CN103004608A - 一种球兰组织培养用培养基及培养方法 - Google Patents

一种球兰组织培养用培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种球兰组织培养用培养基及培养方法，该培养基包含由琼脂、基本培养基MS、激动素KT、6-苄基嘌呤6-BA和萘乙酸NAA组成的外植体诱导培养基，由琼脂、基本培养基MS、6-苄基嘌呤6-BA、萘乙酸NAA、赤霉素GA和硝酸铈组成的增殖继代培养基，由琼脂、基本培养基MS、激动素KT、萘乙酸NAA、赤霉素GA、硝酸镧La(NO3)3和硝酸铈Ce(NO3)3组成的芽分化培养基，由琼脂、基本培养基White、赤霉素GA、氯化镧LaCl3组成的生根培养基，和生根浸泡液；该培养基大大提高了球兰组培苗的质量，使球兰的组培苗繁殖得到有效地提高，进而促进球兰的产业化生产。

Description

一种球兰组织培养用培养基及培养方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种球兰组织培养用培养基及培养方法。
背景技术
随着植物组织培养技术的发展，球兰通过组培技术进行商业化批量培育生产已是趋势。传统的球兰的培育几乎都是通过扦插繁殖法，但此繁殖法生根慢，成活移植后，发苗势不旺，生长也比较缓慢。因此，通过组织培养技术来繁殖球兰，是解决以上繁殖问题的重要技术手段。目前，球兰的组织培养技术在实验室阶段性实验已有报道，有了建立起无菌系并能扩繁的先例，然而此技术日前还只停留在实验室可行阶段，只是提供了应用组织培养技术的手段，而非是良好运用组织培养技术的方法。随着市场的需要，组织培养技术应用在球兰的培育上，主要是期望能进行批量生产并提高瓶苗的移栽成活率，这也是目前亟待解决的重点问题。而要提高瓶苗的质量和移栽成活率，在球兰组织培养的过程中，组织培养的培养基配方是关键。而采用现有的球兰组织培养基配方进行组织培养时，球兰组织培养瓶苗的成活率低，使用效果差，限制了球兰繁殖技术的进一步发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种球兰组织培养用培养基，通过在球兰组织培养的不同阶段选择不同的类型及配方，大大提高了球兰组培苗的质量，使球兰的组培苗繁殖得到有效地提高，从而促进球兰的产业化生产。
本发明的另一目的是提供一种利用上述球兰组织培养用培养基进行球兰组织培养的方法。
为了达到上述发明目的，本发明采用的一个技术方案是：提供一种球兰组织培养用培养基，其特征在于，包含用下述原料配制成的各种培养基：
外植体诱导培养基，包括琼脂6～10g·L-1，基本培养基MS，激动素KT 0.5～1.0mg·L-1，6-苄基嘌呤6-BA 0.5～1.0mg·L-1，和萘乙酸NAA 0.5～1.0mg·L-1；
增殖继代培养基，包括琼脂6～10g·L-1，基本培养基MS，6-苄基嘌呤6-BA1.5～2.0mg·L-1，萘乙酸NAA 0.2mg·L-1，赤霉素GA 0.5～0.8mg·L-1，和硝酸铈Ce(NO3)3 0.20～0.30mg·L-1；
芽分化培养基，包括琼脂6～10g·L-1，基本培养基MS，激动素KT 0.5～1.0mg·L-1，萘乙酸NAA 0.5mg·L-1，赤霉素GA 1.0mg·L-1，硝酸镧La(NO3)3 0.15～0.20mg·L-1，和硝酸铈Ce(NO3)3 0.20～0.30mg·L-1；
生根培养基，包括琼脂6～10g·L-1，基本培养基White，赤霉素GA0.5～1.0mg·L-1，氯化镧LaCl3 10～20mg·L-1；
生根浸泡液，包括萘乙酸NAA 0.2～1.0mg·L-1，赤霉素GA 0.5mg·L-1，硝酸铈Ce(NO3)3 0.15～0.25mg·L-1，和氯化镧LaCl3 15～30mg·L-1。
本发明采用的另一个技术方案是：提供一种球兰组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、外植体选取：选择长势较好、无病虫害的若干成熟叶片作为外植体；
b、外植体消毒灭菌：将外植体的叶片用洗衣粉溶液洗涤，再用清水冲洗10～20分钟；在超净工作台上，用体积分数为65～75％乙醇溶液浸泡5～15s，无菌水冲洗1～3次，再置于升汞溶液中浸泡10～15min，最后用无菌水冲洗4～5次，滤干水分；再将经表面灭菌的叶片切成0.5～2.5cm2的小块，待接种。
c、组织培养：将步骤b制得的外植体在超净工作台上接种于外植体诱导培养基上，培养30～50天后，将形成的愈伤组织进行分切，分别转接于增殖继代培养基上进行培养；愈伤组织进行增殖继代培养后，再将其转接于芽分化培养基上进行丛生芽和芽点的促生培养；当芽生长为2～3cm高的壮苗时，放入生根浸泡液中浸泡20～30min，再将浸泡后的壮苗取出，将壮苗表面的液体吸干并转入White培养基中，6-8天后取出，再转入生根培养基中进行生根培养；
d、移栽：将进行生根培养后的球兰组培苗进行炼苗后移栽。
综上所述：本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过在球兰各阶段培养基中采用特定浓度的激素和稀土元素调配成的培养基对球兰进行培养，解决了通过扦插培育出的球兰壮苗生长缓慢，出苗不齐，移栽成活率低的问题，所培育出的球兰组培苗较非稀土配方培养基培育出的苗质量高，叶片健康，根系发达，出芽及生根率都得到保障，从而打破了仅能在实验室培育的限制，使球兰的组培苗繁殖得到有效地提高，进而促进球兰的产业化生产。
(2)本发明在球兰培养基中加入特定浓度和种类的稀土元素，该稀土元素在特定的浓度下对培养基中添加的其它生长调节物质有促进作用，如稀土元素可增加植物体中生长素的含量，稀土元素对GA活性有促进作用，镧对植物生根有促进生长的作用；该稀土元素与其它生长调节物质之间的相互作用，使本发明的培养基配方更有利于球兰组培苗的生长，大大提高了球兰组培苗的移栽成活率。
(3)本发明提供的球兰组织培养方法在球兰组培苗转入生根培养基之前进行生根浸泡液浸泡处理，能有效提高生根率和后期存活率，更易被植物吸收；并在转入生根培养基前转入White培养基过渡生长，有效调整苗的代谢状态，使之更易存活。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。
实施例1
培养基配方：
外植体诱导培养基：琼脂7g·L-1+基本培养基MS+激动素KT 0.5mg·L-1+6-苄基嘌呤6-BA 0.5mg·L-1+萘乙酸NAA 0.5mg·L-1；
增殖继代培养基：琼脂7g·L-1+基本培养基MS+6-苄基嘌呤6-BA 1.5mg·L-1+萘乙酸NAA 0.2mg·L-1+赤霉素GA 0.5mg·L-1+硝酸铈Ce(NO3)30.20mg·L-1；
芽分化培养基：琼脂7g·L-1+基本培养基MS+激动素KT 0.5mg·L-1+萘乙酸NAA 0.5mg·L-1+赤霉素GA 1.0mg·L-1+硝酸镧La(NO3)30.15mg·L-1+硝酸铈Ce(NO3)3 0.20mg·L-1；
生根培养基：琼脂7g·L-1+基本培养基White+赤霉素GA 0.5mg·L-1+氯化镧LaCl3 10mg·L-1；
生根浸泡液，包括萘乙酸NAA 0.2mg·L-1，赤霉素GA 0.5mg·L-1，硝酸铈Ce(NO3)30.15mg·L-1+氯化镧LaCl315mg·L-1。
采用上述培养基进行组织培养的方法如下：
a、外植体选取：从市场上买入较好的球兰品种，选择长势较好，无病虫害的若干成熟叶片作为外植体。
b、外植体消毒灭菌：将外植体的叶片用洗衣粉溶液洗涤，然后用清水冲洗20分钟；在超净工作台上，用体积分数为65％乙醇溶液浸泡15s，无菌水冲洗2次，再置于0.1％升汞溶液中浸泡10min，最后用无菌水冲洗4～5次，滤干水分；用解剖刀将经表面灭菌的叶片切成0.5cm2的小块，待接种。
c、培养基制备：
①基本堵养基MS和White的制备：根据基本培养基MS和White成分及用量称取药品，使其充分溶解，并按相应浓度分别依次取用，先量取大量元素母液，再依次加入微量元素母液、铁盐母液和有机成分。
②再按外植体诱导培养基、增殖继代培养基、芽分化培养基、生根培养基及生根浸泡液来加入激素及稀土，其分别添加为：
外植体诱导培养基：琼脂7g·L-1+基本培养基MS+激动素KT 0.5mg·L-1+6-苄基嘌呤6-BA 0.5mg·L-1+萘乙酸NAA 0.5mg·L-1；
增殖继代培养基：琼脂7g·L-1+基本培养基MS+6-苄基嘌呤6-BA 1.5mg·L-1+萘乙酸NAA 0.2mg·L-1+赤霉素GA 0.5mg·L-1+硝酸铈Ce(NO3)30.20mg·L-1；
芽分化培养基：琼脂7g·L-1+基本培养基MS+激动素KT 0.5mg·L-1+萘乙酸NAA 0.5mg·L-1+赤霉素GA 1.0mg·L-1+硝酸镧La(NO3)3 0.15mg·L-1+硝酸铈Ce(NO3)3 0.20mg·L-1；
生根培养基：琼脂7g·L-1+基本培养基White+赤霉素GA 0.5mg·L-1+氯化镧LaCl3 10mg·L-1；
生根浸泡液，包括萘乙酸NAA 0.2mg·L-1，赤霉素GA 0.5mg·L-1，硝酸铈Ce(NO3)3 0.15mg·L-1+氯化镧LaCl315mg·L-1。
③溶化琼脂：称取琼脂7g·L-1，用蒸馏水加热烧开熔化琼脂，待琼脂完全熔化后，把调配好的激素和稀土元素溶液加入，用pH试纸测pH值，并用0.1mol/L的NaOH或HCl调节pH值为5.8，最后加水定容至所需体积。
④分装：将配好的培养基分装于培养瓶中，分装时注意不要把培养基倒在瓶口上，以防引起污染，然后用封口膜或瓶盖封口，装入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。
d、组织培养：将步骤b制得的外植体在超净工作台上接种于外植体诱导培养基上，培养30天后，将形成的愈伤组织用解剖刀进行分切，分别转接于增殖继代培养基上进行培养；愈伤组织进行增殖继代培养后，再将其转接于芽分化培养基上进行丛生芽和芽点的促生培养；当芽生长至2～3cm高的壮苗时，从瓶中取出，放入生根浸泡液中浸泡20min，再将浸泡后的壮苗取出，将壮苗用无菌吸水纸将表面液体吸干并转入White培养基中，7天后取出，再转入生根培养基中进行生根培养。
e、移栽：将生根后的球兰组培苗进行炼苗后移栽。
实施例2
培养基配方：
外植体诱导培养基：琼脂10g·L-1+基本培养基MS+激动素KT 1.0mg·L-1+6-苄基嘌呤6-BA 1.0mg·L-1+萘乙酸NAA 1.0mg·L-1；
增殖继代培养基：琼脂10g·L-1+基本培养基MS+6-苄基嘌呤6-BA 2.0mg·L-1+萘乙酸NAA 0.2mg·L-1+赤霉素GA 0.8mg·L-1+硝酸铈Ce(NO3)3 0.30mg·L-1；
芽分化培养基：琼脂10g·L-1+基本培养基MS+激动素KT 1.0mg·L-1+萘乙酸NAA 0.5mg·L-1+赤霉素GA 1.0mg·L-1+硝酸镧La(NO3)3 0.20mg·L-1+硝酸铈Ce(NO3)3 0.30mg·L-1；
生根培养基：琼脂10g·L-1+基本培养基White+赤霉素GA 1.0mg·L-1+氯化镧LaCl3 20mg·L-1；
生根浸泡液，包括萘乙酸NAA 1.0mg·L-1，赤霉素GA 0.5mg·L-1，硝酸铈Ce(NO3)3 0.25mg·L-1+氯化镧LaCl330mg·L-1。
采用上述培养基进行组织培养的方法如下：
a、外植体选取：从市场上买入较好的球兰品种，选择长势较好，无病虫害的若干成熟叶片作为外植体。
b、外植体消毒灭菌：将外植体的叶片用洗衣粉溶液洗涤，然后用清水冲洗10分钟；在超净工作台上，用体积分数为70％乙醇溶液浸泡10s，无菌水冲洗3次，再置于0.1％升汞溶液中浸泡15min，最后用无菌水冲洗4～5次，滤干水分；用解剖刀将经表面灭菌的叶片切成1.5cm2的小块，待接种。
c、培养基制备：
①基本培养基MS和White的制备：根据基本培养基MS和White成分及用量称取药品，使其充分溶解，并按相应浓度分别依次取用，先量取大量元素母液，再依次加入微量元素母液、铁盐母液和有机成分。
②再按外植体诱导培养基、增殖继代培养基、生根培养基及生根浸泡液来加入激素及稀土，其分别添加为：
外植体诱导培养基：琼脂10g·L-1+基本培养基MS+激动素KT 1.0mg·L-1+6-苄基嘌呤6-BA 1.0mg·L-1+萘乙酸NAA 1.0mg·L-1；
增殖继代培养基：琼脂10g·L-1+基本培养基MS+6-苄基嘌呤6-BA 2.0mg·L-1+萘乙酸NAA 0.2mg·L-1+赤霉素GA 0.8mg·L-1+硝酸铈Ce(NO3)3 0.30mg·L-1；
芽分化培养基：琼脂10g·L-1+基本培养基MS+激动素KT 1.0mg·L-1+萘乙酸NAA 0.5mg·L-1+赤霉素GA 1.0mg·L-1+硝酸镧La(NO3)3 0.20mg·L-1+硝酸铈Ce(NO3)3 0.30mg·L-1；
生根培养基：琼脂10g·L-1+基本培养基White+赤霉素GA 1.0mg·L-1+氯化镧LaCl3 20mg·L-1；
生根浸泡液，包括萘乙酸NAA 1.0mg·L-1，赤霉素GA 0.5mg·L-1，硝酸铈Ce(NO3)3 0.25mg·L-1+氯化镧LaCl3 30mg·L-1。
③溶化琼脂：称取琼脂10g·L-1，用蒸馏水加热烧开熔化琼脂，待琼脂完全熔化后，把调配好的激素和稀土元素溶液加入，用pH试纸测pH值，并用0.1mol/L的NaOH或HCl调节pH值为5.8，最后加水定容至所需体积。
④分装：将配好的培养基分装于培养瓶中，分装时注意不要把培养基倒在瓶口上，以防引起污染，然后用封口膜或瓶盖封口，装入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。
d、组织培养：将步骤b制得的外植体在超净工作台上接种于外植体诱导培养基上，培养50天后，将形成的愈伤组织用解剖刀进行分切，分别转接于增殖继代培养基上进行培养；愈伤组织进行增殖继代培养后，再将其转接于芽分化培养基上进行丛生芽和芽点的促生培养；当芽生长至2～3cm高的壮苗时，从瓶中取出，放入生根浸泡液中浸泡30min，再将浸泡后的壮苗取出，将壮苗用无菌吸水纸将表面液体吸干并转入White培养基中，6天后取出，再转入生根培养基中进行生根培养。
e、移栽：将生根后的球兰组培苗进行炼苗后移栽。
实施例3
培养基配方：
外植体诱导培养基：琼脂6g·L-1+基本培养基MS+激动素KT 0.80mg·L-1+6-苄基嘌呤6-BA 0.8mg·L-1+萘乙酸NAA 0.75mg·L-1；
增殖继代培养基：琼脂6g·L-1+基本培养基MS+6-苄基嘌呤6-BA 1.7mg·L-1+萘乙酸NAA 0.2mg·L-1+赤霉素GA 0.6mg·L-1+硝酸铈Ce(NO3)30.25mg·L-1；
芽分化培养基：琼脂6g·L-1+基本培养基MS+激动素KT 0.7mg·L-1+萘乙酸NAA 0.5mg·L-1+赤霉素GA 1.0mg·L-1+硝酸镧La(NO3)3 0.18mg·L-1+硝酸铈Ce(NO3)3 0.25mg·L-1；
生根培养基：琼脂6g·L-1+基本培养基White+赤霉素GA 0.75mg·L-1+氯化镧LaCl3 15mg·L-1；
生根浸泡液，包括萘乙酸NAA 0.6mg·L-1，赤霉素GA 0.5mg·L-1，硝酸铈Ce(NO3)3 0.20mg·L-1+氯化镧LaCl3 23mg·L-1。
采用上述培养基进行组织培养的方法如下：
a、外植体选取：从市场上买入较好的球兰品种，选择长势较好，无病虫害的若干成熟叶片作为外植体。
b、外植体消毒灭菌：将外植体的叶片用洗衣粉溶液洗涤，然后用清水冲洗15分钟；在超净工作台上，用体积分数为75％乙醇溶液浸泡5s，无菌水冲洗1次，再置于0.1％升汞溶液中浸泡13min，最后用无菌水冲洗4～5次，滤干水分；用解剖刀将经表面灭菌的叶片切成2.5cm2的小块，待接种。
c、培养基制备：
①基本培养基MS和White的制备：根据基本培养基MS和White成分及用量称取药品，使其充分溶解，并按相应浓度分别依次取用，先量取大量元素母液，再依次加入微量元素母液、铁盐母液和有机成分。
②再按外植体诱导培养基、增殖继代培养基、芽分化培养基、生根培养基及生根浸泡液来加入激素及稀土，其分别添加为：
外植体诱导培养基：琼脂6g·L-1+基本培养基MS+激动素KT 0.80mg·L-1+6-苄基嘌呤6-BA 0.8mg·L-1+萘乙酸NAA 0.75mg·L-1；
增殖继代培养基：琼脂6g·L-1+基本培养基MS+6-苄基嘌呤6-BA 1.7mg·L-1+萘乙酸NAA 0.2mg·L-1+赤霉素GA 0.6mg·L-1+硝酸铈Ce(NO3)3 0.25mg·L-1；
芽分化培养基：琼脂6g·L-1+基本培养基MS+激动素KT 0.7mg·L-1+萘乙酸NAA 0.5mg·L-1+赤霉素GA 1.0mg·L-1+硝酸镧La(NO3)3 0.18mg·L-1+硝酸铈Ce(NO3)3 0.25mg·L-1；
生根培养基：琼脂6g·L-1+基本培养基White+赤霉素GA 0.75mg·L-1+氯化镧LaCl3 15mg·L-1；
生根浸泡液，包括萘乙酸NAA 0.6mg·L-1，赤霉素GA 0.5mg·L-1，硝酸铈Ce(NO3)3 0.20mg·L-1+氯化镧LaCl3 23mg·L-1。
③溶化琼脂：称取琼脂6g·L-1，用蒸馏水加热烧开熔化琼脂，待琼脂完全溶熔化后，把调配好的激素和稀土元素溶液加入，用pH试纸测pH值，并用0.1mol/L的NaOH或HCl调节pH值为5.8，最后加水定容至所需体积。
④分装：将配好的培养基分装于培养瓶中，分装时注意不要把培养基倒在瓶口上，以防引起污染，然后用封口膜或瓶盖封口，装入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。
d、组织培养：将步骤b制得的外植体在超净工作台上接种于外植体诱导培养基上，培养40天后，将形成的愈伤组织用解剖刀进行分切，分别转接于增殖继代培养基上进行培养；愈伤组织进行增殖继代培养后，再将其转接于芽分化培养基上进行丛生芽和芽点的促生培养；当芽生长至2～3cm高的壮苗时，从瓶中取出，放入生根浸泡液中浸泡25min，再将浸泡后的壮苗取出，将壮苗用无菌吸水纸将表面液体吸干并转入White培养基中，8天后取出，再转入生根培养基中进行生根培养。
e、移栽：将生根后的球兰组培苗进行炼苗后移栽。
虽然结合具体实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但并非是对本专利保护范围的限定。在权利要求书所限定的范围内，本领域的技术人员不经创造性劳动即可做出的各种修改或调整仍受本专利的保护。

Claims (2)

1.一种球兰组织培养用培养基，其特征在于，包含用下述原料配制成的各种培养基：
外植体诱导培养基，包括琼脂6～10g·L-1，基本培养基MS，激动素KT 0.5～1.0mg·L-1，6-苄基嘌呤6-BA 0.5～1.0mg·L-1，和萘乙酸NAA 0.5～1.0mg·L-1；
增殖继代培养基，包括琼脂6～10g·L-1，基本培养基MS，6-苄基嘌呤6-BA1.5～2.0mg·L-1，萘乙酸NAA 0.2mg·L-1，赤霉素GA 0.5～0.8mg·L-1，和硝酸铈Ce(NO3)3 0.20～0.30mg·L-1；
芽分化培养基，包括琼脂6～10g·L-1，基本培养基MS，激动素KT 0.5～1.0mg·L-1，萘乙酸NAA 0.5mg·L-1，赤霉素GA 1.0mg·L-1，硝酸镧La(NO3)3 0.15～0.20mg·L-1，和硝酸铈Ce(NO3)3 0.20～0.30mg·L-1；
生根培养基，包括琼脂6～10g·L-1，基本培养基White，赤霉素GA0.5～1.0mg·L-1，氯化镧LaCl3 10～20mg·L-1；
生根浸泡液，包括萘乙酸NAA 0.2～1.0mg·L-1，赤霉素GA 0.5mg·L-1，硝酸铈Ce(NO3)3 0.15～0.25mg·L-1，和氯化镧LaCl3 15～30mg·L-1。
2.一种球兰组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、外植体选取：选择长势较好、无病虫害的若干成熟叶片作为外植体；
b、外植体消毒灭菌：将外植体的叶片用洗衣粉溶液洗涤，再用清水冲洗10～20分钟；在超净工作台上，用体积分数为65～75％乙醇溶液浸泡5～15s，无菌水冲洗1～3次，再置于升汞溶液中浸泡10～15min，最后用无菌水冲洗4～5次，滤干水分；再将经表面灭菌的叶片切成0.5～2.5cm2的小块，待接种。
c、组织培养：将步骤b制得的外植体在超净工作台上接种于外植体诱导培养基上，培养30～50天后，将形成的愈伤组织进行分切，分别转接于增殖继代培养基上进行培养；愈伤组织进行增殖继代培养后，再将其转接于芽分化培养基上进行丛生芽和芽点的促生培养；当芽生长为2～3cm高的壮苗时，放入生根浸泡液中浸泡20～30min，再将浸泡后的壮苗取出，将壮苗表面的液体吸干并转入White培养基中，6-8天后取出，转入生根培养基中进行生根培养；
d、移栽：将进行生根培养后的球兰组培苗进行炼苗后移栽。
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