CN103355165B - 牡丹胚性愈伤组织的培养方法及其培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牡丹胚性愈伤组织的培养方法及其培养基。通过采用改良后含有特殊成分(如6-BA、KT细胞分裂素、TDZ植物生长调节剂、PIC除草剂及水解酪蛋白等物质)的MS培养基进行牡丹胚性愈伤组织的诱导，针对牡丹种胚外植体，采用本发明特有的培养方法，可使牡丹愈伤组织的诱导率达100％，其中胚性愈伤组织的诱导率达86％以上。

Description

牡丹胚性愈伤组织的培养方法及其培养基

技术领域

本发明属植物组织培养技术领域，涉及一种牡丹胚性愈伤组织的培养方法及其培养基。

背景技术

牡丹(Paeonia Suffruticosa)系芍药科、芍药属多年生灌木，是我国传统名花，已成为世界流行花木之一，市场前景非常广阔。但由于传统的牡丹繁殖方法存在繁殖率低、繁殖周期长等缺陷，严重制约了牡丹的繁殖和育种进程以及商品化发展。利用组织培养方法进行牡丹繁殖，以解决常规繁殖方法存在的不足，是牡丹商品化及产业化发展的必然趋势，同时也是加快牡丹育种和繁殖步伐的重要基础。

目前，牡丹组织培养通常采用如下两种途径：①直接诱导不定芽，然后在生根培养基上诱导生根；②先诱导出愈伤组织，再分化形成不定芽，最后在生根培养基上诱导生根。其中，第①种方法主要集中在鳞芽、胚等少数外植体的培养，但繁殖系数较小；第②种方法研究的范围较广，如土芽、叶柄、叶片、幼芽、心皮、雄蕊等，但存在愈伤组织诱导率低，且获得愈伤组织后能成功分化小苗的报道很少(其主要原因在于获得的愈伤组织质量差，缺少胚性愈伤组织)。

胚性愈伤组织可作为牡丹转基因研究的良好受体材料，胚性愈伤组织的制备可为牡丹的基因工程育种奠定基础。陈怡平等先后用紫斑牡丹的土芽、叶柄、叶片、幼芽、心皮、雄蕊及经组织培养获得的试管苗等作为外值体，来考察不同激素种类和浓度以及不同类型的外植体对愈伤组织诱导的影响。结果表明：在愈伤组织诱导时，组织脱分化对NAA浓度的变化比对BA浓度的变化敏感，NAA浓度稍高于BA浓度是比较理想的配方，而最为理想的配方为MS+BA 1.5mg/L+NAA 2.0mg/L；不同外植体中，试管苗的幼芽和土芽诱导率最高，叶柄和叶片次之；而生殖器官雄蕊和心皮未能诱导成功【陈怡平等，用紫斑牡丹不同外植体诱导愈伤组织的研究，西北师范大学学报(自然科学版)，2001年第3期，p66-69】。陈笑蕾分别采用叶柄、叶片进行愈伤组织诱导、增殖及分化培养，结果发现：各个因素对诱导愈伤组织的影响程度依次为6-BA＞2，4-D＞材料类型＞NAA＞IAA；用近枝干叶柄为材料，并培养于1/2MS+2，4-D 0.5mg/L+IAA 0.2mg/L培养基中，愈伤组织诱导率最高；在愈伤组织增殖培养过程中，6-BA和NAA是主要影响因素【陈笑蕾，牡丹组织培养的初步研究，2005年中国优秀硕士学位论文全文数据库，P24-28】。刘会超等报道了牡丹愈伤组织诱导和继代培养体系的建立，研究了不同外植体、激素对愈伤组织诱导和继代增殖的影响，但无牡丹愈伤组织分化的结果。牡丹愈伤组织诱导率低、质量差等问题影响了牡丹基因工程育种的进程【刘会超等，牡丹愈伤组织诱导和继代培养体系的建立，福建林业科技，2009年6月，p73-78】。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种牡丹胚性愈伤组织的培养方法及其培养基。本发明通过采用改良后含有特殊成分的MS培养基进行愈伤组织的诱导(特殊成分如6-BA、KT细胞分裂素、TDZ植物生长调节剂、PIC除草剂及水解酪蛋白等物质)，针对牡丹种胚外植体，通过本发明特定的培养方法，使牡丹愈伤组织的诱导率达100％，其中胚性愈伤组织的诱导率达86％以上。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。

所述的牡丹胚性愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：

1)采集授粉后80-115天的半成熟牡丹种子(形状大小如成熟牡丹种子，颜色为乳白色至淡褐色，种壳不硬)，筛选其中颗粒饱满的种子，用流水冲洗，再用70％(体积比)酒精消毒，然后用10-15％(体积比)的次氯酸钠溶液消毒，最后用无菌水冲洗；

2)在超净台上，用解剖刀切开消毒后的牡丹种子，剥取种胚；

3)将胚接种到含有特殊成分的MS培养基中，进行暗培养；

4)暗培养25-35天后，得胚性愈伤组织；

5)将暗培养获得的胚性愈伤组织在新鲜的含有特殊成分的MS培养基上继代1-2次后，胚性愈伤组织逐渐产生胚状体；

6)将步骤5)中的胚性愈伤组织和胚状体培养于去除PIC成分的含有特殊成分的MS培养基上，置于光照条件下培养，20-30天后胚性愈伤组织逐渐分化不定芽；胚状体萌发形成小植株；

7)将不定芽直接切割成单芽，转入生根培养基诱导生根，形成牡丹完整植株。

所述的含有特殊成分的MS培养基(即用于诱导牡丹胚性愈伤组织的培养基)，包含如下表1所示物质：

表1

其中，mg/L表示每升培养基中含各成分的毫克数，培养基的pH＝5.8-6.0。

所述的半成熟牡丹种子，其形状大小如成熟牡丹种子，颜色为乳白色至淡褐色，种壳不硬。

所述的暗培养温度为24-26℃。

所述步骤6)光照条件下培养温度为24-26℃，光照强度为1500-2500勒克斯。

所述的生根培养基的配方为：1/2MS(1/2含义是指MS培养基中的无机盐成分减半)+IBA(吲哚丁酸)5mg/L+蔗糖15g/L。

有益效果：

1)本发明将牡丹种子带种皮先后用70％(体积比)酒精和10-15％(体积比)的次氯酸钠溶液消毒后，切取其种胚作外植体，简化了消毒方法，并大大降低了消毒液对外植体的影响，且所用消毒剂对人体健康和环境安全危害小。

2)本发明以牡丹半成熟胚做外植体进行初始培养，外植体可在蒴果内置冰箱(4-6℃)冷藏25天左右而不影响培养效果；避免了土芽、叶柄、叶片、幼芽、心皮、雄蕊等其它外植体受季节影响大的缺点。并且由于牡丹种胚体积小，生命活力强，大大控制了培养物的褐化现象。

3)统计结果显示，采用本发明方法，暗培养后获得的愈伤组织的诱导率达100％，其中86％以上为胚性愈伤组织，容易形成胚状体或分化不定芽，克服了现有技术中牡丹外植体诱导愈伤组织困难、诱导率低、质量差而难形成体细胞胚或分化不定芽的问题。

4)采用本发明方法进行牡丹愈伤组织诱导培养，外植体几乎不发生污染；大大提高了工作效率并节省了研究成本。

5)本发明可为牡丹的转基因研究提供大量胚性愈伤组织作基础材料，对牡丹离体组织培养研究进程及牡丹的基因工程育种具有促进作用。

附图说明

图1为牡丹胚性愈伤组织图。

图2牡丹胚状体。

图3牡丹不定芽图。

图4、图5分别为牡丹种胚在不适宜培养基上的培养结果，其中图4为未获得牡丹愈伤组织，图5为愈伤组织结构松散无胚性。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本发明的保护范围。

实施例1

利用江南牡丹品种(风丹)未成熟胚诱导培养牡丹胚性愈伤组织

1)配制本发明的用于诱导牡丹胚性愈伤组织的培养基，配方如下表2所示。

表2

培养基配制后，调整pH＝5.8-6.0，121±2度、15-20磅下灭菌20分钟。

2)采集授粉90天左右的牡丹半成熟种子，用流水冲洗，再用70％(体积比)酒精消毒1分钟，然后用15％(体积比)的次氯酸钠溶液(活性氯含量5.2％)消毒25分钟，再用无菌水冲洗。

3)在超净台上，用解剖刀切开牡丹种子剥取种胚。

4)将种胚接种于步骤1)配制的培养基中进行暗培养，两周后愈伤组织开始产生，一个月左右逐渐形成胚性愈伤组织(参看图1)，其中，愈伤组织诱导率达100％(诱导获得的愈伤组织数占接种的外植体数之百分比)，胚性愈伤组织占86％(培养获得的胚性愈伤组织占总愈伤组织数的百分比)。

5)将胚性愈伤组织在新鲜的步骤1)配制的培养基上继代1次(20-30天)后，有72％的胚性愈伤组织逐渐产生胚状体(参看图2)。

6)将上述步骤5)获得的胚状体和胚性愈伤组织培养于不含PIC成分的步骤1所述的培养基上，置于光照条件下培养(光照下培养温度24-26℃，光照强度1500-2500勒克斯)，20-30天胚性愈伤组织逐渐分化不定芽(参看图3)；胚状体直接萌发形成牡丹小植株。

7)将不定芽直接切割成单芽，转入生根培养基(配方：1/2MS+IBA 5mg/L+蔗糖15g/L)中诱导生根，形成牡丹完整植株。

比较例2和3

利用江南牡丹品种(风丹)未成熟胚诱导培养牡丹胚性愈伤组织

分别配制培养基2和培养基3，其无机盐和有机物成分同实施例1步骤1)所述，特殊成分变化如下表3所示。

表3

诱导方法如实施例1所述，结果发现，牡丹种胚在培养基2和培养基3上，不能诱导获得牡丹胚性愈伤组织。在培养基2上，外植体只是基部膨大，培养40天也未见形成愈伤组织(图4)；在培养基3上，外植体能形成愈伤组织，但结构松散无胚性，培养40天未见形成胚性愈伤组织(参看图5)。

从上述对比试验可以看出：培养基中的特殊成分是成功诱导培养牡丹胚性愈伤组织的关键技术之一，对特殊成分中部分因素作变化，则不能成功获得牡丹胚性愈伤组织。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (5)

1.一种用于诱导牡丹胚性愈伤组织的培养基，由以下物质组成：

其中，mg/L表示每升培养基中含各成分的毫克数，培养基的pH＝5.8-6.0。

2.一种牡丹胚性愈伤组织的培养方法，包括以下步骤：

1)采集授粉后80-115天的半成熟牡丹种子，筛选其中颗粒饱满的种子，用流水冲洗，再用70％(体积比)酒精消毒，然后用10-15％(体积比)的次氯酸钠溶液消毒，最后用无菌水冲洗；

2)在超净台上，用解剖刀切开消毒后的牡丹种子，剥取种胚；

3)将种胚接种到权利要求1所述的培养基中，进行暗培养；

4)暗培养25-35天后，得胚性愈伤组织；

5)将暗培养获得的胚性愈伤组织在新鲜的权利要求1所述的培养基上继代1-2次后，部分胚性愈伤组织逐渐产生胚状体；

6)将胚性愈伤组织和胚状体培养于去除PIC成分的权利要求1所述的培养基上，置于光照条件下培养，20-30天后胚性愈伤组织逐渐分化不定芽，胚状体萌发形成小植株；

7)将不定芽直接切割成单芽，转入生根培养基诱导生根，形成牡丹完整植株；

所述的生根培养基配方为：1/2MS+IBA 5mg/L+蔗糖15g/L。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的半成熟牡丹种子的形状大小如成熟牡丹种子，颜色为乳白色至淡褐色，种壳不硬。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的暗培养温度为24-26℃。

5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤6)光照条件下培养温度为24-26℃，光照强度为1500-2500勒克斯。