CN107810854B - 生石花离体培养与快繁的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生石花离体培养与快繁的方法，包括：以生石花叶片作为外植体，对该外植体进行消毒处理后接种到启动培养基上，培养3～4周；将上述培养后膨大的所述外植体接种到诱导培养基上，培养6～7周；选取诱导培养后优良的愈伤组织，进行继代增殖培养，培养4周；选取继代增殖培养后生长健壮的丛生芽，接种到生根培养基中，培养5周，当生根率达到一定数量，根长达到移栽标准，将培养瓶开瓶炼苗，之后将组培苗移栽管理，即完成番杏科生石花组培快繁。该方法能够快速、高效的繁殖生石花组培苗植株，并能够提高了外植体成活率和生根率，能够短期内生产大量优质再生种苗，改进了生石花生长速度慢，繁殖效率低等缺陷。

Description

生石花离体培养与快繁的方法

技术领域

本发明涉及生石花培育领域，特别是涉及一种生石花离体培养与快繁的方法。

背景技术

生石花（Lithops sp.）为番杏科生石花属植物，原产于非洲南部。生石花变态叶肥厚，形如彩石，娇小玲珑，新颖奇特，享有“有生命的石头”的美称，成为近年来热门的小型多肉植物品种之一。生石花的繁殖靠种子或扦插，扦插只能用于一个植株自然形成多个头后来产生新植株，因此大多数繁殖靠种子；但其种子细小，生长速度缓慢，从萌发到开花至少需要3年；而分株方式繁殖率较低，实际生产栽培中使用较少。

此外人们对生石花的需求量逐渐上升，价格随着趋势上涨。为满足市场的需求，快速大量繁殖生石花成为一个重要的问题。植物组织培养方法可以在短期内使植物快速繁殖，并缩短植物生长发育周期。目前对于生石花组织培养研究仍处于探索阶段，对其植株离体再生及组培快繁的研究鲜见报道。

发明内容

基于现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种生石花离体培养与快繁的方法，能快速培养生石花，解决生石花生长速度慢，繁殖效率低，正常培养无法满足市场需求的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明实施方式提供一种生石花离体培养与快繁的方法，包括：

以生石花叶片作为外植体，对该外植体进行消毒处理后接种到启动培养基上，培养3～4周；

将上述培养后膨大的所述外植体接种到诱导培养基上，培养6～7周；

选取诱导培养后优良的愈伤组织，进行继代增殖培养，培养4周；

选取继代增殖培养后生长健壮的丛生芽，接种到生根培养基中，培养5周，当生根率达到一定数量，根长达到移栽标准，将培养瓶开瓶炼苗，之后将组培苗移栽管理，即完成番杏科生石花组培快繁。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的生石花离体培养与快繁的方法，其有益效果为：

本发明针对生石花这一肉质草本植物，构建番杏科生石花完整的组培快繁的方法，该方法能够快速、高效的繁殖生石花组培苗植株，并能够提高了外植体成活率和生根率，能够短期内生产大量优质再生种苗，改进了生石花生长速度慢，繁殖效率低等缺陷。

具体实施方式

下面结合本发明的具体内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。本发明实施例中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

本发明实施例提供一种生石花离体培养与快繁的方法，能构建番杏科生石花完整的组培快繁体系，包括：

以生石花叶片作为外植体，对该外植体进行消毒处理后接种到启动培养基上，培养3～4周；

将上述培养后膨大的所述外植体接种到诱导培养基上，培养6～7周；

选取诱导培养后优良的愈伤组织，进行继代增殖培养，培养4周；

选取继代增殖培养后生长健壮的丛生芽，接种到生根培养基中，培养5周，当生根率达到一定数量，根长达到移栽标准，将培养瓶开瓶炼苗，之后将组培苗移栽管理，即完成番杏科生石花组培快繁。

上述方法中，以生石花叶片作为外植体为：

选取生石花直径为2~4cm 的成熟母本植株叶片为外植体。

上述方法中，对该外植体进行消毒处理为：

对该外植体用洗洁精浸泡15min，经流水冲洗30min以上，在超净工作台中，分别用体积浓度为75%的乙醇与体积浓度为2% NaClO溶液进行消毒处理。

上述方法中，所用的启动培养基由：MS （Murashige and Skoog medium培养基；chembase产品，每升取4.74g）+ 6-BA 2.0 mg/L 溶液（6-Benzyl Aminopurine 母液为1mg/mL，每升加入2000微升）、 NAA 0.4 mg/L溶液（Naphthylacetic acid 母液为1mg/mL，每升加入400微升）、蔗糖 30g/L和琼脂 7g/L组成。

上述方法中，将上述培养后膨大的所述外植体接种到诱导培养基上为：

将上述培养后膨大的所述外植体切割成长1.0~1.5 cm的尺寸后，再接种到诱导培养基上。

上述方法中，所用的诱导培养基由：MS（Murashige and Skoog medium培养基；chembase产品，每升取4.74g）+ 6-BA 2.0 mg/L溶液（6-Benzyl Aminopurine 母液为1mg/mL，每升加入2000微升）、NAA 0.4 mg/L溶液（Naphthylacetic acid 母液为1mg/mL，每升加入400微升）、蔗糖30 g/L和琼脂7 g/L组成。

上述方法中，所用的生根培养基由：蔗糖20 g/L、琼脂粉7g/L、1/2MS（Murashigeand Skoog medium 培养基；chembase产品，每升取2.37g）+ 6-BA 0.5 mg/L溶液（6-BenzylAminopurine 母液为1mg/mL，每升加入500微升）和NAA 0.1mg/L溶液（Naphthylaceticacid 母液为1mg/mL，每升加入100微升）组成；该生根培养基的pH为 6.0。

上述方法中，将培养瓶开瓶炼苗为：首先部分开盖，然后完全揭盖2天，接着在自然光下进行3天的开瓶炼苗，移到室外进遮荫度为50%～60%。

本发明针对生长速度慢，繁殖效率低这一缺点，通过对生石花的外植体消毒时间进行检验，对启动培养基、诱导培养基和生根培养基进行筛选，并对移栽进行了摸索，建立了番杏科生石花属完整的组培快繁的体系，成功获得了生石花组培苗。提高了外植体成活率和生根率，能够短期内生产大量优质再生种苗，以期望在今后的生石花生产中得到进一步应用。很好的解决了正常培养生石花生长速度慢，繁殖效率低，无法满足市场需求的问题。

下面对本发明实施例具体作进一步地详细描述。

本发明主要是将生石花叶片为外植体进行消毒处理，接种到启动培养基上培养上，培养3~4 周；外植体膨大后，接种到诱导培养基上，培养6~7 周；选取优良的愈伤组织，进行继代增殖培养，培养4周；选取生长健壮的丛生芽，接种到生根培养基中，培养5 周；当生根率达到一定数量，根长达到移栽标准，即可将培养瓶开瓶炼苗，最后将组培苗移栽管理，构建番杏科生石花完整的组培快繁的体系。

实施例

本实施例提供一种建立番杏科生石花完整的组培快繁体系的方法，包括以下步骤：

步骤1，生石花外植体处理：

选取多肉植物生石花成熟的叶片为外植体，直径约为2~4cm 的成熟母本植株，将材料用洗洁精浸泡15min，经流水冲洗30min以上。在超净工作台中，分别用75%的乙醇和2%NaClO溶液进行消毒处理，其中处理5s~8min的外植体愈伤组织膨大，有分化的趋势，并且无菌率达高41.2%，成活率高达45.6 %。

表1不同消毒浓度对生石花愈伤组织的影响

时间	无菌率%	成活率%	愈伤状态
				5s～8min	41.2b	45.6ab	愈伤组织膨大，有分化的趋势
5s～12min	33.3c	23.4c	愈伤组织小，紧皱
				30s～8min	48.1ab	48.7a	愈伤组织小、紧皱
30s～12min	50.4a	17.2c	外植体颜色变浅，无愈伤

注：不同小写字母表示在0.05 水平上差异不显著。

步骤2，启动培养：

将准备好的材料接种到启动培养基A1上培养上，其中启动培养基A1为：MS+ 6-BA2.0 mg/L+ NAA 0.4 mg/L+ 30g/L蔗糖+ 7g/L琼脂，愈伤状态较较好，生芽率高，分化效果良好；出芽率高达65.2%，确定最佳启动培养基。

下表2为本发明的启动培养基A1与其它几种启动培养基A2-A4的对比

表2 不同激素组合对生石花愈伤诱导的影响

培养基	6-BA (mg/L )	NAA (mg/L)	愈伤状态	出芽率%
					A1	2	0.4	较绿，生芽率高，分化效果良好	65.2±1.3a
A2	3	0.6	嫩黄色，分化现象不明显，且分化慢	8.6±0.9c
					A3	4	0.8	黄绿色，有芽点出现，分化一般	31.4±2.2b
A4	0	0	外植体萎缩，无分化	0

从上表2中可以看出，本发明所用的启动培养基A1，具有高达65.2±1.3a%的出芽率，远高于其它几种启动培养基。

步骤3，愈伤组织分化培养：

由于外植体经过启动培养后膨大，需将其切割成长1.0~1.5 cm左右，接种到诱导培养基B1上，进行筛选，其中诱导培养基B1为：MS+ 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.4 mg/L+ 30g/L蔗糖+ 7 g/L琼脂，愈伤诱导率高达65.7%，丛芽分化率高达75.2%，确定最佳分化培养基。

下表3为本发明的诱导培养基B1与其它几种诱导培养基B2-B3的对比

表3不同激素浓度对生石花愈伤增殖和分化的影响

培养基	6-BA (mg/L )	NAA (mg/L)	愈伤诱导率%	丛芽分化率%
					B1	2	0.4	65.7b	75.2±2.2a
B2	4	0.8	53.5b	58.4±1.8b
					B3	0	0	0	0

从上表3中可以看出，本发明所用的诱导培养基B1，具有高达75.2±2.2a%的丛芽分化率，远高于其它几种诱导培养基。

步骤4，生根培养：

待叶片长至2cm以上时，选取生长健壮的丛生芽，通过无菌条件下取出幼苗，接种到生根培养基中继续培养。生根培养基采用1/2MS 基本培养基，即培养基蔗糖20 g/L，琼脂粉7g/L，pH 6.0，其中C2：1/2MS+ 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.1mg/L，生根率高达51.4%，确定为最佳生根培养基。

下表4为本发明的生根培养基C2与其它几种生根培养基C1、C3-C4的对比

表4不同激素浓度对生石花生根的影响

培养基	6-BA (mg/L )	NAA (mg/L)	平均根数	生根率%
					C1	1	1	0	0
C2	0.5	0.1	9.9	51.4a
					C3	0.1	0.01	6.3	18.5c
C4	0	0.1	5.6	8.3c

从上表4中可以看出，本发明所用的生根培养基C2，具有高达51.4a%的生根率，远高于其它几种生根培养基。

步骤5，炼苗与移栽：

当生根率达到一定数量，根长达到移栽标准，即将培养瓶开瓶炼苗；首先部分开盖，然后完全揭盖2天，接着在自然光下进行3天的开瓶炼苗，移到室外进遮荫度为50%～60%，最后将组培苗移栽管理。

本发明以生石花这一肉质草本植物的叶片为外植体，设计不同浓度梯度的外植体消毒时间，在含有不同激素的培养基上进行组织培养快繁研究，构建了番杏科生石花完整的组培快繁体系，该体系能够快速、高效的繁殖生石花组培苗植株，并能够提高了外植体成活率和生根率，能够短期内生产大量优质再生种苗，改进了生石花生长速度慢，繁殖效率低等缺陷，获得了完整的生石花组织快繁体系，提高了种苗质量，可用于生石花的大量生产繁殖，是一种通用性强，建立繁殖速度快的生石花组织培养体系。本发明也能够应用于生石花研究，为今后的生石花组培苗生产提供了参考。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (3)

1.一种生石花离体培养与快繁的方法，其特征在于，包括：

步骤1，生石花外植体处理：

选取多肉植物生石花成熟的叶片为外植体，将材料用洗洁精浸泡15min，经流水冲洗30min以上；在超净工作台中，分别用75%的乙醇和2% NaClO溶液进行消毒处理，处理5s～8min；

步骤2，启动培养：

将准备好的材料接种到启动培养基A1上培养，所述启动培养基A1为：MS+ 6-BA 2.0mg/L+ NAA 0.4 mg/L+ 30g/L蔗糖+ 7g/L琼脂；

步骤3，愈伤组织分化培养：

外植体经过启动培养后膨大，将其切割成长1.0～1.5cm，接种到诱导培养基B1上，进行筛选，所述诱导培养基B1为：MS+ 6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.4 mg/L+ 30 g/L蔗糖+ 7 g/L琼脂；

步骤4，生根培养：

待叶片长至2cm以上时，选取生长健壮的丛生芽，通过无菌条件下取出幼苗，接种到生根培养基中继续培养，所述生根培养基C2为1/2MS+ 6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.1mg/L+ 20 g/L蔗糖+ 7 g/L琼脂，pH 6.0；

步骤5，炼苗与移栽：

当生根率达到一定数量，根长达到移栽标准，即将培养瓶开瓶炼苗，最后将组培苗移栽管理。

2.根据权利要求1所述的生石花离体培养与快繁的方法，其特征在于，所述方法中，选取多肉植物生石花成熟的叶片为外植体为：

所述多肉植物生石花为直径为2～4cm的成熟母本植株。

3.根据权利要求1或2所述的生石花离体培养与快繁的方法，其特征在于，所述方法中，将培养瓶开瓶炼苗为：

首先部分开盖，然后完全揭盖2天，接着在自然光下进行3天的开瓶炼苗，移到室外进遮荫度为50%～60%。