CN109526744A - 一种杂交水稻花药的培养基配方及其培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种杂交水稻花药的培养基配方及其培养方法，本发明通过改良培养基的成分及成分的用量，实现对杂交水稻花药诱导率的提高，其中甘氨酸及谷胱甘肽的加入对于水稻花药诱导率的提高有明显的促进作用；培养基中添加的秋水仙碱及AgNO3均可对花药的褐化现象有所减轻即反向促进了水稻花药诱导率的提高。

Description

一种杂交水稻花药的培养基配方及其培养方法
技术领域
本发明涉及一种杂交水稻花药的培养基配方及其培养方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术
在水稻育种过程中水稻花药培养技术尤为重要。该花药的培养过程一般是将发育到一定阶段的花药接种至人工培养基上，在一定的光照温度条件下进行离体培养，诱导小孢子形成愈伤组织进而分化出完整的单倍体再生植株。之后经过人工加倍或自然加倍产生双单倍体植株。但是目前普遍存在水稻花药的诱导率较低的问题。
为提高水稻花药的诱导率，有研究人员利用研究了一种植物组织培养方法，首先是将植物组织基因进行活化处理，然后再接种于培养基中培养，经本方法处理后的种子植物(如水稻)花药形成愈伤组织可达50％以上，愈伤组织分化为绿苗率达100％，对于难生根植物(如直干兰桉和柑桔)经处理后在培养基中生根率可达到100％。
另，有研究人员的水稻花药培养方法为外植体的选择，外植体灭菌，花药愈伤的液体悬浮诱导，花药愈伤的增殖培养，花药愈伤组织分化培养，分化苗即花培苗的生根培养，及花培苗炼苗、移栽步骤。本发明将花药接种到液体培养基中进行悬浮培养，提高愈伤诱导率，再将愈伤组织转移到增殖培养基上进行增殖培养，提高愈伤质量和数量。
但是，上述培养方式虽对花药的诱导率有一定提高作用，但是还远远达不到预估水平，本发明即是在上述技术方案的基础上进行的改进。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的在于提供一种杂交水稻花药的培养基配方及其培养方法。
为解决背景技术的相关问题，本发明提供一种杂交水稻花药的培养基配方，各组分在每升培养基中所含重量为：
(1)花药愈伤组织预处理培养基：NLN-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/L，附加0.05-0.2％秋水仙碱，1-3％DMSO，甘氨酸150mg·L-1，谷胱甘肽300mg·L-1，pH5.7，灭菌；
(2)花药愈伤组织诱导培养基：MS基本培养基+2,4-D 2.0mg·L-1+NAA 3.0mg·L-1+KT1mg·L-1+蔗糖或白糖130g·L-1，附加甘氨酸150mg·L-1，谷胱甘肽300mg·L-1，AgNO34.0-5.0mg/L，pH为6.0，灭菌；
(3)花药愈伤组织分化培养基：MS基本培养基+6-BA 2.0mg·L-1+KT 2.0mg·L-1+IAA 0.2mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+蔗糖或白糖130g/L，附加甘氨酸150mg·L-1，谷胱甘肽300mg·L-1，植物凝胶3.8g·L-1，AgNO3 4.0-5.0mg/L，pH为6.0，灭菌；
(4)组培苗生根培养与移栽培养基：1/2MS+0.1NAA mg·L-1+蔗糖20g·L-1，附加植物凝胶3.8g·L-1，pH为6.0，灭菌。
其中，所述灭菌的方式可以为低温灭菌处理。
另外，本发明还在于公开一种利用上述培养基配方培养杂交水稻花药的方法，其特征在于，包括如下主要步骤：
(1)花药愈伤组织预处理：选取花粉发育时期为单核中期到晚期的幼穗，7-9℃放入花药愈伤组织预处理培养基中低温预处理6天后，用次氯酸钠灭菌；
(2)花药愈伤组织诱导培养：将刚接种好的愈伤转到30-32℃暗培养箱，热激处理24后，再将愈伤转到25℃半光条件，倒扣培养15-20天，光照强度为3000-4000lux,光照周期12h/d。至愈伤开始长出后，转到25℃黑暗条件继续培养10-15天，花药愈伤长至2mm左右进行分化培养，诱导培养温度不能高于26℃；
(3)花药愈伤组织分化培养：将生长至2mm左右的花药愈伤转入到分化培养基进行光照培养，光照条件为5000-6000Lux,光照周期为14h/d，培养温度为25℃；
(4)组培苗生根培养与移栽培养：将长至约5-8cm的分化苗，转入生根壮苗培养基生根培养条件为光照强度5000-6000Lux,光照周期为16h/d，培养温度为25℃。
本发明创造的有益效果为：本发明通过改良培养基的成分及成分的用量，实现对杂交水稻花药诱导率的提高，其中甘氨酸及谷胱甘肽的加入对于水稻花药诱导率的提高有明显的促进作用；
培养基中添加的秋水仙碱及AgNO3均可对花药的褐化现象有所减轻即反向促进了水稻花药诱导率的提高。
具体实施方式
下述实施例中的杂交水稻花药均按照如下步骤进行培养：
(1)花药愈伤组织预处理：选取花粉发育时期为单核中期到晚期的幼穗，7-9℃放入花药愈伤组织预处理培养基中低温预处理6天后，用次氯酸钠灭菌；
(2)花药愈伤组织诱导培养：将刚接种好的愈伤转到30-32℃暗培养箱，热激处理24后，再将愈伤转到25℃半光条件，倒扣培养15-20天，光照强度为3000-4000lux,光照周期12h/d。至愈伤开始长出后，转到25℃黑暗条件继续培养10-15天，花药愈伤长至2mm左右进行分化培养，诱导培养温度不能高于26℃；
(3)花药愈伤组织分化培养：将生长至2mm左右的花药愈伤转入到分化培养基进行光照培养，光照条件为5000-6000Lux,光照周期为14h/d，培养温度为25℃；
(4)组培苗生根培养与移栽培养：将长至约5-8cm的分化苗，转入生根壮苗培养基生根培养条件为光照强度5000-6000Lux,光照周期为16h/d，培养温度为25℃。
实施例1
培养基的配置：
(1)花药愈伤组织预处理培养基：NLN-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/L，附加0.05-0.2％秋水仙碱，1-3％DMSO，甘氨酸150mg·L-1，谷胱甘肽300mg·L-1，pH5.7，灭菌；
(2)花药愈伤组织诱导培养基：MS基本培养基+2,4-D 2.0mg·L-1+NAA 3.0mg·L-1+KT1mg·L-1+蔗糖或白糖130g·L-1，附加甘氨酸150mg·L-1，谷胱甘肽300mg·L-1，AgNO34.0-5.0mg/L，pH为6.0，灭菌；
(3)花药愈伤组织分化培养基：MS基本培养基+6-BA 2.0mg·L-1+KT 2.0mg·L-1+IAA 0.2mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+蔗糖或白糖130g/L，附加甘氨酸150mg·L-1，谷胱甘肽300mg·L-1，植物凝胶3.8g·L-1，AgNO3 4.0-5.0mg/L，pH为6.0，灭菌；
(4)组培苗生根培养与移栽培养基：1/2MS+0.1NAA mg·L-1+蔗糖20g·L-1，附加植物凝胶3.8g·L-1，pH为6.0，灭菌。
实施例2
培养基的配置：
(1)花药愈伤组织预处理培养基：NLN-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/L，附加0.05-0.2％秋水仙碱，1-3％DMSO，甘氨酸150mg·L-1，pH5.7，灭菌；
(2)花药愈伤组织诱导培养基：MS基本培养基+2,4-D 2.0mg·L-1+NAA 3.0mg·L-1+KT1mg·L-1+蔗糖或白糖130g·L-1，附加甘氨酸150mg·L-1，AgNO3 4.0-5.0mg/L，pH为6.0，灭菌；
(3)花药愈伤组织分化培养基：MS基本培养基+6-BA 2.0mg·L-1+KT 2.0mg·L-1+IAA 0.2mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+蔗糖或白糖130g/L，附加甘氨酸150mg·L-1，植物凝胶3.8g·L-1，AgNO3 4.0-5.0mg/L，pH为6.0，灭菌；
(4)组培苗生根培养与移栽培养基：1/2MS+0.1NAA mg·L-1+蔗糖20g·L-1，附加植物凝胶3.8g·L-1，pH为6.0，灭菌。
实施例3
(1)花药愈伤组织预处理培养基：NLN-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/L，附加0.05-0.2％秋水仙碱，1-3％DMSO，谷胱甘肽300mg·L-1，pH5.7，灭菌；
(2)花药愈伤组织诱导培养基：MS基本培养基+2,4-D 2.0mg·L-1+NAA 3.0mg·L-1+KT1mg·L-1+蔗糖或白糖130g·L-1，附加谷胱甘肽300mg·L-1，AgNO3 4.0-5.0mg/L，pH为6.0，灭菌；
(3)花药愈伤组织分化培养基：MS基本培养基+6-BA 2.0mg·L-1+KT 2.0mg·L-1+IAA 0.2mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+蔗糖或白糖130g/L，附加谷胱甘肽300mg·L-1，植物凝胶3.8g·L-1，AgNO3 4.0-5.0mg/L，pH为6.0，灭菌；
(4)组培苗生根培养与移栽培养基：1/2MS+0.1NAA mg·L-1+蔗糖20g·L-1，附加植物凝胶3.8g·L-1，pH为6.0，灭菌。
实施例4
培养基的配置：
(1)花药愈伤组织预处理培养基：NLN-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/L，附加1-3％DMSO，甘氨酸150mg·L-1，谷胱甘肽300mg·L-1，pH5.7，灭菌；
(2)花药愈伤组织诱导培养基：MS基本培养基+2,4-D 2.0mg·L-1+NAA 3.0mg·L-1+KT1mg·L-1+蔗糖或白糖130g·L-1，附加甘氨酸150mg·L-1，谷胱甘肽300mg·L-1，pH为6.0，灭菌；
(3)花药愈伤组织分化培养基：MS基本培养基+6-BA 2.0mg·L-1+KT 2.0mg·L-1+IAA 0.2mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+蔗糖或白糖130g/L，附加甘氨酸150mg·L-1，谷胱甘肽300mg·L-1，植物凝胶3.8g·L-1，pH为6.0，灭菌；
(4)组培苗生根培养与移栽培养基：1/2MS+0.1NAA mg·L-1+蔗糖20g·L-1，附加植物凝胶3.8g·L-1，pH为6.0，灭菌。
上述四个实施例的出胚率及褐化现象如下表所示：
表1
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (3)

1.一种杂交水稻花药的培养基配方，其特征在于，各组分在每升培养基中所含重量为：
(1)花药愈伤组织预处理培养基：NLN-13液体培养基+蔗糖或白糖130g/L，附加0.05-0.2％秋水仙碱，1-3％DMSO，甘氨酸150mg·L-1，谷胱甘肽300mg·L-1，pH5.7，灭菌；
(2)花药愈伤组织诱导培养基：MS基本培养基+2,4-D 2.0mg·L-1+NAA 3.0mg·L-1+KT1mg·L-1+蔗糖或白糖130g·L-1，附加甘氨酸150mg·L-1，谷胱甘肽300mg·L-1，AgNO34.0-5.0mg/L，pH为6.0，灭菌；
(3)花药愈伤组织分化培养基：MS基本培养基+6-BA 2.0mg·L-1+KT 2.0mg·L-1+IAA0.2mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+蔗糖或白糖130g/L，附加甘氨酸150mg·L-1，谷胱甘肽300mg·L-1，植物凝胶3.8g·L-1，AgNO3 4.0-5.0mg/L，pH为6.0，灭菌；
(4)组培苗生根培养与移栽培养基：1/2MS+0.1NAA mg·L-1+蔗糖20g·L-1，附加植物凝胶3.8g·L-1，pH为6.0，灭菌。
2.根据权利要求1所述的一种杂交水稻花药的培养基配方，其特征在于，所述灭菌的方式可以为低温灭菌处理。
3.根据权利要求1或2任一所述的培养基配方培养杂交水稻花药的方法，其特征在于，
(1)花药愈伤组织预处理：选取花粉发育时期为单核中期到晚期的幼穗，7-9℃放入花药愈伤组织预处理培养基中低温预处理6天后，用次氯酸钠灭菌；
(2)花药愈伤组织诱导培养：将刚接种好的愈伤转到30-32℃暗培养箱，热激处理24后，再将愈伤转到25℃半光条件，倒扣培养15-20天，光照强度为3000-4000lux,光照周期12h/d。至愈伤开始长出后，转到25℃黑暗条件继续培养10-15天，花药愈伤长至2mm左右进行分化培养，诱导培养温度不能高于26℃；
(3)花药愈伤组织分化培养：将生长至2mm左右的花药愈伤转入到分化培养基进行光照培养，光照条件为5000-6000Lux,光照周期为14h/d，培养温度为25℃；
(4)组培苗生根培养与移栽培养：将长至约5-8cm的分化苗，转入生根壮苗培养基生根培养条件为光照强度5000-6000Lux,光照周期为16h/d，培养温度为25℃。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114711108A (zh) * 2022-04-01 2022-07-08 上海市农业科学院 一种快速确定水稻小孢子发育时期的方法
CN114793904A (zh) * 2022-05-13 2022-07-29 河北省农林科学院粮油作物研究所 一种小麦花药的诱导培养基和培养方法

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