CN105010140A - 一种利用稀土元素促进铁皮石斛丛生芽的诱导和生根的培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用稀土元素促进铁皮石斛丛生芽的诱导和生根的培养基和培养方法。诱导培养基为向1/2MS培养基中加入一定量的花宝二号、硝酸钐、香蕉汁、土豆汁、活性炭、琼脂、白砂糖；生根培养基为向1/2MS培养基中加入一定量的花宝二号、硝酸铕、香蕉汁、土豆汁、活性炭、琼脂、白砂糖。该发明向培养基中增加适量的稀土元素，适量的稀土元素能够增加植物体内源激素的含量，使各种酶的活性增强，呼吸作用提高，有效清除组织内的H₂O₂，从而促进组培苗的生物量增加，获得更多且根系粗壮的组培苗。该方法具有简单易行，获得更多植株，生根时间短，根系发达，经济实用的优点，可大大提高组培苗移栽成活率，满足集约化生产的要求。

Description

一种利用稀土元素促进铁皮石斛丛生芽的诱导和生根的培养基及培养方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种药用植物铁皮石斛丛生芽的诱导与生根的培养方法，是可有效增加出苗率，提高移栽成活率的方法。

背景技术

铁皮石斛又称黑节草，属于兰科附生兰类，是一种珍稀的药用植物，具有养阴生津，润喉护嗓，温胃明目等功效，属国家二级保护的贵重濒危药材之一，历代医学经典均奉其为“药中之上品”。铁皮石斛的药用部分是新鲜或干燥茎，现代医学研究表明：铁皮石斛能显著提高机体免疫功能，抗衰老，抗疲劳，耐缺氧，具有辅助抑制肿瘤等功效。铁皮石斛作为一种名贵的中药材具有很大的市场需求，但由于铁皮石斛种子极小且不含胚乳，需与真菌共生才能萌发，自然条件下繁殖能力极低，再加上生境的破坏，人类长期掠夺式采挖，野生铁皮石斛已濒临灭绝。为了缓解这一局面，发展铁皮石斛人工栽培满足市场需求已经成为大势所趋。

目前关于铁皮石斛组织培养已有相关报道，对于人工栽培瓶苗，出苗率的高低以及移栽存活率的高低是组织培养技术能否应用于工厂化大规模生产的关键。有研究表明，适量的稀土元素能够增加植物体内源激素的含量，从而促进叶绿体膜上Mg²⁺-ATPase活性，使各种酶的活性增强，呼吸作用提高，有效清除组织内的H₂O₂，从而促进组培苗的生物量增加。稀土元素多用于水生植物的富集和缓解、小麦生长调节，未见其应用于铁皮石斛的组织培养。因此，亟需一种将稀土元素与组织培养相结合的新型培养技术，应用于铁皮石斛集约化生产，以有效增加铁皮石斛组培出苗数量，提高铁皮石斛组培苗炼苗移栽的成活率。

发明内容

本发明的旨在于提供一种丛生芽的诱导和生根的培养方法，该培养方法中包括一种利用稀土元素促进丛生芽诱导的培养基和一种稀土元素促进诱导生根的培养基。针对现有技术中出苗率不高，移栽存活率低等问题，本发明提供了一种切实可行的解决方法。本发明具有简单易行，出苗数量多，成苗移栽成活率高，为工厂化育苗提供技术支持。

选取经过分化阶段长成高度为1～2厘米铁皮石斛组培苗为外植体材料，接种到丛生芽的诱导培养基中，经7周左右的生长形成高度约3～4厘米的小苗；选取长势整齐的小苗，将其根部切断，保留2厘米左右的根部，在生根培养基上诱导4周左右，形成6～8厘米高的大苗，根系发达且茎粗壮的成苗即可进行移栽，从而实现了本发明的目的。

本发明为达到其目的，采用的技术方案如下：

一种利用稀土元素促进铁皮石斛丛生芽的诱导与生根培养基，

所述丛生芽的诱导培养基为向1/2M培养基中加入花宝二号1～3g/L、香蕉汁30～60g/L、土豆汁50～80g/L、硝酸钐4～15mg/L、白砂糖15～30g/L、活性炭1～3g/L、琼脂6～8g/L配置而成；生根培养基为向1/2M培养基中加入花宝二号0.5～3g/L、香蕉汁30～60g/L、土豆汁50～80g/L、硝酸铕4～15mg/L、白砂糖15～30g/L、活性炭1～3g/L、琼脂6～8g/L、配置而成。

优化的，如下组分在丛生芽的诱导培养基中的浓度分别为：花宝二号1～2g/L、、香蕉汁40～60g/L、土豆汁60～80g/L、硝酸钐4～12mg/L；如下组分在生根培养基中的浓度分别为：花宝二号1～2g/L、、香蕉汁40～60g/L、土豆汁60～80g/L、硝酸铕4～12mg/L。

进一步优化的，如下组分在丛生芽的诱导培养基中的浓度分别为：花宝二号1g/L、香蕉汁60g/L、土豆汁80g/L、硝酸钐10mg/L；如下组分在生根培养基中的浓度分别为：花宝二号1g/L、、香蕉汁60g/L、土豆汁80g/L、硝酸铕10mg/L。

本发明还公开了一种铁皮石斛丛生芽的诱导和生根的培养方法，包括以下步骤：

(1)诱导丛生芽

铁皮石斛原球茎经过分化，长成具有根茎叶的幼苗，选择其中1～2厘米长势良好的幼苗作为材料，接种于上述丛生芽的诱导培养基中，每瓶接种15株，2周后幼苗恢复活力,3周后茎节间生长点开始萌动，5周左右有许多新芽长出，幼苗数量增多。

(2)诱导生根

选取经过丛生芽的诱导长至3～4厘米的小苗，用剪刀将其缠绕结团的根部剪短，保留2厘米左右，将小苗一根根分离，接种到上述生根培养基中。2周左右，被截断的根部开始分裂生长。

(3)炼苗与移栽

将组培瓶里的成苗放置在自然光下炼苗一周；再将瓶苗取出并洗净根部培养基后，移栽至泥炭土和苔藓体积比为1:1的混合基质中，成活率在95％以上。

本发明中硝酸钐和硝酸铕按下列方法添加到培养基：先将未添加硝酸钐和硝酸铕的培养基高温灭菌，在培养基未冷却前，于超净工作台中，硝酸钐和硝酸铕分别溶于无菌水，经孔径为0.22μm的过滤灭菌器过滤灭菌，再用移液枪分装到每一瓶培养基中，趁热摇匀。

上述方法步骤(2)中，培养的条件为：温度22～26℃，光照强度2000～3000lx，光暗交替16h/8h。

上述方法步骤(3)中，培养的条件为：温度22～26℃，光照强度2000～2500lx，光暗交替12h/12h。

本发明的有益效果在于：

本发明中向常规培养基中添加硝酸钐和硝酸铕，它们都属于稀土元素，低浓度的硝酸钐可促进丛生芽的生长，有效增加铁皮石斛组培苗出苗数量，提高出苗率，从而降低组培苗成本；低浓度的硝酸铕可有效刺激根的分生区，诱导截断根的发端，同时促进组培苗生根，获得粗壮的根系，提高成苗移栽成活率，便于铁皮石斛工厂化生产。此外，向培养基中添加香蕉汁和土豆汁，为组培苗的生长提供了必要的微量元素、天然激素等，有效促进组培苗生长，缩短了成苗时间。另一方面，组培苗转移到新的培养基后短期内会有黄化适应过程，添加稀土元素后，发现可以大大缩短这一过程，使组培苗在较短时间内适应新的培养基。

附图说明

图1.丛生芽的诱导培养4周后组培苗的生长情况(左图：硝酸钐诱导培养基右图：对照组)。

图2.生根培养4周后组培苗的生长情况(左图：硝酸铕诱导培养基右图：对照组)。

图3.生根诱导7周后组培苗的生长情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1～8

(1)配制实例1～8所需的诱导丛生芽的培养基

实例1～8所需的诱导丛生芽的培养基为向1/2MS培养基中添加琼脂、白砂糖、活性炭、花宝二号、香蕉汁、土豆汁、硝酸钐配制而成，花宝二号、香蕉汁、土豆汁、硝酸钐在实施例1～8所需的诱导丛生芽的培养基中的浓度均参见表1所示。表1中的诱导丛生芽的培养基编号1～8号分别依次对应于实施例1～8的诱导丛生芽的培养基。配制实施例1～8的诱导丛生芽的培养基后，将其分别装于1～8号培养瓶中，经高压灭菌冷却后备用。

表1 诱导丛生芽的培养基各成分使用浓度

(2)配置实例1～8所需的诱导生根培养基

实例1～8所需的诱导生根培养基为向1/2MS培养基中添加琼脂、白砂糖、活性炭、花宝二号、香蕉汁、土豆汁、硝酸铕配制而成，花宝二号、香蕉汁、土豆汁、硝酸铕在实施例1～8所需的诱导丛生芽的培养基中的浓度均参见表2所示。表2中的诱导生根的培养基编号1～8号分别依次对应于实施例1～8的诱导生根培养基。配制实施例1～8的诱导生根培养基后，将其分别装于1～8号培养瓶中，经高压灭菌冷却后备用。

表2 诱导生根的培养基各成分使用浓度

在配置诱导丛生芽的培养基和诱导生根培养基时：

(a)配制1/2MS基础母液。

(b)按照表1所述的生根培养基配方，称取适量琼脂、白砂糖和活性炭，将琼脂倒入煮沸自来水中溶解，再倒入白砂糖和活性炭直至溶解后保温备用。

(c)将洗净去皮的香蕉和土豆切成小块，然后放入榨汁机中粉碎，得到的匀浆即为香蕉汁和土豆汁。

(d)将母液、花宝二号、琼脂、白砂糖、活性炭、香蕉汁和土豆汁按一定比例定容后，分装到培养瓶，高温灭菌。

(e)于超净工作台中，将硝酸钐和硝酸铕分别溶于无菌水，经孔径为0.22μm的过滤灭菌器过滤灭菌，再用移液枪分装到(d)中所述每一瓶灭完菌的培养基中，趁热摇匀。

在配制生根培养基时，除各种营养元素母液采用蒸馏水配制外，其他组分均可采用自来水进行配制，可以间接简化程序和降低成本。

(3)组培苗接种及培养

于超净工作台中进行接种，用经过高温消毒的镊子小心将1～2厘米铁皮石斛组培苗从培养瓶中取出，放置在预先消毒的大培养皿上，挑选出其中长势均一的幼苗，一根根插入到实施例1～8的诱导丛生芽的诱导培养基中，每瓶接种15株，培养的条件为：温度22～26℃，光照强度2000～3000lx，光暗交替16h/8h。经7周左右的诱导生长，幼苗长到3～4厘米。选取其中长势整齐的组培苗，用经过高温消毒的镊子从组培瓶中取出，放在灭过菌的大培养皿上，用预先灭菌的剪刀将缠绕在一起的根剪短，保留2厘米左右，再一根根插入到诱导生根培养基中，培养的条件为：温度22～26℃，光照强度2000～2500lx，光暗交替12h/12h。

实施例1～8接种到诱导丛生芽的培养基后，3周左右即可观察到有丛生芽长出，7周左右幼苗数量明显增多。将实施例1～8接种到诱导丛生芽的培养基中生长7周，对各瓶中的组培苗数量进行统计，实验数据见表3，生长情况见图1。

表3 实施例1～8诱导丛生芽的诱导7周后实验数据

由表3可以看出，实施例1号、2号、3号、4号、5号、6号的组培苗丛生芽的诱导效果优于实施例7号和8号的对照组，说明稀土元素硝酸钐有助于诱导丛生芽，增加组培苗数目。其中实施例2号和3号的效果最佳，说明硝酸钐的浓度在10mg/L时，诱导数目最多。

实施例1～8接种到诱导生根培养基后，2周左右截断根部开始再生，同时有不定根生成，4周左右根系粗壮且发达，即可达到炼苗出瓶。于4周左右，对每一瓶组培苗的根的数量及粗壮程度进行统计，实验数据见表4，生长情况见图2、图3。

表4 实施例1～8诱导生根4周后实验数据

由表4可以看出，实施例1号、2号、3号、4号、5号、6号的组培苗生根效果优于实施例7号和8号，根系发达，生长健壮，说明稀土元素硝酸铕有助于根的再生，同时增粗作用明显。其中实施例2号和3号的效果最佳，说明浓度为10mg/L的硝酸铕诱导作用最明显。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，凡未脱离本发明申请专利范围所做的任何简单修改、均等变化与修饰，仍属于本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种利用稀土元素促进铁皮石斛丛生芽的诱导与生根培养基，其特征在于，所述丛生芽的诱导培养基，是以1/2MS培养基为基础，其中加入花宝二号1～3g/L、香蕉汁30～60g/L、土豆汁50～80g/L、硝酸钐4～15mg/L、白砂糖15～30g/L、活性炭1～3g/L、琼脂6～8g/L；所述生根培养基，是以1/2MS培养基为基础，其中加入花宝二号0.5～3g/L、香蕉汁30～60g/L、土豆汁50～80g/L、硝酸铕4～15mg/L、白砂糖15～30g/L、活性炭1～3g/L、琼脂6～8g/L。

2.根据权利要求1所述的利用稀土元素促进铁皮石斛丛生芽的诱导与生根培养基，其特征在于，如下组分在丛生芽的诱导培养基中的浓度分别为：花宝二号1～2g/L、香蕉汁40～60g/L、土豆汁60～80g/L、硝酸钐4～12mg/L、白砂糖30g/L、活性炭1.5g/L、琼脂7.2g/L；如下组分在生根培养基中的浓度分别为：花宝二号1～2g/L、、香蕉汁40～60g/L、土豆汁60～80g/L、硝酸铕4～12mg/L、白砂糖30g/L、活性炭1.5g/L、琼脂7.2g/L。

3.根据权利要求2所述的利用稀土元素促进铁皮石斛丛生芽的诱导与生根培养基，其特征在于，如下组分在丛生芽的诱导培养基中的浓度分别为：花宝二号1g/L、香蕉汁60g/L、土豆汁80g/L、硝酸钐10mg/L、白砂糖30g/L、活性炭1.5g/L、琼脂7.2g/L；如下组分在生根培养基中的浓度分别为：花宝二号1g/L、、香蕉汁60g/L、土豆汁80g/L、硝酸铕10mg/L、白砂糖30g/L、活性炭1.5g/L、琼脂7.2g/L。

4.根据权利要求1～3之一所述的利用稀土元素促进铁皮石斛丛生芽的诱导与生根培养基，其特征在于，硝酸钐和硝酸铕按下列方法添加到培养基：现将未添加硝酸钐和硝酸铕的培养基高温灭菌，在培养基未冷却前，于超净工作台中，硝酸钐和硝酸铕分别溶于无菌水，经孔径为0.22μm的过滤灭菌器过滤灭菌，再用移液枪分装到每一瓶培养基中，趁热摇匀。

5.一种利用稀土元素促进铁皮石斛丛生芽的诱导与生根培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)诱导丛生芽

铁皮石斛原球茎经过分化，长成具有根茎叶的幼苗，选择其中1～2厘米长势良好的幼苗作为材料，接种于丛生芽的诱导培养基中，每瓶接种15株进行丛生芽的诱导；所述丛生芽的诱导培养基，是以1/2MS培养基为基础，其中加入花宝二号1～3g/L、香蕉汁30～60g/L、土豆汁50～80g/L、硝酸钐4～15mg/L、白砂糖15～30g/L、活性炭1～3g/L、琼脂6～8g/L；

(2)诱导生根

选取经过丛生芽的诱导诱导长至3～4厘米的小苗，用剪刀将其缠绕结团的根部剪短，保留2厘米左右，将小苗一根根分离，接种到生根培养基中进行生根诱导；所述生根培养基，是以向1/2MS培养基为基础，其中加入花宝二号0.5～3g/L、香蕉汁30～60g/L、土豆汁50～80g/L、硝酸铕4～15mg/L、白砂糖15～30g/L、活性炭1～3g/L、琼脂6～8g/L；

(3)炼苗与移栽

将组培瓶里的成苗放置在自然光下炼苗一周；再将瓶苗取出并洗净根部培养基后，移栽至泥炭土和苔藓体积比为1:1的混合基质中进行培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中培养的条件为：温度22～26℃，光照强度2000～3000lx，光暗交替16h/8h。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，上述方法步骤(3)中，培养的条件为：温度22～26℃，光照强度2000～2500lx，光暗交替12h/12h。