殖培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为0.6mg/L的6-BA、0.2mg/L的NAA；
所述生根培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为0.1mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA、0.5g/L的活性炭。
其中，所述MS固体培养基的碳源为蔗糖；所述MS固体培养基的凝胶剂为琼脂。
其中，所述蔗糖在MS固体培养基的终浓度为30-40g/L；所述琼脂在MS固体培养基的终浓度为6-7g/L。
其中，培养基的pH值均为5.8。
本发明还提供了上述离体培养用培养基在大花红景天叶片离体培养中的用途。
本发明还提供了一种大花红景天的离体培养方法，它包括如下步骤：
(1)愈伤组织诱导：取大花红景天叶片，灭菌后接种于愈伤组织诱导培养基中，培养，获得愈伤组织；
(2)愈伤组织继代；将愈伤组织转移到愈伤组织继代培养基中，培养；
(3)芽的分化：将继代的愈伤组织转移到芽分化培养基中，培养，使出芽；
(4)繁殖、壮苗培养：将步骤(3)长出的苗转移到芽增殖培养基中，培养，繁殖、壮苗；
(5)诱导生根：将步骤(4)的苗转移到生根培养基中，培养，获得离体再生植株；
其中，所述培养基为上述联合用培养基。
其中，步骤(1)中：所述灭菌采取的方法为：叶片在75％乙醇溶液中浸泡30s，用0.5％NaClO溶液表面消毒5-10分钟，再用无菌水清洗；
优选地，用0.5％NaClO溶液表面消毒5分钟，再用无菌水清洗3-4次。
其中，步骤(1)中：所述培养的条件为：温度为20-25℃，暗培养；
步骤(3)-(5)中：所述培养的条件为：温度为20-25℃，光照为16h/d，光照强度为3500-4000lx。
其中，每个培养程序的时间为20-30天。
申请人经过长期实践和条件摸索，筛选得到本发明特定培养基及离体再生方法。使用本发明特定培养基组合，大花红景天愈伤组织诱导率可高达94％，而且愈伤组织增殖能力好，能够在30天内形成大量愈伤组织；愈伤组织出芽、增殖速度快、效率高；另外，本发明的大花红景天生根率高达96％，且生根过程中无需因褐化而更换培养基，能够有效防止单苗根部因褐化而造成的无法生根或根系弱等问题，有效减少工作量。
而且，在本发明离体培养再生过程中，对叶片的消毒灭菌采用5％的次氯酸钠溶液，具有消毒效果好，易清洗，对叶片伤害小等特点，使叶片的褐化死亡率维持在了较低水平。
综上，本发明以大花红景天叶片为材料，通过特定的联合用培养基及离体再生培养方法，可以有效进行大花红景天离体再生，有利于大花红景天的快繁、工业化生产、遗传转化研究，应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为叶片培养20天后形成的愈伤组织。
图2为愈伤组织分化形成的不定芽。
图3为芽增殖形成的芽丛。
图4为单苗生根后形成的种苗。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的试剂、仪器均为已知产品，通过购买市售产品获得。
TDZ：噻苯隆，是一种细胞分裂素；
NAA：萘乙酸，是一种生长素；
6-BA：6-苄氨基嘌呤，是一种细胞分裂素；
2,4-D：2,4-二氯苯氧乙酸，是一种生长素；
KT：6-糠氨基嘌呤，激动素，是一种细胞分裂素。
MS培养基(Murashige and Skoog培养基)，培养基配方如下：
MS培养基是植物组织培养常用的基本培养基，在实际应用中根据不同培养阶段和不同材料来源，通常需要在基本培养基中加入植物激素，例如不同种类和含量的生长素、细胞分裂素等，合适的植物组织培养基组成是植物组织培养成功的基础。
实施例1 本发明联合用培养基的制备
联合用培养基分别如下：
愈伤组织诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为2.0mg/L的TDZ、1.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT、30g/L的蔗糖、6g/L的琼脂粉，pH5.8；
愈伤组织继代培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为2.0mg/L的TDZ、1.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂粉，pH5.8；
芽分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为1.0mg/L的6-BA、0.02mg/L的2,4-D、40g/L的蔗糖、6g/L的琼脂粉，pH5.8；
芽增殖培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为0.6mg/L的6-BA、0.2mg/L的NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂粉，pH5.8；
生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为0.1mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA、0.5g/L的活性炭、30g/L蔗糖、7g/L琼脂粉，pH5.8。
制备方法如下：
取MS培养基粉末，溶解后加入相应用量的蔗糖、琼脂粉、激素，定容、调pH，灭菌即可。
以配制1L愈伤继代培养基为例：
准确称取MS培养基粉末(上海宇涵生物科技有限公司，货号A0025-250G)4.74g，用超纯水完全溶解并加入30g蔗糖和7g琼脂粉后搅拌均匀使其充分溶解，再加入相应体积的激素溶液后定容至1L，最后用1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调节pH至5.8；
将配制好的培养基倒入可用于高温高压灭菌的蓝盖试剂瓶中进行灭菌，灭菌时瓶盖不完全拧紧保证培养基沸腾时瓶内外气压稳定防止爆炸，灭菌条件如下：温度为121℃，气压为0.105MPa，灭菌时间为20min；
灭菌完成的培养基冷却至60℃左右时，将培养基移入超净工作台中，在无菌环境下完成培养基的分装。
实施例2 本发明大花红景天的离体培养方法
1、实验用培养基
愈伤组织诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为1.0mg/L的TDZ、0.5mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT、30g/L的蔗糖、6g/L的琼脂粉，pH5.8；
愈伤组织继代培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为1.0mg/L的TDZ、0.5mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂粉，pH5.8；
芽分化培养基为：以MS培养基为基础培养基，添加终浓度为1.0mg/L的6-BA、0.02mg/L的2,4-D、40g/L的蔗糖、6g/L的琼脂粉，pH5.8；
芽增殖培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L的NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂粉，pH5.8；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为0.1mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA、0.5g/L的活性炭、30g/L蔗糖、7g/L琼脂粉，pH5.8。
2、实验方法
(1)外植体消毒
取大花红景天幼嫩叶片(本发明中叶片均采自西藏诺迪康药业股份有限公司林芝基地育苗室)，在75％乙醇溶液中浸泡30s，用0.5％NaClO溶液表面消毒5分钟，再用无菌水清洗3-4次，将灭菌后的叶片用无菌纸吸干多余水分；
(2)愈伤组织的诱导及继代增殖
将步骤1中灭菌后的叶片切去边缘，切成0.5cm×0.5cm大小的叶盘，再将叶盘接种到经过常规高压灭菌后的愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织，培养时间为20天，暗培养，温度20-25℃，愈伤诱导率为84％；叶片培养20天后形成的愈伤组织见图1。
愈伤长出后，将愈伤转入继代培养基继代培养30天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；培养30天统计愈伤体积增殖系数为1.6倍；
(3)芽的分化
将步骤2中培养出的愈伤组织转至分化培养基中，培养时间为20天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；培养20天统计出芽率为93％；愈伤组织分化形成的不定芽见图2。
(4)芽增殖培养
将步骤3中培养出的芽从愈伤组织上切下，转至芽增殖培养基中，培养时间30天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；培养30天统计增殖倍数为3.3倍。芽增殖形成的芽丛见图3。
(5)根的诱导
将步骤4中繁殖培养出的芽，转至生根培养基中诱导生根，培养时间30天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃，经过30天的培养统计生根率为96％。
3、实验结果
本发明方法培养得到了离体再生红景天植株。单苗生根后形成的种苗见图4。
实施例3本发明大花红景天的离体培养方法
1、实验用培养基
所述愈伤组织诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为2.0mg/L的TDZ、1.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT、30g/L的蔗糖、6g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述愈伤组织继代培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为2.0mg/L的TDZ、1.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述芽分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为2.0mg/L的6-BA、0.03mg/L的2,4-D、40g/L的蔗糖、6g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述芽增殖培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为0.6mg/L的6-BA、0.2mg/L的NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂粉，pH5.8；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为0.2mg/L的6-BA、0.6mg/L的NAA、0.5g/L的活性炭、30g/L蔗糖、7g/L琼脂粉，pH5.8。
2、实验方法
(1)外植体消毒：将大花红景天幼嫩叶片在75％乙醇溶液中浸泡30s，用0.5％NaClO溶液表面消毒6分钟，再用无菌水清洗3-4次，将灭菌后的叶片用无菌纸吸干多余水分；
(2)愈伤组织的诱导及继代增殖：将步骤1中灭菌后的叶片切去边缘，切成0.5cm×0.5cm大小的叶盘，再将叶盘接种到经过常规高压灭菌后的愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织，培养20天，暗培养，温度20-25℃，统计愈伤诱导率为92％；
愈伤长出后，将愈伤组织转入继代培养基继代增殖，培养30天，统计愈伤体积增殖系数为2.4倍；
(3)芽的分化：将步骤2中培养出的愈伤组织转至分化培养基中，培养20天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；培养20天统计出芽率为89％。
(4)芽增殖培养：将步骤3中培养出的幼苗从愈伤组织上切下，转至繁殖培养基中，培养30天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；培养30天统计增殖倍数为3.9倍。
(5)根的诱导：将步骤4中繁殖培养出的幼苗，转至生根培养基中诱导生根，培养30天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；经过30天的培养统计生根率为90％，培养得到完整的红景天植株。
3、实验结果
本发明方法培养得到了离体再生红景天植株。
实施例4 本发明大花红景天的离体培养方法
1、实验用培养基
所述愈伤组织诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为3.0mg/L的TDZ、1.5mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT、30g/L的蔗糖、6g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述愈伤组织继代培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为2.0mg/L的TDZ、1.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述芽分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为3.0mg/L的6-BA、0.04mg/L的2,4-D、40g/L的蔗糖、6g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述芽增殖培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为0.7mg/L的6-BA、0.3mg/L的NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂粉，pH5.8；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为0.3mg/L的6-BA、0.7mg/L的NAA、0.5g/L的活性炭、30g/L蔗糖、7g/L琼脂粉，pH5.8。
2、实验方法
(1)外植体消毒：将大花红景天幼嫩叶片在75％乙醇溶液中浸泡30s，用0.5％NaClO溶液表面消毒6分钟，再用无菌水清洗3-4次，将灭菌后的叶片用无菌纸吸干多余水分；
(2)愈伤组织的诱导及继代增殖：将步骤1中灭菌后的叶片切去边缘，切成0.5cm×0.5cm大小的叶盘，再将叶盘接种到经过常规高压灭菌后的愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织，培养20天，暗培养，温度20-25℃，统计愈伤诱导率为88％；
愈伤长出后，将愈伤继代增殖培养30天，培养30天统计愈伤体积增殖系数为2.4倍。
3、芽的分化：将步骤2中培养出的愈伤组织转至分化培养基中，培养时间为20天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；培养20天统计出芽率为90％。
4、芽增殖培养：将步骤3中培养出的芽从愈伤组织上切下，转至繁殖培养基中，培养时间30天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；培养30天统计增殖倍数为3.4倍。
5、根的诱导：将步骤4中繁殖培养出的芽，转至生根培养基中诱导生根，培养时间30天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；经过30天的培养统计生根率为92％。
3、实验结果
本发明方法培养得到了离体再生红景天植株。
实施例5 本发明大花红景天的离体培养方法
1、实验用培养基
所述愈伤组织诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为4.0mg/L的TDZ、2.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT、30g/L的蔗糖、6g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述愈伤组织继代培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为2.0mg/L的TDZ、1.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述芽分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为4.0mg/L的6-BA、0.04mg/L的2,4-D、40g/L的蔗糖、6g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述芽增殖培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为0.8mg/L的6-BA、0.4mg/L的NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂粉，pH5.8；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为0.4mg/L的6-BA、0.8mg/L的NAA、0.5g/L的活性炭、30g/L蔗糖、7g/L琼脂粉，pH5.8。
2、实验方法
(1)外植体消毒：将大花红景天幼嫩叶片在75％乙醇溶液中浸泡30s，用0.5％NaClO溶液表面消毒6分钟，再用无菌水清洗3-4次，将灭菌后的叶片用无菌纸吸干多余水分；
(2)愈伤组织的诱导及继代：将步骤1中灭菌后的叶片切去边缘，切成0.5cm×0.5cm大小的叶盘，再将叶盘接种到经过常规高压灭菌后的愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织，培养20天，暗培养，温度20-25℃，统计愈伤诱导率为85％；
愈伤长出后，将愈伤组织转入到继代培养基继代增殖培养30天，培养30天统计愈伤体积增殖系数为2.4倍；
(3)芽的分化：将步骤2中培养出的愈伤组织转至分化培养基中，培养20天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；培养20天统计出芽率为92％。
(4)芽增殖培养：将步骤3中培养出的芽从愈伤组织上切下，转至繁殖培养基中，培养30天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；培养30天统计增殖倍数为3.2倍。
(5)根的诱导：将步骤4中繁殖培养出的芽，转至生根培养基中诱导生根，培养30天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；经过30天的培养统计生根率为85％。
3、实验结果
本发明方法培养得到了离体再生红景天植株。
实施例6 本发明大花红景天的离体培养方法
1、实验用培养基
所述愈伤组织诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为2.0mg/L的TDZ、1.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT、30g/L的蔗糖、6g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述愈伤组织继代培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为2.0mg/L的TDZ、1.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述芽分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为1.0mg/L的6-BA、0.02mg/L的2,4-D、40g/L的蔗糖、6g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述芽增殖培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为1.0mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂粉，pH5.8；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为0.5mg/L的6-BA、1.0mg/L的NAA、0.5g/L的活性炭、30g/L蔗糖、7g/L琼脂粉，pH5.8。
2、实验方法
(1)外植体消毒：将大花红景天幼嫩叶片在75％乙醇溶液中浸泡30s，用0.5％NaClO溶液表面消毒5分钟，再用无菌水清洗3-4次，将灭菌后的叶片用无菌纸吸干多余水分；
(2)愈伤组织的诱导及继代增殖：将步骤1中灭菌后的叶片切去边缘，切成0.5cm×0.5cm大小的叶盘，再将叶盘接种到经过常规高压灭菌后的愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织，培养20天，暗培养，温度20-25℃，统计愈伤诱导率为94％；
愈伤长出后，将愈伤组织转入继代培养基中继代增殖培养30天，培养30天统计愈伤体积增殖系数为2.4倍。
(3)芽的分化：将步骤2中培养出的愈伤组织转至分化培养基中，培养时间为20天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；培养20天统计出芽率为93％。
(4)芽增殖培养：将步骤3中培养出的幼苗从愈伤组织上切下，转至繁殖培养基中，培养时间30天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；培养30天统计增殖倍数为2.7倍。
(5)根的诱导：将步骤4中繁殖培养出的幼苗，转至生根培养基中诱导生根，培养时间30天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃，经过30天的培养统计生根率为78％。
实施例7 本发明大花红景天的离体培养方法
1、实验用培养基
所述愈伤组织诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为2.0mg/L的TDZ、1.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT、30g/L的蔗糖、6g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述愈伤组织继代培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为2.0mg/L的TDZ、1.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT、30g/L的蔗糖、7g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述芽分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为1.0mg/L的6-BA、0.02mg/L的2,4-D、40g/L的蔗糖、6g/L的琼脂粉，pH5.8；
所述芽增殖培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为0.6mg/L的6-BA、0.2mg/L的NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂粉，pH5.8；
所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为0.1mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA、0.5g/L的活性炭、30g/L蔗糖、7g/L琼脂粉，pH5.8。
步骤如下：
(1)外植体消毒：将大花红景天幼嫩叶片在75％乙醇溶液中浸泡30s，用0.5％NaClO溶液表面消毒5分钟，再用无菌水清洗3-4次，将灭菌后的叶片用无菌纸吸干多余水分；
(2)愈伤组织的诱导及继代增殖：将步骤1中灭菌后的叶片切去边缘，切成0.5cm×0.5cm大小的叶盘，再将叶盘接种到经过常规高压灭菌后的愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织，培养时间为20天，暗培养，温度20-25℃，统计愈伤诱导率为94％；
愈伤长出后，将愈伤组织转入继代培养基中继代增殖培养30天，统计愈伤体积增殖系数为2.4倍。
(3)芽的分化：将步骤2中培养出的愈伤组织转至分化培养基中，培养20天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；培养20天统计出芽率为93％。
(4)芽增殖培养：将步骤3中培养出的芽从愈伤组织上切下，转至繁殖培养基中，培养30天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃；培养30天统计增殖倍数为3.9倍。
(5)根的诱导：将步骤4中繁殖培养出的芽，转至生根培养基中诱导生根，培养30天，每日光照培养16小时，暗培养8小时，光照强度3500-4000lx，温度20-25℃，培养统计生根率为96％。
可见，本发明提供的联合用培养基及培养方法可以有效诱导大花红景天叶片的离体再生，尤其以实施例7的培养基组合及离体培养方法最佳，其愈伤诱导率、愈伤增殖系数、芽分化率、芽增殖系数及生根率上均有显著优势。
因此，本发明特定的联合用培养基及离体再生培养方法，可以用于大花红景天高效离体再生，应用前景良好。
Claims (10)
1.一种大花红景天的离体培养联合用培养基，其特征在于：它包括愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代培养基、芽分化培养基、芽增殖培养基和生根培养基，
所述愈伤组织诱导培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为1.0～4.0mg/L的TDZ、0.5-3.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT；
所述愈伤组织继代培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为1.0-2.0mg/L的TDZ、0.5-1.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT；
所述芽分化培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为1.0～4.0mg/L的6-BA、0.02-0.05mg/L的2,4-D；
所述芽增殖培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为0.5～1.0mg/L的6-BA、0.1-0.5mg/L的NAA；
所述生根培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为0.1～0.5mg/L的6-BA、0.5-1.0mg/L的NAA、0.5-1g/L的活性炭。
2.根据权利要求1所述的离体培养用培养基，其特征在于：
所述愈伤组织诱导培养基、继代培养基均为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为2.0mg/L的TDZ、1.0mg/L的2,4-D、0.5mg/L的KT；
所述芽分化培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为1.0mg/L的6-BA、0.02mg/L的2,4-D；
所述芽增殖培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为0.6mg/L的6-BA、0.2mg/L的NAA；
所述生根培养基为：以MS固体培养基为基本培养基，添加终浓度为0.1mg/L的6-BA、0.5mg/L的NAA、0.5g/L的活性炭。
3.根据权利要求1或2所述的离体培养用培养基，其特征在于：所述MS固体培养基的碳源为蔗糖；所述MS固体培养基的凝胶剂为琼脂。
4.根据权利要求3所述的离体培养用培养基，其特征在于：所述蔗糖在MS固体培养基的终浓度为30-40g/L；所述琼脂在MS固体培养基的终浓度为6-7g/L。
5.根据权利要求1或2所述的离体培养用培养基，其特征在于：培养基的pH值均为5.8。
6.权利要求1-5任意一项所述离体培养用培养基在大花红景天叶片离体培养中的用途。
7.一种大花红景天的离体培养方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)愈伤组织诱导：取大花红景天叶片，灭菌后接种于愈伤组织诱导培养基中，培养，获得愈伤组织；
(2)愈伤组织继代；将愈伤组织转移到愈伤组织继代培养基中，培养；
(3)芽的分化：将继代的愈伤组织转移到芽分化培养基中，培养，使出芽；
(4)繁殖、壮苗培养：将步骤(3)长出的苗转移到芽增殖培养基中，培养，繁殖、壮苗；
(5)诱导生根：将步骤(4)的苗转移到生根培养基中，培养，获得离体再生植株；
其中，所述培养基为权利要求1-5任意一项所述的培养基。
8.根据权利要求7所述的离体培养方法，其特征在于：步骤(1)中：所述灭菌采取的方法为：叶片在75％乙醇溶液中浸泡30s，用0.5％NaClO溶液表面消毒5-10分钟，再用无菌水清洗；
优选地，用0.5％NaClO溶液表面消毒5分钟，再用无菌水清洗3-4次。
9.根据权利要求7所述的离体再生方法，其特征在于：
步骤(1)中：所述培养的条件为：温度为20-25℃，暗培养；
步骤(3)-(5)中：所述培养的条件为：温度为20-25℃，光照为16h/d，光照强度为3500-4000lx。
10.根据权利要求7所述的离体再生方法，其特征在于：每个培养程序的时间为20-30天。
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