CN104273028B - 一种景天科植物快速离体繁殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种景天科植物快速离体繁殖的方法，包括种子无菌萌发、诱导不定芽、不定芽伸长离体生根等步骤。本发明的方法，离体萌发小苗可正常生长，短时间内即可诱导小苗由原来的单种单苗继续分化成为单种多苗，大大缩短繁殖周期，且分化出的小苗生长周期大大缩短，为提高景天科植物优质品种的育种效率提供了稳定的技术平台。

Description

一种景天科植物快速离体繁殖的方法

技术领域

本发明涉及景天科植物栽培领域，具体涉及一种景天科植物快速离体繁殖的方法。

背景技术

景天科植物是一类分布广泛，具有较高观赏和药用价值的多肉植物。景天科植物是双子叶植物，约有1600种，分布于世界各地，草本或亚灌木，通常为肉质状。叶互生、对生或轮生，单生，多数无柄，全缘，有锯齿、浅裂或羽状裂，无托叶。果实为蓇葖果，膜质或毛质，常为残存之膜质花瓣所包被，开裂；种子小，碟状,常有肉质胚乳。全世界约25属，1千余种，原产非洲、美洲和欧洲温带地区。

景天科植物在中国有10属约240余种，另有多种引进作为观赏花卉。景天科植物体肥厚肉质，多培育供观赏。如伽蓝菜属、落地生根属、青锁龙属、紫景天属、景天属等。瓦松属、红景天属、紫景天属和景天属的某些种供药用，某些种有抗病毒的性能。本科植物为多年生肉质草本，夏秋季开花，花型较小。表皮有腊质粉，气孔下陷，可减少蒸腾，是典型的旱生植物。景天科植物在国内多作为药用植物进行栽培利用。

景天科植物中含有生物碱、谷甾醇、黄酮类、景天庚糖、果糖、蔗糖和有机酸等药用成分（衣艳君，费菜的利用价值及栽培．特种经济动植物，2000，3(4)：38）。这些药物成分通过防止血管硬化、降血脂、扩张脑血管，改善冠状动脉循环等途径，达到降血压、防中风、防心脏病的效果。中医论著认为，费菜有活血化淤、益气强心和宁心平肝、清热凉血的功能，并有减低苯丙胺的毒性和扩张冠状动脉的作用，外用可消肿止血。珠芽景天(Sedumbulbirerum)中K含量298．94μg/g（郑艳．安徽景天属(Sedum)植物叶表皮研究．植物研究，1999，l9(3)：292-297），有助于预防和治疗高血压。龙新宪等首次发现东南景天(Sedumalfredii Hance)是一种zn超积累植物，它对土壤中高含量的锌有很强的忍耐、吸收和积累能力，这为探明植物超积累Zn的机理和Zn污染土壤的植物修复提供了一种新的种质资源（龙新宪等.四种景天属植物对锌吸收和积累差异的研究.植物学报：英文版，2002，44(2)：152—157）。

景天科植物的经济价值主要体现在两个方面：一为观赏价值，景天科植物具有耐旱、耐寒、耐贫瘠、少病虫害、低养护、粗放管理等特点，可节水、节能、节材、节力，是创建节约型园林和城市绿化不可缺少的植物种类之一。其植株相对低矮，整齐一致，色彩丰富，生长期较长，在园林绿化中可布置花坛、花镜，做镶边植物或组成大型图案，或成片栽植，或点缀石景园等，也可做切花或盆栽供室内外观赏，同时还是屋顶绿化的良好材料。二为药用价值，三七、大花红景天等景天科植物早已作为传统中药材广泛使用，随着科技手段的不断进步，越来越多的景天科植物的药用价值也被发掘。如三种景天科植物佛甲草，垂盆草和凹叶景天中的黄酮提取物被发现可用于阻止肝癌细胞的扩散（陈雨洁等，景天属三种植物药不同提取部位及总黄酮抗肿瘤作用研究，2011，中央民族大学学报，20（2）：89-92）。综上所述，对景天科植物进行系统而全面的开发势必为城市发展和人民健康做出不小的贡献。

由于景天科植物具有较高的观赏和药用价值，国内外对景天科植物的需求与日俱增，新品种的选育是当前景天科植物发展的一个重要局限。景天科植物一般在夏秋季开花，花小而繁茂，种子细小且成熟度不一，采用播种繁殖发芽率极低，且苗期管理稍有不慎，就造成小苗大面积死亡。且由于景天科植物所处自然环境较为恶劣，导致其在幼苗期生长极为缓慢，容易感病，死亡率高。传统人工温室条件下种植景天科植物幼苗，也经常出现苗期大面积死亡的问题。

目前景天科植物的繁殖方式以无性繁殖为主，主要包括分株，茎或叶插的方法。然而该方法直接取材于成体植株，完全保有了母本性状，无法出现新的性状和品种，性状极易退化。传统无性繁殖需在成株基础上取叶片或茎秆等成熟组织进行扦插繁殖所需周期冗长（邱宁宏等，景天的组培快繁技术．特种经济动植物，2003，6(12)：20；罗林会等，费菜的离体快速繁殖．特种经济动植物，2003，6(10)：24；赵莉，不同营养条件对大苞景天愈伤组织诱导及植株再生的影响，2005，四川农业大学硕士论文），对景天植物的生理特性研究和园艺特性的发掘利用等众多方面造成很大的限制。

因此，本领域尚需提供一种新型的景天科植物繁殖方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的景天科植物繁殖方法，可快速大量繁殖，方法重复性好，且周期短。

本发明的第一方面，提供一种景天科植物的繁殖方法，包括步骤：

(a)将所述景天科植物的种子无菌萌发获得无菌苗；

(b)切除所述步骤a)获得的无菌苗的下胚轴后进行诱导培养，长出不定芽；

(c)对所述步骤b)获得的不定芽进行培养，生根获得植株。

在另一优选例中，所述步骤a)中，将所述种子置于含1-10mg/L GA₃和0.1-1mg/LBA的MS固体培养基上，于25±2℃无菌培养，所述种子萌发获得所述无菌苗。

在另一优选例中，所述步骤a)中，将所述种子置于含2-8mg/L GA₃和0.2-0.8mg/LBA的MS固体培养基上，于25±2℃无菌培养，所述种子萌发获得所述无菌苗。

在另一优选例中，所述步骤a)中，将所述种子置于含4-6mg/L GA₃和0.4-0.6mg/LBA的MS固体培养基上，于25±2℃无菌培养，所述种子萌发获得所述无菌苗。

在另一优选例中，所述步骤a)中，培养2-3天后种子开始萌发，5-7天大量种子萌发，10-15天种子萌发结束，发芽率为95-99%。

在另一优选例中，所述步骤b)中，所述诱导培养是指在含0.5-1.5mg/L苄氨基腺嘌呤和0.01-0.5mg/L萘乙酸的MS培养基培养所述无菌苗。

在另一优选例中，所述步骤b)中，切除所述步骤a)获得的无菌苗的下胚轴后，转移至含0.8-1.2mg/L苄氨基腺嘌呤和0.05-0.3mg/L萘乙酸的MS培养基进行诱导培养。

在另一优选例中，所述步骤b)中，8-12天不定芽出现，15-20天见细毛状的不定芽。

在另一优选例中，所述步骤c)包括步骤:

c1)对所述步骤b)获得的不定芽进行培养至单个不定芽长出心叶；

c2)分离步骤c1)获得的长出心叶的不定芽，继续培养至生根获得植株。

在另一优选例中，所述步骤c1)中将所述不定芽置于含0.15-0.25mg/L苄氨基腺嘌呤、0.01-0.05mg/L萘乙酸和0.5-1.5mg/L赤霉素的MS培养基中进行培养。

在另一优选例中，所述步骤c1)中将所述不定芽置于含0.18-0.22mg/L苄氨基腺嘌呤、0.01-0.03mg/L萘乙酸和0.8-1.2mg/L赤霉素的MS培养基中进行培养。

在另一优选例中，所述步骤c1)中培养5-7天单个不定芽长出心叶。

在另一优选例中，所述步骤c2)中将长出心叶的不定芽置于MS培养基中进行培养。

在另一优选例中，所述步骤c2)中培养7-10天得到离体再生的完整小植株。

在另一优选例中，所述方法还包括将步骤c)获得的植株进行炼苗后，移植入栽培土中培养的步骤。

在另一优选例中，所述景天科植物为红爪、木樨、广寒宫、山地玫瑰、黑莲、东云、仙女杯或月影。

本发明中，种子包括各种种子，人为改变或天然来源的种子，人为改变的种子包括导入外源基因的、内源性基因被改变的如敲除、抑制、拮抗、增强。在另一优选例中，所述种子为非转基因种子、转基因种子或内源性基因被改变的种子。在另一优选例中，所述非转基因种子是指不含转入外源基因的天然来源的种子。

在另一优选例中，所述方法还包括在步骤a)前对所述种子进行消毒的步骤。

本发明在适当人工条件诱导下，大幅提高种子发芽率，所获得的离体萌发小苗可正常生长。在此基础上，对萌发小苗进行适当处理，在短时间内即可诱导小苗由原来的单种单苗继续分化成为单种多苗。大大缩短了以往传统无性繁殖需在成株基础上取叶片或茎秆等成熟组织进行扦插繁殖所需的冗长周期，且分化出的小苗生长周期大大缩短，为提高景天科植物优质品种的育种效率提供了稳定的技术平台。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为实施例1广寒宫立体再生繁殖过程状态图，其中，A为无菌萌发的广寒宫芽苗，即起始外植体，bar:3mm；B为直接发生的不定芽，bar:6mm；C为伸长与成熟的不定芽，bar:10mm；D为诱导的不定根，bar:10mm；E为基质中生长4个月的成株，bar:10mm；F为生长10个月左右的商品化大苗，bar:10mm。

具体实施方式

本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次以景天科植物无菌萌发种子苗为起始外植体，进行离体繁殖，离体萌发小苗可正常生长，且在短时间内即可诱导小苗由原来的单种单苗继续分化成为单种多苗，大大缩短了以往传统无性繁殖需在成株基础上取叶片或茎秆等成熟组织进行扦插繁殖所需的冗长周期，且分化出的小苗生长周期大大缩短，为提高景天科植物优质品种的育种效率提供了稳定的技术平台。在此基础上，完成了本发明。

术语

本文所用的MS培养基是本领域目前使用最普遍的培养基，Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基(Murashigeand Skoog A revised medium for rapid growth and bio assays with tobaccotissue cultures.Physiol Plant,1962.15(3):473.)。除非另有说明，采用本领域已知的配方配制MS培养基或MS固体培养基即可。(罗林会等，费菜的离体快速繁殖．特种经济动植物，2003，6(10)：24)

1/2MS基本培养基是指将MS培养基中大量元素质量减半。大量元素是指硝酸钾KNO₃、硝酸铵NH₄NO₃、磷酸二氢钾KH₂PO₄、硫酸镁MgSO₄.7H₂O和氯化钙CaCl₂.2H₂O等五种化合物。

6-苄基腺嘌呤

如本文所用，术语“6-苄基腺嘌呤”、“6-苄腺嘌呤”、“6-苯甲基腺嘌呤”、“6-BA”、“苄基腺嘌呤”、“BA”等均可以与互换使用。

6-苄基腺嘌呤是一种广谱性植物生长调节剂，可促进植物细胞生长，抑制植物叶绿素、核酸、蛋白质的分解，提高氨基酸的含量，延缓叶片衰老，将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，广泛用在农业、果树和园艺作物的从发芽到收获的各个阶段。

本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得6-苄基腺嘌呤，如市场购买或用常规方法制取。

赤霉素

如本文所用，术语“赤霉素”可以与“GA”、“GA₃”互换使用。

赤霉素是一类广泛存在的植物激素，化学结构比较复杂，属于二萜类酸，由四环骨架衍生而得。赤霉素都含有赤霉素烷骨架。在高等植物中赤霉素的最近前体一般认为是贝壳杉烯。赤霉素的基本结构是赤霉素烷，有4个环。在赤霉素烷上，由于双键、羟基数目和位置不同，形成了各种赤霉素，已知的赤霉素类至少有38种。不同的赤霉素生物活性不同，赤霉酸(GA₃）的活性最高。活性高的化合物必须有一个赤霉环系统（环ABCD），在C-7上有羧基，在A环上有一个内酯环。

赤霉素目前广泛应用于农业生产，如提高葡萄产量，或在杂交水稻制种中调节花期以使父母本花期相遇等；对水稻、棉花、蔬菜、瓜果、绿肥等有显著的增产效果。

本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得各种赤霉素，如市场购买或用常规方法制取。一种常规制取赤霉素的方法为用甲醇提取。不同的赤霉素可以用各种色谱分析技术分开。

萘乙酸

如本文所用，术语“萘乙酸”可以与“NAA”互换使用。

萘乙酸是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等。可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。

本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得萘乙酸，如市场购买或用常规方法制取。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的有益之处在于：

(1)首次以景天科植物无菌萌发种子苗为起始外植体，进行离体繁殖，离体萌发小苗可正常生长，短时间内即可诱导小苗由原来的单种单苗继续分化成为单种多苗，大大缩短繁殖周期；

(2)本发明的方法可离体快速大量繁殖景天科植物，重复性好；

(3)本发明的方法繁殖的景天科植物，既能保持亲本的遗传表型，又能够具有所转入的外源目的基因的性状；

(4)为提高景天科植物优质品种的育种效率提供了稳定的技术平台，快繁大量景天科植株种苗，可供进一步的花卉品种的遗传改良；

(5)本发明首次使景天科植物广寒宫成功再生成植株，植株表型与亲本表型一致性高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

（1）培养基准备

配制植物MS固体培养基，加入GA₃(赤霉素，终浓度为5mg/L)和BA(苄氨基腺嘌呤，终浓度为0.5mg/L)，调节PH值至5.8，高温高压灭菌，倒入9cm平板中备用。

同时配制含1mg/L BA(苄氨基腺嘌呤)和0.1mg/L NAA(萘乙酸)的MS培养基；配制含0.2mg/L BA(苄氨基腺嘌呤)、0.02mg/L NAA(萘乙酸)和1mg/L赤霉素GA₃的MS培养基。

（2）种子消毒

将景天科种子广寒宫装入1.5ml EP管中，加入0.01-0.05%微量高锰酸钾溶液（淡紫色）浸泡1小时，漂洗干净后移入1.5ml EP管中加入10%次氯酸钠溶液处理8分钟，期间用旋涡振荡仪将种子与溶液混合3-5次，置入超净台后将溶液吸出，采用无菌双蒸水漂洗3-5次约5分钟。

（3）无菌萌发

在超净台中将种子小心铺在叠有滤纸的MS固体培养基（含5mg/L GA₃和0.5mg/LBA）上，置于25±1度人工培养箱中培养，其中光照2000lex14h，黑暗10h。定期观察，发现2-3天后种子开始萌发，5-7天大量种子萌发，10-15天种子萌发结束，发芽率为95-99%。如此，获得无菌苗，如图1中A所示，以备用。

（4）不定芽诱导

将步骤（3）无菌萌发所得小苗的下胚轴切除，转移至含1mg/L BA和0.1mg/LNAA的MS培养基中诱导不定芽，10天左右不定芽出现，15-20天见细毛状的不定芽，如图1中B所示。

（5）不定芽伸长

将步骤（4）所得不定芽转移至含0.2mg/L BA+0.02mg/L NAA+1mg/L GA₃的MS培养基中，10天左右，不定芽开始伸长，如图1中C所示，5-7天后，单芽见心叶。

（6）不定芽离体生根与移栽

将步骤（5）所得伸长的不定芽分离，转移到MS培养基中，经7-10天生根，成为离体再生的完整小植株，如图1中D所示。

（7）再生植株的移栽与存活

打开培养瓶盖，注入10ml无菌水，对步骤（6）所得离体再生小植株在常规组培光温条件（25±1度，光照2000lex14h，黑暗10h）下炼苗3天，再转入栽培土（土壤基质为常规拟南芥播种组分）中，3-4个月，生长为成株，如图1中E所示。

（8）成株管理与商品化植株的获得

将步骤（7）所得成株置于干燥条件（相对湿度小于50%）下生长，每月向种植基质中浇灌一次营养液（成分为1/2MS基本培养基），保证光照在3000lex以上，保持种植环境通风顺畅。3-4个月后，再生植株大小为8-10cm。生长为可以直接投放市场的商品化大苗，如图1中F所示。

上述实验步骤重复三次，当代繁殖系数为20-25株苗/外植体，再生频率为100%。累计获得广寒宫再生植株386株，经检测，植株表型与亲本表型一致性达到100%。

采用常规的方法，广寒宫成为商品化大苗需18个月左右，而本实施例经由离体快繁途径获得商品化大苗仅需8-10个月，大大缩短了培育所需时间。

实施例2

本实施例的步骤与实施例1基本相同，不同之处采用红爪种子。

实验步骤重复三次，累计获得红爪再生植株265株，经检测，植株表型与亲本表型一致性达到100%。当代繁殖系数为15-20株苗/外植体，再生频率为100%。

采用常规的方法，红爪成为商品化大苗需14个月左右，而本实施例经由离体快繁途径获得商品化大苗仅需8-10个月，大大缩短了培育所需时间。

实施例3

本实施例的步骤与实施例1基本相同，不同之处采用木樨种子。

实验步骤重复三次，当代繁殖系数为20-25株苗/外植体，再生频率为100%。累计获得木樨再生植株279株，经检测，植株表型与亲本表型一致性达到100%。

采用常规的方法，木樨成为商品化大苗需16个月左右，而本实施例经由离体快繁途径获得商品化大苗仅需8-10个月，大大缩短了培育所需时间。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (16)

1.一种景天科植物的繁殖方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)将所述景天科植物的种子无菌萌发获得无菌苗；

(b)切除所述步骤a)获得的无菌苗的下胚轴后进行诱导培养，长出不定芽；

(c)对所述步骤b)获得的不定芽进行培养，生根获得植株；

其中，所述步骤b)中，所述诱导培养是指在含0.5-1.5mg/L苄氨基腺嘌呤和0.01-0.5mg/L萘乙酸的MS培养基培养所述无菌苗；所述步骤a)中，将所述种子置于含1-10mg/LGA₃和0.1-1mg/L BA的MS固体培养基上，于25±2℃无菌培养，所述种子萌发获得所述无菌苗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中，将所述种子置于含2-8mg/LGA₃和0.2-0.8mg/L BA的MS固体培养基上，于25±2℃无菌培养，所述种子萌发获得所述无菌苗。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中，将所述种子置于含4-6mg/LGA₃和0.4-0.6mg/L BA的MS固体培养基上，于25±2℃无菌培养，所述种子萌发获得所述无菌苗。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中，所述步骤b)中，切除所述步骤a)获得的无菌苗的下胚轴后，转移至含0.8-1.2mg/L苄氨基腺嘌呤和0.05-0.3mg/L萘乙酸的MS培养基进行诱导培养。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中，8-12天不定芽出现，15-20天见细毛状的不定芽。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c)包括步骤:

c1)对所述步骤b)获得的不定芽进行培养至单个不定芽长出心叶；

c2)分离步骤c1)获得的长出心叶的不定芽，继续培养至生根获得植株。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤c1)中将所述不定芽置于含0.15-0.25mg/L苄氨基腺嘌呤、0.01-0.05mg/L萘乙酸和0.5-1.5mg/L赤霉素的MS培养基中进行培养。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述步骤c1)中将所述不定芽置于含0.18-0.22mg/L苄氨基腺嘌呤、0.01-0.03mg/L萘乙酸和0.8-1.2mg/L赤霉素的MS培养基中进行培养。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤c1)中培养5-7天单个不定芽长出心叶。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤c2)中将长出心叶的不定芽置于MS培养基中进行培养。

11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤c2)中培养7-10天得到离体再生的完整小植株。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将步骤c)获得的植株进行炼苗后，移植入栽培土中培养的步骤。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述景天科植物为红爪、木樨、广寒宫、山地玫瑰、黑莲、东云、仙女杯或月影。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子为非转基因种子、转基因种子或内源性基因被改变的种子。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述非转基因种子是指不含转入外源基因的天然来源的种子。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤a)前对所述种子进行消毒的步骤。