CN113924977A - 一种控制月季试管苗开花的方法 - Google Patents

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CN113924977A CN202010667481.7A CN202010667481A CN113924977A CN 113924977 A CN113924977 A CN 113924977A CN 202010667481 A CN202010667481 A CN 202010667481A CN 113924977 A CN113924977 A CN 113924977A
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黄勇平
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Abstract

本发明公开了一种控制月季试管苗开花的方法，包括以下步骤：将经组织培养的月季健壮的芽接入花诱导培养基中进行花诱导培养，所述的花诱导培养基中含大于10g/L蔗糖。本发明可高效、稳定的控制月季试管苗开花。试管苗开花是在无菌的条件下进行，体积小，摆放的空间可以人为调整，可以在居家、办公室等室内场所广泛应用，克服病虫害问题，且开花时间和数目可以人工控制，生长约1个月开始就有花蕾出现，每个外植体大约能诱导出5‑10朵花，一直保持到2个月左右的盛开期。这种方法生产花卉不受季节影响，可以进行工厂化大规模生产，无菌无尘，可以广泛地应用于居家、办公、医院等作为花卉观赏应用。

Description

一种控制月季试管苗开花的方法
技术领域
本发明属于植物细胞工程领域，涉及一种控制月季试管苗开花的方法。
背景技术
试管花卉是一种长在小试管或玻璃瓶中的迷你携带的花卉的总称。它是利用植物组织培养技术，在人工控制的相对或绝对无菌环境条件下，将植物幼苗或茎尖组织培养于透明试管或艺术化的玻璃瓶等相对密封空间里。培养花卉的试管因外形美观，而且，体积微小又被称为“天使花房”或“试管花屋”。目前报道的试管花卉的植物种类很多，但是，大多数都是以植物幼苗。随着城市化进程的加速，越来越多的人们生活在城市里，大部分居民都没有种植花卉的庭院和没有时间来自己种植花卉。试管花卉因此可以弥补人们对花卉观赏的需求。试管开花可以在人工控制下，让人们在任何季节观赏到植物花，由于其无菌，自带培养基不需要浇水等养护，可以培养于办公室、医院和偏远地区比如海岛、高山，甚至宇宙飞船和空间站中，因而，具有广阔的应用前景。然而，如何控制试管植物的开花时间一直是一个难题。
月季是一种重要的花卉植物，是重要的切花之一，虽然，月季可以四季开花，但是，需要有户外的栽种场所。通过组织培养方法实现月季在试管中开花，可以为月季的应用开辟新的途径。
发明内容
本发明针对试管植物不能高效、稳定开花的缺陷，提供一种控制月季试管苗开花的方法。
为此，本发明提供一种控制月季试管苗开花的方法，包括以下步骤：将经组织培养的月季健壮的芽接入花诱导培养基中进行花诱导培养，所述的花诱导培养基中含高浓度蔗糖。
所述的高浓度蔗糖是指比常规月季试管苗培养基中所含的蔗糖浓度高，大于10g/L蔗糖，更佳的是30～100g/L蔗糖，最佳的是50g/L蔗糖。常规月季试管苗培养基含10g/L蔗糖。
所述的花诱导培养基还含有常规的月季试管苗培养基所含的成分，包括：(1)WPM，和(2)细胞分裂素和/或生长素。其中，各组分的含量都是常规的。较佳的，所述的细胞分裂素和/或生长素是6-BA和NAA，更佳的是1.5-2mg/L 6-BA，0.05-0.1mg/L NAA。所述的花诱导培养基最佳的为：WPM，1.5mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，30～100g/L蔗糖。
所述的花诱导培养的温度和光照条件是常规的，较佳的是在温度21℃-23℃，光照强度60-80μmol/m2 s-1，每天16小时光照8小时黑暗的条件下培养。培养时间较佳的是半个月至5个月，更佳的是1个月至3个月。
所述的月季是本领常规，较佳的是地被月季，更佳的是老灌丛月季(old bush)或绿萼月季(Rosa Chinensis viridiflora，green Rose)。
较佳的，所述的经组织培养的月季健壮的芽由包括以下步骤获得：对月季带芽茎段的外植体消毒处理，进行芽诱导培养，芽生长健壮培养或芽增殖培养。
本发明还提供一种制备月季试管苗的方法，包括以下步骤：
1)芽诱导培养：对月季带芽茎段的外植体消毒处理，将茎段接种在芽诱导培养基上，黑暗条件下培养，诱导芽的分化，获得芽；
2)芽生长健壮培养：将步骤1)所获得的芽切下转入芽生长健壮培养基上培养，促进芽生长健壮，获得生长健壮的芽；
3)芽增殖培养：将步骤2)所获得的生长健壮的芽转接至芽增殖培养基上培养，再生芽会快速长大并产生丛生芽。
本发明中，所述的对月季带芽茎段的外植体消毒处理的步骤是常规的。较佳的，该步骤包括从健壮的母本植株上，选取带芽的茎段，先用75％(v/v)酒精浸泡30-120秒，再用1-20％(v/v)的次氯酸钠溶液浸5～20分钟，最后用无菌水洗1～8次，用无菌滤纸吸干茎段表面多余的水分。最佳的，该步骤包括从健壮的母本植株上，选取带芽的茎段，先用75％(v/v)酒精浸泡90秒，再用10％(v/v)的次氯酸钠溶液浸10～15分钟，最后用无菌水洗3～5次，用无菌滤纸吸干茎段表面多余的水分。较佳的，从健壮的母本植株上选取带芽的茎段先置于清水中用试管刷清洗，再进行消毒。
所述的芽诱导培养是常规的，在常规的芽诱导培养基中进行。较佳的，所述的芽诱导培养基包括：(1)MS，(2)细胞分裂素和/或生长素，和(3)蔗糖。其中，各组分的含量都是常规的。所述的细胞分裂素和/或生长素是6-BA和IBA，更佳的是1.5-2mg/L 6-BA，0.1-0.2mg/L IBA。所述的蔗糖是10～20g/L蔗糖。最佳的，所述的芽诱导培养基为：MS，1.5mg/L 6-BA，0.2mg/L IBA，10g/L蔗糖。
所述的芽生长健壮培养是常规的，在常规的芽生长健壮培养基中进行。较佳的，所述的芽生长健壮培养基和所述的芽诱导培养基相同。
所述的芽增殖培养是常规的，在常规的芽增殖培养基中进行。较佳的，所述的芽增殖培养基包括：(1)WPM，(2)细胞分裂素和/或生长素，和(3)蔗糖。其中，各组分的含量都是常规的。所述的细胞分裂素和/或生长素是6-BA和NAA，更佳的是1.5-2mg/L 6-BA，0.05-0.1mg/L NAA。所述的蔗糖是10～20g/L蔗糖。最佳的，所述的芽增殖培养基为：WPM，1.5mg/L6-BA，0.1mg/L NAA，10g/L蔗糖。较佳的，步骤3)中所述的丛生芽每3周转接一次。
较佳的，所述的方法还包括4)花诱导培养：包括选取健壮的芽接入花诱导培养基中进行花诱导培养，所述的花诱导培养基中含大于10g/L蔗糖。
最佳的，所述的芽诱导培养基和所述的芽生长健壮培养基均为：MS，1.5mg/L 6-BA，0.2mg/L IBA，10g/L蔗糖；所述的芽增殖培养基为：WPM，1.5mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，10g/L蔗糖；所述的花诱导培养基为：WPM，6-BA 1.5mg/L，NAA 0.1mg/L，30～100g/L蔗糖。
本发明中，所述的MS是本领域常规的，全称是Murashige and SkoogStock培养基，简称MS。
MS成分(单位：mg/L)：
大量元素：NH4NO3 1650,KNO3 1900,CaCl2.2H2O 440,MgSO4.7H2O 370,KH2PO4 700；
微量元素：KI 0.83,H3BO3 6.2,MnSO4.4H2O 22.3,ZnSO4.7H2O 8.6,Na2MnO4.2H2O0.25,CuSO4.5H2O 0.025,CoCl2.6H2O 0.025；
铁盐：FeSO4.7H2O 27.8,Na2-EDTA.2H2O 37.3；
有机成分：肌醇100，烟酸0.5，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5，盐酸硫胺素(维生素B1)0.5，甘氨酸2；
根据需要，加入适当浓度的蔗糖和琼脂，pH调至5.8，121℃高温高压灭菌20分钟。
本发明中，所述的WPM是本领域常规的，是木本植物用培养基(WPM,Woody Plantmedium)。
WPM成分(单位：mg/L)：
NH4NO3 400,K2SO4 900，MgSO4 370,KH2PO4 170,CaCl2 96,MnSO4 22.5,ZnSO4 8.6,H3BO3 6.2，CuSO4 8.6,CuSO4 0.25,NaMoO4 0.25,FeSO4 27.3,C10H16N2O8 37.3，盐酸硫胺素(VB1)1.0,盐酸吡哆辛(VB6)0.5,烟酸(VB5)0.5,甘氨酸2.0，肌醇100。
称取WPM 2.14g，另取硝酸钙0.56g，加热溶解于1000ml蒸馏水，分装pH＝5.80，121℃高压灭菌20分钟。备用。
本发明中，较佳的，所述的芽诱导培养在21℃-23℃，黑暗条件下培养14天；
较佳的，所述的芽生长健壮培养在温度21℃-23℃，光照强度60-80μmol/m2 s-1，每天16小时光照8小时黑暗的条件下培养14天；
较佳的，所述的芽增殖培养在温度21℃-23℃，光照强度60-80μmol/m2s-1，每天16小时光照8小时黑暗的条件下培养，更佳的，每2-3周转接一次；或，
较佳的，所述的花诱导培养在温度21℃-23℃，光照强度60-80μmol/m2s-1，每天16小时光照8小时黑暗的条件下培养，培养时间是半个月至5个月，更佳的是1个月至3个月。
较佳的，所述的选取健壮的芽是从步骤2)所获得的芽中选取，或者从步骤3)所获得的芽中选取，更佳的是从步骤3)每2-3周转接一次所获得的芽中选取。
本发明的有益效果有：本发明可高效、稳定的控制月季试管苗开花。老灌丛月季和绿萼月季是分别具有非常高的观赏价值的粉红花色和绿色花色的月季品种。在室外培养的缺点是花期短和易被病虫害侵袭，难以在居家的阳台培养。本发明的试管苗开花是在无菌的条件下进行，体积小，摆放的空间可以人为调整，可以在居家、办公室等室内场所广泛应用，克服病虫害问题，且开花时间和数目可以人工控制，生长约1个月开始就有花蕾出现，每个外植体大约能诱导出5-10朵花，一直保持到2个月左右的盛开期。本发明利用植物组织培养技术，在人工控制的无菌环境条件下，对消毒的月季外植体在附加适当浓度激素和糖的培养基上进行芽诱导，待芽长大，再将其转接至芽增殖培养基进行芽扩增，最后将增殖的芽转接至花诱导培养基，人工控制生成试管苗开花的时间和数目。这种方法生产花卉不受季节影响，可以进行工厂化大规模生产，无菌无尘，可以广泛地应用于居家、办公、医院等作为花卉观赏应用。
附图说明
图1老灌丛月季芽诱导，在黑暗条件下生长14天。
图2老灌丛月季芽健壮，在光照条件下生长14天。
图3老灌丛月季芽增殖培养的方法，在光照条件下培养20天。
图4花诱导培养基对老灌丛月季花的诱导情况,a,b,c,d,e,f的糖的浓度分别是0,10,30,50,70,100g/L，转接45天。
图5蔗糖对于老灌丛月季开花诱导的促进作用。左图，在含有不同浓度蔗糖培养基上生长不同天数的图片；右图分别对生长于0,1g/L,10g/L,30g/L和50g/L蔗糖的培养基上生长45天，55天和61天老灌丛月季外植体花芽分化率的统计。
图6绿萼月季芽诱导培养基上绿萼芽诱导情况。
图7绿萼月季芽增殖培养情况。
图8花诱导培养基对绿萼月季花的诱导情况,a,b,c,d,e,f的糖的浓度分别是0,10,30,50,70,100g/L，转接45天。
图9蔗糖对于绿萼月季开花诱导的促进作用。左图，在含有不同浓度蔗糖培养基上生长30,46,59天的图片；右图分别对生长于0,10g/L,30g/L，50g/L和70g/L蔗糖的培养基上生长30天，46天和59天绿萼外植体花芽分化率的统计。
图10显示本发明不仅可以快速诱导月季试管苗开花，还能增加其开花数量。(A)绿萼月季在花诱导培养基上生长30天，显示每个外植体至少可以诱导5朵以上的花；(D)是(A)的局部放大。(B)和(C)是老灌丛月季分别在花诱导培养基上生长20天和40天的图，(E)和(F)分别是(B)和(C)的局部放大，显示每个外植体可以诱导5朵以上的花。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例子作进一步说明。
实施例1老灌丛月季开花诱导
1.芽诱导、增殖和健壮
从健壮的母本植株上，选取带芽的茎段，先用75％(v/v)酒精浸泡90秒，再用10％(v/v)的次氯酸钠溶液浸10～15分钟，最后用无菌水洗3～5次，用无菌滤纸吸干茎段表面多余的水分。
将茎段接种在芽诱导培养基(MS，1.5mg/L 6-BA，0.2mg/L IBA，10g/L蔗糖)上，在21℃-23℃，黑暗条件下培养14天，诱导芽的分化(图1)。
随后将伸长的芽切下转入芽生长健壮培养基(MS，1.5mg/L 6-BA，0.2mg/L IBA，10g/L蔗糖)上，在温度21℃-23℃，光照强度60-80μmol/m2s-1，每天16小时光照8小时黑暗的条件下培养14天(图2)，促进芽生长健壮。
再将生长健壮的芽转接至芽增殖培养基(WPM，1.5mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，10g/L蔗糖)上，在温度21℃-23℃，光照强度60-80μmol/m2 s-1，每天16小时光照8小时黑暗的条件下培养，这时再生芽会快速长大并产生丛生芽(图3)。每3周可转接一次，平均每个月可增殖10～15倍。
2.花诱导
(1)老灌丛月季试管苗花诱导的基本培养基和操作步骤
选取上述健壮的芽转接至花诱导培养基(WPM，1.5mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，30～100g/L蔗糖)上，在温度21℃-23℃，光照强度60-80μmol/m2 s-1，每天16小时光照8小时黑暗的条件下培养，可有效地诱导开花(图4)。
(2)蔗糖在控制花芽诱导时间和诱导率中的作用研究
图4显示蔗糖对于老灌丛月季试管苗开花诱导有明显的促进作用，在蔗糖浓度小于30g/L的诱导培养基上2个月内不会开花，而在蔗糖浓度大于30g/L的培养基上生长1个月开始有花蕾出现，至45天花蕾数量达到最多，每个外植体大约能诱导出11-12朵花，一直保持到2个月左右的盛开期。因此，本发明认为50g/L蔗糖的花诱导培养基诱导开花的效率最高(图5)。
老灌丛月季花型华丽，颜色丰富多变，香味浓郁，是目前广泛栽培的品种。最佳生长温度为15℃-25℃，低于5℃或大于30℃就会进入半休眠状态，但是，它缺点是受温度影响大，耐热耐晒性差，单花期短，抗病性弱，需要经常打农药预防。本发明室内试管苗培养对于温度可以控制，完全无菌，可以克服室外种植的缺点，不需要特别养护，在室温条件下就可以开花，可在很大范围内应用(图10)。
实施例2绿萼开花诱导
1.芽诱导、增殖和健壮
从健壮的母本植株上，选取带芽的茎段，消毒灭菌后(方法同实施例1)，接种于芽诱导培养基(MS，1.5mg/L 6-BA，0.2mg/L IBA，10g/L蔗糖)，在黑暗条件下培养14天(图6)，
随后将伸长的芽切下转入芽生长健壮培养基(MS，1.5mg/L 6-BA，0.2mg/L IBA，10g/L蔗糖)上，在温度21℃-23℃，光照强度60-80μmol/m2s-1，每天16小时光照8小时黑暗的条件下培养14天(图2)，促进芽生长健壮。
再将生长健壮的芽转接至芽增殖培养基(WPM，1.5mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，10g/L蔗糖)上，在温度21℃-23℃，光照强度60-80μmol/m2 s-1，每天16小时光照8小时黑暗的条件下培养，这时再生芽会快速长大并产生丛生芽(图7)。每3周可转接一次，平均每个月可增殖10～15倍。
2.开花诱导
(1)绿萼月季试管苗花诱导的基本培养基和操作步骤
选取上述健壮的芽转接至花诱导培养基(WPM，1.5mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，30～100g/L蔗糖)上，在温度21℃-23℃，光照强度60-80μmol/m2 s-1，每天16小时光照8小时黑暗的条件下培养，可有效地诱导开花(图8)。
(2)蔗糖在控制花芽诱导时间和诱导率中的作用研究
图8显示蔗糖对于绿萼试管苗开花诱导有明显的促进作用，在蔗糖浓度小于10g/L的诱导培养基上2个月内不会开花，而在蔗糖浓度大于30g/L的培养基上生长1个月开始有花蕾出现，至45天达到最大，每个外植体大约能诱导出8-9朵花，一直保持到2个月左右的盛开期。当培养基中蔗糖浓度大于70g/L，也可以诱导开花，但是，每个外植体大约诱导出1-2朵花，大大低于50g/L和70g/L蔗糖的培养基。虽然50g/L和70g/L蔗糖的培养基的花诱导开花效率一致，但70g/L蔗糖的培养基上的外植体长势较差，因此本发明认为50g/L蔗糖的培养基最适合诱导绿萼开花(图9)。
绿萼月季是现存中国古代月季中十分珍稀的品种，由于花型与花色稀少，被很多月季品种园或园林单位列为镇园之宝，但是，绿萼繁殖与栽培比较困难。在室外绿萼长势较弱，抗病能力很差，容易受到蚜虫等虫害的侵蚀。因此，本发明利用试管苗开花是一种非常有应用前景的观赏绿萼的途径(图10)。
本发明的实施例以及附图只是为了展示本发明的设计构思，本发明的保护范围不应当局限于这一实施例。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种控制月季试管苗开花的方法，其特征在于，包括以下步骤：将经组织培养的月季健壮的芽接入花诱导培养基中进行花诱导培养，所述的花诱导培养基中含大于10g/L蔗糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高浓度蔗糖是30～100g/L蔗糖。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的花诱导培养基还包括：(1)WPM，和(2)6-BA和NAA；更佳的，所述的花诱导培养基还包括：(1)WPM，和(2)1.5-2mg/L 6-BA，0.05-0.1mg/L NAA。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的月季是地被月季，更佳的是老灌丛月季(old bush)或绿萼月季(Rosa Chinensis viridiflora，green Rose)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的经组织培养的月季健壮的芽由包括以下步骤获得：对月季带芽茎段的外植体消毒处理，进行芽诱导培养，芽生长健壮培养或芽增殖培养。
6.一种制备月季试管苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)芽诱导培养：对月季带芽茎段的外植体消毒处理，将茎段接种在芽诱导培养基上，黑暗条件下培养，诱导芽的分化，获得芽；
2)芽生长健壮培养：将步骤1)所获得的芽切下转入芽生长健壮培养基上培养，促进芽生长健壮，获得生长健壮的芽；
3)芽增殖培养：将步骤2)所获得的生长健壮的芽转接至芽增殖培养基上培养，再生芽会快速长大并产生丛生芽。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，
所述的芽诱导培养在芽诱导培养基中进行，所述的芽诱导培养基包括：(1)MS，(2)1.5-2mg/L 6-BA，0.1-0.2mg/L IBA，和(3)10～20g/L蔗糖；
所述的是芽生长健壮培养在芽生长健壮培养基中进行，所述的芽生长健壮培养基和所述的芽诱导培养基相同；
所述的芽增殖培养在芽增殖培养基中进行，所述的芽增殖培养基包括：(1)WPM，(2)1.5-2mg/L 6-BA，0.05-0.1mg/L NAA，和(3)10～20g/L蔗糖。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括4)花诱导培养：包括选取健壮的芽接入花诱导培养基中进行花诱导培养，所述的花诱导培养基中含大于10g/L蔗糖。
9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，所述的芽诱导培养基和所述的芽生长健壮培养基均为：MS，1.5mg/L 6-BA，0.2mg/L IBA，10g/L蔗糖；所述的芽增殖培养基为：WPM，1.5mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，10g/L蔗糖；所述的花诱导培养基为：WPM，6-BA1.5mg/L，NAA 0.1mg/L，30～100g/L蔗糖。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，
所述的对月季带芽茎段的外植体消毒处理包括从健壮的母本植株上，选取带芽的茎段，先用75％(v/v)酒精浸泡30-120秒，再用1-20％(v/v)的次氯酸钠溶液浸5～20分钟，最后用无菌水洗1～8次，用无菌滤纸吸干茎段表面多余的水分；
所述的芽诱导培养在21℃-23℃，黑暗条件下培养14天；
所述的芽生长健壮培养在温度21℃-23℃，光照强度60-80μmol/m2 s-1，每天16小时光照8小时黑暗的条件下培养14天；
所述的芽增殖培养在温度21℃-23℃，光照强度60-80μmol/m2 s-1，每天16小时光照8小时黑暗的条件下培养，每2-3周转接一次；或，
所述的花诱导培养在温度21℃-23℃，光照强度60-80μmol/m2 s-1，每天16小时光照8小时黑暗的条件下培养，培养时间是半个月至5个月。
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