CN106465680B

CN106465680B - 一种快速的芹菜组培体系

Info

Publication number: CN106465680B
Application number: CN201510510440.6A
Authority: CN
Inventors: 熊爱生; 谭国飞
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2015-08-19
Filing date: 2015-08-19
Publication date: 2020-11-20
Anticipated expiration: 2035-08-19
Also published as: CN106465680A

Abstract

本发明涉及一种快速的芹菜组培体系，本技术体系可以用于快速获得芹菜愈伤组织及组培苗，满足芹菜科研和遗传育种的要求。该技术体系包括：芹菜种子预处理方法、种子消毒方法、接种方法、培养条件、培养基使用及激素浓度的配比等。该技术体系能够快速获得芹菜愈伤组织及组培苗，对芹菜扩繁及科学研究具有重要的意义。

Description

一种快速的芹菜组培体系

技术领域

本发明涉及一种芹菜组培体系的建立，用于快速获得芹菜愈伤组织及组培苗，满足芹菜扩繁及科研需求。该体系包括：芹菜种子预处理方法、种子消毒方法、接种方法、培养条件、培养基及激素浓度的配比等。该技术能够快速获得芹菜愈伤组织及组培苗，对芹菜扩繁及科学研究具有重要的意义。

背景技术

组培是利用生物细胞全能性，快速获得完整生物体或获得特定生物材料的方法。组培广泛用于农业的实际生产及科学研究等领域，如花卉快速繁殖、马铃薯脱毒、转基因功能验证等。目前，很多农作物已经建立了较为成熟的组培技术体系，如兰花、马铃薯、胡萝卜、白菜等，然而芹菜组培体系还没有相关报道，制约了芹菜的科学研究。芹菜种子小、种子发芽抑制物质含量较为丰富、前期生长缓慢等特点，影响芹菜组培体系的建立。为此，我们结合芹菜的生长特性和遗传特点，建立了一种快速的芹菜组培技术体系。该技术体系，可满足芹菜扩繁和科学研究的需求。该技术体系对芹菜转基因功能验证、芹菜材料快速繁殖以及芹菜相关基础理论研究，均具有十分重要的意义。

根据芹菜种子小、富含抑制物质的特点，该体系对芹菜种子先进行浸水处理后，再采用一定浓度的次氯酸钠消毒剂进行振荡消毒，其后按照一般组培技术流程进行。该技术体系主要涉及到：芹菜种子预处理方法、种子消毒方法、接种方法、培养条件、培养基及激素浓度配比等。

发明内容

1.本发明目的在于提供一种快速芹菜组培的技术体系。

2.发明通过芹菜种子预处理方法、种子消毒方法、接种方法、培养条件、培养基及激素浓度配比等，实现芹菜组培体系的快速建立。

附图说明

图1.振荡消毒芹菜种子(除去抑制物质)

图2.培养皿中接种芹菜种子量

图3.芹菜外植体分离所需芹菜大小要求

图4.诱导芹菜芽分化及根的产生

具体实施方式

1.种子预处理。芹菜种子小，很难除去种子中的杂物及发育不好的芹菜种子，同时芹菜富含黄酮类抑制物质，严重影响芹菜的发芽。采用蒸馏水对芹菜种子进行预处理，其目的在于使芹菜种子中的杂物及发育不良的种子漂浮，及时除去。蒸馏水预处理也可以使黄酮类物质更好的在后面振荡消毒中分离出来，利于芹菜种子的发芽。芹菜种子预处理参数为1g芹菜种子，采用40mL蒸馏水浸泡，约4h，每隔30min，摇动一次，除去漂在上面的杂物及发育不良种子。预处理结束后用移液器移除水分。

2.振荡消毒。目的在于使芹菜种子所含抑制物脱离出来，以及使得芹菜种子消毒彻底。消毒采用次氯酸钠消毒，工作浓度为20％(v/v)次氯酸钠，振荡采用振荡器进行，1200转/min。消毒23min，可将80％～90％黄酮物质脱离(图1)，感菌率只有0.5％～1％。

3.接种。芹菜种子消毒完成后，将消毒好的种子，放于已紫外消毒好的工作台上，工作台紫外消毒需要3h左右。用移液器移除消毒液，然后用灭菌好的蒸馏水进行清洗，洗到蒸馏水为无色为此(3～4次，目的在于尽量除去芹菜发芽抑制物)，用移液器移除水分。将种子接种于事先准备好的1/2MS培养基中，培养皿为直径9cm，高为2cm。为了利于芹菜苗生长，接种量为每个培养皿约50～60粒种子为宜，接种好的培养皿及时用封口膜封住(图2)。

4.光下培育。芹菜种子为需光种子，其萌发需要一定的光强和光照时间，也需要适宜的温度。将接种好的芹菜，放置于光密度为50μmol*(m²·s)^-1，光周期12h/12h(光照/黑暗)，温度为25℃/20℃(光照/黑暗)光培箱中。每隔2d，检测是否感菌，及时移除或转接。约4d芹菜开始发芽，7d子叶展开。

5.外植体分离培养及愈伤诱导。当芹菜子叶展开时，需要再进行3d左右的培养(图3)，利于子叶增大及下胚轴伸长等。培养基采用1/2MS，激素为1.0mg/L IAA和1.0mg/L 6-BA。分离外植体，下胚轴剪成长度为0.3～0.4cm小段，每片子叶剪成3小片为宜，可将下胚轴及子叶分开接种于培养基中。接种好的外植体，放置于黑暗环境下培养，温度为25℃培养箱，3～4d可看出愈伤长出，培养7d，移到种子发芽条件中光培箱中培养，使愈伤组织长大。

6.分化成株诱导。愈伤于光下培养7d左右，可进行分化诱导。诱导培养基为MS培养基，无需添加激素。将分化好的愈伤接入MS培养基中，密度控制在30个愈伤，封口膜封好后，放入愈伤诱导培养箱中，温度为25℃。培养7d后，移入种子萌发环境中培养，约需15d可看出芽长出(图4)。继续培养15d可发育成具有叶片和少量根部的植株。培养到一定大小，经过锻炼后，可进行移栽；或者可继续分离组织，按照上面的步骤，扩繁芹菜。

7.结果1：振动消毒方法，可消除抑制物质，使芹菜种子发芽提前；同时该消毒方法，灭菌彻底，可以满足芹菜组培需要。

8.结果2：该方法可在15d左右，获得芹菜愈伤组织，35d左右芹菜开始分化，2个月左右便可得到组培苗。

Claims

1.一种快速的芹菜组培体系，其特征在于，该体系包括：

(1)种子预处理：1g芹菜种子，采用40mL蒸馏水浸泡4h，每隔30min，摇动一次，除去漂在上面的杂物及发育不良种子；预处理结束后用移液器移除水分；

(2)振荡消毒：采用工作浓度为20％(v/v)次氯酸钠振荡消毒，1200转/min，消毒23min；

(3)接种：芹菜种子消毒完成后，将消毒好的种子，放于已紫外消毒好的工作台上；用移液器移除消毒液，然后用灭菌好的蒸馏水进行清洗，洗到蒸馏水为无色为止，用移液器移除水分；将种子接种于事先准备好的1/2MS培养基中，接种好的培养皿及时用封口膜封住；

(4)光下培育：将接种好的芹菜，放置于光密度为50μmol*(m²·s)^-1，光周期12h/12h(光照/黑暗)，温度为25℃/20℃(光照/黑暗)光培箱中；每隔2d，检测是否感菌，及时移除或转接；

(5)外植体分离培养及愈伤诱导：当芹菜子叶展开时，再培养3d；培养基采用1/2MS，激素为1.0mg/L IAA和1.0mg/L 6-BA；分离外植体，下胚轴剪成长度为0.3～0.4cm小段，每片子叶剪成3小片，将下胚轴及子叶分开接种于培养基中；接种好的外植体，放置于黑暗环境下培养，温度为25℃培养箱，培养7d，移到光培箱中培养；

(6)分化成株诱导：愈伤于光下培养7d，进行分化诱导；将分化好的愈伤接入MS培养基中，密度控制在30个愈伤，封口膜封好后，放入愈伤诱导培养箱中，温度为25℃；继续培养，培养到一定大小，经过锻炼后，进行移栽；或者继续分离组织，按照上述步骤，扩繁芹菜。