CN106489739A - 一种红花丰花月季试管花的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种红花丰花月季试管花的生产方法，属于植物的组织培养及试管开花技术领域。以红花丰花月季当年生枝条作外植体，经外植体消毒、丛生芽诱导与增殖、试管内成花培养等途径，最终获得小巧精致、花色艳丽的红花丰花月季试管花，本发明的方法可有效地诱导红花丰花月季试管花芽的形成，花芽诱导率可达92.31％，并有70.00％的花芽可正常发育并成功诱导开花。将试管花接在装有彩色培养基的工艺玻璃瓶内，可制成供观赏的工艺试管花“手指玫瑰”投入市场，花期可长达15～20天，花期过后仍可观叶达60天以上。本发明工艺简单、生产周期短，生产成本低，可周年生产，花期可随意调控，观赏期长，观赏价值高，有巨大的市场开发潜力。

Description

一种红花丰花月季试管花的生产方法

技术领域

本发明属于植物的组织培养及试管开花技术领域，具体涉及一种红花丰花月季的组织培养方法，特别涉及一种红花丰花月季试管花的生产方法。

背景技术

月季(Rosa chinensis)属蔷薇科蔷薇属多年生木本花卉，常绿或半常绿低矮灌木。原产中国，为我国十大名花之一，世界五大鲜切花之一，有“花中皇后”的美誉。月季对生态环境的适应性十分广泛，在全世界分布极广，北至严寒的北欧、加拿大，南至炎热的印度及北非，都能见到栽培的月季，是世界8个国家的国花，如英国、美国、伊拉克、保加利亚等。在中国则几乎南北各地都可栽植，是我国40多个城市的市花，如北京、天津、石家庄、大连、郑州等城市。月季四时花开不断、姿态优美、花色艳丽、芳香宜人，抗寒抗旱，适应性强、繁殖容易、管理方便，深受人们的喜爱，在切花生产、园林绿化、庭园美化等方面都发挥着重要作用，它还可用于食品加工，提取香料等，其叶、花、果、种子还具有治病的功效，是非常重要的观赏花卉且具有重要的商业价值。

丰花月季(Rosa hybrida)系现代月季中的后起之秀，株高一般在60～150cm，花成团或成簇开放，花径5～8cm；花瓣数15～30片，花形杯状，球状或盘状；花色有纯黄、白、桃红、肉红、鲜红、洋红、金黄、粉红等。丰花月季是一类新兴的月季地栽品系，广泛应用在花篱、花镜、花坛中，因其品种繁多、花色艳丽、千姿百态、持续开花、适应性广、容易栽培等特性被广泛栽培，深受人们的喜爱，在园林绿化美化领域占有重要地位，具有极高的商业价值。

本发明的红花丰花月季品种，花色是人们非常喜爱的鲜红色，花成簇开放，花径6～8cm，花瓣15枚左右，花形盘状，淡香，勤花，多花，长势强健，抗病力强，是很好的盆栽观赏、园林绿化、摆放花坛、庭院装饰品种。

试管花即利用组织培养技术，通过人工调控其培养条件，使开花植物在无菌密封的培养容器内生长并开花。自1946年中国学者罗士韦在对菟丝子茎尖培养时发现了花器官的形成后，植物组织培养技术便开始用于植物离体开花的研究，至今已有70年的历史，许多科学家为证实这一论断做出了不懈努力，目前报道的试管内开花植物已经达100多种，可以说试管花研究已经迈出了很大一步。由于试管花有其独特的观赏价值，将试管花制作成精美的装饰品，因其精致美观、袖珍可爱，携带方便，不需要浇水、施肥、病虫害等特别的养护，可放于床头、案边、餐桌，免去了普通花卉日常管理的繁琐，由于可以人工控制诱导开花的环境和花期，使人们一年365天都可以欣赏到盛开的鲜花，弥补了花期淡季无花欣赏的不足，精致可爱的试管花令人赏心悦目，消除疲劳，适应现代人快节奏的生活方式。

由于植物尤其是木本植物在试管内开花受许多培养条件的影响，诱导开花难度较大，因此培养的试管植物花芽诱导率低，花芽开花率低，这无疑提高了企业的生产成本，因此造成微型花卉市场开花的试管花卉极为少见。市场上销售的大多是无花的“手指苗圃”、“天使花房”等试管花卉。国外一般称月季花为玫瑰花，目前市场上用月季花制作成的“手指玫瑰”大部分是进口的韩国产品。

近些年来国内外陆续有月季试管花的研究报道。周俊辉等(2008)用微型月季诱导试管开花的研究表明，通过调整基本培养基中氮磷的比例、提高培养基的蔗糖浓度到55g/L可以使微型月季的试管花诱导率达到41.7％(周俊辉，杨寅桂,刘义存等.微型月季的试管开花诱导研究[J].江西农业大学学报，2008,30(3)：504-508)。褚剑峰等(2008)对玫瑰试管花技术的研究中指出，不同的玫瑰品种在相同的培养条件下有不同的开花率，提高磷肥在一定程度上可以促进离体植物试管内开花，提高昼夜温差较恒温培养可以提高花芽的分化和延长开花时间(褚剑峰,郑琪,孙叶芳等.玫瑰试管花技术研究及商品化生产[J].上海农业学报，2008,24(1):130-132)。CN 102870681 B公开了一种月季“月月红”品种试管内开花及雌蕊单性开花的方法及其培养基，经过采取改良MS培养基中加入0.02mg/L脱落酸，变温培养，光照强度1500lx±300lx，相对湿度70％±5％的条件下诱导二倍体月季试管苗开花率达50％左右，使二倍体花和雌蕊单倍体花呈塔式开放并且同时存在20～35d、开花率达30％左右。Nguyen HongVu.等(2006)在对越南玫瑰品种“First Prize”离体花芽形态发生的研究中发现，蔗糖是花芽形态发生的关键因素，细胞分裂素6-BA和ZT比TDZ更适宜诱导玫瑰形成试管花，减少MS培养基中无机盐和有机盐含量对试管开花有积极影响(Nguyen Hong Vu&Phan Hoang Anh&Duong Tan Nhut.，The role of sucrose and different cytokininsin the in vitro floral morphogenesis of rose(hybrid tea)cv.“First Prize”[J].Plant Cell Tiss Organ Cult.(2006)87:315-320)。

综上所述，目前用国内红花丰花月季品种制成的“手指玫瑰”还未见报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种具有高观赏价值、成本低廉的红花丰花月季试管花的生产方法。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究，最终获得了如下技术方案：

一种红花丰花月季试管花的生产方法，包括如下步骤：

(1)材料的选择及外植体灭菌处理：采集红花丰花月季当年生枝条茎段为外植体，经过无菌处理后接种到外植体启动培养基上进行培养，获得第一代无根试管苗；

(2)丛芽诱导和继代增殖培养：取步骤(1)获得的无根试管苗接种到继代增殖培养基上进行继代培养，获得丛生无根试管苗；重复循环丛生试管苗继代增殖步骤，直至获得大量用于花芽诱导的月季增殖苗；

(3)试管内成花培养：从步骤(2)获得的丛生无根试管苗中切取高2～3cm、健壮、带顶芽的单芽无根试管苗接种于花芽诱导培养基，调整培养环境，诱导花芽形成并绽放，形成试管花；

(4)工艺试管花的制作：将诱导得到的试管花在含苞待放时剪切，剪切高度在6～8cm高，带2～5片复叶，然后接入已经灭菌好的装有彩色培养基的工艺玻璃瓶中，盖上铝制金色瓶盖，工艺试管花就制作完成。

步骤(1)中所述的消毒方法为取红花丰花月季当年生半木质化緑枝条作为外植体，去掉叶片，剪成15～20cm长(依洗涤容器而定)的茎段，用低浓度的洗洁精水对茎段进行清洗5～10min，再用自来水冲洗干净，将茎段外植体剪切成2～3cm长、带1个侧芽的茎段，放入空容器瓶中，置于超净工作台上，加入0.1％的升汞灭菌5～15min，期间不断摇动，倒出升汞，用无菌水冲洗4～5次，获得消毒后的茎段。

步骤(1)中所述的外植体启动培养基为MS+6-BA 0.5～1.5mg/L+IBA 0.1～0.3mg/L+卡拉胶9g/L+白砂糖30g/L，pH＝5.8～6.0。

优选为MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.2mg/L+卡拉胶9g/L+白砂糖30g/L，pH＝5.8～6.0。

外植体的叶腋芽3d时就见膨大，10d左右伸长可达1cm以上，有小叶展开，25～30d时叶腋芽可伸长2～3cm以上，可以剪切进入继代增殖培养过程。

步骤(2)中所述的继代增殖培养基为MS+6-BA 1.0～3.0mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+卡拉胶9g/L+白砂糖30g/L，pH＝5.8～6.0。

优选为MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.2mg/L+卡拉胶9g/L+白砂糖30g/L，pH＝5.8～6.0。

将启动培养获得的叶腋芽(即第一代无根试管苗)剪切接入以上继代增殖培养基，培养30～40d便可以得到增殖2倍以上的丛生芽。

步骤(3)中所述的花芽诱导培养基为改良MS培养基+6-BA 0.2～2.0mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+卡拉胶9g/L+白砂糖30g/L，pH＝5.8～6.0。

所述的改良MS培养基为改良MS-1培养基或改良MS-2培养基；

所述的改良MS-1培养基为：KH₂PO₄ 340～850mg/L，其余同MS培养基；

所述的改良MS-2培养基为：NH₄NO₃ 825mg/L；KNO₃ 950mg/L；MgSO₄·7H₂O 185mg/L；CaCl₂·2H₂O 220mg/L；KH₂PO₄ 85～255mg/L；其余同MS培养基。

优选为MS1+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+卡拉胶9g/L+白砂糖30g/L，pH＝5.8～6.0。

所述的MS1为：KH₂PO₄ 850mg/L，其余同MS培养基；

将丛生芽中高2～3cm以上的生长健壮且含顶芽的单芽接入以上花芽诱导培养基，40～90d之内不断有花芽产生，60～110d之内持续有花芽开放，花芽发育期在19～23d之间，花期可达15～20d。

所述的MS培养基的组成成分见表1；

表1 MS培养基的组成成分表(mg/L)

大量元素	含量	微量元素	含量	铁盐	含量	有机物	含量
								NH4NO3	1650	MnSO4·4H2O	22.3	Na2-EDTA	37.3	肌醇	100
KNO3	1900	ZnSO4·7H2O	8.6	FeSO4·7H2O	27.8	维生素B1	0.1
								MgSO4·7H2O	370	H3BO3	6.2			烟酸	0.5
KH2PO4	170	KI	0.83			维生素B6	0.5
								CaCl2·2H2O	440	Na2MoO4·2H2O	0.25			甘氨酸	2.0
		CuSO4·5H2O	0.025
										CoCl2·6H2O	0.025

本发明中，所述的植物激素定义及简称如下：植物生长素包括吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)，植物细胞分裂素包括6-苄基腺嘌呤(6-BA)；

步骤(1)、(2)所述的培养用的是塑料盖封口的普通培养瓶；

步骤(3)所述的培养用的是透气封口膜封口的三角瓶；透气封口膜大小为11cm*11cm，过滤膜直径16mm，过滤孔径0.2～0.3μm，空气通量(M3/m2.hr@p＝0.01MPa)＝1020；

步骤(1)和(2)所述的培养在大型培养室的培养架上进行，培养条件为温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照12h/d。

步骤(3)所述的培养在智能人工气候箱中进行；培养条件为温度20℃～25℃，光照强度5000～6000lx，光照10h/d。

步骤(4)所述的彩色培养基为花芽诱导培养基中添加食用色素；优选为添加2mL/L的食用色素；

所述的食用色素为柠檬黄、胭脂红、苹果绿、天蓝色或葡萄紫。

更优选的，采用MS1+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+卡拉胶9g/L+白砂糖30g/L，pH＝5.8～6.0，分别添加5种不同颜色的色素即柠檬黄(2mL/L)、胭脂红(2mL/L)、苹果绿(2mL/L)、天蓝色(2mL/L)、葡萄紫(2mL/L)，分装在直径3.7cm，高12cm的圆柱形白色透明的工艺玻璃瓶中，倒入量约为25毫升，约占瓶子体积的1/4，经121℃、1.1kg/cm²压力条件下灭菌20min后，获得具有观赏价值的彩色培养基。

步骤(4)所述的工艺试管花制作完成后，放置在室内有散射光的地方以供观赏，花期可达15～20d，花凋谢后，可以观叶达60d以上。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)本发明首次以盆栽红花丰花月季为材料，经过外植体消毒、丛生芽诱导及继代增殖、试管内成花培养等途径，最终获得小巧精致、花色艳丽、具有特殊观赏价值的红花丰花月季试管花。将试管花接种到工艺瓶内，可以制成工艺试管花“手指玫瑰”投入市场，为花卉爱好者提供了一种新的花卉观赏形式，有巨大的市场开发潜力。

(2)本发明涉及的红花丰花月季试管苗花芽诱导率达到92.31％，开花率达到70％，且效果稳定，远远大于同类试管花诱导率和开花率。

(3)本发明涉及的红花丰花月季试管花生产方法，生产周期短，不受季节限制，随时可以诱导红花丰花月季试管苗开花，能够缩短其营养生长时间使其提前开花，制作工艺简单、成本低廉、实用性强，推广性好，观赏时间长，无需浇水、施肥等管理，可以美化生活环境和工作环境，调节花期淡季，对于在试管内研究植物开花机理、花芽的形成与分化、开展试管杂交育种等将具有重要实践意义，社会效益、经济效益显著。

附图说明

图1是本发明中红花丰花月季茎段外植体培育15天后叶腋芽的伸长情况。

图2是本发明中红花丰花月季培育40天时的无菌试管苗丛生芽。

图3是本发明中红花丰花月季花芽诱导70天时形成的花芽。

图4是本发明中红花丰花月季花芽诱导80天时试管花盛开。

图5是本发明中盛花期大量开花的红花丰花月季试管花。

图6是本发明中红花丰花月季试管花接于装有彩色培养基的工艺花瓶中所形成的工艺试管花。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明中的试验材料选自红花丰花月季当年生半木质化绿枝条，采自广东省广州市华南农业大学林学与风景园林学院花卉试验基地。并用扦插的方式繁殖一定数量后提供茎段外植体的采集。该品种原始来源为购自广州市荔湾区花卉博览园的公开销售品种。

外植体的消毒及无菌苗的获得

取红花丰花月季生长健壮、无病虫害的当年生半木质化绿枝条作为外植体，去掉叶片，剪成15～20cm长(依洗涤容器而定)的茎段，用低浓度的洗洁精水对茎段进行清洗5～10min，去掉茎段上的灰尘和杂质，再用流水冲洗干净，将茎段外植体剪切成2～3cm长、带1个侧芽的茎段，放入空容器瓶中，置于超净工作台上，加入0.1％的升汞灭菌5min、10min、15min，期间不断摇动，倒出升汞，用无菌水冲洗4～5次，获得消毒后的茎段。

将消毒好的茎段接入外植体启动培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.2+卡拉胶9g/L+白砂糖30g/L，pH＝5.8～6.0)中，每瓶接1株，每个处理接种50株，在温度为25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照12h/d条件下培养。每3d观察并记录污染及出芽情况。3d时叶腋芽即有膨大，25～30d时茎段叶腋芽伸长达2～3cm以上，剪切叶腋芽进入继代增殖扩繁阶段。外植体培育15d后叶腋芽的伸长情况，如图1所示。

继代增殖培养：将茎段外植体启动培养后获得的叶腋芽剪切至继代增殖培养基(MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.2mg/L+卡拉胶9g/L+白砂糖30g/L，pH＝5.8～6.0)中培养30～40d，可以得到增殖2倍以上的丛生芽。培育40天时的无菌试管苗丛生芽如图2所示。反复继代增殖过程，直至获得大量用于花芽诱导的月季增殖苗。培养条件为温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照12h/d。

花芽诱导阶段

(1)花芽诱导培养基配制

依据不同的试验设计，配制不同的花芽诱导培养基。基本的花芽诱导培养基配制方法是：基本培养基为改良MS培养基(配制MS培养基做对照培养基)，附加一定浓度的细胞分裂素6-BA和一定浓度的生长素NAA组合，加入9g/L卡拉胶、30g/L白砂糖，用自来水配制，用1mol的NaOH或1mol的HCl调节pH＝5.8～6.0，分装在150mL的三角培养瓶中，每瓶倒入培养基90～100mL，透气封口膜封口，置于高压灭菌锅中，在121℃、1.1kg/cm²压力条件下保持20min，然后取出培养瓶冷却至室温，接入高2～3cm以上、顶芽长势好、展叶好、生长健壮的单芽试管苗于上述花芽诱导培养基中，每瓶接入两株单芽试管苗，置于温度20℃，光照强度5000～6000lx、光照时间10h/d的智能人工气候箱中培养，诱导开花。

(2)花芽形成期及开花期调查方法：花芽诱导培养30d之内，每5d观察一次试管苗的长势，培养30d后每1～2d观察一次试管苗的生长情况和花芽形成情况，记录花芽最初形成时间、花芽发育情况和花芽开花情况。直至最后一朵花开放并凋谢为止。红花丰花月季花芽诱导70天时形成的花芽如图3所示；诱导80天时试管花盛开如图4所示；盛花期大量开花的红花丰花月季试管花如图5所示。

(3)采用Excel软件对调查数据进行统计分析。

花芽诱导率＝总花芽瓶数/接种瓶数*100。

无花芽率＝无花芽瓶数/接种瓶数*100。

开花率＝开花数量/总花芽数量*100。

(4)氮磷钾不同配比对红花丰花月季试管花花芽诱导和开花的影响

花芽诱导培养基中，对MS基本培养基进行改良，试验设计见表2，每一处理附加相同激素6-BA 0.5mg/L和NAA 0.1mg/L组合，白砂糖30g/L，卡拉胶9g/L，pH＝5.8～6.0。

表2 氮磷钾不同配比诱导红花丰花月季试管花试验设计

编号	NH4NO3/mg/L	KNO3/mg/L	KH2PO4/mg/L
				MS1	1650	1900	850
MS2	1650	1900	510
				MS3	1650	1900	340
MS(CK)	1650	1900	170
				MS4	825	950	85
MS5	825	950	255

注：MS4、MS5中的MgSO₄·7H₂O 185mg/L；CaCl₂·2H₂O 220mg/L，其余同MS。

经过130d的持续观察，试验结果列于表3、表4和表5。

表3结果表明，将MS培养基中的KH₂PO₄的量提高到340mg/L(MS3)、510mg/L(MS2)、850mg/L(MS1)，花芽诱导率是逐步上升的，MS1花芽诱导率达到最高，为92.31％；将MS培养基中的大量元素减半后(MS4)，花芽诱导率也较对照MS的花芽诱导率有所提高，为31.58％，将MS培养基中的大量元素减半后，又增加1倍KH₂PO₄的量，使KH₂PO₄的量达到255mg/L(MS5)，结果是花芽诱导率较MS4又有提高，达40.00％；对照MS培养基的花芽诱导率最低，为20.00％。从开花率的结果可以看出，磷钾含量最高的MS1的开花率达到最高，为70.00％，降低磷钾含量至MS2和MS3，开花率也降低，对照MS则没有开花的花芽。将MS培养基中的大量元素减半(MS4)，则降低了氮磷钾的含量，又有16.67％的开花率，在MS4的基础上增加1倍磷钾的含量，开花率即大幅度的提高至70.00％，进一步的证明降低氮含量，提高磷钾含量有利于试管花开放。

表3 氮磷钾不同配比对红花丰花月季试管花花芽诱导和开花的影响

结合表4和表5可知，在花芽诱导培养基中生长的试管苗40d之前均是营养生长阶段，40d之后陆陆续续出现花芽，进入生殖生长阶段。最早见到花芽的是MS1，在MS1中培养40d时即可见到在花芽诱导试管苗的顶端生长点处有极小但肉眼可见的花芽产生，该花芽发育19d后正常开放，40～90d之内各个处理陆续有花芽产生，花芽发育19～23d后开放。最早与最晚的花芽形成可以相差40d，可见植株的个体发育之间差异很大。50d时除MS(CK)和MS5以外，几个处理均有花芽产生，但没有开花的花芽。至70d时MS1已经有85.00％的花芽形成，并有20.00％的花芽开放，MS(CK)的花芽有100.00％都是在50～70d之间形成的，MS3在70d时也已经有84.62％的花芽形成。70d时几个处理的开花率在0～20.00％之间。花芽开花的盛花期是在70～90d，90d以后所有处理再无新的花芽产生。至110d时所有的花芽均已开放。MS5处理中花芽形成比较滞后，40.00％的花芽在70d之内产生，而其他几个处理70d之内已经形成66.67～100.00％的花芽，MS5中60.00％的花芽产生在70～90d，开花的盛花期也就滞后，为90～110d才达到盛花。这也可能说明培养基中氮的浓度的降低，使植株的氮素营养缺乏，会延缓其进入生殖生长阶段。

本发明的MS1花芽诱导培养基中，有近一半的培养瓶中是抽出1个花芽，近一半的培养瓶中可以抽出2个花芽，有极少的培养瓶中甚至抽出了3个花芽，抽出1个花芽的瓶开花率很高(占80％)，抽出2个花芽的瓶有40％可以开2朵花，60％的瓶则只开1朵花，另一朵花在生长发育过程中即褐变枯萎脱落，不能正常开花。极少量抽出3个花芽的瓶则有1个花芽能正常开放，另2个花芽在生长发育过程中即褐变枯萎脱落，不能正常开花，原因可能是植物开花时需要较多的养分，此时培养基的养分不能满足第2朵花甚至是第3朵花开放所致。

红花丰花月季试管花在最初开放的几天里花瓣是非常鲜艳的红色，7d以后逐渐变成紫红色、浅紫色、浅粉色，至15d以后花瓣逐渐变黄枯萎，脱落或不脱落，最长的花期可达20d，视试管花的培养温度而变化，试管花所在的环境温度越低，试管花的花期就越长。红花丰花月季试管花花瓣数为5～13瓣，8～10瓣占的比例较大，试管花展开以后的花径在2.0～3.5cm之间，大部分花的直径在3cm左右。

表4 氮磷钾不同配比对红花丰花月季试管花花芽形成时间和开花时间的影响

表5 氮磷钾不同配比对红花丰花月季试管花诱导花芽形成和花芽发育历期的影响

(5)植物生长调节剂不同浓度及组合对红花丰花月季试管花花芽诱导和开花的影响

基本培养基采用MS1培养基，附加细胞分裂素6-BA不同浓度(0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mg/L)和生长素NAA不同浓度(0.1、0.2mg/L)组合，加入9g/L卡拉胶、30g/L白砂糖，用自来水配制，用1mol的NaOH或1mol的HCl调节pH＝5.8～6.0，分装在150mL的三角培养瓶中，每瓶倒入培养基90～100mL，透气封口膜封口，置于高压灭菌锅中，在121℃、1.1kg/cm²压力条件下保持20min，然后取出培养瓶冷却至室温，接入高2～3cm以上、顶芽长势好、展叶好、生长健壮的单芽试管苗于上述花芽诱导培养基中，每瓶接入两株单芽试管苗，置于温度20℃，光照强度5000～6000lx、光照时间10h/d的智能人工气候箱中培养，诱导开花。

调查方法：花芽诱导培养30d之内，每5d观察一次试管苗的长势，培养30d后每1～2d观察一次试管苗的生长情况和花芽形成情况，直至最后一朵花开放并凋谢为止。

植物生长调节剂不同浓度及组合对红花丰花月季试管花花芽诱导率和开花率试验结果列于表6。

在本发明设计范围内，当NAA的浓度为0.1mg/L时，低浓度的6-BA(0.2～1.0mg/L)可以诱导试管苗形成花芽并且开花，花芽诱导率为52.63％～80.95％，开花率为46.67～76.19％，但当6-BA的浓度再升高至1.5mg/L和2.0mg/L时，则无花芽形成，由此可见，高浓度的6-BA不利于试管花的形成。当NAA浓度提高到0.2mg/L时，6-BA浓度从0.2mg/L至2.0mg/L均诱导出花芽，6-BA浓度为0.5mg/L时花芽诱导率达到最高，为86.96％，且有62.96％的花芽开花，随着6-BA浓度升高，花芽诱导率下降，只有6.25％～38.89％，但诱导出的花芽开花率均比较高，达到85～100％，可见，尽管6-BA浓度提高后没有更多的花芽产生，但只要形成花芽，则花芽开放的几率就很大。综上所述，本发明中最适宜诱导红花丰花月季试管苗形成花芽并开花的激素组合为6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L。

表6 不同浓度植物生长调节剂组合对红花丰花月季试管花花芽诱导和开花的影响

(6)透气塑料膜和不透气塑料膜封口对红花丰花月季试管花花芽诱导及开花的影响

本发明采用150mL三角瓶作为培养瓶，培养基为MS3+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+卡拉胶9g/L+白砂糖30g/L，pH＝5.8～6.0，每瓶倒入培养基90～100mL，透气封口膜封口，置于高压灭菌锅中，在121℃、1.1kg/cm²压力条件下保持20min，然后取出培养瓶冷却至室温，接入高2～3cm以上、顶芽长势好、展叶好、生长健壮的单芽试管苗于上述花芽诱导培养基中，每瓶接入两株单芽试管苗，这时将其中一半的培养瓶的透气塑料膜的透气孔用透明胶带封住，作为不透气塑料膜封口试验，然后置于温度20℃，光照强度5000～6000lx、光照时间10h/d的智能人工气候箱中培养，诱导开花。

调查方法：花芽诱导培养30d之内，每5d观察一次试管苗的长势，培养30d后每1～2d观察一次试管苗的生长情况和花芽形成情况，直至最后一朵花开放并凋谢为止。

封口膜的透气性对红花丰花月季试管花的影响结果见表7。结果表明，封口膜不透气对花芽的形成影响不大，花芽诱导率略高于透气膜的花芽诱导率，但对花芽的正常开花影响很大，只有11.11％的花芽可以正常开放，有88.89％的花芽没能正常开放，而透气膜封口的试管花则有81.25％的花芽能正常开花。由此可见，透气培养可以大大提高红花丰花月季试管花开花率。

表7 透气培养与不透气培养对红花丰花月季试管花花芽诱导和开花的影响

不同温度培养对红花丰花月季试管花花芽诱导和开花的影响

本发明设计了3个不同的培养温度(20℃、23℃、25℃)培养红花丰花月季试管苗，基本培养基为MS1，附加激素6-BA 0.5mg/L和NAA 0.1mg/L，白砂糖30g/L，卡拉胶9g/L。培养基配制方法同前。诱导开花的试管苗接种好后，放置于光照强度5000lx、光照时间10h/d以及不同温度设置的智能人工气候箱中诱导开花。试验结果调查方法同前。

不同的培养温度培养红花丰花月季试管花，其对花芽诱导和开花的影响列于表8。花芽诱导率最高的是20℃的处理，达73.33％，开花率最高的则是23℃的处理，达70.37％，温度继续升高至25℃时，花芽诱导率和开花率均有所下降。所以20～23℃是最佳的诱导试管花的温度。

表8 不同培养温度对红花丰花月季试管花花芽诱导和开花的影响

工艺试管花的制作过程

彩色培养基的配制

本发明配制的彩色培养基采用MS1基本培养基+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+卡拉胶9g/L+白砂糖30g/L，pH＝5.8～6.0，分别添加5种不同颜色的色素即柠檬黄(2mL/L)、胭脂红(2mL/L)、苹果绿(2mL/L)、天蓝色(2mL/L)、葡萄紫(2mL/L)，分装在直径3.7cm，高12cm的圆柱形白色透明的工艺玻璃瓶中，倒入量约为25毫升，约占瓶子体积的1/4，经121℃、1.1kg/cm²压力条件下灭菌20min后，获得具有观赏价值的彩色培养基，所有色素均为食用色素，对环境无污染。彩色培养基冷却凝固后备用。

工艺试管花的制作和观赏

将诱导得到的试管花在含苞待放时剪切，剪切高度在6～8cm高，带2～5片复叶，然后接入已经灭菌好的装有彩色培养基的工艺玻璃瓶中，盖上铝制金色瓶盖，再装饰上彩纸、彩绳、亮片等装饰物，工艺试管花就制作完成，可进行销售了。本发明中红花丰花月季试管花接于装有彩色培养基的工艺花瓶中，如图6所示。试管花在工艺玻璃瓶中第二天即可以全部展开，试管花花径在2.0～3.5cm。试管花在工艺瓶中可以开放15～20d，花期的长短依个体差异和环境的温度有关，环境温度低，花期则较长，环境温度高，花期则较短。工艺试管花不需要任何的施肥、浇水等管理，只需要室内自然条件下有一些散射光即可。在散射光的作用下，花瓣凋谢后，月季试管苗仍能在彩色培养基中生活且有新生叶片长出，可以继续观赏，直至试管苗的所有叶片枯萎为止，可以持续观赏60d以上。本发明是在可控的环境下生产，不受自然条件的限制，周年可以生产，周年可以有开花的红花“手指玫瑰”欣赏。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种红花丰花月季试管花的生产方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)材料的选择及外植体灭菌处理：采集红花丰花月季当年生枝条茎段为外植体，经过无菌处理后接种到外植体启动培养基上进行培养，获得第一代无根试管苗；

(2)丛芽诱导和继代增殖培养：取步骤(1)获得的无根试管苗接种到继代增殖培养基上进行继代培养，获得丛生无根试管苗；重复循环丛生试管苗继代增殖步骤，直至获得大量用于花芽诱导的月季增殖苗；

(3)试管内成花培养：从步骤(2)获得的丛生无根试管苗中切取高2～3cm、健壮、带顶芽的单芽无根试管苗接种于花芽诱导培养基，调整培养环境，诱导花芽形成并绽放，形成试管花；

(4)工艺试管花的制作：将诱导得到的试管花在含苞待放时剪切，剪切高度在6～8cm高，带2～5片复叶，然后接入已经灭菌好的装有彩色培养基的工艺玻璃瓶中，盖上铝制金色瓶盖，工艺试管花就制作完成。

2.根据权利要求1所述的红花丰花月季试管花的生产方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的消毒方法为取红花丰花月季当年生半木质化緑枝条作为外植体，去掉叶片，剪成15～20cm长的茎段，用低浓度的洗洁精水对茎段进行清洗5～10min，再用自来水冲洗干净，将茎段外植体剪切成2～3cm长、带1个侧芽的茎段，放入空容器瓶中，置于超净工作台上，加入0.1％的升汞灭菌5～15min，期间不断摇动，倒出升汞，用无菌水冲洗4～5次，获得消毒后的茎段。

3.根据权利要求1所述的红花丰花月季试管花的生产方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的外植体启动培养基为MS+6-BA0.5～1.5mg/L+IBA0.1～0.3mg/L+卡拉胶9g/L+白砂糖30g/L，pH＝5.8～6.0。

4.根据权利要求1所述的红花丰花月季试管花的生产方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的继代增殖培养基为MS+6-BA1.0～3.0mg/L+IBA0.1～0.5mg/L+卡拉胶9g/L+白砂糖30g/L，pH＝5.8～6.0。

5.根据权利要求1所述的红花丰花月季试管花的生产方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的花芽诱导培养基为改良MS培养基+6-BA0.2～2.0mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+卡拉胶9g/L+白砂糖30g/L，pH＝5.8～6.0；

所述的改良MS培养基为改良MS-1培养基或改良MS-2培养基；

所述的改良MS-1培养基为：KH₂PO₄ 340～850mg/L，其余同MS培养基；所述的改良MS-2培养基为：NH₄NO₃ 825mg/L；KNO₃ 950mg/L；MgSO₄·7H₂O 185mg/L；CaCl₂·2H₂O 220mg/L；KH₂PO₄ 85～255mg/L；其余同MS培养基。

6.根据权利要求1所述的红花丰花月季试管花的生产方法，其特征在于：

步骤(3)所述的培养用的是透气封口膜封口的三角瓶。

7.根据权利要求6所述的红花丰花月季试管花的生产方法，其特征在于：

所述的透气封口膜大小为11cm*11cm，过滤膜直径16mm，过滤孔径0.2～0.3μm，空气通量＝1020。

8.根据权利要求1所述的红花丰花月季试管花的生产方法，其特征在于：

步骤(1)和(2)所述的培养条件为温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照12h/d；

步骤(3)所述的培养条件为温度20℃～25℃，光照强度5000～6000lx，光照10h/d。

9.根据权利要求1所述的红花丰花月季试管花的生产方法，其特征在于：

步骤(4)所述的彩色培养基为花芽诱导培养基中添加食用色素。

10.根据权利要求9所述的红花丰花月季试管花的生产方法，其特征在于：

所述的食用色素为柠檬黄、胭脂红、苹果绿、天蓝色或葡萄紫。