CN102405841A - 一种利用花梗诱导石蒜愈伤组织的方法 - Google Patents

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本发明公开了一种利用花梗诱导石蒜愈伤组织的方法，包括：取经灭菌处理的石蒜花梗，接种于诱导培养基中，在光照条件下培养28-32d后转入黑暗条件下培养88-92d；所述的诱导培养基为含2.0-2.5mg/L 2，4-D和1.5-2.5mg/L BA的MS培养基，所述的MS培养基中含蔗糖浓度为30-60g/L，琼脂浓度为5-8g/L，pH5.6-5.8。本发明用石蒜花梗作外植体，诱导培养基中培养产生石蒜愈伤组织，不以消耗鳞茎为代价，能有效保护优质、珍稀石蒜种质资源。

Description

一种利用花梗诱导石蒜愈伤组织的方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用花梗诱导石蒜愈伤组织的方法。
背景技术
石蒜(Lycoris radiata)是原产我国的著名球根花卉，兼具观赏价值与药用价值。石蒜自然繁殖率低，鳞茎幼年期长达5-6年。而近几年因对石蒜药用价值的发掘，石蒜资源被大量采集，野生资源保护面临危机。
1979年Koyama最早报道石蒜的组织培养，我国有关石蒜属植物的组培研究也逾20年，国内研究主要集中在探索通过石蒜不同外植体，如鳞茎、鳞芽、胚等来诱导不定芽或愈伤组织的途径获得小植株。通过鳞茎诱导不定芽途径所需时间短、变异少，是快速繁殖的良好手段；而愈伤组织生长快速、均匀、数量大，是进行育种、转化体系建立的有效途径。但取鳞片为外植体，需以损失石蒜鳞茎为代价，对于种质资源渐缺的石蒜而言，此方法风险较大。许多学者对石蒜属植物的愈伤诱导进行了探索，证明了石蒜鳞茎可诱导出愈伤组织，但未见利用花器官为外植体成功诱导愈伤的报道。
申请公布号为CN102144554A的发明专利公开了一种采用植物组织培养产生石蒜的方法，包括以下步骤：(1)MS培养基作为基本培养基，2，4-D、IAA、NAA、6-BA和IBA作为调控的生长激素制备培养基；(2)石蒜鳞茎作为外植体，消毒；(3)将鳞茎外植体接种在鳞茎诱导培养基上进行诱导培养，长出小鳞茎；(4)将小鳞茎转接入生根培养基上进行生根培养，使其具备独立从土壤、基质中吸收营养元素的能力；(5)将小鳞茎转接到培养基上培养；(6)把接种瓶瓶口打开进行炼苗；取出小鳞茎，移栽至蛭石、珍珠岩和营养土为混合基质的营养杯中；转接到大棚中，成活率达94-96％。该发明的方法采用的是石蒜鳞茎为外植体诱导培养产生石蒜，该方法需以损失石蒜鳞茎为代价，对于种质资源渐缺的石蒜而言，此方法风险较大。
发明内容
本发明提供了一种利用花梗诱导石蒜愈伤组织的方法，用石蒜花梗作外植体，诱导培养基中培养产生石蒜愈伤组织，不以消耗鳞茎为代价，能有效保护优质、珍稀石蒜种质资源。
一种利用花梗诱导石蒜愈伤组织的方法，包括：
取经灭菌处理的石蒜花梗，接种于诱导培养基中，在光照条件下培养28-32d后转入黑暗条件下培养88-92d；
所述的诱导培养基为含2.0-2.5mg/L 2，4-D和1.5-2.5mg/L BA的MS培养基，所述的MS培养基中含蔗糖浓度为30-60g/L，琼脂浓度为5-8g/L，pH5.6-5.8。
所述的光照培养条件为光照周期为12-14h/d，光照强度为1100-1250μmol·m-2·s-1，培养温度为22-28℃。
所述的黑暗培养条件为培养温度22-28℃。
所述的灭菌处理为将石蒜花梗置于含洗洁精与吐温80的清水中浸泡10-15min后，清水冲洗2-3h，然后用体积比为70-75％的乙醇消毒8-12min，质量体积比为0.1％的升汞溶液浸泡10-12min，无菌水冲洗4-5次。
所述的石蒜花梗取自石蒜幼嫩花序。
本发明的有益效果是：
1)提出一种利用石蒜花梗诱导愈伤组织的方法，最高愈伤诱导率可达78.13％；
2)该方法所用外植体为石蒜未展开花序的花梗，较石蒜鳞茎作外植体内生菌少，大大缓解石蒜组培污染率高的问题，提高愈伤组织诱导成功率；
3)用花梗作外植体，不以消耗鳞茎为代价，能有效保护优质、珍稀石蒜种质资源。
附图说明
图1为实施例1光照培养30d后的图像；
图2为实施例1黑暗培养30d后的图像；
图3为实施例1黑暗培养60d后的图像；
图4为实施例1黑暗培养90d后的图像。
具体实施方式
实施例1
1)培养基的配制，包括基本培养基和愈伤组织诱导培养基，各组分与每升的含量分别为：
①基本培养基：MS(Murashige和Skoog 1962)，加入蔗糖30g，琼脂8g，调pH5.7；
②诱导培养基：MS+2，4-D(2，4二氯苯氧乙酸)2mg，BA(苄氨基腺嘌呤)2mg。
2)外植体的准备：采摘石蒜幼嫩花序(花序未展开)，置于4℃冰箱存放；接种前一天取出，置于含洗洁精与吐温80体积比为1∶1的清水中浸泡15min后，清水冲洗3h，后用体积比为75％的乙醇消毒10min，体积比为0.1％的升汞溶液浸泡10min，无菌水冲洗4-5次，获得无菌花序；切下子房底部至花茎顶端的花梗部分，再将花梗切成2-3mm小段，作为接种外植体。
3)愈伤组织诱导培养：将无菌的2-3mm长石蒜花梗外植体接种至诱导培养基中，置于光照培养，培养30d，花梗颜色微黄或黄，体积稍有膨大，无愈伤组织出现(如图1所示)，然后转入黑暗继续诱导培养90d。黑暗培养30d时，花梗体积进一步膨大，部分花梗切口处产生泡状突起，花梗表面有透明圆形小突起(如图2所示)；黑暗培养60d时，花梗表面突起明显且粗糙，无水渍状愈伤组织出现(如图3所示)；黑暗培养90d时，原有花梗外植体褐化，产生浅黄色水渍状愈伤组织(如图4所示)。
诱导培养环境条件为：
第一阶段：培养温度为25±2℃，光照周期为12h/d，光照强度为1212.5μmol·m-2·s-1，培养时间30d。
第二阶段：黑暗培养，培养温度为25±2℃，培养时间为90d。愈伤诱导120d后，统计黄色水渍状愈伤组织诱导率为78.13％。
愈伤组织诱导率＝(产生愈伤组织外植体数/外植体接种数)×100％。
实施例2
1)培养基的配制，包括基本培养基和愈伤组织诱导培养基，各组分与每升的含量分别为：
①基本培养基：MS(Murashige和Skoog 1962)，加入蔗糖30g，琼脂8g，调pH5.6；
②诱导培养基：MS+2，4-D 2mg，BA 2.5mg。
2)外植体的准备：采摘石蒜幼嫩花序(花序未展开)，置于4℃冰箱存放；接种前一天取出，置于含洗洁精与吐温80体积比为1∶1的清水中浸泡15min后，清水冲洗3h，后用体积比为75％的乙醇消毒12min，体积比为0.1％的升汞溶液浸泡12min，无菌水冲洗4-5次，获得无菌花序；切下子房底部至花茎顶端的花梗部分，再将花梗切成2-3mm小段，作为接种外植体。
3)愈伤组织诱导培养：将无菌的2-3mm长石蒜花梗外植体接种至诱导培养基中，置于光照培养，培养30d，花梗颜色微黄或黄，体积稍有膨大，无愈伤组织出现，转入黑暗继续诱导培养90d。黑暗培养30d时，花梗体积进一步膨大，部分花梗切口处产生泡状突起，花梗表面有透明圆形小突起；黑暗培养60d时，花梗表面突起明显且粗糙，无水渍状愈伤组织出现；黑暗培养90d时，原有花梗外植体褐化，产生浅黄色水渍状愈伤组织。
诱导培养环境条件为：
第一阶段：培养温度为25±2℃，光照周期为12h/d，光照强度为1212.5μmol·m-2·s-1，培养时间为30d；
第二阶段：黑暗培养，培养温度为25±2℃，培养时间为90d。愈伤诱导120d后，统计黄色水渍状愈伤组织诱导率为77.62％。
实施例3
1)培养基的配制，包括基本培养基和愈伤组织诱导培养基，各组分与每升的含量分别为：
①基本培养基：MS(Murashige和Skoog 1962)，加入蔗糖30g，琼脂8g，调pH5.8；
②诱导培养基：MS+2，4-D 2.5mg，BA 2mg。
2)外植体的准备：采摘石蒜幼嫩花序(花序未展开)，置于4℃冰箱存放；接种前一天取出，置于含洗洁精与吐温80体积比为1∶1的清水中浸泡15min后，清水冲洗3h，后用体积比为75％的乙醇消毒10min，体积比为0.1％的升汞溶液浸泡12min，无菌水冲洗4-5次，获得无菌花序；切下子房底部至花茎顶端的花梗部分，再将花梗切成2-3mm小段，作为接种外植体。
3)愈伤组织诱导培养：将无菌的2-3mm长石蒜花梗外植体接种至诱导培养基中，置于光照培养，培养30d，花梗颜色微黄或黄，体积稍有膨大，无愈伤组织出现，转入黑暗继续诱导培养3个月。黑暗培养30d时，花梗体积进一步膨大，部分花梗切口处产生泡状突起，花梗表面有透明圆形小突起；黑暗培养60d时，花梗表面突起明显且粗糙，无水渍状愈伤组织出现；黑暗培养60d时，原有花梗外植体褐化，产生浅黄色水渍状愈伤组织。
诱导培养环境条件为：
第一阶段：培养温度为25±2℃，光照周期为12h/d，光照强度为1212.5μmol·m-2·s-1，培养时间30d；
第二阶段：黑暗培养，培养温度为25±2℃，培养时间为90d。愈伤诱导120d后，统计黄色水渍状愈伤组织诱导率为75.37％。

Claims (5)

1.一种利用花梗诱导石蒜愈伤组织的方法，其特征在于，包括：
取经灭菌处理的石蒜花梗，接种于诱导培养基中，在光照条件下培养28-32d后转入黑暗条件下培养88-92d；
所述的诱导培养基为含2.0-2.5mg/L 2，4-D和1.5-2.5mg/L BA的MS培养基，所述的MS培养基中含蔗糖浓度为30-60g/L，琼脂浓度为5-8g/L，pH5.6-5.8。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的光照培养条件为，光照周期为12-14h/d，光照强度为1100-1250μmol·m-2·s-1，培养温为22-28℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的黑暗培养条件为培养温度22-28℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的灭菌处理为将石蒜花梗置于含洗洁精与吐温80的清水中浸泡10-15min后，清水冲洗2-3h，然后用体积比为70-75％的乙醇消毒8-12min，质量体积比为0.1％的升汞溶液浸泡10-12min，无菌水冲洗4-5次。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的石蒜花梗取自石蒜幼嫩花序。
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