CN102217549B - 玫瑰海棠试管花的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种玫瑰海棠试管花的培养方法，属于植物组织培养及试管开花技术领域。其特征是，以玫瑰海棠的成熟叶片作主要外植体，通过外植体消毒处理、丛生芽诱导、小苗生长与增殖、试管内成花培养等途径，成功地增育出了小型精巧、花色丰富、形态多样，具有特殊观赏价值的试管花。本发明操作简单，实验周期短，生产成本低，所生产的试管花，与传统栽培模式相比，花期可随意调控，不受季节影响，且节约了能源及场地，它对于美化生活和工作环境，调节花期淡季，增加观赏花的新品种、新形式，探索开花机理等将具有重要实践意义。玫瑰海棠因其在花色、花姿、花型及花期等上占有突出优势，很适合开发精品试管花，提高其观赏特性，创造更高的经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种观赏花卉玫瑰海棠试管花的培养方法，属于生物技术领域，具体地说是属于植物组织培养及试管成花技术范畴。
背景技术
玫瑰海棠（Begonia mannii）， 别名丽格海棠，为秋海棠属的一种多年生常绿草本花卉，是近年从国外引进的新品种，为上世纪50年代荷兰育种家Peigen利用球根秋海棠（Begonia tuberhybrida）与索科特拉海棠（Begonia socotrana）杂交育成的新品系。其株形极像球茎秋海棠，但无明显的球茎；其花色娇艳，花大色丽，具有玫瑰般的姿、色、香，因而被称为玫瑰海棠。其具有以下几大特点：①花色娇嫩柔美、艳丽多彩（有紫红、大红、粉红、黄、橙黄、白复色等）；②花朵繁密、花型多样（花瓣有单瓣、半重瓣、重瓣以及花瓣皱边等多种）、花姿优美；③其枝叶强壮，叶形美丽（心形），叶色多样（绿色、棕色等）；④花期长达4-6个月；⑤较耐荫，抗逆性强，适于室内观赏栽培，盆栽可用来点缀会议室、客厅、会客室、卧室、书房、阳台、橱窗等，小巧玲珑，雅致美观，窈窕妩媚，风姿卓越，也可装入艺术吊篮悬挂于室内观赏，艳丽华贵，别具一格。因此，其高价值的观赏性，使其经济价值提高,目前已成为世界著名的球根盆栽花卉之一。
玫瑰海棠的研究主要集中于栽培、育种及组织培养方面。玫瑰海棠播种繁殖所需时间长，主要采用扦插或分株繁殖，但茎段扦插成活率低，分株繁殖速度慢, 且易产生变异、品种退化，难以满足市场大量需求。而组织培养技术具有繁殖速度快，增殖倍数高，周期短，品种复状等特点, 玫瑰海棠为草本花卉，且组织的再生能力很强，利用组培技术可以在短期内培育大量小植株，为生产上提供大量种苗，加快繁殖速度，提高经济效益。因此近年来，玫瑰海棠的组培快繁技术研究在国内外报道较多。这为玫瑰海棠种苗的规模化快速繁殖提供了一条可靠而有效的途径，克服了传统繁殖方法的不足。
玫瑰海棠自引入我国后，很受欢迎，市场销量很好。但按照传统的栽培模式，玫瑰海棠的开花时间及花期仍然不够理想。玫瑰海棠性喜冷凉，生长适温在15℃-28℃，适合秋季扦插，春天即可开花。但春季的气温已渐升高，花不耐久放，市场接受度不大。若改为5-6月份扦插，则花期刚好在冬末春初的元旦、春节开放，且花期大大延长。但5-6月，我国大部分地区气温已升高，怎样在自然条件下度过炎热夏季是栽培上的重点和难点。建空调温室要花费大量的财力或能源，也不理想。因此，如在传统的秋季栽培模式下，能利用简单的技术，对花期进行调控，使其提前开花，这无疑是一种很好的途径。而试管花的研究，刚好可以解决这一问题。试管成花,即在培养瓶内直接诱导开花，对于研究传统栽培模式下植物的开花机制、花期调控、试管育种等具有重要的指导意义，还可节约通过改变栽培环境如增建温室等来延长花期所耗费的能源。这是目前植物成花研究的一个新的领域及热点。
试管成花，具有大田栽培无可比似的优点，如成花时间、花期可随意调控，不受季节影响，且实验周期短，而成熟的技术又可以直接用于大田生产。另外，如能培育出观赏价值很高的试管花，并能在室内进行大规模化的生产，它对于美化生活和工作环境、调节花期淡季、增加观赏花的新品种、新形式等将具有重要实践意义。
试管花的研究在国外几年前就有报道，在我国近年才起步。但主要集中于兰花，如法国的Julien Costantin于1999年进行了兰科植物的试管开花研究，郑立明等于2005年对中国兰的试管开花进行了研究。
玫瑰海棠试管内开花目前在国内外报道极少。玫瑰海棠在花色、花姿、花型及花期等上占有突出优势，很适合开发试管花。本发明旨在培育小型、精巧且具有高观赏价值的离体试管花，提高玫瑰海棠的观赏特性，创造更高的经济价值。为今后进行玫瑰海棠试管花的规模化生产提供技术依据，为其它高档花卉的观赏性精品试管花的生产提供借鉴，也为玫瑰海棠大田栽培条件下的花期调控提供理论依据。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种操作简单，周期短，生产成本低，具有高观赏价值的玫瑰海棠离体试管花的生产方法。
本发明的技术方案，其步骤为：
1．材料的选择：选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片或芽（顶芽或侧芽）。
2．外植体灭菌处理：先从供试的玫瑰海棠植株上用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用75%的酒精浸泡50-80s，然后置于0.1%升汞溶液中消毒8-15min，最后用无菌水反复漂洗6-8次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分；
3．丛芽的诱导：
（1）叶片外植体 将消毒后的叶片切成约1-2cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为MS培养基，补充6-苄基氨基嘌呤（6-BA）0.5～1.0mg/L，吲哚乙酸（IAA）1.5～2.0mg/L，PH值为5.8～6.0，10～12天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织，19～22天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至33～36天开始长出许多丛芽，培养条件为温度20-23℃，光照强度1500-2500Lux，光照时间5～8h/天。
（2）芽外植体 将消毒后的顶芽或侧芽，接种于诱导培养基，培养基为MS培养基，补充6-BA1.0～1.5mg/L，IBA0.1～0.3mg/L，PH值为5.8～6.0，10～12天芽开始生长，约1个月形成3-4cm的丛生小苗。
4．增殖培养：将从外植体得到的丛芽或小苗在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为MS培养基，补充6-BA1.0～1.5mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.2～0.5mg/L，PH值为5.8～6.0，23～26天，已长成3-4cm的小苗,并从苗基部又长出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为9-12倍，培养条件为温度20-23℃，光照强度2000-2500Lux，光照时间10～12h/天。
5．试管内成花培养：待增殖培养基中的小苗，长至3-4ｃｍ高，带4-5片小叶时，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为MS培养基，补充6-BA0.01～0.03mg/L，IAA0.1～0.2mg/L，多效唑（MET）0.1～0.3mg/L， PH值为5.8～6.0，培养2周时更换一次新鲜培养基，24～27天，顶芽分化出花蕾，33～36天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花1-3朵，花朵外观、色泽正常，成花率为65～75%，培养条件为温度20-23℃，光照强度2000-2500Lux，光照时间10～12h/天。
本发明的有益效果是：直接利用玫瑰海棠叶片，增育出了小型精巧、花色丰富、形态多样，具有特殊观赏价值的玫瑰海棠试管花，其特点如下：
（1）操作简单。利用几种成分简单的培养基，即可将叶子培养成丰富多彩的小花。本发明也试验了利用芽直接诱导丛生小芽的途径（芽→芽），但是在生产上，如果大量取芽，会导致田间植株生长不良，或者要牺牲整个植株。取叶相对比较理想，不会太多影响植株。而且本发明利用叶片，采用附加6-BA及 IAA的简单MS培养基，不需产生愈伤组织，直接从叶表面诱导出了小芽，这是非常理想的。因为如果先通过产生愈伤组织，再从组织块上分生小芽，通过了器官-→细胞→器官的过程，在这个过程中可能会发生变异，难免保证原品种的优良特性。而且通过这条途径，愈伤组织往往需要经过继代培养，历时较长，不是最佳快速繁殖途径。这点也是本发明的创新点之一，目前尚未有资料报道通过这种叶→芽（器官→器官）的途径来获得新生芽的。
（2）周期短。本发明从采摘田间叶片外植体，到获得无菌的丛生芽，通过增殖的健状无根小苗，直接诱导小型开花植株，整个过程大约需要100天左右，与田间的自然生长过程（从扦插小苗→大植株→开花，约需16-18个月）相比，明显缩短了生长周期。如果不经过外植体的诱导阶段，有现成的无菌小苗，只需1个月左右的时间即可生产出瓶花。而且本发明选用的增殖培养基配方，增殖倍数能达到9-12倍，也能明显地提高生产效率。
（3）生产成本低。本发明的培养基配方中，只利用了四种简单的生长激素（6-BA、IAA、IBA、MET），就可以完成整个生产过程。而且这几种激素成本比较低，是组培中常规使用的试剂。这一点非常重要，否则关系到以后的生产规模及推广使用等问题。
本发明所用的成花培养基，激素组合比较简单，而且首次在玫瑰海棠中创新地使用了MET（多效唑），而且成花效果还比较好。外植体是否能分化出花芽与植物的发育、营养及激素的种类和用量有着密切的关系，激素的种类和用量又起着决定性的作用。多效唑（Paclobutrazol，又名 Multiple-Effect Triazole,MET）是 20世纪80年代初发现的新型植物生长调节剂，对于提高植物抗逆性、促进成花和坐果、壮苗生根等具有重要作用，现已广泛应用于大田生产。多效唑在玫瑰海棠开花调节中的作用机理，还值得探讨。
具体实施方式
以下的实施例子是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实例一：
从供试的玫瑰海棠植株上，选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片；用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用75%的酒精浸泡50s，然后置于0.1%升汞溶液中消毒8min，最后用无菌水反复漂洗6次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分。
将消毒后的叶片切成约1-2cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为MS培养基，补充6-BA0.5mg/L，IAA1.5mg/L，PH值为5.8，10天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织，19天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至35天开始长出许多丛芽，培养条件为温度22℃，光照强度2000Lux，光照时间6h/天。
将从叶外植体得到的丛芽在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为MS培养基，补充6-BA1.0mg/L，IBA0.3mg/L，PH值为6.0，23天,已长成3-4cm的小苗,并从苗基部又长出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为9倍，培养条件为温度23℃，光照强度2500Lux，光照时间12h/天；
待增殖培养基中的小苗，长至3-4ｃｍ高，带4-5片小叶时，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为MS培养基，补充6-BA0.01mg/L，IAA0.2mg/L，MET0.1mg/L， PH值为5.8，培养2周时更换一次新鲜培养基，25天，顶芽分化出花蕾，35天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花2朵，花朵外观、色泽正常，成花率为75%，培养条件为温度23℃，光照强度2000Lux，光照时间11h/天。
实例二：
从供试的玫瑰海棠植株上，选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片；用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用75%的酒精浸泡80s，然后置于0.1%升汞溶液中消毒15min，最后用无菌水反复漂洗8次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分。
将消毒后的叶片切成约1-2cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为MS培养基，补充6-BA1.0mg/L，IAA2.0mg/L，PH值为6.0，12天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织，20天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至33天开始长出许多丛芽，培养条件为温度21℃，光照强度1500Lux，光照时间8h/天。
将从叶外植体得到的丛芽在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为MS培养基，补充6-BA1.5mg/L，IBA0.5mg/L，PH值为5.8，26天,已长成3-4cm的小苗,并从苗基部又生出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为12倍，培养条件为温度22℃，光照强度2000Lux，光照时间10h/天；
待增殖培养基中的小苗，长至3-4ｃｍ高，带4-5片小叶时,，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为MS培养基，补充6-BA0.03mg/L，IAA0.2mg/L，MET0.3mg/L， PH值为5.8，培养2周时更换一次新鲜培养基，27天，顶芽分化出花蕾，36天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花3朵，花朵外观、色泽正常，成花率为70%，培养条件为温度22℃，光照强度2500Lux，光照时间12h/天。
实例三：
从供试的玫瑰海棠植株上，选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片；用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用75%的酒精浸泡60s，然后置于0.1%升汞溶液中消毒10min，最后用无菌水反复漂洗7次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分。
将消毒后的叶片切成约1-2cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为MS培养基，补充6-BA0.8mg/L，IAA1.8mg/L，PH值为5.9，11天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织，22天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至36天开始长出许多丛芽，培养条件为温度21℃，光照强度2500Lux，光照时间5h/天。
将从叶外植体得到的丛芽在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为MS培养基，补充6-BA1.3mg/L，IBA0.2mg/L，PH值为5.8，25天,已长成3-4cm的小苗,并从苗基部又生出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为11倍，培养条件为温度22℃，光照强度2000Lux，光照时间10h/天。
待增殖培养基中的小苗，长至3-4ｃｍ高，带4-5片小叶时,，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，养基为MS培养基，补充6-BA0.02mg/L，IAA0.1mg/L，MET0.2mg/L， PH值为5.8，培养2周时更换一次新鲜培养基，24天，顶芽分化出花蕾，33天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花3朵，花朵外观、色泽正常，成花率为73%，培养条件为温度22℃，光照强度2500Lux，光照时间12h/天。
实例四：
从供试的玫瑰海棠植株上，选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠幼嫩的芽（顶芽或侧芽）；除去叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用75%的酒精浸泡70s，然后置于0.1%升汞溶液中消毒9min，最后用无菌水反复漂洗7次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分。
将消毒后的顶芽或侧芽，轻轻插入诱导培养基，培养基为MS培养基，补充6-BA1.0mg/L，IBA0.3mg/L，PH值为5.8，10天芽开始生长，约1个月形成3-4cm的丛生小苗。培养条件为温度22℃，光照强度2000Lux，光照时间12h/天。
将从芽外植体得到的无菌小苗在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为MS培养基，补充6-BA1.0mg/L，IBA0.3mg/L，PH值为5.8，25天,已长成3-4cm的小苗,并从苗基部又生出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为10倍，培养条件为温度22℃，光照强度2200Lux，光照时间11h/天；
待增殖培养基中的小苗，长至3-4ｃｍ高，带4-5片小叶时,，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为MS培养基，补充6-BA0.02mg/L，IAA0.2mg/L，MET0.1mg/L， PH值为5.8，培养2周时更换一次新鲜培养基，25天，顶芽分化出花蕾，35天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花2朵，花朵外观、色泽正常，成花率为71%，培养条件为温度22℃，光照强度2500Lux，光照时间12h/天。
Claims (2)
1.一种玫瑰海棠试管花培养的方法，其特征在于采用玫瑰海棠叶片形成丛生芽的快速繁殖方法，在此基础上对其试管苗进行花芽诱导，它包括下列步骤：
（1）材料的选择：选取无病虫害、生长健壮的玫瑰海棠叶片；
（2）外植体灭菌处理：先从供试的玫瑰海棠植株上用剪刀剪下幼嫩的叶片，用自来水洗去泥沙后，水中加入洗洁精，再反复冲洗干净，于无菌条件下用75%的酒精浸泡50-80s，然后置于0.1%升汞溶液中消毒8-15min，最后用无菌水反复漂洗6-8次，用灭过菌的滤纸吸干表面水分；
（3）丛芽的诱导：将消毒后的叶片切成约1-2cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为MS培养基，补充6-苄基氨基嘌呤6-BA0.5～1.0mg/L，吲哚乙酸IAA1.5～2.0mg/L，PH值为5.8～6.0，10～12天时，叶表面细胞渐膨大，但不长愈伤组织，19～22天时在叶表面上零星地冒出几个绿色小芽点，至33～36天开始长出许多丛芽，培养条件为温度20-23℃，光照强度1500-2500Lux，光照时间5～8h/天；
（4）增殖培养：将从叶外植体得到的丛芽在无菌操作的条件下进行继代增殖，培养基为MS培养基，补充6-BA1.0～1.5mg/L，吲哚丁酸IBA0.2～0.5mg/L，PH值为5.8～6.0，23～26天，已长成3-4cm的小苗，并从苗基部又长出许多的小苗来，苗叶片浓绿、生长健壮，增殖倍数为9-12倍，培养条件为温度20-23℃，光照强度2000-2500Lux，光照时间10～12h/天；
（5）试管内成花培养：待增殖培养基中的小苗，长至3-4ｃｍ高，带4-5片小叶时，轻轻取出，将其从基部剪切，置于成花诱导培养基中，培养基为MS培养基，补充6-BA0.01～0.03mg/L，IAA0.1～0.2mg/L，多效唑MET0.1～0.3mg/L， PH值为5.8～6.0，培养2周时更换一次新鲜培养基，24～27天，顶芽分化出花蕾，33～36天花芽开放，侧芽陆续分化出花蕾，每苗出花1-3朵，花朵外观、色泽正常，成花率为70～75%，培养条件为温度20-23℃，光照强度2000-2500Lux，光照时间10～12h/天。
2. 根据权利要求1的玫瑰海棠试管花培养方法，其特征步骤（1）也可选用玫瑰海棠幼嫩的顶芽或侧芽；特征步骤（3）为：将消毒后的顶芽或侧芽，接种于诱导培养基，培养基为MS培养基，补充6-BA1.0～1.5mg/L，IBA0.1～0.3mg/L，PH值为5.8～6.0，10～12天芽开始生长，约1个月形成3-4cm的丛生小苗，培养条件为温度20-23℃，光照强度2000-2500Lux，光照时间11～12h/天；特征步骤（4）为：将从芽外植体得到的小苗进行继代增殖，增殖培养基同上，培养条件同上。
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